JPS59116548A - 親水性ラテツクス粒子を含有する診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は親水性ラテックス粒子を含む診断薬に関する。

特に迅速かつ簡単に実施し、かつしはしは速成で観察す
ることができるために免疫学で多くの診断測定の範囲内
で利用される抗原抗体複合物の凝集反応には免疫学的に
活性な物質、例えは抗体のキャリヤとして親水性ラテッ
クス粒子が長い間使用されている。この親水性ラテック
ス粒子は大ていはポリスチレンホモポリマーまたはコポ
リマー、例えばスチレン／ブタジェンコポリマーまたは
アクリルニトリル／ブタジェン／スチレンコポリマー（
ＡＢＳ　）から成り、かつエマルジョン重合により製造
される。

長い間知られているエマルジョン重合では、一般に４成
分が冷加される：水に難溶性のモノマーまたは数棟の水
に難溶性のモノマーの混合物、水、乳化剤および水浴性
開始剤。七ツマ−は乳化剤によって小滴の形状に液化さ
れ、その際多数の乳化剤分子の会合によって中でも一部
は空の、かつ一部は七ツマー分子によって満たされた大
きなミセルか形成される。後者は七ツマ−の“可爵化“
とじて示される。水浴性開始剤は、水相の谷モノマー分
子の重合、またモノマーで調たされたミセルで並びにモ
ノマー滴で重合を開始もしくは活性化することのできる
ラジカルを形成する。しかし実際には重合は膨潤したミ
セルで起る、それというのも一方でミセル中のモノマー
濃度が周囲における個々のｍけたモノマー分子の濃度よ
りも者しく大きく、また他方でミセルの活性化の確率が
モノマー滴の数に比べてミセルの数か多いためにきわめ
て高いからである。充填ミセルの直径は重合中にミセル
が最終的に球形のラテックス粒子に移行するまで増大す
る。活性化されないミセルの乳化剤分子および消費され
たモノマー滴の表面からの乳化剤分子はラテックス粒子
の表面をおおい、かつ生成するポリマー分散液の安疋化
に役立つ。

例えば界面活性剤または湿潤剤であってよい乳化剤また
はエマルジョン安定剤の冷加下に公知方法により製造さ
れるラテックスは次の欠点を持っており、これらの欠点
は特に免疫学的に活性な物質のキャリヤとしての使用お
よび連続的な溶液測定系での使用を妨ける： １、　ラテックス粒子の疎水性表面に所望の免疫学的に
活性な物質、例えは抗体の他に非特異的に多数の他の血
清成分が結合する； ２、共有結合によらず吸着的にのみ結合せる免疫学的に
活性な物質は診断試験の経過の中で測定中に再び分離す
る場合がある： ６、　エマルジョン重合で乳化剤または安定剤として使
用される界面活性剤が水溶液中に拡散して生物学的に活
性なたん白質の構造を、したかつて活性を破壊する場合
がある： ４、娑定化作用を有する界面活性剤を除（際にラテック
ス懸濁液か凝集し、かつ遠心分離の際にも安定性かこわ
れる。その際生成する沈澱物は再懸濁させて前の状態に
するのがきわめて困難かまたはもはや可能ではない。

これらの欠点を回避するために既に種々の提案がなされ
たが、これらは當に前記の問題の一部のみを解決し得た
にすき゛なかった。

カルボキシル化ＡＢＳ−コポリマーおよびカルボキシル
化スチレン／ブタジェンコポリマーから成る、粒度０．
０１〜０．９μｍの疎水性ラテックス粒子か西ドイツ国
特許公告第２２０３３７７号公報から公知であり、これ
らは血清学的に不活性のキャリヤとして生物学的に活性
なたん白質に対して使用され、その際たん白質はキャリ
ヤに、ラテックス中に導入されたカルボキシル基を介し
てアミド結合の形成下に共有結合される。

西ドイツ国特許公開第２８１２８４５号公報からＡＢＳ
−コポリマーから成る、粒度肌０５〜１μｍの疎水性ラ
テックスが公知であり、この場合にもラテックスはカル
ボキシル基で変性され、かつ反応性ｇｔｕｓと縮合して
おり、そのために免疫学的に活性な物質も共有結合でき
る。

