JPH0713641B2 - 診断用試薬の製造方法 - Google Patents

診断用試薬の製造方法

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JPH0713641B2
JPH0713641B2 JP59089319A JP8931984A JPH0713641B2 JP H0713641 B2 JPH0713641 B2 JP H0713641B2 JP 59089319 A JP59089319 A JP 59089319A JP 8931984 A JP8931984 A JP 8931984A JP H0713641 B2 JPH0713641 B2 JP H0713641B2
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学液診断用試薬の製造方法に関する。更に
詳しくは、鋭敏性,安定性,迅速性のすぐれた免疫学的
診断用試薬の製造方法を提供するものである。
抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応,補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてい
る。そして、遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検
出する反応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の
高い抗血清が得られることによって、特異性の高い抗体
を血球粒子,ベントナイト粒子,カオリン粒子,ラテッ
クス粒子などの粒子担体に固定させておき、対応する抗
原を凝集反応によって検査するなど、臨床検査における
凝集反応の応用範囲が著しく拡大している。
免疫学的凝集反応用としての担体は種々のものが公知
で、該担体を使用した種々の診断用試薬が知られてい
る。
例えば、特開昭57-135801号公報には、スチレン−グリ
シジルメタクリレート共重合ラテックス粒子に免疫活性
物質を共重合させて診断用試薬を得る方法が提供されて
いる。しかしながら、この方法により得られた診断用試
薬は、抗原抗体反応性が低いという欠点がある。また、
凝集反応は、一般に電解質を含んだ体液(例えば、血清
又は尿)と診断用試薬とを混合して行なわれる。この混
合の際の診断用試薬の非特異的凝集を避けるため、診断
用試薬を得るにあたって、担体への免疫活性物質の固定
は電解質を含んだ緩衝液中で行なわれる。従って、担体
は電解質を含んだ緩衝液中で安定でなければならない。
しかしながら、上記の共重合ラテックス粒子は、電解質
を含んだ緩衝液中での分散安定性が極めて悪いという欠
点を有している。
しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定量分析の発展と共に免疫学的凝集反応
は鋭敏性と迅速性が増加し、非特異的凝集反応が起こら
ない、しかもより保存安定性に優れた等の性状を有する
診断用試薬の開発が要望されている。
本発明者等はかかる要望を満たすべく鋭意研究を重ねて
来た結果、特定した製法により得た特定の組成の重合体
粒子で、しかも特定組成比のものが免疫活性物質を吸着
しているとき、前記要望を満すだけでなく著しくすぐれ
た効果をもたらすことを見出した。更に研究を重ねた結
果、本願発明を完成し、ここに提案するに至った。
即ち、本発明は、 一般式、 (但し、R1は水素原子又はアルキル基で、R2は疎水基で
ある。)で示される構造単位を与える単量体(A)と 一般式、 (但し、Rは水素原子又はアルキル基である)で示され
る構造単位を与える単量体(B)とを第1段目重合し、
続いて単量体(A)を添加し第2段目重合して得た、該
単量体(B)の構造単位が3.0モル%をこえて20モル%
以下の範囲で含まれる重合体粒子の表面に、免疫活性物
質を吸着することを特徴とする免疫学的凝集反応性を有
する診断用試薬の製造方法である。
本発明で使用する重合体粒子は、 (但し、R1は水素原子又はアルキル基で、R2は疎水基で
ある)で示される構造単位と、 (但し、Rは水素原子又はアルキル基である)で示され
るヒドロキシル構造単位とよりなり、且つ該ジヒドロキ
シル構造単位が3.0モル%を超えて20モル%以下の範囲
で含まれる、重合体粒子である。
上記一般式(A)で示される構造単位のうちR1で示され
るアルキル基は特に限定されるものではないが、一般に
工業的観点から低級アルキル基、例えば炭素原子数1〜
4のメチル基,エチル基,プロピル基,ブチル基等が好
適に使用される。また一般式(A)で示される構造単位
のうちR2は疎水基であれば特に限定されず公知のものが
使用出来るが、工業的に好適に使用されるものを例示す
れば、アリール基;ハロゲン化アリール基;ニトリル
基;アルキルエステル基;アルキルエーテル基;グリシ
