CN102103142B - Tafi含量的体外检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种TAFI含量的体外检测方法，利用PAMAM树状多聚物能与抗体结合的生物特性，与传统ELISA方法相结合，将其用于TAFI含量的体外检测，开辟了TAFI新的体外诊断学方法，提高了TAFI体外检测的灵敏度。该方法包括包被抗体的酶标板，样品稀释液，TAFI标准品，洗净液，PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，抗体稀释液，显色缓冲液，30％过氧化氢，邻苯二胺和终止液的TAFI含量体外检测试剂盒。它解决了现有技术存在的设备昂贵，检测时间较长等缺陷，与其它检测试剂盒相比，具有操作简便、快捷，成本低廉，诊断敏感，检出限低等优点，作为辅助诊断，提高相关疾病的检出率和准确率，达到了早期发现，早期治疗的目的；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于临床预测心脑血管疾病等发生可能性的检测凝血酶激活的纤溶抑制物（thrombin-activatable
fibrinolysis inhibitor，简称TAFI）含量的新方法，特别是用于检测人个体生物样品，如血液、血清、血浆、尿液、粘液、粪便、脑脊液、胸腔积液、腹水、唾液、组织或细胞等的TAFI含量的体外检测方法。在医学检验中，它主要通过对人个体生物样品中的TAFI含量的体外测定，以辅助心脑血管疾病、急性早幼粒细胞白血病、内源性凝血系统缺陷疾病、炎症等相关疾病的诊断和大规模临床普查。
背景技术
众所周知，血栓性疾病是一类严重影响健康的疾病，尤其是心脑血管栓塞性疾病已成为我国人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的临床表现千差万别，诊断和治疗往往非常复杂，因此，早期发现、早期治疗尤为重要。目前，血栓性疾病的检查方法主要有心电图、超声心动图、胸部X射线、血压监测、头颅X射线、脑CT扫描、脑MRI检查、DSA、MRA、经颅多普勒超声检查等。射线类检查会对人体产生一定程度的电离辐射，组织血流灌注的功能性成像检查方法较多，这些检查设备通常比较昂贵，增加了成本，有的还需特殊装备，成像时间较长，无法短期获得结果。在医学检验中，尚缺乏一种简单、快捷、准确的用于临床预测心脑血管疾病等发生可能性的检测方法，不利于对疾病的早期发现，早期治疗。
据相关文献报导，TAFI具有被凝血酶激活后下调纤溶活性的功能，是一种存在于血浆中的含金属Zn的羧肽酶前体，又被称为血浆羧肽酶原B、血浆羧肽酶原U、血浆羧肽酶原R。TAFI前体由肝脏合成，是一条包含423个氨基酸的单链糖蛋白，在循环至血液中的过程中，切掉N端22个氨基酸的信号肽，形成401个氨基酸的56kDa的TAFI；TAFI也存在于血小板内，血小板激活时释放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶等蛋白水解酶可以作用于TAFI的Arg92，将其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具有切除部分降解的纤维蛋白C端Arg或Lys的能力，使纤溶蛋白酶原不能被激活，因而具有下调纤溶系统的功能，但其构象具有高度不稳定性。
TAFI于1988年被首次发现，活化后具有内在不稳定性，通常在37℃条件下孵育2h失去活性，并且能特异性地分解底物上精氨酸。后经多位科技工作者对其cDNA进行分离以及测定，并利用纤溶酶原-琼脂糖柱层析的方法从血浆中分离、提纯其酶原蛋白pro-pCPB，进一步分析发现TAFI通过凝血酶激活后具有羧肽酶活性，发挥纤溶抑制作用。
TAFI与心脑血管疾病有一定关系。动脉粥样硬化（atherosclerosis，简称AS）是缺血性心脑血管疾病（如心绞痛、心肌梗死、脑卒中等）共同的病理基础，也是导致血管内血栓形成的主要原因。近几年的研究表明，AS的发生发展与炎症、凝血-纤溶调节系统密切相关。目前研究表明，TAFI通过降低纤溶活性可促进静脉血栓的形成，血浆高TAFI水平能增加静脉血栓事件。
目前，用来检测TAFI水平的方法主要有两类，一类是通过测定酶活力的方法间接测定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶调节蛋白激活TAFI，测定TAFIa的酶活力；另一类是免疫学方法，包括酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和火箭免疫电泳。其中，夹心ELISA法检测TAFI抗原是目前相对成熟的检测方法，检测灵敏度高，特异性强，准确性好，检测方法安全易行。2005年出现了两种针对TAFI的特异性单克隆抗体，成功运用ELISA方法检测TAFI、TAFIa和失活的TAFI。但这些方法因自身存在一定的缺陷，都没有成为国际公认的TAFI参照标准法。