この公知の疎水性ラテックスによって前記の第２の問題
は解決されるが他のすべての欠点は相変わらず存在する
。

したかつて疎水性ラテックスの代わりに親水性グルを免
疫学的に活性な物質のキャリヤとして使用することも試
みられた。親水性ゲルは吸着性を全くまたはきわめて僅
かしか持たず、他方たん白質のかかるグルへの共有結合
は公知であるので、その製法および粒度に基づいて“ラ
テックス“と示してもよい“マイクログル“が提案され
た。かかる親水性ラテックスは例えは米国特許第４１３
８３８３号明細書から公知である。該ラテックスは０．
６５μｍよりも小さな直径を有する球形粒子から成り、
ラジカルによって開始される水性エマルジョン重合の条
件下に製造され、その際七ツマ−としてアクリルアミド
、アクリル酸、メタクリル酸ｌたはアクリレートが使用
される。乳化剤としては例えば金属石けんが使用される
。こうして得られる親水性マイクロケゞルに生物学的お
よび／または免疫学的に活性な物質が自体公知の方法で
カルボジイミド−ブリッジまたはグルタルジアルデヒド
−ブリッジを介して共有結合する。これによって前記の
第１と第２の問題か解決されるか、第６と第４の問題は
解決されない。それというのもエマルジョン重合は相変
らず乳化剤または安定剤の添加下に実施しなけれはなら
ないからである。

本発明の課題は、前記の４つの欠点すべてを回避するこ
とのできる親水性ラテックスを含有する診断薬を見い出
すことである。したかつて本発明の課題は、特に生物学
的および／または免疫学的に活性な物質を共有結合する
ことができ、生物学的に活性なたん白質の構造、したが
って活性を損なわず、その安定性が遠心分離の際にこわ
れず、かつ凝集し、かつ引続き再び容易に懸濁させるこ
とのできる親水性ラテックス粒子を含有する診断薬を見
出すことである。

この課題は本発明によれは水に難浴性のモノマーのホモ
ポリマーまたはコポリマーから成る親水性ラテックス粒
子を含有する診断薬によって解決される。該親水性ラテ
ックス粒子は水溶性の、ラジカルを形成する開始剤の存
在で、しかし乳化剤、安定剤または湿潤剤を添加せずに
エマルジョン重合によって製造可能であり、かつホモポ
リマーの場合に七ツマ−が、もしくはコポリマーの場合
にモノマー類の一部が分子中に少な（とも１飼の重合可
能なＣ＝Ｃ−二重結合を有するエポキシドである。

意想外にも冒頭で引用された公知技術にも記述されてい
る、当業界で長い間支配的であった思想に反して乳化剤
、安定剤または湿潤剤の祭加がエマルジョン重合の実施
に１つたく必要ではないことが示された。したがって、
乳化剤として使用される金属石けんまたは界面活性剤は
ラテックス粒子から拡散し、かつラテックス粒子に共有
結合せるたん白質の生物学的活性な損ない筐たは先金に
破壊したために従来は無条件に必要であった、ポリマー
のラテックス粒子からの大ていはきわめて困難かつ煩雑
な乳化剤の除去が省略される。

少な（とも１１Ｉｉ！ｉｌの重合可能な二重結合を含む
グリシジル化合物なモノマーとして使用するのがきわめ
て有利であると示された。該化合物の構造は重合性の二
重結合中に疎水性部分およびエポキシド基、オキシラン
環中に同時に親水性部分を有する。生成するラテックス
懸濁液は乳化坤」、安定剤または湿＠剤の不在にもかか
わらず凝集しない。ラテックス懸濁液の安矩化は遠心分
離の際にもこわされない。末端エポキシド基は種々の反
応（加水分解、アミツリシス、アミツリシス、輪台）を
きわめて受は易いのでエポキシド基は単分散系に分散し
たラテックス球体の表面を該エポキシド基が水相方向に
配向されるようにおおっているにちがいない。

七ツマ−としては有利にグリシジルメタクリレート、グ
リシジルアクリレート、グリシジルビニルエーテル、グ
リシジルビニルフタレートおよび６，４−エポキシブト
（１）エンか使用される。その際これらのモノマーの１
種を専ら使用シ、ソノ結果、生成する親水性ラテックス
粒子はホモポリマーであるが、これらのモノマーの混合
物を共重合してもよい。

エポキシド基の金蓋を制御するために前記のグリシジル
化合物１種Ｉたは数種と一緒に他のモノマー、例えはス
チレン、ジエン、アクリルアミド、メタクリルアミド、
アルキル−、ヒドロキシアルキル−およびアミノアルキ
ルアクリレート、アルキル−、ヒドロキシアルキル−お
よびアミノアルキルメタクリレート、ビニルエーテル、
ビニルエステル、Ｎ−ビニルピロリドン等も共重合する
ことができる。

