JPH0613567B2 - 反応性重合体粒子及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、水媒体中で分散安定性のよい反応性重合体粒
子を提供するものである。特に酵素、細菌、ウイルス、
毒素、薬物、及び免疫活性物質などを固定化して診断用
試薬として好適に使用しうる反応性重合体粒子及びその
製造方法を提供するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点） 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応、補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてい
る。そして、凝集反応は、遊離細胞や細菌膜表面に局在
する抗原を検出する反応と共に、抗原精製技術の進歩に
より特異性の高い抗血清が得られることによって、特異
性の高い抗体を血球粒子、ベントナイト粒子、カオリン
粒子、ラテックス粒子などの粒子担体に固定させてお
き、対応する抗原を凝集反応によって検査するなど、臨
床検査における応用範囲が著しく拡大している。

免疫学的凝集反応用としての担体は種々のものが公知
で、該担体を使用した種々の診断用試薬が知られてい
る。これらを大別すると免疫活性物質を物理的に吸着し
た診断用試薬と免疫活性物質を共有結合で結合させた診
断用試薬になる。これらの試薬にはそれぞれ一長一短が
あり現在なお完全に満足出来る診断用試薬は存在しな
い。

診断用試薬の担体としては、一般に重合体粒子が用いら
れており、診断用試薬に適した重合体粒子の開発が望ま
れている。

かくして、免疫活性物質を固定化した担体の非特異的凝
集反応を抑制することと、保存安定性を高めるために数
多くの方法が開発されている。これらの方法は、免疫活
性物質を固定化した担体に保護コロイドを添加する方法
と、担体を親水性重合体粒子にする方法に大別される。
前者の方法については、例えば、免疫活性物質を担体に
固定化した後に、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの親
水性蛋白質を添加する方法が一般的によく採用されてい
るが、検定混合物中で非特異的な蛋白質−蛋白質相互作
用に起因する妨害作用が指摘されている（特開昭５６−
１５８９４７号公報）。また後者の方法について、例え
ば、特開昭５６−３０４０５号公報、特開昭５６−１４
１５５９号公報には繰返し単位が2,3−ジオキシプロピ
ルメタクリレート単位から成る親水性架橋共重合体粒子
を用いる方法が、また特開昭５７−１３５８０１号公報
にはスチレン−グリシジルメタクリレート共重合体粒子
を合成し、エポキシ基を加水分解してジヒドロキシル基
に変換して親水性重合体粒子を得る方法が提案されてい
る。これらの方法は極めて秀れた方法ある。しかし、親
水性基であるジヒドロキシル基濃度を増加させると重合
体粒子の安定性を向上させることが可能であるが、免疫
活性物質を共有結合させる活性点濃度が減少するために
免疫活性物質の固定化量が減少するとか、あるいは免疫
活性物質を吸着固定化するに有効な疎水性表面が減少す
るために、免疫学的凝集反応の鋭敏性が著しく低下する
欠点がある。このように免疫活性物質の固定化担体の免
疫学的凝集反応性と物理的安定性を同時に満足させるこ
とは従来極めて困難であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、免疫学的凝集反応の鋭敏性に優れると共
に、非特異的凝集反応が低く、かつ保存安定性の優れた
免疫活性物質の固定化担体となる重合体粒子について鋭
意研究を重ねて来た結果、グリシジル（メタ）アクリレ
ート単量体単位を有する重合体粒子にアミノ基及び／又
はイミノ基とエポキシ基とがさらに導入され、アミノ基
及び／又はイミノ基に由来する窒素原子濃度に対して特
定量のエポキシ基を有する反応性重合体粒子を用いるこ
とにより、前記要望を満す優れた効果をもたらすことを
見い出した。

即ち、本発明はグリシジル（メタ）アクリレート単量体
単位を有する重合体粒子にアミノ基及び／又はイミノ基
とさらにエポキシ基とが導入されてなる反応性重合体粒
子であって、該反応性重合体粒子の表面に於ける窒素原
子の濃度をＣ_N（μmole／ｇ−反応性重合体粒子）、エ
ポキシ基の濃度をＣ_EPX（μmole／ｇ−反応性重合体粒
子）とするとき、次式 Ｃ_EPX≧0.6×Ｃ_N を満たす濃度のエポキシ基を有することを特徴とする反
応性重合体粒子である。

本発明に於ける重合体粒子は、次式 （但し、Ｒは水素原子又はメチル基である。）で示され
るグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有す
る。本発明の重合体粒子は、上記したグリシジル（メ
タ）アクリレート単量体単位のみを有するものであって
もよく、該グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位
と他の単量体単位とを有するものであっても良い。上記
した他の単量体単位としては、グリシジル（メタ）アク
リレートと共重合可能なモノマーで示される単量体単位
であればどのようなものでもよい。就中、本発明に於い
て好ましい他の単量体単位は、次式 （但し、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ₂はハ
ロゲン原子、置換若しくは非置換のフェニル基、アルコ
キシカルボニル基又はアシルオキシ基である。） で示される疎水性ビニル系単量体単位である。ここで、
フェニル基の置換基としては特に限定されないが、ハロ
ゲン原子、ハロアルキル基、アルキル基等を挙げること
ができる。このような疎水性ビニル系単量体単位の中で
もＲ₂が置換若しくは非置換のフェニル基、又は塩素原
子である疎水性ビニル系単量単位が好ましい。また、他
の単量体単位としては次式 （但し、Ｒ₃は水素原子又はカルボキシル基であり、Ｒ₄
は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ₅はカルボキシル
基、スルホニルフェニル基、ヒドロキシアルコキシカル
ボニル基、又は で示される基（但し、Ｒ′はアルキレン基、ｎは１〜２
０の整数である。）である。） で示される親水性ビニル系単量体単位を採用することが
できる。

上記したグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位の
重合体粒子に占める割合は特に限定されないが、得られ
る反応性重合体粒子に免疫活性物質を吸着させて診断用
試薬として使用する場合は、グリシジル（メタ）アクリ
レート単量体単位が0.05〜２０モル％、さらに0.1〜１
５モル％であることが好ましい。また、免疫活性物質を
共有結合させることによって診断用試薬として使用する
場合は２０〜１００モル％、さらに３０〜９９モル％で
あることが好ましい。

上記したグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位以
外の他の単量体としては、前記した疎水性ビニル系単量
体単位及び親水性ビニル系単量体単位を用いることが好
ましいが、親水性ビニル系単量単位の割合が多くなり過
ぎると反応性重合体粒子の分散安定性に不都合を生じる
ことがある。従って、本発明の反応性重合体粒子を吸着
による診断用試薬として用いる場合は、親水性ビニル系
単量体はグリシジル（メタ）アクリレート単量体に対し
て０〜２０モル％の範囲で、また、共有結合による診断
用試薬として用いる場合は、グリシジル（メタ）アクリ
レート単量体に対して０〜５０モル％の範囲で用いるこ
とが好ましい。