本发明人曾在专利号为CN200410020546.X的“乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒”中，利用含氨功能基高分子PAMAM树突状物的生物特性标记抗体，进行乳腺癌的Her-2免疫组织化学的体外诊断，可使检测乳腺癌获得准确的判断结果。由此，开辟了新的体外诊断学方法。PAMAM（聚酰胺-胺）是一种纳米级树突状多聚物，PAMAM树状大分子（PAMAM Dendrimer）是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合物相比，可在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团，因而具有精确的分子结构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性。经研究表明，用PAMAM来携带寡核酐酸基因片段进行体内和体外实验，证明其具有非常好的传递功能；可应用PAMAM结合抗体片段靶向性治疗前列腺癌。专利号为US2003/0044407A1的“标记抗体或抗体片段的免疫脂质或多聚物用于系统治疗的传输或诊断试剂”中，也公开了一种应用PAMAM标记稀有金属和抗体注入体内，通过核磁共振测定进行影像学诊断的方法。但是因其在体内分解、代谢所产生的毒性作用尚不清楚，有动物实验研究表明，一定的PAMAM剂量可使小鼠产生溶血性变化。因此，体内实验难于广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种TAFI含量的体外检测方法，它解决了现有技术存在的设备昂贵，检测时间较长等缺陷，与其它检测方法相比，具有操作简便、快捷、成本低廉，诊断敏感，检出限低等优点，作为用于临床预测心脑血管疾病的辅助诊断，可显著提高疾病的检出率和准确率，有利于疾病的早期发现，早期治疗；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
本发明所采用的技术方案的具体操作步骤如下：
步骤一 采集人个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；
步骤二 利用体外检测试剂盒，对待检样品进行TAFI含量测定；
所述体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的30%过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使底物显色反应停止的终止液；检测操作时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用所述抗体稀释液300倍稀释，所述TAFI标准品加入1ml所述样品稀释液溶解，所述酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺13mg：显色缓冲液体积13ml：30%过氧化氢体积6.5μl；
步骤三 利用所述样品稀释液对所述待检样品进行100-2000倍稀释；
步骤四 取1ml样品稀释液溶解所述TAFI标准品，其浓度为48ng/ml，用所述样品稀释液对48ng/ml的标准溶液做2倍梯度稀释，制成浓度分别为24ng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1.5ng/ml，0.75ng/ml的标准工作液，以所述样品稀释液作为空白对照液；
步骤五 分别取所述标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品50μl，加入所述包被抗体的酶标板孔中，每个样品2个重复，室温静置1小时，所述待检样品中的TAFI抗原与包被在酶标板上的抗体特异结合，形成固相抗原抗体复合物；
步骤六 弃去酶标板孔中的液体，拍干，加入所述试剂盒的洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中的未结合物质；
步骤七 取所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体20μl，加入所述抗体稀释液6ml中，制成酶联抗体工作液；
步骤八 向结合有抗原抗体复合物的所述包被抗体的酶标板孔中加入所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体50μl，室温静置1小时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体与所述固相抗原抗体复合物上的TAFI抗原结合；
步骤九 弃去所述包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入所述洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中未结合的所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，此时固相载体上带有的酶量与所述待检样品中受检抗原的量成正比；