着色料または螢光性化合物、例えはフルオレセインのモ
ノマーの重合性誘導体の存在で重合してもよい。このよ
うにしてヒトまたは動物の組織で抗原もしくは抗体を検
出するために好適である着色した、もしくは螢光性のラ
テックス粒子か得られる。この検出方法は組祇学で組織
断片を製造するのに特に好適である。七ツマ−の重合性
誘導体としては有利に着色料もしくは螢光性化合物が使
用され、この中に自体公知の方法でメククリル基もしく
はアクリル基が導入される。

生成するラテックス粒子の水に対するに浴性を高めるた
めにエマルジョン重合中に常用の架橋剤、例えはアルキ
レン−またはヒドロキシアルキレンジアクリレート、ア
ルキレン−着たはヒドロキシアルキレンジメタクリレー
ト、アルキレンビスアクリルアミドまたはアルキレンビ
スアクリルメタクリルアミド、ジビニルベンゼン等をｖ
Ｊξ加してもよい。

開始剤としてエマルジョン重合で常用の水浴性開始剤を
使用することかできる。有利にベルオキソジスルフエー
ト、ベルオキソボレート、過酸化水素または好適なレド
ックス系が使用される。

水に難醇性のモノマー１種または数種を乳化剤不含のエ
マルジョン重合により親水性ラテックス粒子を製造する
ための方法は空中酸素もしくは遊離の酸素に対して敏感
である。したがって酸素をすべてのポリマー成分および
各群から十分な煮洲、不溶性ガス雰囲気下における蒸溜
または窒素、アルゴンまたは他の不活性ガスの導通によ
りきわめて慎重に除去したけれはならない。

乳化剤不含のエマルジョン重合は有利に水相対モノマー
相の浴比を容量に関して８：１〜１６：１で実施する。

水相に浴けた開始剤の微塵は有利に０．５〜１゜５９７
１であり、かつ七ツマー相中のエポキシドの濃度は有利
に１〜１００重量％である。

エマルジョン重合は有利に温度０〜８０℃で実施する。

温度は選択された開始剤に依存する。

ベルオキソニ像酸カリウムの使用の際には有利に６０〜
７０℃で作業する。同様に反応時間は開始剤の選択に依
任し、５〜４０時間である。

親水性ラテックス粒子は厳密に球形で、単分散系で分散
され、かつ直径約０．１５〜１．５μｍの互いにほぼ同
じ大きさの粒子である。

親水性ラテックス粒子はエマルジョン重合終了後同重合
されないモノマーの残分な含んでいる場合かあり、この
残分は水蒸気蒸溜贅たは透析により除去することかでき
る。この場合にも遠心分離によりラテックス粒子を安定
性をこわさずに沈降させることができ、その結果引続き
再分散することかできる、親水性ラテックス粒子の特に
有利な性質は保持される。このようにして本発明による
ラテックスは数置の遠心分離およびデカンテーションに
よって簡単に鞘製することかできる。

ラテックスの末端の遊離エポキシド基は種々の化学物置
に対して島反応性であり、したかって容易に加水分解で
き、過ヨウ素酸塩もしくは過ヨウ素酸を用いては化して
アルデヒド基にし、アンモニア、第１アミン、ジアミン
またはヒドラジンと反応させて第１または第２アミン基
にし、または他の公知の反応を用いて変性することがで
きる。ラテックスのエマルジョンは乳化剤を欠いている
にもかかわらずエポキシド基の変性が所望によりエマル
ジョン重合の間も笑施し得るｔ丘ど高い安定性を有し、
そのために既に重合反応から表面が例えば第１アミン基
で変性されたラテックスが生成する。次いで変性された
、または誘導体化されたエポキシド基は、キャリヤとし
て作用する親水性ラテックス粒子に共有結合される生物
学的におよび／または免疫学的に活性なたん白質との“
結合（Ｋｕｐｐｌｕｎｇ　）“に使用される。

前記の課題は親水性ラテックス粒子を生物学的および／
または免疫学的に活性な物質の血清学的に不活性なキャ
リヤとして、例えばペプチド、たん白質、酵素、ホルモ
ン、ビタミン、抗原、抗体および微生物のキャリヤとし
て使用することにより解決される。

本発明の目的はキャリヤとして親水性ラテックス粒子お
よびこのキャリヤに直接または“ブリッジ“としての結
合剤を介して共有結・合する、生物学的およＯ・／また
は免疫学的に活性な前記の物質を含む診断薬である。

本発明による診断薬は同位元素標識免疫定敞法（ＲＩＡ
　）、＃素免疫定敏法（ＥＩＡ　）およびいわゆるＥＬ
ＩＳＡ　（酵素結合免疫吸着定敢法）で使用するのに特
に好適である。

