JP2997520B2 - 血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査のための生物学的試料からのｄ―ダイマーの直接化学結合的方法 - Google Patents
血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査のための生物学的試料からのｄ―ダイマーの直接化学結合的方法Info
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は血液凝固系の障害の指標であることができる
フィブリンの破壊生産物である、Ｄ−ダイマーを検出す
る方法に関し、より詳細には本発明は生物学的試料中で
直性化学的にＤ−ダイマーに結合する、新規なフラグメ
ントＥ試薬、及び該方法を実施するためのキットに関す
る。
フィブリンの破壊生産物である、Ｄ−ダイマーを検出す
る方法に関し、より詳細には本発明は生物学的試料中で
直性化学的にＤ−ダイマーに結合する、新規なフラグメ
ントＥ試薬、及び該方法を実施するためのキットに関す
る。
本発明を要約すれば、本発明により生物学的試料から
のＤ−ダイマーの直接的な化学的結合を用いた、固体相
に付着したヒト フィブリノーゲンの精製したフラグメ
ントＥを利用する、フィブリン分解生成物であるＤ−ダ
イマーの簡単な検出アッセイを実施する方法及び試験キ
ットが提供され、本発明のＤ−ダイマーをアッセイする
ためのこの直接結合法は多数の方式で実施することがで
き、本発明の一つの具体化においては、フラグメントＥ
はラテックス担体粒子にコンジュゲート（conju−gat
e）され、凝集アッセイが実施されることである。
のＤ−ダイマーの直接的な化学的結合を用いた、固体相
に付着したヒト フィブリノーゲンの精製したフラグメ
ントＥを利用する、フィブリン分解生成物であるＤ−ダ
イマーの簡単な検出アッセイを実施する方法及び試験キ
ットが提供され、本発明のＤ−ダイマーをアッセイする
ためのこの直接結合法は多数の方式で実施することがで
き、本発明の一つの具体化においては、フラグメントＥ
はラテックス担体粒子にコンジュゲート（conju−gat
e）され、凝集アッセイが実施されることである。
既往技術の記載 最も普通なヒトの血液凝固系の障害は，心臓のような
血管中で形成された時に血流を制限し、重大な心臓の病
気を招く血栓、血餅の形成である。更に血栓又はその一
部の循環器系内での移動は突然に血流を妨げることによ
り、血栓塞栓症をもたらすことがある。凝固亢進状態に
よりフィブリン溶解治療を受けている患者は、血塊の破
壊を注意深く検査することが必要である。そのためフィ
ブリン溶解、血栓の破壊を検出する鋭敏且つ特異的な手
段を有することが重要である。
血管中で形成された時に血流を制限し、重大な心臓の病
気を招く血栓、血餅の形成である。更に血栓又はその一
部の循環器系内での移動は突然に血流を妨げることによ
り、血栓塞栓症をもたらすことがある。凝固亢進状態に
よりフィブリン溶解治療を受けている患者は、血塊の破
壊を注意深く検査することが必要である。そのためフィ
ブリン溶解、血栓の破壊を検出する鋭敏且つ特異的な手
段を有することが重要である。
フィブリンはそれが懸濁している全血を凝固する力を
有する接着性の性質の分枝状繊維のウェブから成る。フ
ィブリン溶解は凝集過程に対して補完的な系であり、通
常はフィブリンの沈着を防いで、それと平衡状態にあ
る。酵素プラスミンによるフィブリンの消化はＤ−ダイ
マーを含む分解生産物を生じる。
有する接着性の性質の分枝状繊維のウェブから成る。フ
ィブリン溶解は凝集過程に対して補完的な系であり、通
常はフィブリンの沈着を防いで、それと平衡状態にあ
る。酵素プラスミンによるフィブリンの消化はＤ−ダイ
マーを含む分解生産物を生じる。
病的なフィブリン溶解においては、フィブリノーゲン
及びフィブリンのプラスミン分解生産物の血漿濃度が増
大している。それ故ヒトの血液又は尿中におけるフィブ
リノーゲン分解生成物（FDP）の存在は血栓的障害の指
標である。FDPは伝統的に凝集アッセイにより測定され
てきた。例えば：葡萄球菌凝集により；血球凝集免疫ア
ッセイにより；抗血清が付着しているラテックス粒子の
使用による等である。
及びフィブリンのプラスミン分解生産物の血漿濃度が増
大している。それ故ヒトの血液又は尿中におけるフィブ
リノーゲン分解生成物（FDP）の存在は血栓的障害の指
標である。FDPは伝統的に凝集アッセイにより測定され
てきた。例えば：葡萄球菌凝集により；血球凝集免疫ア
ッセイにより；抗血清が付着しているラテックス粒子の
使用による等である。
ホーウィガー（Hawiger）等、“Measurement of Fibr
inogen and Fibrin Degradation Products in Serum by
Staphylococcal Clumping Test"、J.Lab.Clin.Med.75:
93−108（1970）は、葡萄球菌の特異菌株は単量体的フ
ィブリン又はより高分子量のFDPの存在において凝集す