步骤十 取所述邻苯二胺1片，溶解于所述显色液13ml中，加入30%所述过氧化氢6.5μl混匀，制成所述酶作用底物；
步骤十一 加入所述酶作用底物100μl，避光反应10分钟，固相上的酶催化所述酶作用底物成为淡黄色产物；
步骤十二加入所述终止液100μl终止反应，淡黄色产物立即转化为棕色，于492nm处测定吸光值；
步骤十三 根据所述TAFI标准品的吸光值与浓度的关系，制作标准曲线，根据标准曲线计算所述待检样品中TAFI抗原的含量。
所述包被抗体和酶标抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，所述鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7，所述3B1为特异性结合TAFI和失活的TAFI，所述4E7仅与TAFI结合。
所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体是由辣根过氧化物酶联抗体与带正电荷的PAMAM树突状多聚物混合，在室温条件下反应10~15分钟制成，二者的混合浓度为0.1~10：1摩尔比。
所述包被抗体的酶标板的制备为，用磷酸盐缓冲液稀释抗体4E7至15μg/ml，每孔100μl包被酶标板，用含有10mM乙二胺四乙酸二钠（pH7.3）的1%明胶溶液作为封闭液，每孔200μl封闭酶标板。
所述TAFI标准品的制备为，以标化TAFI作为标准品，倍比稀释做标准曲线，ELISA方法测定人混合血浆浓度，测定结果为38400ng/ml，取该血浆0.3ml，加入100mM乙二胺四乙酸二钠（pH7.3）溶液240μl，蒸馏水3.3ml，100mM壳聚糖溶液0.96ml，充分混匀，制成终浓度为TAFI2.4μg/ml、乙二胺四乙酸二钠5mM、壳聚糖20mM的溶液，取该溶液20μl分装至灭菌过的冻存管底部，冷冻干燥后4℃保存。
样品稀释液的制备为，取1g牛血清白蛋白，加入100mM乙二胺四乙酸二钠(pH7.3)溶液100ml、10倍浓度磷酸盐缓冲液100ml和蒸馏水800ml，充分混匀。
所述体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的96孔包被抗体的酶标板一块；用于稀释待检样品的样品稀释液，2×100ml/瓶；用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，冻干品1×48ng/管；洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，2×100ml/瓶；用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体1×30μl/管；及抗体稀释液，1×10ml/瓶；作为酶作用底物的30%过氧化氢1×30μl/管，邻苯二胺，1×13mg/片，及底物显色缓冲液，1×30ml/瓶；使底物显色反应停止的终止液，1×10ml/瓶。
所述TAFI含量的体外检测方法的应用：其技术要点是：用于检测人体生物样品中的血液、血清、血浆、尿液、粘液、粪便、脑脊液、胸腔积液、腹水、唾液、组织或细胞。
所述TAFI含量的体外检测方法的应用：其技术要点是：将对人个体样品中TAFI含量的测定，根据TAFI与相关疾病的关系，应用于辅助心脑血管疾病、急性早幼粒细胞白血病、内源性凝血系统缺陷疾病、炎症等的与TAFI含量相关联疾病的诊断。
本发明具有的优点及积极效果是：由于本发明所采用的体外检测试剂盒的内容物中包括针对TAFI的特异性单克隆抗体和酶联免疫测定所需试剂，并根据含氨功能基高分子PAMAM树突状物的生物特性，用PAMAM标记抗体的方法，与现有成熟的ELISA检测方法相结合，用于检测人体生物样品的TAFI含量的体外检测，开辟了TAFI新的体外诊断学方法，所以它解决了现有技术存在的设备昂贵，检测时间较长等缺陷。将这种体外诊断学方法用于临床预测心脑血管疾病的可能性，其操作简便、快捷、成本低廉，诊断敏感，检出限低。因PAMAM是被合成的一种常用的纳米级树突状多聚物，其大小、形状及功能基团的放置都可以精确控制，故在直径上呈现出可被较好控制的单分散性。同时，它还有较好的水溶性，经过反复的聚合反应，在其表面形成了高密度的氨基基团，在生理环境的pH时带正电性，可与带负电荷的酶联抗体蛋白结合，样品中的TAFI抗原与标记了PAMAM的酶联特异抗体进行免疫学反应，通过酶催化的级联放大反应，在492nm波长下检测吸光值，吸光值与抗原浓度呈正比关系，从而达到定量测定抗原含量的目的。将PAMAM应用于ELISA检测可以明显提高检测的灵敏度和特异性，这种体外诊断学方法优于现有技术中采用的其它普通方法。因此，本发明的方法可应用于人个体样品中TAFI含量的体外测定，根据TAFI与相关疾病的关系，作为辅助诊断，提高相关疾病的检出率和准确率，达到了早期发现，早期治疗的目的；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