以上のような組成とすることによって、一般に、表面の
エポキシ基が0.05〜４００μmole／ｇ−重合体粒子、よ
り好ましくは0.1〜２００μmole／ｇ−重合体粒子の重
合体粒子を得ることができる。

以上に述べた重合体粒子の製造方法は、公知の方法が何
ら制限なく使用し得る。即ち、グリシジル（メタ）アク
リレートを単独で重合することによって、或いは、グリ
シジル（メタ）アクリレートは共重合可能なビニル系単
量体とを共重合させることによって、上記の重合体粒子
を得ることができる。グリシジル（メタ）アクリレート
と共重合させるビニル系単量体の代表的なものを挙げれ
ば、スチレン、ビニルトルエン、クロルメチルスチレ
ン、クロルスチレン、塩化ビニル、臭化ビニル、メチル
（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、
プロピル（メタ）アクリレート、酢酸ビニル等の疎水性
ビニル系単量体、また、アクリル酸、メタクリル酸、マ
レイン酸、スチレンスルホン酸、２−ヒドロキシエチル
メタアクリレート、グリセロールモノメタクリレート、
ポリエチレングリコールモノメタクリレート等の親水性
ビニル系単量体などが例示される。これらのビニル系単
量体は２種以上を混合して用いることもできる。さらに
また、必要に応じて、ジビニルベンゼン、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタ
クリレート、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル等
の架橋性単量体も好適に使用できる。

これらの単量体を用いて重合体粒子を得るための重合方
法は特に限定されず、公知の方法が好適に採用される。
例えば、アニオン性界面活性剤、非イオン系界面活性剤
の存在下に水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて乳
化重合する方法、界面活性剤を使わずに水媒体中で水溶
性ラジカル開始剤を用いて不均一重合する方法、部分鹸
化ポリビニルアルコール。ポリビニルピロリドン等の保
護コロイド存在下に懸濁重合する方法、ビニル系単量体
は溶解するが重合体は溶解しない有機溶媒中で沈澱重合
する方法等が採用される。

本発明で使用する反応性重合体粒子の平均粒子径は特に
限定されないが、凝集反応による診断用試薬に用いる場
合には、その鋭敏性や保存安定性を良好にするために一
般には0.05乃至１０ミクロンの範囲内にあることが好ま
しい。さらにまた、該反応性重合体粒子は、粒子径の分
散値の小さい方が、再現性が良いために望ましい。従っ
て、このような粒子径となるような重合体粒子を得るこ
とが好ましい。

本発明の反応性重合体粒子は、上記の重合体粒子にアミ
ノ基及び／又はイミノ基が導入され、さらにエポキシ基
が導入されたものであり、反応性重合体粒子の表面に於
ける窒素原子の濃度をＣ_N（μmole／ｇ−反応性重合体
粒子）、エポキシ基の濃度をＣ_EPX（μmole／ｇ−反応
性重合体粒子）とするとき、下記式〔Ａ〕 Ｃ_EPX≧0.6×Ｃ_N 〔Ａ〕 好ましくは、下記式〔Ｂ〕 Ｃ_EPX≧0.8×Ｃ_N 〔Ｂ〕 さらに好ましくは、下記式〔Ｃ〕 Ｃ_EPX≧1.0×Ｃ_N 〔Ｃ〕 を満たす濃度のエポキシ基を有する。アミノ基及び／又
はイミノ基の導入は、後述するように分子中にアミノ基
及び／又はイミノ基を有し、且つ該アミノ基及び／又は
イミノ基の窒素原子に結合する水素原子の数が２個以上
である含窒素化合物とグリシジル（メタ）アクリレート
単量体単位を有する重合体粒子とを反応させることによ
って行なう。即ち、含窒素化合物のアミノ基及び／又は
イミノ基とグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位
のエポキシ基との反応を利用する。この反応は、下記
〔Ｉ〕又は〔II〕のように進行しているものと推測でき
る。

このようにして導入されたアミノ基及び／又はイミノ基
は、複数個のエポキシ基を有するエポキシ化合物のエポ
キシ基との反応に利用されて、エポキシ基の導入が行な
われる。この場合、先にアミノ基及び／又はイミノ基の
導入を行なうために用いられた含窒素化合物のアミノ基
及び／又はイミノ基の窒素原子に結合する水素原子の数
が２個である場合には、エポキシ基を分子中に３個以上
有するエポキシ化合物を用いる。また、アミノ基及び／
又はイミノ基の窒素原子に結合する水素原子の数が３個
以上である含窒素化合物を用いた場合には、分子中にエ
ポキシ基を２個以上有するエポキシ化合物が用いられ
る。この反応は次の〔III〕又は〔IV〕のように進行し
ているものと推測される。

このようにアミノ基及び／又はイミノ基とエポキシ基と
を導入することにより、当初の重合体粒子のグリシジル
（メタ）アクリレート単量体単位に基づくエポキシ基の
濃度よりも高い濃度のエポキシ基を反応性重合体粒子に
導入することができる。即ち、反応性重合体粒子の表面
に於けるエポキシ基の濃度を前述のとおりＣ_EPX（μmol
e／ｇ−反応性重合体粒子）とし、アミノ基、イミノ
基、エポキシ基の導入前の重合体粒子のグリシジル（メ
タ）アクリレート単量体単位に基つくエポキシ基の濃度
をＧ（μmole／ｇ−反応性重合体粒子）とすると、重合
体粒子中のグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位
が２０〜１００モル％の重合体粒子を用いた場合には Ｃ_EPX≧1.1×Ｇ 好ましくは Ｃ_EPX≧1.5×Ｇ を満たすエポキシ基の濃度を有する反応性重合体粒子と
することができ、重合体粒子中のグリシジル（メタ）ア
クリレート単量体単位が0.05〜２０モル％の重合体粒子
を用いた場合には、次式 Ｃ_EPX≧1.5×Ｇ 好ましくは Ｃ_EPX≧2.0×Ｇ を満たす反応性重合体粒子とすることも可能である。