るという事実に基づいた試験法を開示している。この方
法においては、血清又は尿試料の逐次的希釈物を葡萄球
菌細胞の懸濁液と混合して凝集の存在又は不存在に留意
している。
inogen and Fibrin Degradation Products in Serum by
Staphylococcal Clumping Test"、J.Lab.Clin.Med.75:
93−108（1970）は、葡萄球菌の特異菌株は単量体的フ
ィブリン又はより高分子量のFDPの存在において凝集す
るという事実に基づいた試験法を開示している。この方
法においては、血清又は尿試料の逐次的希釈物を葡萄球
菌細胞の懸濁液と混合して凝集の存在又は不存在に留意
している。
マースキー（Merskey）等、“A Rapid,Simple Method
for Measuring Fibrinolytic Split Products in Huma
n Serum"、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.131:871−875（196
9）、は二段法血液凝集−抑制試験法を開示している。
第一段階において、試験血清試料の希釈物をヒト フィ
ブリノーゲンに対する抗体の希釈溶液でインキュベート
する。第二段階において，ヒトの血漿で被覆された褐色
（tanned）の赤血球を添加することにより未反応の抗体
が検出される。凝集が起こらないならば、試料は抗体を
中和するのに充分なFDPを含んでいたということであ
る。
for Measuring Fibrinolytic Split Products in Huma
n Serum"、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.131:871−875（196
9）、は二段法血液凝集−抑制試験法を開示している。
第一段階において、試験血清試料の希釈物をヒト フィ
ブリノーゲンに対する抗体の希釈溶液でインキュベート
する。第二段階において，ヒトの血漿で被覆された褐色
（tanned）の赤血球を添加することにより未反応の抗体
が検出される。凝集が起こらないならば、試料は抗体を
中和するのに充分なFDPを含んでいたということであ
る。
カーネー（Carney）等、“A Sensitive Latex Slide
Assay for Fibrin（ogen）Fragment E"、Clinical Chim
ica Acta 147:173−177（1985）、はラテックス粒子が
直接血清中のFDPと反応する抗体で被覆されたラテック
ス凝集試験を開示している。Ｄ−ダイマーに対しモノク
ローン性抗体DD−3B6/22を使用することにより、フィブ
リンとフィブリノーゲン分解生産物の間の差異を認める
ことを必要とする特異性を導入した。Ｄ−ダイマー、フ
ィブリン分解生成物の検出は、凝集の存在に対し一層特
異的であるから、従来他の技術で可能であったよりも、
血栓症又は凝固亢進状態の検出を一層大きい感度及び特
異性を以て可能とするこの方法は重要な改善であった。
エルムズ（Elms）等、“Rapid Detection of Cross−Li
nked Fibrin Degra−dation Products in Plasma Using
Monoclonal Antibody Coated Latex Particles"、A.J.
C.P.85（３）360−364（３月1986）により記載されてい
るように、フィブリノーゲンのフィブリンへの転化、及
びその凝集形成の過程におけるXIII a因子による架橋の
際の形態的及び構造的変化の検出は、プラスミン溶解性
開裂生産物の間の区別を可能とする新抗原決定基の開発
をもたらした。特に、Ｄ−ダイマー形態を含む架橋フィ
ブリン誘導体に特異的である、モノクローン性抗体（DD
−3B6/22）は、血漿又は血清のいずれかにおけるフィブ
リン分解生成物を検出できるラテックス凝集手法の開発
に使用された。このアッセイの感度はＤ−ダイマー約25
0ng/mlであるように思われる。
Assay for Fibrin（ogen）Fragment E"、Clinical Chim
ica Acta 147:173−177（1985）、はラテックス粒子が
直接血清中のFDPと反応する抗体で被覆されたラテック
ス凝集試験を開示している。Ｄ−ダイマーに対しモノク
ローン性抗体DD−3B6/22を使用することにより、フィブ
リンとフィブリノーゲン分解生産物の間の差異を認める
ことを必要とする特異性を導入した。Ｄ−ダイマー、フ
ィブリン分解生成物の検出は、凝集の存在に対し一層特
異的であるから、従来他の技術で可能であったよりも、
血栓症又は凝固亢進状態の検出を一層大きい感度及び特
異性を以て可能とするこの方法は重要な改善であった。
エルムズ（Elms）等、“Rapid Detection of Cross−Li
nked Fibrin Degra−dation Products in Plasma Using
Monoclonal Antibody Coated Latex Particles"、A.J.