本发明所用的体外检测试剂盒与人纤溶抑制因子/凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）酶联免疫分析试剂盒进行比较实验。实验材料为已确诊的心脑梗死患者血浆58例，使用TAFI酶联免疫分析试剂盒和本发明所用的体外检测试剂盒同时进行酶联免疫测定，本发明所用的体外检测试剂盒与TAFI酶联免疫分析试剂盒测定的阳性率分别为36.2%和20.6%，该结果显示，本发明方法对TAFI抗原的检测特异性更高，更准确。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步描述。
图1是单克隆抗体3B1与TAFI特异性结合免疫印迹图。
图中序号说明：①Marker；②纯化的TAFI，浓度为0.252μg；③空白；④人血浆。
图2是单克隆抗体4E7与TAFI特异性结合ELISA曲线。
图3是TAFI标准曲线。
图4是心脑梗死患者与健康者血浆TAFI含量对照图。
具体实施方式
以下结合图1～4和实施例对本发明作进一步描述。本发明是采用体外检测试剂盒的内容物中的针对TAFI的特异性单克隆抗体和酶联免疫测定所需试剂，并根据含氨功能基高分子PAMAM树突状物的生物特性，用PAMAM标记抗体的方法，与现有成熟的ELISA检测方法相结合，用于检测人体生物样品的TAFI含量的体外检测。该TAFI含量的体外检测试剂盒内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的96孔包被抗体的酶标板一块；用于稀释待检样品的样品稀释液，2×100ml/瓶；用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，1×48ng/管（冻干品）；洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，2×100ml/瓶；用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，1×30μl/管；抗体稀释液，1×10ml/瓶；作为酶作用底物的30%过氧化氢，1×30μl/管，邻苯二胺，1×13mg/片，及底物显色缓冲液，1×30ml/瓶；使底物显色反应停止的终止液，1×10ml/瓶。检测操作时，PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用抗体稀释液300倍稀释，TAFI标准品加入1ml样品稀释液溶解，酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺13mg：显色缓冲液体积13ml：30%过氧化氢体积6.5μl。通过比色，测知标本中TAFI抗原的量。盒内各试剂的剂量可根据实际检测待检样品的需要配制。
本发明所采用的TAFI含量的体外检测试剂盒的内容物的制备方法如下：
1、PAMAM Dendrimer的合成
PAMAM Dendrimer由0代至10代，其分子直径在10Å至130Å之间，属于纳米尺度的分子。其合成是采用分支法，即分子由核心部分开始向外生长。根据树木分枝的规律将预先制好的单体按放射状的顺序、分支的枝梢再接分支，依次重复组合起来。以乙二胺(EDA)为引发核，第1步反应(a)与丙烯酸甲酯(MA)通过Michael加成反应生成1个四元酯[称为0.5代(G)]；第2步反应(b)四元酯与过量的乙二胺发生氨解反应生成1个四元酰胺化合物(称为1代)。重复(a)、(b)Michael加成和氨解的反应步骤,即可得到不同代数的PAMAM树状大分子化合物。合成产物均用FT2IR、FAB2MS、1 H NMR和13 C NMR进行结构表征。以下是PAMAM合成反应路线。
不同pH值PAMAM对增溶的影响不同，不同质量浓度的PAMAM溶液对增溶试验也产生5.0代PAMAM不同质量浓度。通过实验证明在较大的pH值范围内和不同的缓冲条件（水、磷酸盐缓冲液、0.5mmol/L NaCl等）下稳定存在，并不解离。
2、包被抗体和酶标抗体的制备
包被抗体和酶标抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7。
杂交瘤制备：以纯化的人血浆TAFI为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠；取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有限稀释法克隆，最终获得2株持续且稳定分泌抗人TAFI单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3B1和4E7；