しかも、アミノ基及び／又はイミノ基とエポキシ基の導
入により親水性である水酸基が生成し、このために分散
安定性の優れた反応性重合体粒子が得られる。

本発明の反応性重合体粒子のエポキシ基の濃度が、前記
式〔Ａ〕で示される値未満の場合には、アミノ基及び／
又はイミノ基の導入量に応じてエポキシ基の導入量が増
加していないことを示す。即ち、アミノ基及び／又はイ
ミノ基とエポキシ基の導入前の重合体粒子のグリシジル
（メタ）アクリレート単量体単位に基づくエポキシ基の
濃度Ｇに比べて、アミノ基及び／又はイミノ基とエポキ
シ基とを導入後の反応性重合体粒子のエポキシ基の濃度
Ｃ_EPXの方が小さいことになる。このような、反応性重
合体粒子に免疫活性物質を吸着させて診断用試薬として
も、エポキシ基濃度が当初の重合体粒子のそれよりも減
少し、その開環によって生成する水酸基濃度が減少する
ために、診断用試薬の安定性が低下する。また、上記の
ような反応性重合体粒子に免疫活性物質を共有結合させ
て診断用試薬としても、免疫活性物質の共有結合に用い
るエポキシ基濃度が当初の重合体粒子のそれよりも減少
することによって、共有結合で固定される免疫活性物質
の量が減少し、このため診断用試薬の鋭敏性が低下す
る。

前記した特定量のエポキシ基の濃度を有する反応性重合
体粒子の製造方法としては、次の(イ)及び(ロ)の方法が採
用される。

(イ)グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有す
る重合体粒子と、分子中にアミノ基及び／又はイミノ基
を有し、且つ該アミノ基及び／又はイミノ基の窒素原子
に結合する水素原子の数が２個である含窒素化合物とを
反応させ、次いで、得られた重合体粒子と分子中にエポ
キシ基を３個以上有するエポキシ化合物とを反応させる
ことを特徴とする反応性重合体粒子の製造方法。

(ロ)グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有す
る重合体粒子と、分子中にアミノ基及び／又はイミノ基
を有し、且つ該アミノ基及び／又はイミノ基の窒素原子
に結合する水素原子の数が３個以上である含窒素化合物
とを反応させ、次いで、得られた重合体粒子と分子中に
エポキシ基を２個以上有するエポキシ化合物とを反応さ
せることを特徴とする反応性重合体粒子の製造方法。

本発明に於いてアミノ基及び／又はイミノ基を有し、該
アミノ基及び／又はイミノ基の窒素原子に結合する水素
原子の数が２個である含窒素化合物としては公知のもの
が特に制限されず採用される。例えば、N,N′−ジメチ
ルエチレンジアミン、N,N′−エチルエチレンジアミ
ン、1,3−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミノ〕プロパン、N,N′−ジメチル−1,6−ジアミノヘキ
サン、N,N′−ジエチル−1,6−ジアミノヘキサン、N,
N′−ジアセチルエチレンジアミン、等のイミノ基を有
するイミノ化合物を挙げることができる。

さらにまた、次式に示す如く１当量のジアミノ化合物と
２当量のモノエポキシ化合物の付加反応生成物が好適に
採用される。

例えば、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノ
ブタン、3,3′−ジアミノ−２−プロパノール、ジエチ
レングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、
等のジアミノ化合物１当量とエチレンオキシド、プロピ
レンオキシド、1,2−エポキシブタン、グリシドール、
メチルグリシジルエーテル、グリセロールグリシジルエ
ーテル、等のモノエポキシ化合物２当量の付加反応生成
物が好適に採用される。

本発明に於いてアミノ基及び／又はイミノ基を有し、該
アミノ基及び／又はイミノ基の窒素原子に結合する水素
原子の数が３以上である含窒素化合物としては、公知の
ものが特に制限されず採用される。例えば、ジアミノエ
タン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、3,3′−ジ
アミノジプロピルアミン、3,3′,3″−トリアミノトリ
プロピルアミン、Ｎ−（β−ヒドロキシプロピル）エチ
レンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテ
トラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレン
ヘキサミン、ヘキサエチレンペンタミン、ポリオキシエ
チレンジアミン、等の多価アミノ化合物を挙げることが
できる。

本発明に於いてエポキシ基を２個以上有するエポキシ化
合物としては、公知のエポキシ化合物が採用される、例
えば1,3−ブタジエンジエポキシド、1,4−ブタンジグリ
シジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエー
テル、セカンダリーブチルフェノールジグリシジルエー
テル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、グ
リセロールジグリシジルエーテル、1,6−ヘキサンジオ
ールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジ
グリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエー
テル、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテ
ル、ペンタエリスリトールトリグリシジルエーテル、ペ
ンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル、グルコ
ーストリグリシジルエーテル、グルコーステトラグリシ
ジルエーテル、グルコシドトリグリシジルエーテル、グ
リシジル（メタ）アクリレート等の多価エポキシ化合物
を挙げることができる。

本発明に於いて、グリシジル（メタ）アクリレート単量
体単位を有する重合体粒子と、アミノ基及び／又はイミ
ノ基を有する含窒素化合物との反応は、重合体粒子と重
合体粒子が有する特定量のエポキシ基と反応させるべき
含窒素化合物とを水媒体中、エポキシ基に不活性な緩衝
液中、あるいはエポキシ基と反応性の極めて欠しくかつ
重合体粒子を溶解させないメタノール、エタノール、イ
ソプロパノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、
等の水と親和性の大きい有機溶媒中、あるいはこれらの
混合媒体中で混合して反応すればよい。特に水媒体中で
の反応が好ましく採用される。また、反応温度は重合体
粒子の分子構造やエポキシ基濃度、含窒素化合物の分子
構造、及び反応媒体によって異なるが、一般的には４℃
乃至１００℃、好ましくは４℃乃至６０℃の範囲が好適
に採用される。反応媒体に有機溶媒を用いる場合には重
合体粒子を溶解させない反応温度を選ぶことが重要であ
る。さらにまた含窒素化合物の濃度は重合体粒子の分子
構造、エポキシ基濃度、含窒素化合物の分子構造、及び
反応条件によって異なるが、重合体粒子のエポキシ基濃
度に対して２乃至500モル倍となるべく選べば良い。さ
らにまた、重合体粒子と含窒素化合物の混合方法は特に
限定的でない。一般的には、重合体粒子の懸濁媒体中へ
含窒素化合物の溶液を一括して添加する方法もしくは滴
々添加する方法、あるいは含窒素化合物の溶液中へ重合
体粒子の懸濁液を一括もしくは滴々添加する方法が好ま
しく採用される。