例１（参考） ベルオキソニ硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２０Ｂ　）　０．０
８ｇを蒸溜水８０ｍｂＫ溶かし、かつ３０分間窒素を導
通させることにより空中酸素を排除する。

同時にグリシジルメタクリレートｉｏｍｇから同様に空
中酸素を除く。２成分をガラス反応器に入れ、かつ更に
１０分間窒素で処理する。次いで反応器を閉じ、かつ反
応を温度６５°Ｃで不断に攪拌下に６時間実施する。こ
の期間の後変換率は９８％である。反応生成物は直径０
．４４μｍの球形の、単分散系に分配されるポリグリシ
ジルメタクリレート粒子から成るラテックスである。

例２　（蚕考） 例１と同様にしてに２Ｓ２０８０．０８　ｊｊを溶かし
た蒸溜水１６０ｄおよびグリシジルメタクリレ−）　１
５ｍｆｔ％とメチレフ８５重敞チの混合物１０ｍ１を別
個に酸素を排除し、かつ温度６５°Ｃで不断に攪拌下に
６時間互いに反応させる。変換率は７１．６％である。

重合しない残置モノマーを水蒸気蒸溜により除く。生じ
る単分散糸コポリマーのラテックス粒子は直径０．２２
μｍをｆｌＩ６（参考） 例１と同様にして、蒸溜水ｉｏｏｍｌ中のに２Ｓ２０８
０．１ｙの溶液およびグリシジルメタクリレート１５重
量−と酢酸ビニル８５重量％の混合物１０ｒｔｔ１３を
互いに反応させる。変換率は８０％である。残量モノマ
ーを水蒸気蒸溜により除く。

生成するラテックスは直径０．１６μｍ　の単分散系、
球形粒子である。

こうして製造されたラテックス１００ｍＡ４を０．１　
Ｍ　−ＮａＯＨ浴液１００ＴＬｅと混合し、かつ温度約
２５°Ｇで２４時間放置、する。〃口承分解中および後
もラテックスの安定性は保持される。エマルジョ／を遠
心分離し、上澄みをデカンテーションし、かつ固体相を
再び水中に分散させる。

遠心分離および再分散を２度繰返す。生じる中性エマル
ジョンを（Ｍ　−Ｈ２ＳＯ４でＰｉ−１５にし、かつ過
ヨウ素酸をエポキシド基と当量で加える。

酸化は２５℃で約２４時間行なう。引続き未反応低分子
物質を透析によって除く。安定なエマルジョンの変性ラ
テックス粒子はアルデヒド基２．８重量％または０．９
７ミＩＪモル／ｇを含有する。

例４（参考） 例１のようにして蒸溜水１００１ｎｌ中のに２Ｓ２０８
０．１ｇの溶液およびグリシジルメタクリレート１５重
量係とイソプレン８５４量チの混合物　。

１０祷を温度６５℃で２４時間反応させる。変換率は７
６％である。引続き残量モノマーを水蒸気蒸溜により除
く、その際直径０．２５μｍの安定な、単分散系に分散
する球形のラテックス粒子が生じる。

引続きこのエマルション１００ｍ１Ｋ７ンモニア水溶液
（２５％）１０（Ｃ＋ｌを７１ｔ１え、かつ室温で２４
時間放置し、その際エポキシド基がアンモノリシスによ
ってアミン基に変わる。引続き反応生成物を過ヨウ素酸
で処理し、その際アルデヒド基４．５重量％または１．
５５ミリモル／ｇを含有するラテックスが生じる。

例５（参考） 例１のようにして水１．５Ｚ中のに２Ｓ２０８１．５ｇ
の溶液およびグリシジルメタクリレ−ｉ５ｍＡ’を別個
に酸素を除き、かつ互いに反応させる。

更に酸素不含のグリシジルメタクリレート１２０ｍＡを
酸素排除下に６時間の間反応容器に連続的に漏下する。

次いで史にろ０分間重合を続ける。

変換率は８５％であり、かつ生成する粒子は直径１．１
μｍ　を有する。

例６（参考） 例１のようにしてグリシジルメタクリレート１重量饅と
メチレフ９９重量係の混合物１０ｍＡおよび蒸溜水１０
０ｍ／；中のに２８２０８０．１ｇの溶液を６５°Ｃで
２２時間重合し、その１直径０．５μｍの親水性ラテッ
クス粒子が生成する。変換率は９０％である。