C.P.85（３）360−364（３月1986）により記載されてい
るように、フィブリノーゲンのフィブリンへの転化、及
びその凝集形成の過程におけるXIII a因子による架橋の
際の形態的及び構造的変化の検出は、プラスミン溶解性
開裂生産物の間の区別を可能とする新抗原決定基の開発
をもたらした。特に、Ｄ−ダイマー形態を含む架橋フィ
ブリン誘導体に特異的である、モノクローン性抗体（DD
−3B6/22）は、血漿又は血清のいずれかにおけるフィブ
リン分解生成物を検出できるラテックス凝集手法の開発
に使用された。このアッセイの感度はＤ−ダイマー約25
0ng/mlであるように思われる。
グリーンバーグ（Greenberg）等は、論文“Measureme
nt of Plasma Fibrin D−dimer Levels with the Use o
f a Monoclonal Antibody Coupled to Latex Beads"、
A.J.C.P.87（１）94−100（１月1987）、において、フ
ィブリン分解に対する特異的試験（ダイマー試験）を提
供するために、ラテックス ビーズにカップリングされ
たフィブリンＤ−ダイマー対モノクローン性抗体（DD−
3B6）を開示している。ダイマーアッセイはフィブリノ
ーゲン欠乏血に添加された２μg/mlの精製フィブリンＤ
−ダイマー又はフィブリンＤ−ダイマー／フラグメント
−Ｅ複合体を検出した。
nt of Plasma Fibrin D−dimer Levels with the Use o
f a Monoclonal Antibody Coupled to Latex Beads"、
A.J.C.P.87（１）94−100（１月1987）、において、フ
ィブリン分解に対する特異的試験（ダイマー試験）を提
供するために、ラテックス ビーズにカップリングされ
たフィブリンＤ−ダイマー対モノクローン性抗体（DD−
3B6）を開示している。ダイマーアッセイはフィブリノ
ーゲン欠乏血に添加された２μg/mlの精製フィブリンＤ
−ダイマー又はフィブリンＤ−ダイマー／フラグメント
−Ｅ複合体を検出した。
Ｄ−ダイマーを含むFDPのための凝集アッセイ技術は
開発されたが、これらの技術の安定性及び感度はまだ最
適化されていない。
開発されたが、これらの技術の安定性及び感度はまだ最
適化されていない。
本発明の総括 本発明はＤ−ダイマー フラグメントを含む可能性の
ある、血漿、尿、又は他の組織又は体液のような生物学
的試料からのＤ−ダイマーの直接結合のために、固体相
に付着したフラグメント−Ｅを用いるＤ−ダイマー用の
簡単な検出アッセイである。従って新規フラグメント−
Ｅ試薬を用いる血栓崩壊及び凝固亢進状態を診断し、検
査するために生物学的試料中のＤ−ダイマーを検出する
直接的方法を提供することが本発明の目的である。
ある、血漿、尿、又は他の組織又は体液のような生物学
的試料からのＤ−ダイマーの直接結合のために、固体相
に付着したフラグメント−Ｅを用いるＤ−ダイマー用の
簡単な検出アッセイである。従って新規フラグメント−
Ｅ試薬を用いる血栓崩壊及び凝固亢進状態を診断し、検
査するために生物学的試料中のＤ−ダイマーを検出する
直接的方法を提供することが本発明の目的である。
アッセイを実施するためのキットを提供することが本
発明の他の目的である。
発明の他の目的である。
本発明のこれら及び他の目的は下記のより詳細な記述
から明らかになるであろう。
から明らかになるであろう。
本発明の詳述 血餅又は血栓のマトリックスはフィブリンにより形成
される。フィブリンはXIII a因子により架橋され、安定
した塊を形成する。ヒトの架橋したフィブリンは酵素プ
ラスミンにより分解される。Ｄ−ダイマー／フラグメン
トＥ複合体、（DD）Ｅは架橋したフィブリンから放出さ
れる主要な可溶性プラスミン分解生成物である。この複
合体はプラスミンによって更に分解されることができ
る。初期の（DD）Ｅ複合体はフラグメントＤ−ダイマー
及びE1を含んでいる。更に酵素により分解される際に、
フラグメントE1はＤ−ダイマーフラグメントに結合する
能力を失うことなくフラグメントE2に開裂する。フラグ
メントE2からE3への分解は、結果としてフィブリンの末
端分解生産物がフラグメントDD及びE3であるという複合
体の解離をもたらす。フラグメントE1及びE2は架橋した
フィブリンからのフラグメント−DDに結合する能力を有
するが、DD−Ｅ複合体、フィブリノーゲン、又はフィブ
リノーゲン又は非架橋フィブリンのプラスミン分解生成
物のいずれとも結合しない。
される。フィブリンはXIII a因子により架橋され、安定
した塊を形成する。ヒトの架橋したフィブリンは酵素プ
ラスミンにより分解される。Ｄ−ダイマー／フラグメン
トＥ複合体、（DD）Ｅは架橋したフィブリンから放出さ
れる主要な可溶性プラスミン分解生成物である。この複
合体はプラスミンによって更に分解されることができ
る。初期の（DD）Ｅ複合体はフラグメントＤ−ダイマー
及びE1を含んでいる。更に酵素により分解される際に、
フラグメントE1はＤ−ダイマーフラグメントに結合する
能力を失うことなくフラグメントE2に開裂する。フラグ