以上の方法によってアミノ基及び／又はイミノ基が導入
された重合体粒子とエポキシ基を複数個有するエポキシ
化合物の反応は、重合体粒子のアミノ基及び／又はイミ
ノ基と反応させるべきエポキシ化合物を水媒体中、エポ
キシ基に不活性な緩衝液中、あるいはエポキシ基と反応
性の極めて欠しくかつ重合体粒子を溶解させないメタノ
ール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸
メチル、酢酸エチル、等の水と親和性の大きい有機溶媒
中、あるいはこれらの混合媒体中で混合して反応すれば
よい。特に水媒体中での反応が好ましく採用される。ま
た、反応温度は重合体粒子の分子構造やアミノ基及び／
又はイミノ基濃度、含窒素化合物の分子構造、及び反応
媒体によって異なるが、一般的には４℃乃至１００℃、
好ましくは４℃乃至６０℃の範囲が好適に採用される。
反応媒体に有機溶媒を用いる場合には重合体粒子を溶解
させない反応温度を選ぶことが重要である。さらにまた
エポキシ化合物の濃度は重合体粒子の分子構造、アミノ
基及び／又はイミノ基濃度、エポキシ化合物の分子構
造、及び反応条件によって異なるが、重合体粒子の粒子
表面のアミノ基及び／又はイミノ基濃度に対して１０乃
至５００モル倍の範囲が好適に採用される。さらにまた
反応時間は一概に限定できないが、一般には１０分乃至
１００時間が好ましく、更には３０分乃至５０時間がよ
り好ましく採用される。

本発明に於ける反応性重合体粒子の有するエポキシ基
は、反応性重合体粒子に免疫活性物質を吸着して診断用
試薬とする場合にはその大部分を、また、免疫活性物質
を共有結合により結合して診断用試薬とする場合には免
疫活性物質の共有結合に使用した残りの大部分を以下の
方法によって親水基に変換することができる。

以下の方法により反応性重合体粒子のエポキシ基を親水
基に変換することにより、診断用試薬の免疫学的凝集反
応の鋭敏性が優れると共に、非特異的凝集反応が低く、
かつ保存安定性に優れる特徴がある。

(1)反応性重合体粒子を加熱加水分解するか、もしくは
酸性水溶液中で加水分解することによりエポキシ基をジ
ヒドロキシル基に変換する。

(2)２−メルカプトエタノール、２−メルカプトプロパ
ノール、３−メルカプト−1,2−プロパンジオール、メ
ルカプトペンタエリスリトール等のメルカプトアルカノ
ール類と反応することにより、エポキシ基をヒドロキシ
ル基に変換する。

(3)エタノールアミン、プロパノールアミン、ジエタノ
ールアミン、２−アミノ−２−エチル−1,3−プロパン
ジオール、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン等
のヒドロキシアミン類と反応することにより、エポキシ
基をヒドロキシル基に変換する。

(4)チオグリコール酸、チオプロピオン酸、等のメルカ
プトカルボン酸類と反応することにより、エポキシ基を
カルボキシル基に変換する。

(5)グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
グリシン、等のカルボキシル化アミン類と反応すること
により、エポキシ基をカルボキシル基に変換する。

(1)〜(5)の反応条件は本発明で用いる重合体粒子に含窒
素化合物を反応させる条件に準じて行なえばよい。さら
にまた、本発明で得られた反応性重合体粒子に上述の
(1)〜(5)の親水化反応を行なう前に、前記(イ)及び(ロ)に
示した方法により含窒素化合物を反応させ次いでエポキ
シ化合物を反応させる方法を複数回繰返し行なうことも
可能である。

このようにして得られた反応性重合体粒子のエポキシ基
の濃度は、前記した〔Ａ〕式を満足することが必要であ
るが、さらに、0.1〜1000μmole／ｇ−反応性重合体粒
子、より好ましくは0.2〜500μmole／ｇ−反応性重合体
粒子であることが好ましい。

本発明により得られた反応性重合体粒子は、水媒体中で
の疎水性有機化合物の吸着剤、生体内での各種細胞、組
織による貧食作用の観察用粒子、及び酵素、蛋白質ある
いは免疫活性物質の固定化用粒子等に応用でき、特に免
疫活性物質を吸着法もしくは共有結合法で固定化した診
断用試薬は免疫学的凝集反応性が大きいだけでなく、分
散安定性と保存安定性に優れる特徴がある。

以下に、本発明で得られた反応性重合体粒子を診断用試
薬として用いた場合について説明する。

本発明で得られた反応性重合体粒子に吸着法もしくは共
有結合法によって固定化する免疫活性物質としては、特
に限定的でなく公知のものが使用出来る。代表的なもの
を例示すれば、例えば、変性ガンマグロブリン、抗核因
子、ヒトアルブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグ
ロブリンＧ（IgG）、抗ヒトIgG抗体、イムノグロブリン
Ａ（IgA）、抗ヒトIgA抗体、イムノグロブリンＭ（Ig
M）、抗ヒトIgM抗体、ストレプトリジンＯ、ストレプト
キナーゼ、ヒアルロンダーゼ、抗ストレプトリジンＯ抗
体、Ｃ−反応性蛋白質、抗Ｃ−反応性蛋白抗体、アルフ
ァーフェトプロテイン（AFP）、抗AFP抗体、癌胎児性抗
原（CEA）、抗CEA抗体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（HC
G）、抗HCG抗体、抗エストロゲン抗体、抗インシュリン
抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（HB_s）、抗HB_s、梅毒トレポネ
マ抗原、風疹抗原、インフルエンザ抗原、補体成分Ｃ₁
ｑ、抗Ｃ₁ｑ抗体、抗Ｃ₃ｑ抗体、等の公知の免疫活性物
質をあげることができる。

本発明で得られた反応性重合体粒子に固定化される該免
疫活性物質の量は、各検査項目に適している割合で反応
性重合体粒子に固定化させればよく、一概に限定されな
い。一般には、該免疫活性物質の量が多い程、診断用試
薬の鋭敏性が上がるため、鋭敏性を要求する場合には、
前記の反応性重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を
吸着又は共有結合させることが好ましい。

本発明により得られた反応性重合体粒子は免疫活性物質
の固定化能力と親水性のバランスが極めて良く調節され
ているので、抗原又は抗体と反応性重合体粒子を緩衝液
又は生理食塩水などの水媒体中で混合し、抗原又は抗体
が化学的に変化しないように、そしてそれらの免疫学的
性質を保持させるように、非常に温和な条件下に抗原又
は抗体を反応性重合体粒子表面に固定化させることがで
きるだけでなく、該媒体中で極めて安定性が高い特徴が
ある。反応性重合粒子表面に固定化された免疫活性物質
の量は、重合体粒子の蛋白結合部位を飽和又はブロック
されるように選ぶことが好ましいが、残存する蛋白結合
部位を免疫学的に不活性な適当な物質でブロック又は不
活性化さることができる。