１ ＯＨＯＨ 例１により製造されたラテックス懸濁液２０廐を２Ｎ−
苛性ソーダ液５ｍＪとともに一夜にわたって室温で攪拌
し、次いで５時間水に対して透析′″３−る。残溜１゛
る懸濁液を過ヨウ素酸ナトリウム１００ｍ９の添加によ
りｐＨ３に調節し、かつ−夜にわたって室温で撹拌し、
次いで４時間蒸溜水に対して透析する。

例８（参考） １、アミド化 ２、アセタールの酸性加水分解 例１により製造されたラテックス懸濁液２ＯＮを濃アン
モニア溶液１０祷とともに室温で２０時間撹拌し、かつ
流水に対して４８時間透析する。杓らねる懸濁液を遠心
分離する。乾燥物質の窒素含量は約１％であり、これは
各約１０のエポキシド単位１のアミノ化に相当し、しか
し表面の優れた反応では確実により高い誘導体化度に相
当する。遠心分離された固体物質をＵ、ＩＮ−苛性ソー
ダ液２ＱｍＡで吸収する。これに撹拌下にジメチルホル
ムアミド６　ｍｌ　Ｋ　ｋかしたコハク酸ヒＦロキ７サ
クシンイミドエステルーアミドアセトアルデヒドーアセ
クール１．５ｇを滴下する。生成づ−る懸〜液を史に６
時間撹拌し、次いで１Ｎ−塩酸でｐＨ３にし、かつ流れ
る蒸溜水に対して１２時間透析する。

＝Ｈ Ｏ俳、ａ（ 例１により製造されたラテックス懸濁液２０ｍ１にＮａ
２Ｓ’９Ｈ２００，５ｇを刀口え、かつ室温で２日攪拌
する。引続き＆濁液の臭いがなくなるまで流れる蒸溜水
に対して透析し、次いで懸濁液を遠心分離する。乾燥物
質はイオウ約２％を有し、これは約１０のエポキシド単
位の誘導体化に相当し、表面での優れた反応では確実に
より高い誘導体化度に相当する。

遠心分離された生成物にジメチルホルムアミド６罰に溶
かした６−マレインイミドヘキサン醒ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル１ｇを加え、室温で６時間攪拌し、次
いで流れる蒸溜水に対して１２時間透析する。

例１０ ラテックス−γ−グロブリンコンシュデート（Ｋｏｎｊ
ｕｇａｚ　）　　の形成 アーグロプリン溶液１Ｎ（たん白質５６．６〜含有）に
ａ）例１により製造されたラテンクス懸濁液 ｂ）例７により誘導体化さねたラテックス懸濁液 Ｃ）秒１．３により誘導体化された　　〃ｄ）例９によ
り誘導体化された　　〃 各２３ｍ／！を加え、かつ室温で１２時間透析する。

残留する懸濁液を遠心分離する。引続き上澄み液中の遊
離のたん白質を測定する。実測値からラテックス粒子に
結合さｉた割合を計算することができる。それによれば バンチａ）は　γ−ゲ日プリン　　８■を結合して含有
、〃　ｂ）は　　　　　　　４３〜を結合して含有、／
／Ｃ）は　　　〃　　　１５〜を結合して含有、〃　ｄ
）は　　　ｕ　　　　１９ｍ９を結合して含有。

例１１ ラテンクスーＩｇＧ−共液体 例１０のようにしてＩｇ（）−溶液および種々のラテッ
クス１１１５液からラテックス＝ＩｇＧ共液体を製造す
る。抗体複合体形成によってラテックス粒子にＩｇＧ−
分子が積載されていること、が検以下本発明による親水
性ラテックス粒子の使用例として、詳細にはヒツジの抗
Ｔ４−血清からのＴ４−抗体を用いてチロキシン（Ｔ４
）を免疫定量するだめの、および二重抗体−分離法を用
いて血清中のヒトチレオトロビン（ＴＳＨ）を定量する
ための２つの診断薬を記載する。

例１２ ヒツジの抗Ｔ４−血清に対するキャリヤとしてのホモポ
リグリシジルメタクリレートラテックス粒子の使用：　
Ｔ、　−ＥＬＩＳＡを行なうための診断薬 チロキシン（Ｔ４）をＥＬＩＳＡを用いて定量するため
に先ずヒツジの抗Ｔ４−血清からのＴ４−抗体を本発明
による親水性ホモポリグリシジルメタクリレートラテッ
クス粒子に、該粒子を例７〜９のいずれ〃）によって誘
導体化し、かつ例１０および１１と同様にしてＴ４−抗
体と反応させることによって共有結合させる。こうして
得られるソリッド−フェース（５ｏｌｉｄ−Ｆａｃｅ　
）−抗体は試験のための第１試薬である。第２試薬とし
てＴ４　　を自体公知の方法で好適な酵素、例えばペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ　）またはβ−ガラクトシダーセ
゛（β−Ｇａｌ）で標識する、すなわち結合して酵素コ
ンシュｒ−）にする。酵素としてこの例ではβ−（）ａ
ｌを使用する。第６試薬は未知量のＴ４　　を含有する
試料であり、かつ第４試薬は酵素コンジュゲートのβ−
Ｇａｌの詣用の基質であり、詳細にはこの例ではトリス
−Ｈ（Ｊ−緩衝液（ｐＨ７，３）　中０）ニトロフェニ
ル−β−がラクトシトである。