メントE2からE3への分解は、結果としてフィブリンの末
端分解生産物がフラグメントDD及びE3であるという複合
体の解離をもたらす。フラグメントE1及びE2は架橋した
フィブリンからのフラグメント−DDに結合する能力を有
するが、DD−Ｅ複合体、フィブリノーゲン、又はフィブ
リノーゲン又は非架橋フィブリンのプラスミン分解生成
物のいずれとも結合しない。
本発明は生物学的試料から直接化学的にＤ−ダイマー
を結合するために、固体相に付着した精製されたフラグ
メントＥを用いてフィブリンのプラスミン分解を検出す
る方法を提供する。
を結合するために、固体相に付着した精製されたフラグ
メントＥを用いてフィブリンのプラスミン分解を検出す
る方法を提供する。
精製されたフラグメントＥはオレキサ（Olexa）及び
ブジンスキー（Budzynski）により、Biochemistry 19、
991（1979）及びJ.Biol.Chem.254、4925（1979）に記載
された方法により製造できる。これらの報告に記載され
た基礎的方法は、XIII因子の多いフィブリノーゲンから
フィブリン塊の形成を以て開始する。塊をプラスミンで
加水分解し、得られる分解物を遠心して大きい塊粒子を
除去する。（DD）Ｅ複合体を含む可溶性分解生産物を含
有する上澄液を次いでアガロース ゲル カラム上で分
離する。分離した（DD）Ｅ複合体を次いで濃厚な塩溶液
中でインキュベートし、Ｄ−ダイマー及びE1又はE2フラ
グメントを解離する。フラグメントを次いでアガロース
ゲル カラム上で分離し、フラグメントE1又はE2を精
製する。
ブジンスキー（Budzynski）により、Biochemistry 19、
991（1979）及びJ.Biol.Chem.254、4925（1979）に記載
された方法により製造できる。これらの報告に記載され
た基礎的方法は、XIII因子の多いフィブリノーゲンから
フィブリン塊の形成を以て開始する。塊をプラスミンで
加水分解し、得られる分解物を遠心して大きい塊粒子を
除去する。（DD）Ｅ複合体を含む可溶性分解生産物を含
有する上澄液を次いでアガロース ゲル カラム上で分
離する。分離した（DD）Ｅ複合体を次いで濃厚な塩溶液
中でインキュベートし、Ｄ−ダイマー及びE1又はE2フラ
グメントを解離する。フラグメントを次いでアガロース
ゲル カラム上で分離し、フラグメントE1又はE2を精
製する。
本発明のＤ−ダイマーをアッセイするための直接結合
法は多数の方法で実施することができる。本発明の一つ
の具体化において、精製されたフラグメントＥをラテッ
クス担体粒子にコンジュゲートし、凝集するアッセイが
実施される。本発明の説明の中で使用されるように、ラ
テックス担体粒子は水に不溶性であり、約0.2ないし1.0
μｍの範囲の粒径（直径）を有し、免疫学的反応に関し
て不活性であるラテックス重合体を含む。典型的な適当
なラテックス担体粒子は、通常約１ないし20％の固体濃
度の水性ラテックス分散物として商業的に供給されてい
るものである。それらが上記に示す判断基準に合致する
限り、多くの種類のラテックスが本発明で使用するのに
適当である。一般に適当なラテックス担体重合体はカル
ボキシル化ポリスチレン、アクリル酸重合体、メタクリ
ル酸重合体、アクリロニトリル ブタジエン スチレ
ン、ポリ酢酸ビニル アクリレート、ポリビニルピリジ
ン及び塩化ビニルアクリレートである。フラグメントＥ
−ラテックス試薬のラテックス濃度は0.5ないし２％の
範囲にある。
法は多数の方法で実施することができる。本発明の一つ
の具体化において、精製されたフラグメントＥをラテッ
クス担体粒子にコンジュゲートし、凝集するアッセイが
実施される。本発明の説明の中で使用されるように、ラ
テックス担体粒子は水に不溶性であり、約0.2ないし1.0
μｍの範囲の粒径（直径）を有し、免疫学的反応に関し
て不活性であるラテックス重合体を含む。典型的な適当
なラテックス担体粒子は、通常約１ないし20％の固体濃
度の水性ラテックス分散物として商業的に供給されてい
るものである。それらが上記に示す判断基準に合致する
限り、多くの種類のラテックスが本発明で使用するのに
適当である。一般に適当なラテックス担体重合体はカル
ボキシル化ポリスチレン、アクリル酸重合体、メタクリ
ル酸重合体、アクリロニトリル ブタジエン スチレ
ン、ポリ酢酸ビニル アクリレート、ポリビニルピリジ
ン及び塩化ビニルアクリレートである。フラグメントＥ
−ラテックス試薬のラテックス濃度は0.5ないし２％の
範囲にある。
本発明の好適な具体化において、精製されたフラグメ
ントＥは、等量部のアミジン改質ラテックス ビーズ
（インターフェーシャル・ダイナミックス［Interfacia
l Dynamics］社;2.4％固体）と、精製されたフラグメン
トＥとを0.1ないし10mg/ml、及び最も好適には2mg/mlの
最終濃度まで混合することによって、アミジン改質ラテ
ックス ビーズ（AML）にコンジュゲートされる。混合
物を４℃で一夜インキュベートし、次いで燐酸塩緩衝溶
液（PBS）中で洗浄する。得られるフラグメントＥ−ア
ミジン改質ラテックス試薬を次いでPBSのような適当な