（効果及び作用） 本発明の反応性重合体粒子を用いた診断用試薬は、免疫
学的凝集反応の鋭敏性が大きいだけでなく、分散安定性
や保存安定性がすぐれるという特徴がある。その理由は
必ずしも明らかではないが、本発明者等は次のように推
測している。本発明の反応性重合体粒子は免疫活性物質
を共有結合法で固定化するエポキシ基等の官能基の数或
いは免疫活性物質を吸着する表面のエリアの広さと、分
散安定性と保存安定性に寄与する水酸基等の親水基の数
とが独立函数となっており、そのどちらも大きくするこ
とができるという特徴を有する。この事実は診断用試薬
の合成上極めて重要な因子である。免疫活性物質を固定
化する官能基濃度或いは表面のエリアの広さが多ければ
多い程、診断用試薬の鋭敏性は向上するが、重合体粒子
の分散安定性と保存安定性が低下する欠点がある。一
方、重合体粒子の親水基濃度が多ければ多い程診断用試
薬の分散安定性と保存安定性が増加するが、鋭敏性が著
しく低下する欠点が生じる。しかしながら、本発明の反
応性重合体粒子は、これらの矛盾を解決し、鋭敏性及び
分散安定性の共に優れたものである。従って、本発明の
反応性重合体粒子は、新規な診断用試薬の開発に於いて
極めて重要な位置を占めるものである。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

尚、実施例及び比較例に於ける窒素原子及びエポキシ基
の定量は以下の方法により行なった。

(1)窒素原子の定量 反応性重合体粒子を乾燥後、三菱化成（株）製の微量窒
素分析装置（モデルTN-02型）を用いて窒素原子の濃度
（Ｃ_N）を測定した。

(2)エポキシ基濃度の定量 重合体粒子及び反応性重合体粒子を１重量％濃度で蒸留
水に分散した懸濁液１容とε−アミノカプロン酸を0.5
Ｍ濃度に溶解した水溶液１容を混合し、pH＝８に調製し
た後、６０℃で２４時間攪拌下に反応した。反応後室温
で１週間蒸留水中で透析を繰返した後、遠心分離して重
合体粒子を回収し、乾燥後、三菱化成（株）製の微量窒
素分析装置（モデル、TN-02型）を利用してエポキシ基
と反応したε−アミノカルボン酸量を測定し、ε−アミ
ノカプロン酸を反応しない重合体粒子のブランク値を差
し引くことにより、重合体粒子及び反応性重合体粒子の
表面に於けるエポキシ基の濃度（Ｃ_EPX）を分析した。

実施例１〜３及び比較例１〜２ (1)重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコに窒素置換した後に、蒸留
水２７００cc加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、攪拌下に過硫酸カリウムを5.0ミリモル／濃度に
なるように添加した。次いでジ−２−エチルヘキシルス
ルホコハク酸1.5ｇを乳化剤として添加した後、７０℃
に加温したグリシジルメタクリレート３０ミリモル、メ
タクリル酸３ミリモル、及びスチレン１００ミリモルの
混合物を添加して１時間重合を行なった。その後スチレ
ン2.6モルを定量ポンプで滴々添加してから７０℃で２
９時間攪拌下に重合した。重合後、室温まで冷却してか
ら、得られた重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別して大
きな凝集体を除いた。次いで透析を行なった後に、遠心
分離、蒸留水への再分散の操作を繰返した後に、イオン
交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄
を行なって重合体粒子を精製した。得られた重合体粒子
の粒子径は0.232μｍであった。また、該重合体粒子の
表面に於けるエポキシ基濃度（Ｇ）は1.6μmole／ｇ−
重合体粒子であった。

(2)反応性重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水に分散させ
た懸濁液２００mlと第１表に示す含窒素化合物を溶かし
た水溶液５０mlを混合し、室温で７２時間攪拌下に反応
した。反応後、重合体粒子を遠心分離、蒸留水への再分
散の操作を繰返した後に、窒素置換してから９８℃で２
時間加熱することにより重合体粒子の未反応のエポキシ
基を加水分解した。次いで、該重合体粒子を２重量％濃
度で蒸留水に分散させた懸濁液１００mlと第１表に示し
たエポキシ化合物を溶かした水溶液１００mlを混合し、
室温で攪拌下に７２時間反応した。反応後、遠心分離、
蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精製することに
より、本発明の反応性重合体粒子を得た。得られた反応
性重合体粒子の窒素原子濃度（Ｃ_N）及びエポキシ基の
濃度（Ｃ_EPX）は第１表に示す通りであった。さらに、
該反応性重合体粒子を９８℃で２時間加熱することによ
り反応性重合体粒子のエポキシ基を加水分解した。次い
で反応性重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した後に、
遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精製
した。

(3)ヒトIgGを固定化した反応性重合体粒子の調製 (2)で得られた本発明の反応性重合体粒子を固型分濃度
１重量％でグリシン緩衝液に分散した。本発明に於いて
グリシン緩衝液とはグリシン0.05モル及び食塩0.05モル
を水１に溶解し、次いで２規定水酸化ナトリウム水溶
液でpHを8.2に調製し、さらにアジ化ナトリウムを１ｇ
添加したものである。

本発明に於いてヒトIgGは、ヒト血清を飽和硫安で塩析
し、さらに透析を行ない精製したものを用いた。

ヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し１mg／mlに調製
する。次いで倍数希釈法によりヒトIgGをグリシン緩衝
液により希釈してヒトIgG希釈液を調製する。１重量％
濃度の反応性重合体粒子分散液１容にヒトIgG希釈液１
容を加え攪拌し、室温下２時間放置する。次いで遠心分
離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返えすこと
によりヒトIgGを固定化した反応性重合体粒子を洗浄し
た後に、グリシン緩衝液に固型分濃度を0.5重量％にな
るように再分散させ、４℃で保存した。

(4)抗原・抗体反応 ヒトIgGをウサギに免疫して得た抗ヒトIgGウサギ全血清
を６０℃，３０分非動化処理を行なった。この血清を以
下抗ヒトIgGウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で２０倍に希釈
したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトIgGウサ
ギ血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒトIgGウサギ血
清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうためにガ
ラス製１０穴のホールグラスを用意し、グリシン緩衝液
で希釈した抗ヒトIgGウサギ血清を各ホールに0.04ml加
える。次いでヒトIgGを固定化した反応性重合体粒子の
グリシン緩衝液分散液を各ホールに0.04ml加える。この
後直ちに平沢製作所製テーハー式攪拌機によりホールグ
ラスを１分間に１２０回転の速度で水平回転し攪拌を行
なう。抗原・抗体反応により反応性重合体粒子の凝集の
有無から、ヒトIgGを固定化した反応性重合体粒子の特
性である鋭敏性を評価した。ホールグラスを用いた実施
例１の反応性重合体粒子の凝集試験の結果を第１図に示
す。第１図は１０分間の攪拌後の凝集状態を示す。凝集
が全く認められない場合(-)、凝集の有無が判定しがた
い場合(±)、明らかに凝集が認められる場合、凝集の強
い順に，，＋と判定した。図中Ｃは抗原もしくは抗
体を全く含まないことを示す。凝集試験の結果、明らか
に凝集の認められたホールに於ける抗ヒトIgGウサギ血
清希釈液の最高希釈倍数をもって、反応性重合体粒子の
鋭敏性を評価した。