試験の原理は次の６つの反応経過に基づく：１、一方の
親水性ラテックス粒子に共有結合せるＴ４−抗体と他方
の酵素Ｓ識Ｔ４＜Ｍ酵素コンシュｒ−ト″）と試料中に
含まれる遊離のＴ４　　との間の免疫反応。この反応で
はソリンドーフェースー抗体、醇累コンシュケ８−トお
よび試料のＴ４　　の曲に競合的結合が起こる。

２、Ｂ／Ｆ−分離（Ｂ＝結合、Ｆ＝遊離）。これは結合
した酵素コンシュデート（Ｂ）と結合しない酵素コンシ
ュダート（Ｆ）の分離である。

この分離は有利に遠心分離または例えば水または好適な
緩衝液に対する透析によって達成される。

６、酵素コノシュｒ−）と帛用の、使用さハる酵素に関
して特異的な基質との間に進行し、かつ比色法または他
の公知方法で追跡することのできる酵素検出反応。酵素
活性は上澄み液（遊離部分）中でかまたは再懸濁された
沈澱物（結合部分）中で測定１−ることかできる。

実施例 前記のようにして製造されたラテックス−抗Ｔ４＠濁液
な水または緩衝溶液中で比１　：　１０００で希釈する
。この懸濁液０．５ｍに種々の既知量のＴ４−含量を有
するＴ４−血清標世溶液１００ＩＩ７およびＴ４−β−
（）ａｌ−コンシュデート浴液１００μノを加える。反
応混合物を室温で６０分恒温保持′１−る。恒温保持の
間１バンチを不断に振盪し、かつ同じＴ４−標準含量を
有する１バツチを単に放置した。次いでそれぞれ懸濁液
を遠心分離し、かつＦ−相が存在する上澄み液を分離し
た。Ｂ−相、すなわちソリンドーフェース抗体に結合し
たＴ４−β−Ｃａｌコンジュケ８−トは沈澱物中に存在
する。酵素活性を測定するためにこれを ｐ−ニトロフェニル−β− ガラクト７ド（シグマ社）　４５０■／ｌ塩化ナトリウ
ム　　　　　　　１００ミリモル塩化マグネシウム　　
　　　　１０ミリモルトリス緩衝剤／Ｈ（Ｊ　　　　　
　　　１０ミリモルメルカプトエタノール　　　　０，
４　ｖ／ｖ％から成る、ＰＨ７，６の過剰の基質溶液に
加え、かつ公知方法で波長４０５　ｎｍ　　で吸光度を
測定する。外部の止械的な混合をしない場合に懸濁状態
で保持されるラテックス粒子が約１１％減少したシグナ
ルを与えることが示された。

このようにしてＴ４−検量曲線を測定した後、引続き同
様にしてＴ４−標準血清１００μｌの代わりに未知量の
Ｔ４　　含量の試料それぞれ１００μｌを使用し、かつ
再懸濁後のＢ−相の吸光度を基質溶液中で測定すること
により定量を行なった。

親水性ラテックス粒子が抗体および抗原のキャリヤとし
てきわめて好適であり、かつそれらの免疫反応性を損な
わないことが認められた。

したがって親水性ラテックス粒子はソリッド−フェース
−酵素免疫試験でキャリヤとして有利に使用することが
できる。更に緩衝剤条件にある載承性ラテックス粒子が
長期間にわたって懸濁状態を保持し、したがって粒子の
密度がほぼ１に等しいことが認められた。その上に本発
明による親水性ラテックス粒子は免疫反応性を損なわず
に良好に遠心分離可能であり、かつ再懸濁可能である。

例１６ ヒトテレオトロビン（ＴＳＨ）を定量するための酵素免
疫定量（Ｅ　Ｉ　’Ａ　） ヒト血清中のＴＳＨの測定は甲状腺医病の診断で著しく
重要である。基礎ＴＳＨ濃度の著しい上昇で１次甲状腺
機能減弱が認められる。その仰血消中のＴＳ）（基礎値
０．５〜６μＵがＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出因子
）で刺激後に上昇しない場合に甲状腺機能減弱は確実に
あり得ない。