生理学的緩衝液中で牛血清アルブミン（BSA）と共に又
はグリシンとBSAと共に再分散する。
ントＥは、等量部のアミジン改質ラテックス ビーズ
（インターフェーシャル・ダイナミックス［Interfacia
l Dynamics］社;2.4％固体）と、精製されたフラグメン
トＥとを0.1ないし10mg/ml、及び最も好適には2mg/mlの
最終濃度まで混合することによって、アミジン改質ラテ
ックス ビーズ（AML）にコンジュゲートされる。混合
物を４℃で一夜インキュベートし、次いで燐酸塩緩衝溶
液（PBS）中で洗浄する。得られるフラグメントＥ−ア
ミジン改質ラテックス試薬を次いでPBSのような適当な
生理学的緩衝液中で牛血清アルブミン（BSA）と共に又
はグリシンとBSAと共に再分散する。
ラテックス凝集アッセイは、約25μのフラグメント
Ｅ−AML試薬を約10μのＤ−ダイマーを含む可能性の
ある、血漿、尿又は他の組織と共にスライド グラス上
で一緒にすることにより、この試薬を用いて実施するこ
とができる。スライドを約２分間回転した後、凝集の観
察を行うことができる。凝集が起こるならば、試料中に
Ｄ−ダイマーが存在する。凝集は又例えばマイクロタイ
ター（microtiter）ウェル（well）、フロー（flow）血
球計算法（cytometry）を用いる血球凝集技術のような
当業界周知の技術を用いて検出することもできる。
Ｅ−AML試薬を約10μのＤ−ダイマーを含む可能性の
ある、血漿、尿又は他の組織と共にスライド グラス上
で一緒にすることにより、この試薬を用いて実施するこ
とができる。スライドを約２分間回転した後、凝集の観
察を行うことができる。凝集が起こるならば、試料中に
Ｄ−ダイマーが存在する。凝集は又例えばマイクロタイ
ター（microtiter）ウェル（well）、フロー（flow）血
球計算法（cytometry）を用いる血球凝集技術のような
当業界周知の技術を用いて検出することもできる。
本発明の他の具体化において、フラグメントＥ、好適
にはフラグメントE1、ただしE2/又はE3を含んでいるE1
にコンジュゲートを結合することにより非抗体アッセイ
が実施される。コンジュゲート−フラグメントＥ試薬を
次いで血漿、尿、血清のような生物学的試料と共にイン
キュベートし、洗浄して試料に結合していない過剰のフ
ラグメントＥを除去し、結合したフラグメントＥ−Ｄ−
ダイマー生産を測定するためにコンジュゲートを定量す
る。この方法はＤ−ダイマーの検出のための濾過装置系
上で実施でき、又は結合したＤ−ダイマー対未結合のＤ
−ダイマーを分子排除（molecular exclusion）技術又
はイオン−共有結合技術により分離することができ、次
いで液体状態で検出することができる。適当なコンジュ
ゲートはペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータ−グル
コシダーゼを含む。
にはフラグメントE1、ただしE2/又はE3を含んでいるE1
にコンジュゲートを結合することにより非抗体アッセイ
が実施される。コンジュゲート−フラグメントＥ試薬を
次いで血漿、尿、血清のような生物学的試料と共にイン
キュベートし、洗浄して試料に結合していない過剰のフ
ラグメントＥを除去し、結合したフラグメントＥ−Ｄ−
ダイマー生産を測定するためにコンジュゲートを定量す
る。この方法はＤ−ダイマーの検出のための濾過装置系
上で実施でき、又は結合したＤ−ダイマー対未結合のＤ
−ダイマーを分子排除（molecular exclusion）技術又
はイオン−共有結合技術により分離することができ、次
いで液体状態で検出することができる。適当なコンジュ
ゲートはペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータ−グル
コシダーゼを含む。
本発明の他の具体化においては、Ｄ−ダイマーの捕捉
（capture）分子として使用された、フラグメントE1/E2
の濃度を定量するために、変形ELISA技術を使用するこ
とができる。この方法においては、フラグメントE1/E2
は固体支持体に吸着される。Ｄ−ダイマーを含む血漿、
尿又は他の体液のような生物学的試料を次いでフラグメ
ントE1/E2への結合のために添加する。Ｄ−ダイマーに
対し特異的なモノクローン性又はポリクローン性抗体が
次いでペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータ−グルコ
シダーゼのような酵素にコンジュゲートされる。コンジ
ュゲート（抗−Ｄ−ダイマー／酵素）は次いでフラグメ
ントE1/E2に直接結合しているＤ−ダイマーに結合す
る。使用された酵素に対する特異的な基質の添加はＤ−
ダイマーの定量を可能とする。
（capture）分子として使用された、フラグメントE1/E2
の濃度を定量するために、変形ELISA技術を使用するこ
とができる。この方法においては、フラグメントE1/E2
は固体支持体に吸着される。Ｄ−ダイマーを含む血漿、
尿又は他の体液のような生物学的試料を次いでフラグメ
ントE1/E2への結合のために添加する。Ｄ−ダイマーに
対し特異的なモノクローン性又はポリクローン性抗体が
次いでペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータ−グルコ
シダーゼのような酵素にコンジュゲートされる。コンジ
ュゲート（抗−Ｄ−ダイマー／酵素）は次いでフラグメ
ントE1/E2に直接結合しているＤ−ダイマーに結合す
る。使用された酵素に対する特異的な基質の添加はＤ−
ダイマーの定量を可能とする。
本発明を概略的に説明したが、或特定の実施例を参照
することにより一層完全な理解を得ることができる。下
記の実施例は説明の目的のためにのみ本文に記載された
もので、本発明を限定するものではない。
することにより一層完全な理解を得ることができる。下
記の実施例は説明の目的のためにのみ本文に記載された
もので、本発明を限定するものではない。
実施例 １ ラテックス試薬の製造： 2mgの精製したフラグメントE1を0.02MPBSのアリコー
ト３×500mlに対し６時間、即ち各３×２時間透析し
た。ジルフォード（Gilford）分光光度計を用いて吸光
度A280を測定した。透析された試料容積1mlに対する始
めの読みは3.333吸光度単位であった。1ml（0.489μ）
のアミジン改質ラテックスビーズ（AML）（ロット番号1
0−43−57A、インターフェーシャル・ダイナミックス
社）をポリプロピレンの１×75mmのチューブに入れ、3,
000rpmで遠心してビーズをペレットとした。ペレットと
したAMLビーズから上澄液を傾斜法で捨て、1mlの透析さ
れたフラグメントE1を添加した。チューブを穏やかに回
転し、ビーズを再分散させた。フラグメントE1/AMLビー
ズ混合物を４℃で12時間インキュベートをした。次いで
チューブを遠心し、AMLビーズをペレットとした。上澄
液は捨てた。2.920吸光度単位で吸光度が測定（吸光度2
80）された。218μｇのフラグメントE1がAML1ml当たり
結合した、即ち10.9％が結合したことである。
ト３×500mlに対し６時間、即ち各３×２時間透析し
た。ジルフォード（Gilford）分光光度計を用いて吸光
度A280を測定した。透析された試料容積1mlに対する始
めの読みは3.333吸光度単位であった。1ml（0.489μ）
のアミジン改質ラテックスビーズ（AML）（ロット番号1
0−43−57A、インターフェーシャル・ダイナミックス
社）をポリプロピレンの１×75mmのチューブに入れ、3,
000rpmで遠心してビーズをペレットとした。ペレットと
したAMLビーズから上澄液を傾斜法で捨て、1mlの透析さ
れたフラグメントE1を添加した。チューブを穏やかに回
転し、ビーズを再分散させた。フラグメントE1/AMLビー
ズ混合物を４℃で12時間インキュベートをした。次いで
チューブを遠心し、AMLビーズをペレットとした。上澄
液は捨てた。2.920吸光度単位で吸光度が測定（吸光度2
80）された。218μｇのフラグメントE1がAML1ml当たり
結合した、即ち10.9％が結合したことである。
実施例 ２ Ｄ−タイマー試験方法： 25μのAML−フラグメントE1ラテックスビーズ試薬
を10μの試料（血漿）、標準物（精製Ｄ−ダイマー）
又は対照（緩衝液又は食塩水）のいずれかとスライドグ
ラス上で混合した。スライドグラスを２分間回転し、凝
集を観察した。下記の結果が得られた： 実施例 ３ フラグメントE1/AML試薬の感度の評価： 本発明を充分説明したからには、本文に開示したよう
な本発明の精神又は範囲から逸脱することなく本発明を
変更又は変形することができることは、当業者には明白
であろう。
を10μの試料（血漿）、標準物（精製Ｄ−ダイマー）
又は対照（緩衝液又は食塩水）のいずれかとスライドグ
ラス上で混合した。スライドグラスを２分間回転し、凝
集を観察した。下記の結果が得られた： 実施例 ３ フラグメントE1/AML試薬の感度の評価： 本発明を充分説明したからには、本文に開示したよう
な本発明の精神又は範囲から逸脱することなく本発明を
変更又は変形することができることは、当業者には明白
であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デビツド・ジエイムズ・ワルネク アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08816 イーストブランズウイツク・ゴ ーデンアベニユー 19 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/56 C12Q 1/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】Ｄ−ダイマーを含む可能性のある生物学的
物質の試料を、固体支持体に化学的に結合したヒトフィ
ブリノーゲンの精製されたフラグメントＥを含む試薬と
混合することを含んで成る、血栓及び凝固亢進状態の診
断及び検査のための、Ｄ−ダイマーを含む可能性のある
生物学的試料中のフィブリン分解生産物であるＤ−ダイ
マーを直接検出する非−抗体アッセイ方法。 - 【請求項２】該固体支持体がラテックス担体粒子を含ん