反応性重合粒子の特性として、さらに反応性重合体粒子
の分散安定性を評価した。すなわち、反応性重合体粒子
にヒトIgG希釈液を加え室温で１月放置した後の反応性
重合体粒子の分散状態をもって反応性重合体粒子のヒト
IgG固定化時の分散安定性を評価した。又ヒトIgG固定化
後３ケ月経過した後の反応性重合体粒子の分散状態をも
ってヒトIgGを固定化した反応性重合体粒子の保存中の
分散安定性を評価した。

尚、比較例１として、(1)で得られた重合体粒子に実施
例１と同様の操作で、本発明で特定した範囲以下の粒子
表面のエポキシ基濃度（Ｃ_EPX）の反応性重合体粒子を
得た。得られた反応性重合体粒子を実施例１と同様の操
作で性能を調べた。その結果を第１表に示す。

また、比較例２として、(1)で得られた重合体粒子を９
８℃で２時間加熱することによりエポキシ基を加水分解
した。次いで重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した後
に、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して
精製した。得られた重合体粒子を実施例１と同様の操作
で性能を調べた。その結果を第１表に示す。

第１表の結果から明らかな如く、本発明の反応性重合体
粒子はヒトIgGを吸着で固定化した後に残存する結合部
位を親水性の蛋白、例えば、ウシ血清アルブミンなどで
ブロックさせることなく、分散安定性がよく、かつ鋭敏
性が高いという特徴がある。

実施例４ (1)反応性重合体粒子の調製 実施例１でられた反応性重合体粒子（粒子表面の窒素原
子濃度（Ｃ_N）＝5.6μmole／ｇ−反応性重合体粒子、エ
ポキシ基濃度（Ｃ_EPX）＝6.4μmole／ｇ−反応性重合体
粒子）を２重量％濃度で蒸留水に分散させた懸濁液５０
mlと３００μmoleのα−チオグリセロールの水溶液１０
mlを混合し、室温で４８時間攪拌下に反応した。反応
後、反応性重合体粒子を遠心分離、蒸留水への再分散の
操作を５回繰返して精製した。

(2)抗ヒトCRP抗体を固定化した反応性重合体粒子の調製 (1)で得られた反応性重合体粒子を固型分濃度１重量％
でpH＝8.2に調製したグリシン緩衝液に分散させた。次
いでヤギの産生した抗CRP血清を塩析と透析でγ−グロ
ブリンに濃縮した後、アフィニティクロマトにより精製
して得た精製CRP抗体を１０００μｇ／ml濃度に含有す
るグリシン緩衝液を調製した後に倍数希釈法により希釈
してCRP抗体希釈液を調製した。反応性重合体粒子分散
液１容と精製CRP抗体の希釈液１容とを加え、攪拌し、
室温下２時間放置した。次いで遠心分離、グリシン緩衝
液への再分散の操作を繰り返して洗浄した後、CRP抗体
を固定化した反応性重合体粒子をグリシン緩衝液に固型
分濃度を0.5重量％になるように調製した。

(3)抗原・抗体反応 検体として既知濃度のヒトCRP血清を５６℃で３０分間
加熱処理して非働化したが、グリシン緩衝液で希釈系列
を調節した。実施例１と同様の操作で、ガラス製１０穴
のホールグラスを利用して抗原・抗体反応を調べた。そ
の結果、鋭敏性は７日後及び３ケ月後共に５μｇ／mlで
あった。また、分散安定性は７日後１本、３ケ月後に１
本の非特異的凝集が認められた。

実施例５及び比較例３ (1)重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ccを加えて７５℃に保った後に、窒素雰囲気
下、攪拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／、チオ硫酸
ナトリウム５ミリモル／、硫酸銅0.25ミリモル／を
添加した。次いで７５℃に加温したグリシジルアクリレ
ート１５ミリモル及びメチルメタクリレート２５０ミリ
モルの混合物を添加して７５℃で３０分間攪拌下に重合
した。その後、メチルメタクリレート2.6モルを定量ポ
ンプで滴々添加して、更に７５℃で２時間攪拌下に重合
した。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なっ
た。得られた重合体粒子の粒子径は0.208μｍであっ
た。この重合体粒子の表面におけるエポキシ基濃度
（Ｇ）は0.8μmole／ｇ−重合体粒子であった。

(2)反応生重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水に分散させ
た懸濁液２００mlと２００μmoleジエチレントリアミン
を溶かした水溶液５０mlを混合し、室温で７２時間攪拌
下に反応した。反応後、重合体粒子を遠心分離、蒸留水
への再分散操作を繰返した後に、２重量％濃度で蒸留水
に分散させた懸濁液２００mlと６００μmoleのグリセロ
ールジグリシジルエーテルの水溶液１００mlを混合し、
室温で攪拌下に５０時間反応した。反応後、遠心分離、
蒸留水への再分散操作を繰返して精製した反応性重合体
粒子を得た。得られた反応性重合体粒子に上記反応を全
く同様の操作を繰返して、分岐数の多い反応性重合体粒
子を合成した。かくして得られた反応性重合体粒子の窒
素原子濃度（Ｃ_N）は2.1μmole／ｇ−反応性重合体粒
子、エポキシ基の濃度（Ｃ_EPX）は2.6μmole／ｇ−反応
性重合体粒子であった。さらに該反応性重合体粒子を９
８℃で２時間、窒素雰囲気下で加熱することにより反応
性重合体粒子のエポキシ基を加水分解した。次いで反応
性重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した後に、遠心分
離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精製した。

(3)熱変性ヒトIgGの固定化 (2)で得た反応性重合体粒子をグリシン緩衝液に0.5重量
％になるように分散させた。次いで６０℃で１０分間加
熱処理したヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し１mg
／mlに調製した。0.5重量％濃度の反応性重合体粒子分
散液１容に熱変性したヒトIgG希釈液１容を加え、攪拌
し、室温下２時間放置した。その後、遠心分離して洗浄
した後、固型分濃度が0.5重量％になるように0.05重量
％濃度の牛血清アルブミンを含むグリシン緩衝液に再分
散した。

(4)リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として、実
施例１と同様にしてガラス製１０穴のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各
ホールに0.04mlを加え、次いで熱変性ヒトIgGを固定化
した反応性重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈した分散
液を各ホールに0.04ml加えて実施例１と同様の操作で鋭
敏性及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は１日
後×２５６０、３ケ月後×２５６０、であり、分散安定
性は１日後及び３ケ月後に共に非特異凝集反応は認めら
れなかった。