抗体鉴定：按照罗氏公司抗体亚类试剂盒说明书测定这两种单克隆抗体的类型均为IgG1，κ；以模拟血浆作为对照，免疫印迹和ELISA分析显示，3B1和4E7这两种单克隆抗体均与人源TAFI抗原特异性结合，其中3B1可以特异性结合TAFI和失活的TAFI，如图1所示，3B1能够特异性识别血浆中的TAFI。图2 单克隆抗体4E7与TAFI特异性结合ELISA曲线。以15μg/ml4E7包被酶标板，以TAFI、TAFI和4E7混合物、TAFI和小鼠IgG混合物分别作为抗原，3B1作为酶联抗体，进行ELISA反应。从曲线图可以看
出，游离4E7竞争性抑制TAFI与固相4E7结合，说明4E7仅与TAFI特异性结合。
抗体制备：杂交瘤细胞体外培养法。
抗体纯化：中空纤维滤柱（美国通用公司）浓缩杂交瘤培养上清，蛋白A-琼脂糖亲和层析柱（美国通用公司）分离纯化浓缩液中的单克隆抗体。
抗体效价：经ELISA法测定纯化后的3B1和4E7单克隆抗体，效价分别105和 106。
3、PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体的制备
按美国KPL公司辣根过氧化物酶连接试剂盒使用说明书，将辣根过氧化物酶标记的抗体3B1与上述合成步骤1中所制作的带正电荷的PAMAM Dendrimer，以0.1~10：1摩尔比率的浓度混合，室温条件下反应10-15分钟，制成PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体。这是一个使PAMAM与辣根过氧化物酶标记的抗体混合在一起的极好比率及顺序，是简单、有效、稳定、非化学的结合方法。该方法比化学或其他方法有效或更有效。
4、TAFI标准品的制备
从美国血液技术公司购买人血浆纯化的TAFI，相对分子质量60000，特异活性5.8Units/mg，作为标化浓度的TAFI。利用人混合血浆与标化浓度的TAFI进行比对，稀释适当倍数，获得含预期浓度TAFI的血浆，作为实验用标准品。该方法制备TAFI标准品无需纯化，操作简单，成本低廉，适合大批量制备。具体操作步骤如下：
以标化TAFI作为标准品，倍比稀释做标准曲线（如图3所示），ELISA方法测定人混合血浆浓度，操作方法见实施例一。测定结果乘以1600倍的稀释倍数后，得到测定结果为38400ng/ml，取该血浆0.3ml，加入100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液240μl，蒸馏水3.3ml，100mM壳聚糖溶液0.96ml，充分混匀，制成终浓度为TAFI 2.4μg/ml、乙二胺四乙酸二钠5mM、壳聚糖20mM的溶液，取该溶液20μl分装至灭菌过的冻存管底部，冷冻干燥后4℃保存。
5、100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液的配制
取37.22g 乙二胺四乙酸二钠溶解于800ml蒸馏水中，1mol/l NaOH调节pH至7.3，定容至1L。
6、封闭液的配制
取2g明胶溶于800ml蒸馏水中，60℃水浴溶解，加入100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液100ml，室温定容至1L。
7、包被抗体的酶标板的制备
按商品说明书配制磷酸盐缓冲液。用磷酸盐缓冲液稀释抗体4E7至15μg/ml，向酶标板中每孔添加100μl，冷暗处过夜；去除包被液，每孔加入300μl磷酸盐缓冲液，静置10分钟，弃去；用含有10mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液的1%明胶溶液作为封闭液，每孔添加200μl封闭液，冷暗处过夜，去除封闭液，每孔加入300μl洗净液，静置10分钟，弃去，冷冻干燥过夜。
8、样品稀释液的配制
取1g 牛血清白蛋白，加入100mM
pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液100ml， 10倍浓度磷酸盐缓冲液100ml，蒸馏水800ml，充分混匀。
9、洗净液的配制
向1L 磷酸盐缓冲液中加入0.5ml
吐温20，充分混匀。
10、抗体稀释液的配制
取100ml磷酸盐缓冲液，加入1g 牛血清白蛋白混匀。
11、显色缓冲液的配制
取7.0g一水合柠檬酸和23.9g十二水合磷酸氢二钠溶解于800ml蒸馏水中，定容至1L。
12、酶作用底物的配制
向13ml显色缓冲液中加入一片13mg的邻苯二胺，再加入6.5μl 30%过氧化氢，混匀，避光。
13、终止液的配制
取18mol/l浓硫酸20ml，缓慢加入160ml蒸馏水中，制成2mol/l硫酸。
以下结合实施例详细说明本发明TAFI含量的体外检测方法的具体操作步骤。
实施例一：
现以人血浆为例，用本发明方法对58例确诊为心脑梗死的患者血浆样品及30例健康血浆样品进行TAFI含量测定。具体操作步骤如下：
步骤一 采集抗凝血液立即于30分钟内，4℃条件下，3000rpm离心10分钟，取上清作为待检样品，-20℃保存。
步骤二 利用体外检测试剂盒，对待检样品进行TAFI含量测定。