で成る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】ラテックス試薬を製造する方法が： 該フラグメントＥを透析すること； 該ラテックス担体粒子を濃縮すること； 該透析されたフラグメントＥを該ラテックス担体粒子と
混合すること； 該混合物をインキュベートすること； ラテックス担体粒子に結合したフラグメントＥを含む得
られるラテックス試薬を分離すること、 を含んで成る、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】該ラテックス担体粒子がアミジン改質ラテ
ックスビーズから成る、特許請求の範囲第２項に記載の
方法。 - 【請求項５】該試薬中の該フラグメントＥの最終濃度が
0.1mg/mlないし10mg/mlである、特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 - 【請求項６】該試薬中の該フラグメントＥの最終濃度が
2mg/mlである、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】該フラグメントＥがフラグメントE1を含ん
で成る、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項８】該フラグメントＥがフラグメントE1を含ん
で成る、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項９】ラテックス担体粒子に結合した精製された
フラグメントＥを含むラテックス試薬； ヒトの生物学的試料中にＤ−ダイマーが存在する時に生
起する凝集を観察するのに適合した、該ラテックス試薬
を該試料と一緒にするための表面、 を含んで成るヒトの生物学的試料中のＤ−ダイマーを検
出するためのキット。 - 【請求項１０】該フラグメントＥがフラグメントE1を含
んで成る、特許請求の範囲第９項に記載のキット。 - 【請求項１１】精製されたフラグメントＥとコンジュゲ
ートしたアミジン改質ラテックス ビーズを含んで成
る、血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査のための、Ｄ
−ダイマーを含む可能性のある生物学的試料中のフィブ
リンの分解生産物であるＤ−ダイマーを直接結合するこ
とができるラテックス試薬。 - 【請求項１２】該フラグメントＥがフラグメントE1であ
る、特許請求の範囲第11項に記載の試薬。 - 【請求項１３】該固体支持体が蛋白質コンジュゲートを
含んで成る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１４】該蛋白質コンジュゲートがペルオキシダ
ーゼを含んで成る、特許請求の範囲第13項に記載の方
法。 - 【請求項１５】フラグメントＥを固体支持体に吸着する
こと； Ｄ−ダイマーを含む可能性のある生物学的試料を該固体
支持体に添加すること； Ｄ−ダイマーに特異的な抗体を、該固体支持体に結合し
た該フラグメントＥに直接付着しうる該試料中のＤ−ダ
イマーと結合可能な酵素にコンジュゲートすること；及
び 該生物学的試料中のＤ−ダイマーが定量できるように該
抗体にコンジュゲートした該酵素に特異的な基質を添加
すること、 を含んで成る、血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査の
ための、Ｄ−ダイマーを含む可能性のある生物学的試料
中のフィブリンの分解生成物であるＤ−ダイマーを直接
検出する方法。 - 【請求項１６】該フラグメントＥがフラグメントE1を含
んで成る、特許請求の範囲第15項に記載の方法。 - 【請求項１７】精製されたフラグメントＥとコンジュゲ
ートされたラテックスビーズ； 該試料中にＤ−ダイマーが存在する時に生起する凝集を
観察するのに適合した、該コンジュゲートされたラテッ
クス ビーズを該試料と一緒にするための表面、 を含んで成るヒトの生物学的試料中のＤ−ダイマーを検
出するためのキット。 - 【請求項１８】精製されたフラグメントＥとコンジュゲ
ートされた酵素； 該試料中にＤ−ダイマーが存在する時に生起する凝集を
観察するのに適合した、該コンジュゲートされた酵素を
該試料と一緒にするための表面、 を含んで成るヒトの生物学的試料中のＤ−ダイマーを検
出するためのキット。 - 【請求項１９】該酵素がペルオキシダーゼである、特許
請求の範囲第18項に記載のキット。 - 【請求項２０】該フラグメントＥがフラグメントE1を含
んで成る、特許請求の範囲第17項に記載のキット。 - 【請求項２１】該フラグメントＥがフラグメントE1を含
んで成る、特許請求の範囲第18項に記載のキット。 - 【請求項２２】該フラグメントＥがフラグメントE1を含
んで成る、特許請求の範囲第19項に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39544689A | 1989-08-17 | 1989-08-17 | |
| US395446 | 1989-08-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03103195A JPH03103195A (ja) | 1991-04-30 |