尚、比較例３として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記と同様の操作でテストすると、鋭敏性は１日後×
１２８０、３ケ月後は非特異凝集のため評価できなかっ
た。

実施例６ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００cc加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、攪拌下に過硫酸カリウム１０ミリモル／濃度にな
るように添加した。次いで７０℃に加温したグリシジル
メタアクリレート１００ミリモル及びクロルメチルスチ
レン４００ミリモルの混合物を添加して７０℃で１時間
攪拌下に重合した。その後スチレン2.5モルを定量ポン
プで滴々添加してから、７０℃で２９時間攪拌下に重合
した。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なっ
た。得られた重合体粒子の粒子径は0.324μｍであっ
た。重合体粒子表面におけるエポキシ基濃度（Ｇ）は3.
5μmole／ｇ−重合体粒子であった。

得られた重合体粒子を実施例１と同様の操作でテトラエ
チレンペンタミン、1,4−ブタンジグリシジルエーテル
を反応させ、窒素原子濃度（Ｃ_N）が12.5μmole／ｇ−
反応性重合体粒子、エポキシ濃度（Ｃ_EPX）が13.3μmol
e／ｇ−反応性重合体粒子となる反応性重合体粒子を合
成した。かくして得られた反応性重合体粒子を実施例１
と同様の操作でヒトIgGを固定化し、抗ヒトIgGウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は
１日後×１２８０、３ケ月後×１２８０、また分散安定
性は１日後と３ケ月後共非特異的凝集が認められなかっ
た。

実施例７ (1)重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ccを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、攪拌下に過硫酸カリウム４ミリモル／、チオ硫酸
ナトリウム２ミリモル／、および硫酸銅0.2ミリモル
／を添加した。次いで７０℃に加温したグリシジルメ
タクリレート1.5モル及びスチレン0.5モルの混合物を添
加して７０℃で６時間重合した。重合後、室温まで冷却
してから得られた重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別し
て大きな凝集体を除いた。次いで透析を行なった後に遠
心分離、蒸留水への再分散の操作を繰返した後に、イオ
ン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗
浄を行なって重合体粒子を精製した。得られた重合体粒
子の粒子径は0.304μｍであった。重合体粒子表面にお
けるエポキシ基濃度（Ｇ）は8.4μmole／ｇ−重合体粒
子であった。

(2)反応製重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水に分散した
懸濁液２００mlと3.4μmoleのテトラ（アミノメチル）
メタンの水溶液２００mlを混合し、室温で４８時間攪拌
下に反応した。反応後、重合体粒子を遠心分離、蒸留水
への再分散の操作を３回繰返した後に、９８℃で２時間
加熱することにより、重合体粒子の未反応のエポキシ基
を加水分解した。次いで、得られた重合体粒子を２重量
％濃度に再調製した懸濁液１００mlに過ヨウ素酸ナトリ
ウム１５mmolと酢酸１５mmolの混合物５０mlを添加し、
４０℃で一夜攪拌した後、pHが6.5以上になるまで透析
をつづけて精製して、重合体粒子のジヒドロキシル基を
ホルミル化した。

得られたホルミル化重合体粒子を1.5重量％濃度に再調
製した懸濁液１００mlに３００μmoleのジエチレングリ
コールジグリシジルエーテル水溶液２０mlを加えて、室
温で７２時間攪拌下に反応した後に、濾紙（No.２）で
濾別し、次いで遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３
回繰返して精製した。かくして得られた反応性重合体粒
子の窒素原子濃度（Ｃ_N）は11.6μmole／ｇ−反応性重
合体粒子であり、エポキシ基濃度（Ｃ_EPX）は18.3μmol
e／ｇ−反応性重合体粒子であった。

(3)抗原・抗体反応−１ (2)で得られた反応性重合体粒子のエポキシ基を加水分
解してジヒドロキシル基に変換した後に、実施例１で使
用したグリシン緩衝液をホウ酸緩衝液（0.1Ｍ pH8.2，
NaCl 0.05Ｍ）を用いた以外、全て実施例１と同様の操
作でヒトIgGを固定化した診断用試薬の性能を評価し
た。

その結果、鋭敏性は７日後×５１２０、３ケ月後×５１
２０、分散安定性は７日後に０本、３ケ月後には１本の
非特異凝集が認められた。

(4)抗原・抗体反応−２ (2)で得られた反応性重合体粒子を１重量％濃度に再調
製した懸濁液５０mlに１００μmoleのε−アミノカプロ
ン酸水溶液５０mlを加えて、pH＝8.2に調製し室温で７
２時間攪拌下に反応した。次いで濾紙（No.２）で濾別
した後、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返
して精製することにより、エポキシ基をカルボキシル基
に変換した反応性重合体粒子を得た。

ヤギの産生したアルファーフェトプロテイン（以下AFP
と略す）の抗体をアフィニティクロマトにより精製して
得た精製AFP抗体を１mg／ml濃度に含有するホウ酸緩衝
液を調製した後に倍数希釈法により希釈してAFP抗体希
釈液を調製した。１重量％濃度の反応性重合体粒子の懸
濁液１容にAFP抗体希釈液１容を加え攪拌下に室温で４
時間放置した。そして遠心分離した後に固型分濃度が0.
5重量％となるようにグリシン緩衝液に調製し４℃に保
存した。

検体としてヒト血清中のAFP濃度が１０００μｇ／mlで
あるものを原液とし、グリシン緩衝液で希釈系列を調製
した。実施例１と同様にしてガラス製１０穴のホールグ
ラスにグリシン緩衝液で希釈したAFPを各ホールに0.04m
lを加え、次いでAFP抗体を固定化した診断用試薬の分散
液を各ホールに0.04mlを加えて実施例１と同様の操作で
鋭敏性、分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は１日
後、３か月後共に２５μｇ／mlであった。分散安定性は
１日後、３か月後共に非特異凝集は認められなかった。

実施例８ (1)重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ccを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下に過硫酸カリウム5.0ミリモル／、チオ硫酸ナトリ
ウム5.0ミリモル／、硫酸銅0.25ミリモル／、及び
メルカプトエタノール0.5ミリモル／を添加した。次
いで７０℃に加温したグリシジルメタクリレート2.0モ
ル及びエチレングリコールジメタクリレート４０ミリモ
ルの混合物を添加して７０℃で２時間攪拌下に重合し
た。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。
得られた重合体粒子の粒子径は0.245μｍであった。重
合体粒子表面のエポキシ基濃度（Ｇ）は、１２０μmole
／ｇ−重合体粒子であった。