ジルエステル基;塩素,臭素,沃素,フッ素等のハロゲ
ン原子等である。更にまた前記一般式(B)で示される
ジヒドロキシル構造単位中、Rのアルキル基は前記一般
式(A)式中のR1のアルキル基と同様なものが使用出来
る。
本発明で使用する前記一般式(A)及び(B)で示され
る構造単位を有する重合体粒子は一般にこれらの構造単
位を与える単量体を共重合させることによって得ること
が切る。例えば前記一般式(A)で示される構造単位を
与える単量体(A)の代表的なものを挙げれば、スチレ
ン,ビニルトルエン,α−メチルスチレン,クロルメチ
ルスチレン,アクリロニトリル,塩化ビニル,メチル
(メタ)アクリレート,エチル(メタ)アクリレート,
プロピル(メタ)アクリレート,グリシジル(メタ)ア
クリレート,あるいはエチルビニルエーテル等である。
これらの単量体(A)は単独であるいは混合して用いる
とよい。これらの中で、アリール基,ハロゲン化アリー
ル基,アルキルエステル基又はハロゲン原子を有するビ
ニル系単量体が好適に使用され、特にスチレン,ビニル
トルエン,クロルメチルスチレン等のアリール基又はハ
ロゲン化アリール基をもつビニル系単量体の重合体は最
も好適に採用される。
また本発明の前記一般式(B)を与える単量体(B)の
代表的なものを例示すれば、グリシジルアクリレート;
グリシジルメタクリレート;2,3−ジオキシアクリレー
ト;2,3−ジオキシメタクリレート等である。上記のグリ
シジルアクリレート又はグリシジルメタクリレート等の
エポキシ基を有する単量体を使用する場合には、一般に
前記一般式(A)を与える単量体(A)と共重合した
後、加水分解する方法が採用される。加水分解の方法と
しては、例えば弱酸性,弱アルカリ性条件下、あるいは
80℃以上の加熱条件下にエポキシ基を加水分解する方法
が好適に採用される。
また本発明で用いる重合体粒子は前記(B)式で示され
る構造単位が3.0モル%を超えて20モル%以下の範囲の
間にあることが極めて重要である。該(B)式の構造単
位が極めて少ない場合には、特に3.0モル%より少ない
場合には、免疫学的凝集反応性は高まるが、免疫活性物
質を重合体粒子に吸着させる操作過程での分散安定性が
悪くなるばかりでなく、診断用試薬の保存安定性が低下
する欠点がある。逆に、該(B)式の構造単位が20モル
%より多い場合には、免疫活性物質の該重合体粒子への
吸着による固定化が著しく低下する。従って、保存安定
性は改良されるが、免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性
が極めて悪くなる。本発明における前記(B)式で示さ
れる構造単位が重合体粒子中3.0モル%を超えて20モル
%以下の範囲にあることが、疎水基を有するビニル構造
単位と相補し合って、該重合体粒子の表面に免疫活性物
質を吸着して固定化した診断用試薬の免疫学的凝集反応
の迅速性と鋭敏性を向上させるだけでなく、非特異的凝
集反応の抑制と保存安定性を高める効果を同時に発揮し
ていると推定される。更に好ましくは、本発明における
(B)式で示される構造単位は重合体粒子中に3.0モル
%を超えて15モル%以下の範囲で含まれることが好適で
ある。
本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特に限定さ
れないが、一般には0.05乃至10ミクロンの範囲内、好ま
しくは0.1乃至2ミクロンの範囲内にあるのが好まし
い。該粒子径が0.05ミクロン以下では微弱な免疫学的凝
集反応を肉眼で観察することが困難になる場合がある。
また粒子径が10ミクロン以上になると分散安定性,保存
安定性が悪くなる場合がある。さらにまた、該重合体粒
子の粒子径の単分散性は小さいことが望ましい。
本発明の重合体粒子を得るための製造方法は特に限定さ
れず公知の方法が採用される。例えば、好適な方法を例
示すれば次の(1)及び(2)に示すとおりである。
(1) グリシジル(メタ)アクリレート(以後、B単
量体と呼ぶ)と疎水基を有するビニル系単量体(以後、
A単量体と呼ぶ)との混合物を界面活性剤の存在もしく
は不存在下に水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて
所定時間重合を行なった(第1段目重合)後に、続いて
A単量体を添加して重合を継続することにより重合体粒
子を合成する(第2段目重合)。次いで該重合体粒子の
エポキシ基を加水分解する方法。
第1段目に用いるB単量体の添加量は、全単量体に対し
て3.0モル%を超え20モル%以下である。また第1段目
重合に用いるB単量体とA単量体の組成比は、B単量体
の組成によって異なるが、5/59乃至95/5モル比、より好
ましくは10/90乃至70/30モル比を採用するとよい。
第1段目重合に添加するA単量体とB単量体の混合物の
水に対する濃度は限定的ではないが、通常水に対して0.