| JP2997520B2 true JP2997520B2 (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=23563075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2215103A Expired - Lifetime JP2997520B2 (ja) | 1989-08-17 | 1990-08-16 | 血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査のための生物学的試料からのｄ―ダイマーの直接化学結合的方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0655627B1 (ja) |
| JP (1) | JP2997520B2 (ja) |
| AT (2) | ATE216082T1 (ja) |
| CA (1) | CA2023354C (ja) |
| DE (2) | DE69033944T2 (ja) |
| DK (2) | DK0413587T3 (ja) |
| ES (2) | ES2090106T3 (ja) |
| GR (1) | GR1001221B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2769093B1 (fr) * | 1997-09-30 | 1999-11-12 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procede in vitro d'evaluation des risques thrombotiques par dosage du fibrinogene plasmatique |
| DE102007026153A1 (de) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Dade Behring Marburg Gmbh | Stabile D-Dimer Flüssigzubereitung |
| CN103235130A (zh) * | 2013-04-18 | 2013-08-07 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种高灵敏、高线性的d-d二聚体检测试剂盒及其使用方法 |
| CN109187955A (zh) * | 2018-08-01 | 2019-01-11 | 深圳市锦瑞生物科技有限公司 | 一种用于检测d-二聚体的试剂盒及其检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| AU572125B2 (en) * | 1983-03-17 | 1988-05-05 | Mabco Limited | Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses |
-
1990
- 1990-08-15 CA CA002023354A patent/CA2023354C/en not_active Expired - Lifetime
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- 1990-08-16 GR GR900100616A patent/GR1001221B/el not_active IP Right Cessation
- 1990-08-16 DE DE69033944T patent/DE69033944T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-16 ES ES90309018T patent/ES2090106T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-16 EP EP95200426A patent/EP0655627B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-16 DK DK95200426T patent/DK0655627T3/da active
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- 1990-08-16 AT AT90309018T patent/ATE133495T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-16 JP JP2215103A patent/JP2997520B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1990-08-16 ES ES95200426T patent/ES2174896T3/es not_active Expired - Lifetime
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