それに対してＴＳＨ値が少なくとも２．５μＵ　／ｍＡ
’、し〃・し２５μＵ／ｍ１以上で上昇する場合には甲
状腺物質代謝は高い確率で損なわれていない。

２５μＵ／ｄを僅かに上回った基礎値の上昇は潜在的な
症状発現前の甲状腺機能減弱を推測することができる。

既にＴＳＨの酵素免疫定量は公知である〔６クリ二カ・
ヒミカ・アクタ（ＣｉｉｎｉｃａＣｈｅｍｉｃａ　Ａｃ
ｔ、ａ　）″、第６７巻、２６３〜２６８Ｎ（１９７６
年）；”エンツイーメ・ラベルド・イムノアツセイ・オ
ブ・ホルモンズ・アンドＯドラッグス（ｅｎｚｙｍｅ　
１ａｂｅｌｌｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆ　ｈｏ
ｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｄｒｕｇｓ　”、３２７　ゝ３
３７ｎＯ８，Ｂ、Ｐａｌ　、　Ｗａｌｚｅｒ　ｄｅ　Ｇ
ｒｕｙｔ、ｅｒ　、ベルリンおよびＮ、Ｙ、（１９７８
年）：″アナリューチカル、ビオケミストリ（Ａｎａｌ
ｙｔ、１ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”第９６
巻、４１９〜４２５頁（１９７９年）〕。

しかしこれらの公知の測定法はきわめて長い恒温保持時
間（５日まで）を必要とし、鋭敏ではなく　（ＴＳＨ５
μＵ／ｍＪ）または高価な測定装置（螢光測定装置また
は発光測定装置）を前提とし、その際その他にパンチを
混合するための装置が必要である。

本発明による親水性ラテックス粒子の使用は２１日にす
ぎない全恒温保持時間で二重抗体分離技術によるＴＳＨ
の測光法による測定を可能にする。その際第２の抗体が
本発明による親水性ラテックス粒子に共有結合される。

次いで結合された酵素活性をＢ／Ｆ−分離により測定す
る。

ラテックス粒子は水の密度よりも著しくは高くない密度
を有しているので、ラテックス粒子は酵素反応の間も懸
濁状態にあり、これにより常用の混合が省略される。抗
体の高い負荷可能性のために可能であるきわめて希釈さ
れたラテックス粒子を使用する場合には酵素反応終了後
の粒子の遠心分離も省略される、それというのも懸濁液
を通過して測光できるからである。

免疫学的試験方法で一般に使用されるラテンクスとは異
なり抗体を負荷された、本発明による親水性ポリダリシ
ジルメタクリレート粒子は遠心分離後容易に再懸濁させ
ることができる。

同じ理由から酵素で標識された抗原のきわめて小さな非
特異的結合が示される（第１抗体の不在での結合さハた
活性）。

実施例 ’Ｉ’ＳＨ−標準（ＴＳＨ不含血消中の国際参照調剤１
ｖｌＲＣ６８／３８　）　０．２ａを１　：１　ｂｏｏ
ｏｏで水または好適な緩衝溶液で希釈した、自体公知の
、例えばモルモットの抗ＴＳ）ｉ−抗血ｆｆｒ０．１ｍ
ｌとともに恒温保持する。１２時間後グルコースオキシ
ダーゼ（ＣＯＤ）に共有結合せるＴＳＨ（ＴＳＨ約１．
５　Ｘ　１０−９ｇに相当）から成る醇素コンシュケ゛
−トの溶液Ｑ、１ｍ／！を第１工程の混合物にピペット
で添加する。この混合物に更に１２時間後ラテックス懸
濁液０．１　＝をピペットで添加する。該懸濁液はメタ
クリレートラテックス０．１〜１ｍｙ　／　ｍｌを含有
し、その際例１１に記載されているように転線ラテック
ス粒子ｉｏｏｏｍｐにつき、モルモン）　−Ｉｇ（）に
対するヤギの抗血清から得られた免疫グロブリン７ラク
シヨンのたん白質５〜１５０■を加え、かつそうして親
水性ラテックス粒子に共有結合された。１時間後遠心分
離し、かつラテックス粒子の沈澱物を好適な緩衝溶液１
ｍｌで洗う、それによりラテックス粒子は再懸濁される
。引続き改めて数置遠心分離し、かつ洗浄する。上澄み
液を棄てる。