05乃至30容量%、好ましくは0.1乃至10容量%が望まし
い。
第1段目重合に用いる水溶性ラジカル開始剤の種類とし
ては、過硫酸ナトリウム,過硫酸カリウム及び過硫酸ア
ンモニウム等の過硫酸塩、又は過硫酸塩とチオ硫酸ナト
リウム,チオ硫酸カリウム,チオ硫酸水素ナトリウム等
のチオ硫酸化合物及び銅イオン,鉄イオン等の分解促進
剤を組み合わせたしドックス系触媒が好適に使用され
る。水溶性ラジカル開始剤の濃度は重合温度,単量体濃
度に依存するために限定的でないが、0.05乃至20ミリモ
ル/lの範囲が好適に採用される。また、水溶性ラジカル
開始剤は第1段目に全量添加しても良く、第1段目及び
第2段目に分けて添加しても良い。
第1段目重合にB単量体に対して0〜20モル%の水溶性
ビニル系単量体、例えば、メタクリル酸,アクリル酸,
スチレンスルフオン酸,2−ヒドロキシエチル(メタ)ア
クリレート,ビニルピロリドン,ポリエチレングリコー
ル(メタ)アクリル酸エステル等を混合して使用するこ
とも可能である。
界面活性剤を添加する態様と、添加しない態様が採用さ
れるが、界面活性剤を添加した場合、A単量体が重合し
てできた重合体とグリシジル(メタ)アクリレートの重
合体との相溶性が大きい場合には、本発明の効果が発揮
されない場合がある。従って、重合体粒子に免疫活性物
質を吸着固定化した試薬の抗原・抗体反応性、及び分散
安定性を高めるには界面活性剤を添加しないことが望ま
しい。
第1段目の重合温度は40℃乃至85℃、より好ましくは50
℃乃至80℃がよい。重合時間はA単量体とB単量体の組
成と添加量によって異なるが、一般には10分乃至5時
間、より好ましくは20分乃至3時間と比較的短かい方が
好適に採用される。
第2段目重合に添加するA単量体の添加割合は、第1段
目重合に添加するB単量体の添加量及びB単量体とA単
量体の組成比によって異なるが、一般的には第1段目重
合と第2段目重合に添加する全単量体に占める割合で60
モル%から96モル%、より好ましくは70モル%から95モ
ル%の範囲であることが好適である。
第2段目重合にはA単量体成分単独で添加することが望
ましいが、A単量体に対して0〜2モル%のB単量体も
しくは前記した水溶性ビニル系単量体を混合して使用す
ることもできる。
第2段目重合に添加するA単量体の添加は一定速度で逐
次添加することが好適に採用される。
第2段目重合の温度は40℃乃至85℃、好ましくは50℃乃
至80℃が好適に採用される。
第1段目重合の後に第2段目重合を継続して行なうこと
が望ましい。
エポキシ基を加水分解する方法は、前述したように、重
合体粒子を弱酸性または弱アルカリ性溶液中に浸漬する
方法、又は80℃以上に加熱する方法が好適に採用され
る。
(2) 2,3−ジオキシ(メタ)アクリレートとA単量
体との混合物を界面活性剤の存在下もしくは不存在下に
水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて所定時間、重
合を行なった(第1段目重合)後に、続いてA単量体を
添加して重合を継続することにより重合体粒子を合成す
る(第2段目重合)方法。
この製造方法に於ける詳細は、前記(1)の製造方法と
同様である。
本発明の重合体粒子に物理吸着によって固定化する免疫
活性物質としては、特に限定的でなく公知のものが使用
出来る。代表的なものを例示すれば、例えば、変性ガン
マグロブリン,リウマチ因子,抗核因子,ヒトアルブミ
ン,抗ヒトアルブミン抗体,イムノグロブリンG(Ig
G),イムノグロブリンA(IgA),イムノグロブリンM
(IgM),ストレブトリジンO,抗ストレプトリジンO抗
体,C−反応性蛋白,抗C−反応性蛋白抗体,アルフア−
フエトプロテイン(α−FP),抗α−FP抗体,癌胎児性
抗原(CEA),抗CEA抗体,ヒト胎盤ラクトゲン(HP
L),抗HPL抗体,ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG),
抗HCG抗体,抗エストロゲン抗体,抗インシユリン抗体,
B型肝炎表面抗原(HBS),抗HBS抗体,梅毒トレポネー
マ抗原,風疹抗原,補体成分C1q,抗補体成分C1q抗体,
等の公知の免疫活性物質をあげることができる。本発明
の重合体粒子に吸着で固定化される該免疫活性物質の量
は、各検査項目に適している割合で重合体粒子に固定化
させればよく、一概に限定されない。一般には、該免疫
活性物質の量が多い程、診断用試薬の鋭敏性及び迅速性
が上がるため、鋭敏性及び迅速性を要求する場合には、
前記の重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を吸着さ
せることが好ましい。前記した重合体粒子の製造方法
(1)及び(2)により製造した重合体粒子は、免疫活
性物質の飽和吸着量が多く、例えば、ヒトIgGの飽和吸
着量は、重合体粒子の単位表面積当り1.5mg/m2以上の値
を示す。
本発明の製造方法において得られる重合体粒子は疎水性