(2)反応性重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水に分散した
懸濁液２００mlと１０mmolの１−アミノ−2,2−ビス
（アミノメチル）プロパン−１−オール水溶液２００ml
を混合し、室温で４８時間攪拌下に反応した。反応後、
遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精製
した。得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水２０
０mlに分散させ、５０mmolの1,4−ブタンジオールジグ
リシジルエーテル２００mlと混合して室温で７２時間攪
拌下に反応した後に、濾紙（No.２）で濾別した。次い
で遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精
製した。かくして得られた反応性重合体粒子の窒素原子
濃度（Ｃ_N）は３００μmole／ｇ−反応性重合体粒子、
エポキシ基濃度（Ｃ_EPX）は４３０μmole／ｇ−反応性
重合体粒子であった。

(3)抗原・抗体反応 (2)で得られた反応性重合体粒子を固型分濃度１重量％
でホウ酸緩衝液に分散させた。次いでヒト絨毛性ゴナド
トロピン（hCG）を１０００IU/ml濃度に含有するホウ酸
緩衝液を調製した後に倍数希釈法により希釈したhCG希
釈溶液１容と１重量％の反応性重合体粒子１容を混合
し、攪拌下に室温で２時間放置した後、４℃にて攪拌下
に１週間放置した。次いで遠心分離した後にグリシン緩
衝液に再分散し、固型分濃度を0.5重量％に調製した。

抗hCGウサギ抗体をグリシン緩衝液で２０倍に希釈した
ものを原液とし、倍数希釈法により抗hCGウサギ抗体を
グリシン緩衝液で希釈して抗hCG抗体希釈液を調製す
る。その後実施例１と同様の操作で鋭敏性、分散安定性
を評価した。その結果、鋭敏性は７日後×３２０、３ケ
月後×３２０であった。また分散安定性は７日後及び３
ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集が認められなかっ
た。

実施例９ (1)反応性重合体粒子の調製 実施例８で得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留水
に分散した懸濁液２００mlと１０mmoleの１−アミノ−
2,2−ビス（アミノメチル）プロパン−１−オール水溶
液２００mlを混合し、室温で４８時間攪拌下に反応し
た。反応後、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回
繰返して精製した後に、９８℃で２時間加熱することに
より、重合体粒子の未反応のエポキシ基を加水分解し
た。次いで、得られた重合体粒子を２重量％濃度で蒸留
水２００mlに分散させ、５０mmoleの1,4−ブタンジオー
ルジグリシジルエーテル２００mlと混合して室温で７２
時間攪拌下に反応した後に、濾紙（No.２）で濾別し
た。次いで、遠心分離蒸留水への再分散の操作を３回繰
返して精製した。かくして得られた反応性重合体粒子の
窒素原子濃度（Ｃ_N）は２８５μmole／ｇ反応性重合体
粒子、エポキシ濃度（Ｃ_EPX）は４００μmole／ｇ反応
性重合体粒子であった。

(2)抗原・抗体反応 (1)で得られた反応性重合体粒子を２重量％濃度で蒸留
水に分散した懸濁液１００mlにε−アミノカプロン酸５
mmoleを加え、pH＝8.2に調節して室温で７２時間攪拌下
に反応した。反応後、遠心分離、蒸留水への再分散の操
作を３回繰返して精製した。

かくして得られたカルボキシル化重合体粒子を固型分濃
度１重量％でpH＝6.0のリン酸緩衝液に分散した。次い
でヒト胎盤ラクトゲン（hPL）を１０００IU/ml濃度に含
有するリン酸緩衝液を調製した後に倍数希釈法により希
釈したhPL希釈溶液１容と１重量％濃度のカルボキシル
化重合体粒子１容を混合し、４℃で２日間攪拌下に放置
した。次いで遠心分離した後に、リン酸緩衝液に再分散
し、固型分濃度を0.5重量％に調製した。

抗hPLウサギ抗体をリン酸緩衝液で２０倍に希釈したも
のを原液とし、倍数希釈法により抗hPLウサギ抗体をリ
ン酸緩衝液で希釈して抗hPL抗体希釈液を調製する。そ
の後、実施例１と同様の操作で鋭敏性と分散安定性を評
価した。その結果、鋭敏性は７日後×１６０、３ケ月後
×１６０であった。また、分散安定性は７日後及び３ケ
月後共に保存中に全く非特異的凝集が認められなかっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた反応性重合体粒子を担体
とした診断用試薬の凝集試験の結果を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グリシジル（メタ）アクリレート単量体単
   位を有する重合体粒子にアミノ基及び／又はイミノ基と
   さらにエポキシ基とが導入されてなる反応性重合体粒子
   であって、該反応性重合体粒子の表面に於ける窒素原子
   の濃度をＣ_N（μmole／ｇ−反応性重合体粒子）、エポ
   キシ基の濃度をＣ_EPX（μmole／ｇ−反応性重合体粒
   子）とするとき、次式 Ｃ_EPX≧0.6×Ｃ_N を満たす濃度のエポキシ基を有することを特徴とする反
   応性重合体粒子。
2. 【請求項２】グリシジル（メタ）アクリレート単量体単
   位を有する重合体粒子と、分子中にアミノ基及び／又は
   イミノ基を有し、且つ該アミノ基及び／又はイミノ基の
   窒素原子に結合する水素原子の数が２個である含窒素化
   合物とを反応させ、次いで、得られた重合体粒子と分子
   中にエポキシ基を３個以上有するエポキシ化合物とを反
   応させることを特徴とする反応性重合体粒子の製造方
   法。
3. 【請求項３】グリシジル（メタ）アクリレート単量体単
   位を有する重合体粒子と、分子中にアミノ基及び／又は
   イミノ基を有し、且つ該アミノ基及び／又はイミノ基の
   窒素原子に結合する水素原子の数が３個以上である含窒
   素化合物とを反応させ、次いで、得られた重合体粒子と
   分子中にエポキシ基を２個以上有するエポキシ化合物と
   を反応させることを特徴とする反応性重合体粒子の製造
   方法。
4. 【請求項４】グリシジル（メタ）アクリレート単量体単
   位を有する重合体粒子にアミノ基及び／又はイミノ基と
   さらにエポキシ基とが導入されてなる反応性重合体粒子
   であって、該反応性重合体粒子の表面に於ける窒素原子
   の濃度をＣ_N（μmole／ｇ−反応性重合体粒子）、エポ
   キシ基の濃度をＣ_EPX（μmole／ｇ−反応性重合体粒
   子）とするとき、次式 Ｃ_EPX≧0.6×Ｃ_N を満たす濃度のエポキシ基を有する反応性重合体粒子よ
   りなることを特徴とする免疫診断用試薬の担体。