所用体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的30%过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使底物显色反应停止的终止液；检测操作时，PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用抗体稀释液300倍稀释，TAFI标准品加入1ml样品稀释液溶解，酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺13mg：显色缓冲液体积13ml：30%过氧化氢体积6.5μl。
步骤三 用样品稀释液对待检样品进行1600倍稀释。
步骤四 取1ml样品稀释液溶解TAFI冻干标准品，其浓度为48ng/ml。用样品稀释液对48ng/ml的标准溶液做2倍梯度稀释，制成浓度分别为24ng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1.5ng/ml，0.75ng/ml的标准工作液，置于冰盒上，半小时以内使用。
步骤五 分别取标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品50μl，加入包被抗体的酶标板孔中，每个样品2个重复，室温静置1小时。待检样品中的TAFI抗原与包被抗体的酶标板上的抗体特异结合，形成固相抗原抗体复合物。
步骤六 弃去包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去包被抗体的酶标板孔中的未结合物质。
步骤七 取PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体20μl，加入抗体稀释液6ml中，制成酶联抗体工作液。
步骤八 向结合有抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板孔中加入PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体50μl，室温静置1小时，PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体与固相抗原抗体复合物上的TAFI抗原结合。
步骤九 弃去包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去包被抗体的酶标板孔中未结合的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，此时固相载体上带有的酶量与待检样品中受检抗原的量成正比。
步骤十 取邻苯二胺1片，溶解于显色液13ml中，加入30%过氧化氢6.5μl混匀，制成酶作用底物。
步骤十一 加入酶作用底物100μl，避光反应10分钟，固相上的酶催化底物成为淡黄色产物。
步骤十二加入终止液100μl终止反应，淡黄色产物立即转化为棕色，于492nm处测定吸光值。
步骤十三 根据标准品吸光值与浓度的关系，制作标准曲线，如图3所示。根据标准曲线计算待检样品中TAFI抗原的含量，如图4所示。
经T检验，心脑梗死组血浆TAFI含量与健康组TAFI含量的P<0.01（P=0.0028），两组数据具有显著差异。以健康组含量平均值与2倍标准偏差的和为参考上限，心脑梗死的检出率可以达到36.2%。因此该方法作为辅助诊断，对心脑血管疾病的预测具有意义。
实施例二：
本发明方法还可以测定人尿液中的TAFI含量。采集人晨尿，于30分钟内，4℃条件下，1500rpm离心5分钟，取上清作为待检样品。用样品稀释液对待检样品进行100倍稀释。后续步骤同实施例一。
实施例三：
现以人血浆为例，用本发明方法对195例确诊为心脑血管疾病的患者血浆样品及30例健康血浆样品进行TAFI含量测定。操作步骤同实施例一。经T检验，心脑血管疾病组血浆TAFI含量与健康组TAFI含量的P<0.01（P=0.0079），两组数据具有显著差异。以健康组含量平均值与2倍标准偏差的和为参考上限，心脑血管疾病的检出率可以达到21.0%。因此该方法作为辅助诊断，对心脑血管疾病的预测具有意义。
Claims (4)
1.一种TAFI含量的体外检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：
步骤一 采集人个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；
步骤二 利用体外检测试剂盒，对待检样品进行TAFI含量测定；
所述体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的30%过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使底物显色反应停止的终止液；检测操作时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用所述抗体稀释液300倍稀释，所述TAFI标准品加入1ml所述样品稀释液溶解，所述酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺13mg：显色缓冲液体积13ml：30%过氧化氢体积6.5μl；所述包被抗体和酶标抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，所述鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7，所述3B1为特异性结合TAFI和失活的TAFI，所述4E7仅与TAFI结合；