と親水性のバランスが極めて良く調節されているので、
該重合体粒子表面に比較的多量の免疫活性物質を極めて
容易に物理吸着法で固定化できる特徴がある。例えば、
抗原又は抗体と重合体粒子を緩衝液又は生理食塩水など
の水媒体中で混合し、抗原又は抗体が化学的に変化しな
いように、そしてそれらの免疫学的性質を保持させるよ
うに、非常に温和な条件下に抗原又は抗体を重合体粒子
表面に吸着させることができる。重合体粒子表面に吸着
された免疫活性物質の量は、重合体粒子の疎水基の吸着
部位を飽和又はブロックされるように選ぶことが好まし
いが、残存する吸着部位を適当な物質、例えば免疫学的
に不活性な牛血清アルブミン,ゼラチン等でブロックさ
せることができる。
本発明の製造方法により得られる免疫学的診断用試薬
は、分散安定性と保存安定性が著しく優れている。特
に、診断用試薬を構成する重合体粒子は、電解質を多量
に含む緩衝液中で十分安定であるため、免疫活性物質の
固定は電解質を含む緩衝液中で行なえる。従って、本発
明の製造方法により得られる診断用緩衝試薬は体液と混
合時に非特異的凝集を防止できるという特徴をも有して
いる。免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性も良好である
特徴を有する。この理由は必ずしも明確でないが、ヒド
ロキシル基はカルボキシル基,スルホン酸基等のアニオ
ン極性基と異なり、水媒体中での重合体粒子の分散安定
性にpH依存性が極めて少ないこと、また、免疫学的凝集
反応の実施において、水の蒸発による懸濁液組成の変化
がおこり、懸濁液のイオン強度が変化しても、ジヒドロ
キシル基を含有する重合体粒子はその影響を受け難いこ
と、さらにまた、ジヒドロキシル基はヒドロキシル基が
隣接する位置にあるので、特定のジヒドロキシル基の濃
度で診断用試薬の分散安定性と保存安定性の効果が高め
られると推定される。さらには、特定濃度範囲のジヒド
ロキシル基が重合体粒子表面に局在化していると考えら
れ、比較的多量のジヒドロキシル基を導入しても、重合
体粒子表面の疎水性部分の面積が大きくなり、この疎水
性部分に充分な量の免疫活性物質が吸着されて固定化で
きるため、免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性が向上す
ると推定される。しかも、比較的多量のジヒドロキシル
基が導入されているため、診断用試薬の分散安定性と保
存安定性は優れている。
本発明で提供する診断用試薬は前記説明から或いは後述
する実施例からそのすぐれた性能が明白であるが、物理
吸着タイプの診断用試薬でかかる特性を発揮することは
驚異的なことである。例えば、前記した特開昭57-13580
1号公報の例2ではグリシジルメタクリレート15重量%
とスチレン85重量%の混合物を水溶性ラジカル開始剤を
用いて水媒体中で乳化剤の不存在下に65℃で6時間重合
して直径0.5μmの親水性ラテックス粒子を得ている。
この得られたラテックス粒子のエポキシ基を同例7に示
されたように加水分解し、次いで過ヨウ素酸ナトリウム
を加えて反応させ、アルデヒド基に変換した。次いで該
ラテックス粒子のアルデヒド基濃度に対して5倍当量,1
0倍当量,20倍当量とヒトIgG濃度を変化させpH=7.4のリ
ン酸緩衝液中で後述する本願発明実施例1と同様の操作
でヒトIgGを固定化したラテックス粒子と抗ヒトIgGウサ
ギ血清との抗原・抗体反応を行なうと、みかけの鋭敏性
は1日後×1280であったが、ヒトIgGを固定化していな
いラテックス粒子と抗ヒトIgGウサギ血清の希釈液を混
合すると非特異的凝集反応がおこるために正確な鋭敏性
を評価できなかった。また、分散安定性も1日後4,3ケ
月後2と極めて悪かった。さらに該ラテックス粒子にヒ
トIgGをpH=7.4のリン酸塩緩衝液(リン酸0.01モル/l,N
aCl0.15モル/l)中で固定化すると1日後、全て非特異
的凝集が発生したので、全く抗原・抗体反応の凝集反応
を行なえなかった。従って、特開昭57-135801号公報に
記載のスチレン−グリシジルメタクリレート共重合ラテ
ックス粒子に免疫活性物質を共有結合させる方法は、抗
原・抗体反応性が低いだけでなく、分散安定性が極めて
悪い。特にNaClなどの電解質を含む緩衝液中の安定性は
非常に悪い。このことは電解質を含んでいる体液成分
(尿,血清)の使用ができないということを示してい
る。
これに対して、本発明(実施例4)の15重量%グリシジ
ルメタクリレートを含むポリスチレンラテックス粒子に
ついてエポキシ基を加水分解して得た重合体粒子をpH=
7.4のリン酸緩衝液を用いて本発明実施例1と同様の抗
原・抗体反応を行なうと、鋭敏性は1日後×640,3ケ月
後×1280,迅速性は1日後100秒,3ケ月後80秒,及び分散
安定性は1日後及び3ケ月後共に保存中に全く非特異的
凝集は認められなかった。また該重合体粒子にヒトIgG
をpH=7.4のリン酸塩緩衝液(リン酸0.01モル/l,NaCl0.