各バンチにＧＯＤの基質溶液１１１Ｌｌをピペットで入
れ、かつ短時間振盪する。その後少なくとも２時間ラテ
ックス粒子は均一に懸濁されたままである。次いで懸濁
液を目盛りクベットに入れ、かつ４０５　ｎｍで吸光度
を測定する。各吸光度から基質盲検値Ｌ工を引く。Ｌ工
は、抗ＴＳＨ−抗血清とＴＳＨ−（）ＯＤとの混合物に
添加された前記のラテックス懸濁液と同じ物質を負荷さ
れたラテックス粒子を含む基質溶液１ｒＩＬｌの吸光度
である。

こうして求められた吸光度を種々のＴＳＨ標準濃度に関
して記録する。この検量曲線を用いて臨床試料中の未知
含景のＴＳＨの濃度を測定した吸光度に基づいて読み取
る。

好適な緩衝溶液として有利にＥＤＴＡ　Ｏ，００５モル
、ウシ血清アルブミン０．１％兼びにＮａＣＪ！０．１
５モルを含む０．０４Ｍ−ホスフェート溶液（ｐＨ７，
４）を使用する。

ＧＯＤ−基質溶液として有利にグルコース５Ｉ／１００
Ｎ、２．２′−アジ／−ジー〔６−ニチルーベンズチア
ゾロンースルホン酸（６）　）　（ＡＢＴＳ　）　１０
０ｍ９／　１００ｍｇ、ベルオキシダーセ゛（ＰＯＤ）
５ｍ９／Ｉ　Ｑ　Ｏｍｇ、０．０５Ｍ−ホスフェート緩
衝液（ｐＨ５，６）を含む水溶液を使用する。

比較のために６つの血清試料のＴＳＨ含量を前記ＥＩＡ
　（Ａ）湛びに公知の二重抗体−ＲＩＡ　（Ｂ）で測定
した。次表に示す通りそれぞれ測定値は良く一致する： （Ａ）　　　　　　（Ｂ） 血清１　１１．２　ｐＵｙ４ｎｌ　　１２．５　μｇ、
４２　７．６μル似　　　７．１μ明佃 血清６　６．８μＴＪ／＆Ｌｌ　　　　４．５μ明疵前
記のＴＳＨ−測定からも、本発明による親水性ラテック
ス粒子が生物学的および／または免疫学的に活性な物質
、特に抗体のキャリヤとしてきわめて好適であることが
得られる。

非特異的結合の測定 ＴＳＨ標準試料を前記の試験実施の項目で記載されたよ
うにして処理しく試料Ｃ）、かつほとんど試料Ｃと同じ
反応にかけられた同様の試料（試料Ｄ）と比較する。抗
ＴＳＨ−抗血清のみは省いた。試料ＣとＤの懸濁液中で
測定された吸光度の比較は非特異的結合が１．５％より
も小さいことを示す。

８０ ０発　明　者　カレル・ボウヒヤル チェツコスロヴアキア国プラー グ５ベロヤニソヴア６ ０発　明　者　ヤロスラフ・カラル チェツコスロヴアキア国プラー グ６ベロホルスカ１３５ ０発　明　者　フランチゼク・スヴエクチェツコスロヴ
アキア国フレベ ク・プリフナ２６ ０発　明　者　工ヴア・ヅルコヴア チェツコスロヴアキア国プラー グ４イエレメンコーヴア６２ ０出　願　人　チェスコスロヴエンスカー・アカデミ−
・ヴイエド チェツコスロヴアキア国プラー グ・ナロドニ３ ２６２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 土　キャリヤとして水に難済性のモノマーである分子中
   に少なくとも１　（ｆＭの重合可能なＣ＝Ｃ−二重結合
   を有するエポキシドのホモポリマーまたはコポリマーか
   ら成る親水性ラテックス粒子およびこのキャリヤに＠接
   または“ブリッジ”としての結合剤を介して共有結合七
   石生物学的にかつ／またけ免疫学的に活性な物質を含有
   することを％徴とする、診断薬。 ２、生物学的にかつ／または免役学的に活性な物質とし
   てベゾチド、たん白質、酵素、ホルモン、ビタミン、抗
   原、抗体または微生物を特徴する特許請求の範囲第１項
   記載の診断薬。 ６、　チロキシン測定のための診断薬として生物学的に
   かっ／または免疫学的に活性な物質としてチロキシン抗
   体を特徴する特許請求の範囲第２項記載の診断薬。 ４、　ヒトチレオトロビン測定の診断薬として生物学的
   にかつ／または免疫学的に活性な物質としてヒトーチレ
   オトロぎン抗体を特徴する特許請求の範囲第２項記載の
   診断薬。