所述包被抗体的酶标板的制备为，用磷酸盐缓冲液稀释抗体4E7至15μg/ml，每孔100μl包被酶标板，用含有10mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液的1%明胶溶液作为封闭液，每孔200μl封闭酶标板；
步骤三 利用所述样品稀释液对所述待检样品进行100-2000倍稀释；
步骤四 取1ml样品稀释液溶解所述TAFI标准品，其浓度为48ng/ml，用所述样品稀释液对48ng/ml的标准溶液做2倍梯度稀释，制成浓度分别为24ng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1.5ng/ml，0.75ng/ml的标准工作液，以所述样品稀释液作为空白对照液；
步骤五 分别取所述标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品50μl，加入所述包被抗体的酶标板孔中，每个样品2个重复，室温静置1小时，所述待检样品中的TAFI抗原与包被在酶标板上的抗体特异结合，形成固相抗原抗体复合物；
步骤六 弃去酶标板孔中的液体，拍干，加入所述试剂盒的洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中的未结合物质；
步骤七 取所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体20μl，加入所述抗体稀释液6ml中，制成酶联抗体工作液；
步骤八 向结合有抗原抗体复合物的所述包被抗体的酶标板孔中加入所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体50μl，室温静置1小时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体与所述固相抗原抗体复合物上的TAFI抗原结合；
步骤九 弃去所述包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入所述洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中未结合的所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，此时固相载体上带有的酶量与所述待检样品中受检抗原的量成正比；
步骤十 取所述邻苯二胺1片，溶解于所述显色液13ml中，加入30%所述过氧化氢6.5μl混匀，制成所述酶作用底物；
步骤十一 加入所述酶作用底物100μl，避光反应10分钟，固相上的酶催化所述酶作用底物成为淡黄色产物；
步骤十二 加入所述终止液100μl终止反应，淡黄色产物立即转化为棕色，于492nm处测定吸光值；
步骤十三 根据所述TAFI标准品的吸光值与浓度的关系，制作标准曲线，根据标准曲线计算所述待检样品中TAFI抗原的含量。
2.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体是由辣根过氧化物酶联抗体与带正电荷的PAMAM 树突状多聚物混合，在室温条件下反应10~15分钟制成，二者的混合浓度为0.1~10：1摩尔比。
3.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：所述TAFI标准品的制备为，以标化TAFI作为标准品，倍比稀释做标准曲线，ELISA方法测定人混合血浆浓度，测定结果为38400ng/ml，取该血浆0.3ml，加入100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液240μl，蒸馏水3.3ml，100mM壳聚糖溶液0.96ml，充分混匀，制成终浓度为TAFI 2.4μg/ml、乙二胺四乙酸二钠5mM、壳聚糖20mM的溶液，取该溶液20μl分装至灭菌过的冻存管底部，冷冻干燥后4℃保存。
4.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：样品稀释液的制备为，取1g 牛血清白蛋白，加入100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液100ml、10倍浓度磷酸盐缓冲液100ml和蒸馏水800ml，充分混匀。
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