15モル/l)中で固定化させても全く非特異的凝集反応が
発生しなかった。従って、本発明で使用する重合体粒子
は電解質を多量に含む緩衝液中に於いて安定であるか
ら、本発明の診断用試薬は、体液と混合時の非特異的凝
集を防止することができる。しかも、本発明の診断用試
薬は、抗原・抗体の反応性が大きいという特徴を有す
る。
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
実施例1〜4と比較例1〜6 (1) 重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水2700CCを加えて70℃に保った後に、窒素雰囲気板、攪
拌下に過硫酸カリウムを5.0ミリモル/l濃度になるよう
に添加した。次いで70℃に加温したグリシジルメタクリ
レートとスチレンの混合物を第1表に示す割合で添加し
て、70℃で第1表に示す如く第1段目の重合を行なっ
た。その後第2段目重合のスチレンを第1表に示す割合
で定量ポンプで逐次添加して所定時間70℃で攪拌下に重
合した。重合後、室温まで冷却してから、得られた重合
体粒子を濾紙(NO2)で濾別して大きな凝集体を除い
た。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後、
水蒸気蒸留を6時間行なうことによって重合体粒子上の
エポキシ基をジヒドロキシル基に変換した。この加熱条
件で全てのエポキシ基が加水分解してジヒドロキシル基
が生成していることが赤外吸収スペクトル及び塩酸付加
法によるエポキシ基の分析で確認された。次いで遠心分
離,蒸留水への再分散の操作を繰返した後に、イオン交
換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を
行なって重合体粒子を精製した。得られた重合体粒子の
粒子径を第1表に示す。
(2) ヒトIgGを固定化した重合体粒子の調製 (1) 重合体粒子の調製で得られた本発明の重合体粒
子を固型分濃度1%でグリシン緩衝液に分散した。本発
明に於いてグリシン緩衝液とはグリシン0.5モル及び食
塩0.05モルを水1に溶解し、次いで2規定水酸化ナト
リウム水溶液でpHを8.2に調製し、さらにアジ化ナトリ
ウムを1g添加したものである。
本発明に於いてヒトIgGは、ヒト血清を飽和硫安で塩析
し、さらに透析を行ない精製したものを用いた。
ヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し1mg/mlに調整す
る。次いで倍数希釈法によりヒトIgGをグリシン緩衝液
により希釈してヒトIgG希釈液を調製する。1%濃度の
重合体粒子分散液1容にヒトIgG希釈液1容を加え攪拌
し、室温下2時間放置する。次いでウシ血清アルブミン
を1%の濃度になるように添加し、4℃に保ち1夜放置
してヒトIgGを固定化した重合体粒子を得た。次いで遠
心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返すこ
とによりヒトIgGを固定化した重合体粒子を洗浄した。
さらに遠心分離した後、ヒトIgGを固定化した重合体粒
子をウシ血清アルブミンを0.1%の濃度で添加したグリ
シン緩衝液に再分散し固型分濃度を0.5%に調整し、4
℃に保ち保存した。
(3) 抗原・抗体反応 ヒトIgGをウサギに免疫して得た抗ヒトIgGウサギ全血清
を60℃,30分非動化処理を行なった。この血清を以下抗
ヒトIgGウサギ血清と呼ぶ。
抗ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で20倍に希釈し
たものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトIgGウサギ
血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒトIgGウサギ血清
希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうためにガラ
ス製10穴のホールグラスを用意し、グリシン緩衝液で希
釈した抗ヒトIgGウサギ血清を各ホールに0.04ml加え
る。次いでヒトIgGを固定化した重合体粒子のグリシン
緩衝液分散液を各ホールに0.04ml加える。この後直ちに
平沢製作所製テーハー式攪拌機によりホールグラスを1
分間に120回転の速度で水平回転し攪拌を行なう。抗原
・抗体反応により重合体粒子の凝集が認められるまでに
要する時間、すなわち凝集像出現時間及び所定時間攪拌
後の重合体粒子の凝集の有無から、ヒトIgGを固定化し
た重合体粒子の特性である迅速性及び鋭敏性を評価し
た。ホールグラスを用いた重合体粒子の凝集試験の結果
を図1に示す。図1は10分間の攪拌後の凝集状態を示
す。凝集が全く認められない場合(−)、凝集の有無が
判定しがたい場合(±)、明らかに凝集が認められる場
合、凝集の強い順に+++,++,+と判定した。図中
Cは抗原もしくは抗体を全く含まないことを示す。凝集
試験の結果、明らかに凝集の認められたホールに於ける
抗ヒトIgGウサギ血清希釈液の最高希釈倍数をもって、
重合体粒子の鋭敏性を評価した。一方、抗ヒトIgGウサ
ギ血清希釈液の希釈倍数が×640の希釈液を加えたホー
ルにつき凝集像が認められるまでの時間をもって迅速性
を評価した。
重合体粒子の特性としては、さらに重合体粒子の分散安
定性を評価した。すなわち、重合体粒子にヒトIgG希釈
液を加え室温で2時間放置した後の重合体粒子の分散状
態をもって重合体粒子のヒトIgG固定化時の分散安定性
を評価した。又ヒトIgG固定化後3ケ月経過した後の重
合体粒子の分散状態をもってヒトIgG固定化した重合体
粒子の保存中の分散安定性を評価した。
さらにまた、重合体粒子の特性として、電解質を含んだ
緩衝液中での重合体粒子の分散安定性を評価した。即
ち、重合体粒子をイオン交換水に1%濃度になるように
調製した後、NaCl濃度が0.10モル/l及び0.15モル/lのグ
リシン緩衝液1mlに40μl添加して充分に混合してから
室温で3日間静置して分散安定性を調べた。その結果を
第1表に示す。
尚、比較例として、(A)式で示される構造単位が本発
明の範囲外となる如く、第1表に示す割合でグリシジル
メタクリレートとスチレンの混合物を用いた以外、全て
上記実施例と同様の操作で調節した重合体粒子及びその
診断用試薬の特性を第1表に示す。また、本発明の
(A)式で示される構造単位を含まない重合体粒子とし
て、ダウ・ケミカル社製ポリスチレンラテックス粒子径
=0.497ミクロン,分散値=1.2%(比較例6)を用い
た。但し、このダウ・ケミカル社製のポリスチレンラテ
ックスは水蒸気蒸留を行なうと、著しく凝集粒子を発生
するために、水蒸気蒸留を行なわずに水洗いで精製した
ものを用いた。その結果を第1表に示す。
実施例5 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水2700CCを加えて75℃に保った後に、窒素雰囲気下、攪
拌下に過硫酸カリウム5ミリモル/l,チオ硫酸ナトリウ
ム5ミリモル/l,硫酸銅0.25ミリモル/l,及びα−メルカ
プトエタノール1.0CCを添加した。次いで75℃に加温し
たグリシジルアクリレート100ミリモル及びメチルメタ
クリレート200ミリモルの混合物を添加して75℃で30分
間攪拌下に重合した。その後、メチルメタクリレート2.
5モルを定量ポンプで逐次添加して、更に75℃で2時間
攪拌下に重合した。その後の操作は実施例1と同様の操
作を行なった。得られた重合体粒子の粒子径は0.197ミ
クロンであった。この重合体粒子を実施例1と同様の操
作でヒトIgGを吸着して固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清
との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は1
日後×640,3ケ月後×640,迅速性は1日後90秒,3ケ月後7
0秒,また分散安定性は1日後及び3ケ月後共に保存中
に全く非特異的凝集が認められなかった。さらに実施例
1と同様のNaCl濃度が0.10モル/l及び0.15モル/lのグリ
シン緩衝液中での分散安定性は、いずれも0であり、非
特異的凝集は認められなかった。
実施例6 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水2700CCを加えて70℃に保った後に、窒素雰囲気下、攪
拌下に過硫酸カリウムを20ミリモル/l濃度になるように
添加した。次いで70℃に加温したグリシジルメタクリレ
ート300ミリモルとクロルメチルスチレン200ミリモルの
混合物を添加して70℃で1.5時間攪拌下に重合した。そ
の後クロルメチルスチレン2.5モルを定量ポンプで逐次
添加して、更に70℃で30時間攪拌下に重合した。その後
の操作は実施例1と同様の操作を行なった。得られた重
合体粒子を実施例1と同様の操作でヒトIgGを吸着して
固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・抗体反応を
行なった。その結果、鋭敏性は1日後×320,3ケ月後×6
40,迅速性は3ケ月後60秒,また分散安定性は1日後及
び3ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認めら
れなかった。さらに、実施例1と同様のNaCl濃度が0.10
モル/l及び0.15モル/lのグリシン緩衝液中での分散安定
性は、いずれも0であり、非特異的凝集は認められなか
った。
実施例7 攪拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換した後
に、蒸留水2700CCを加えて65℃に保った後に窒素雰囲気
板に過硫酸カリウム10ミリモル/l濃度になるように添加
した。次いで65℃に加温したグリシジルメタクリレート
90ミリモルと塩化ビニルモノマー300ミリモルの混合物
を窒素圧でオートクレーブに圧入して65℃に攪拌下に30
分間重合した。その後塩化ビニルモノマー2.3モルを逐
次添加して65℃で4時間攪拌下に重合した。次いで残存
する未反応の塩化ビニルモノマーをパージしてから、得
られた重合体粒子を濾紙(NO2)で濾別して大きな凝集
体を除いた。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除
いた後に、pH=3の酸性水溶液中で重合体粒子上のエポ
キシ基を加水分解してジヒドロキシル基に変換した。次
いでセロフアン膜で1カ月透析を行なった後に、イオン
交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄
を行なって重合体粒子を精製した。かくして得られた重
合体粒子を実施例1と同様の操作でヒトIgGを吸着して
固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・抗体反応を
行なった。その結果、鋭敏性は1日後×1280,3ケ月後×
2560,迅速性は1日後40秒,3ケ後20秒,また分散安定性
は1日後1本,及び3ケ月後2本の非特異的凝集反応が
認められた。さらに実施例1と同様のNaCl濃度が0.10モ
ル/l及び0.15モル/lのグリシン緩衝液中での分散安定性
は、いずれも0であり、非特異的凝集は認められなかっ
た。
実施例8 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水2700CCを加えて70℃に保った後に窒素雰囲気下に過硫
酸カリウム10ミリモル/l濃度になるように添加した。次
いで70℃に加温した2,3−ジオキシメタクリレート80ミ
リモルとスチレン420ミリモルの混合物を添加して70℃
で1時間攪拌下に重合した。次いでスチレン2.0モルを
定量ポンプで逐次添加して70℃で24時間攪拌下に重合し
た。その後室温まで放冷してから、得られた重合体粒子
を濾紙(NO2)で濾別して凝集体を除いた。更に粗い重
合体粒子を遠心分離で除いた後に、イオン交換樹脂で脱
イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重
合体粒子を精製した。この重合体粒子を実施例1と同様
の操作でヒトIgGを吸着して固定化し、抗ヒトIgGウサギ
血清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性
は1日後×1280,3ケ月後×2560,迅速性は1日後60秒,3
ケ月後40秒,また分散安定性は1日後及び3ケ月後共に
保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかった。さ
らに実施例1と同様のNaCl濃度が0.10モル/l及び0.15モ
ル/lのグリシン緩衝液中での分散安定性は、いずれも0
であり、非特異的凝集は認められなかった。
実施例9 ヒトIgG飽和吸着量の測定 実施例1〜8及び比較例1〜6で得られた重合体粒子を
精秤してグリシン緩衝液に1%濃度になるように調製し
た重合体粒子懸濁液1.50gと塩析ヒトIgGを2mg/mlになる
ように調製したグリシン緩衝液1.5mlをよく混合した
後、4℃で一夜放置した。次いで15000rpmで20分間遠心
分離を行ない、上澄液を採取した。沈殿した重合体粒子
を更にグリシン緩衝液3CCを加えて再分散させた。同様
な操作を2回繰返した後、採取した全ての上澄液を集
め、更に15000rpmで20分間遠心分離を行ない、上澄液中
のヒトIgG量を波長280nmの吸光度を測定することによっ
て求めた。求められたヒトIgG量の残りを重合体粒子に
吸着されたヒトIgG飽和吸着量とした。また沈殿した重
合体粒子を充分に乾燥した後に、精秤することにより、
重合体粒子に吸着されたヒトIgG飽和吸着量の精度をチ
エックした。求められたヒトIgG飽和吸着量を重合体粒
子の粒子径から計算した重合体粒子表面積(m2単位)で
表示した。
実施例10と比較例7〜8 熱変性ヒトIgGの固定化 pH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例2で用いた重
合体粒子を0.5%になるよう分散させた。次いで60℃で1
0分間熱処理したヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し
1mg/mlに調整した。0.5%濃度の重合体粒子分散液1容
に熱変性したヒトIgG希釈液1容を加え、攪拌し、室温
下2時間放置した。その後ウシ血清アルブミンを1%の
濃度になるように添加し、4℃に保ち1夜放置して熱変
性ヒトIgGを固定化した重合体を得た。次いで遠心分
離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰返して洗浄し
た後、熱変性ヒトIgGを固定化した重合体粒子をウシ血
清アルブミンを0.1%の濃度で添加したグリシン緩衝液
に再分散し、固型分濃度を0.5%に調整した。
リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で20倍に希釈したものを原液として、実施
例1と同様にしてガラス製10穴のホールグラスにグリシ
ン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各ホー
ルに0.04mlを加え、次いで熱変性ヒトIgGを固定化した
重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈した分散液を各ホー
ルに0.04ml加えて実施例1と同様の操作で鋭敏性,迅速
性及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は1日後
×1280,3ケ月後×1280,迅速性は1日後65秒,3ケ月後50
秒,及び分散安定性は1日後及び3ケ月後共に保存中に
全く非特異的凝集反応が認められなかった。
尚、比較例7として比較例1で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭敏性は1
日後×1280,3ケ月後は×160,迅速性は1日後90秒,3ケ月
後は非特異凝集のため評価できなかった。また、分散安
定性は1日後6本,3ケ月後は3本であった。
さらにまた、比較例8として比較例3で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭
敏性は1日後×20以下,3ケ月後は×20以下であり、迅速
性は評価できなかった。また分散安定性は1日後,3ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかっ
た。
実施例11と比較例9 アルフア−フエトプロテインの抗体の固定化 pH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例2で用意した
重合体粒子を1.0%になるように分散させた。次いで家
兎の産生したアルフア−フエトプロテイン(以下α−FP
と略す)の抗体をアフイニテイ−クロマトグラフイーに
より精製して得た精製α−FP抗体を、グリシン緩衝液で
500μg/mlの濃度に希釈した。重合体粒子分散液1容と
精製α−FP抗体の希釈液1容とを加え、攪拌し、室温下
2時間放置した。その後ウシ血清アルブミンを1%の濃
度になるように添加し、4℃に保ち1夜放置してα−FP
抗体を固定化した重合体粒子を得た。次いで遠心分離、
グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返して洗浄した
後、α−FP抗体を固定化した重合体粒子をウシ血清アル
ブミンを0.1%の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分
散し、固型分濃度を0.5%に調整した。
アルフア−フエトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα−FPの濃度が1000μg/mlであ
るものを原液とし、グリシン緩衝液で10倍ごとの希釈系
列を調整した。実施例1と同様にして、ガラス製10穴の
ホールグラスにグリシン緩衝液で希釈したα−FPを各ホ
ールに0.04ml加え、次いでα−FP抗体を固定化した重合
体粒子の分散液を各ホールに0.04ml加えて、実施例1と
同様の操作で鋭敏製,分散安定性を調べた。その結果、
鋭敏製は1日後10μg/ml,3ケ月後10μg/mlであった。分
散安定性は1日後及び3ケ月後共に保存中に全く非特異
的凝集反応が認められなかった。
尚、比較例9として比較例1で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作で試験すると、鋭敏性は1日
後10μg/ml,3ケ月後は非特異的凝集反応の結果、評価で
きなかった。
【図面の簡単な説明】
第1図は、実施例2で得られた本発明の診断用試薬の凝
集状態を示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】一般式、 (但し、R1は水素原子又はアルキル基で、R2は疎水基で
    ある。)で示される構造単位を与える単量体(A)と 一般式、 (但し、Rは水素原子又はアルキル基である)で示され
    る構造単位を与える単量体(B)とを第1段目重合し、
    続いて単量体(A)を添加し第2段目重合して得た、該
    単量体(B)の構造単位が3.0モル%をこえて20モル%
    以下の範囲で含まれる重合体粒子の表面に、免疫活性物
    質を吸着することを特徴とする免疫学的凝集反応性を有
    する診断用試薬の製造方法。
  2. 【請求項2】疎水基がアリール基、ハロゲン化アリール
    基、アルキルエステル基又はハロゲン原子である特許請
    求の範囲(1)記載の診断用試薬の製造方法。
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