JPH10197534A

JPH10197534A - 凝集により試験液中の分析物を検出するための方法及び試薬キット、固定リガンド分子を担持する合成粒子並びにその使用

Info

Publication number: JPH10197534A
Application number: JP9346351A
Authority: JP
Inventors: Peter Schwind; シュヴィントペーター; David Bashforth; バッシュフォースデイヴィッド; Roderick N Hobbs; エヌホッブスロデリック; Graham Margetts; マーゲッツグレアム; Michael J Marshall; ジェイマーシャルマイケル; Mark J J Roberts; ジェイジェイロバーツマーク
Original assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung
Current assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 1998-07-31
Also published as: HK1008244A1; EP0849595A1; AU4690797A; NO975937L; CN1191312A; ES2156610T3; AU724475B2; NO975937D0; US6203706B1; CN1123772C; ATE201100T1; DE59606885D1; PT849595E; GR3035882T3; NO319296B1; EP0849595B1; BR9705648A; DK0849595T3; AR010364A1

Abstract

(57)【要約】【課題】凝集により試験液中の分析物を検出するため
の方法及び試薬キット、固定リガンド分子を担持する合
成粒子並びにその使用【解決手段】本発明は、試験液を凝集試薬及び不活性
マトリックスと接触させ、反応混合物に重力を作用さ
せ、分析物と凝集試薬との反応を検定する、凝集により
試験液中の分析物を検出する方法に関し、該方法では、
凝集試薬として合成粒子を使用し、該粒子がマトリック
スに対して実質的に赤血球のように挙動するように該粒
子の直径及び密度を選択する。更に、表面上にリガンド
分子が吸着されている新規の合成粒子及び検出試薬とし
ての該粒子の使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、凝集により試験液
中の分析物を検出する方法に関し、その際、試験液を凝
集試薬及び不活性マトリックスと接触させ、反応混合物
に重力を作用させ、分析物と凝集試薬との反応を検定す
る。更に、本発明による方法を実施するための新規の試
薬を開示する。

【０００２】

【従来の技術】血球凝集試験及び粒子凝集試験による分
析物の検出法は公知である。これらの試験は、特に感染
性疾患の診断において抗原検出又は抗体検出のために使
用される。しかしながら、これらの方法は全て、該方法
が、時間的及び人件的に経費がかかり、かつ結果が往々
にして非常に困難にのみ解釈されうるという共通の欠点
を有する。

【０００３】非固定（unfixiert）赤血球が凝集試薬と
して使用される血球凝集試験に関しては、ゲル−イムノ
アッセイ法が公知であり、この方法では、血球凝集物は
不活性マトリックスを介する遠心分離工程により個々の
非凝集赤血球から分離される（ヨーロッパ特許（ＥＰ−
Ａ）第０１９４２１２号、同第０３０５３３７号、同第
０５５７５４６号、同第０６３４２１６号、同第０４８
５２２８号明細書及び国際公開（ＷＯ）９５／３１７３
１号明細書を参照）。これらの方法によると、凝集され
た赤血球は不活性マトリックスの上又は中に保持され、
ひいては、マトリックスを貫通することができ、かつ反
応容器の底に沈降する未反応の個々の赤血球から明確に
分離させることができる。

【０００４】１９８７年からの優先権主張に由来するヨ
ーロッパ特許第０３０５３３７号明細書においてのみ、
凝集試薬として合成粒子、例えばラテックス又は重合ア
ガロースを使用することができることが確認されてい
る。しかしながら、このような合成粒子の特性に関する
記載は無い。更に、この提案は、後に特許においも他の
刊行物においても取り上げられていない。対照的に、最
近の刊行物、例えばヨーロッパ特許第０５５７５４６号
明細書では、凝集試薬としての非固定赤血球は考慮され
ていない。

【０００５】しかしながら、非固定赤血球の欠点は、一
定の反応条件下で溶血をもたらすその不安定性にある。
この不安定性は、往々にして、非固定赤血球をベースと
する生成物の不所望に短い耐用期間をもたらす。更に、
赤血球調製物、殊に抗体又は抗原に結合された赤血球調
製物を、標準化してかつ再生産可能に製造することは、
大きな経費をかけてのみ可能である。従って、赤血球調
製物での物理的特性の十分な均一性は、実際的には不可
能である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の根底
にある１つの課題は、凝集試薬として赤血球を使用する
ことにより生じる上記の欠点を少なくとも部分的に排除
することにあった。殊に、本発明により、凝集試薬とし
て使用することができ、かつ公知のゲル−イムノアッセ
イで赤血球の挙動を模擬することができる合成粒子を提
供する。更に、この合成粒子は、生体物質の容易な結合
を可能にし、該粒子が、凝集試薬として従来使用された
赤血球と、感度及び特異性に関して少なくとも等価値で
あるような性質を有するべきである。この合成粒子を、
従来公知の方法よりも簡単に実施され、かつ判定されう
る凝集法で使用する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この課題は、試験液を凝
集試薬及び不活性マトリックスと接触させ、反応混合物
に重力を作用させ、分析物と凝集試薬との反応を検定す
る、凝集により試験液中の分析物を検出する方法により
解決され、この方法は、凝集試薬として合成粒子を使用
し、該粒子がマトリックスに対して実質的に赤血球のよ
うに挙動するように該粒子の直径及び密度を選択するこ
とを特徴とする。

【０００８】意想外に、密度及び直径を最適に調節した
場合には、ゲル−イムノアッセイで問題なく不活性マト
リックスを通過することができ、ひいては新鮮な赤血球
を完璧に模擬する合成粒子を実際に製造することができ
ることを確認した。

【０００９】本発明をもたらした試みの範囲内で、硬質
ポリマーの粒子の通過は、赤血球（直径６〜８μｍ）と
比べてより強く遅くなることが明らかになった。このこ
とは、所定の標準条件下では具体的には、市販により得
られる直径３〜７．５μｍを有する標準粒子は不完全に
のみゲルマトリックス中に沈降し、その一方で、より大
きな（１１．９μｍ）又はより小さな（＜１μｍ）合成
粒子は、わずかにのみゲル中に貫入することができたこ
とを意味した。遠心分離時間（１０分〜５０分まで）又
は遠心分離速度（１０３０〜１３００ｒｐｍ）のパラメ
ーターを引き上げると、確かに良好ではあるが、なお完
全な沈降は生じない。これら両方の措置により最適な沈
降に達することができたとしても、遠心分離時間及び遠
心分離速度の変更／引き上げは、下記の理由から非常に
不利である：１．本発明による系は特に、比較可能な方法と比べて時
間を浪費しない方法を可能にするべきである。５０分の
可能な遠心分離時間では、インキュベーションを含めて
２０分の目標試験時間は、それにより３倍になる。

【００１０】２．当業者に公知のように、感度は、ゲル
遠心分離法では遠心分離速度の上昇とともに低下する。

【００１１】３．所定のパラメーターを遵守する場合に
は、本発明による系に、市販により得られる遠心分離機
を使用することができる。

【００１２】意想外に、赤血球のそれよりも小さい直径
及び通常よりも高い密度の合成粒子を用いると、不活性
マトリックスを通過する際の、赤血球と比較可能な挙動
を得ることができることを確認した。その際、球形の合
成粒子も、非対称の合成粒子も使用することが可能であ
る。

【００１３】本発明による方法に有利なのは、≦５μｍ
及び殊に１〜５μｍの平均直径を有する合成粒子である
ことが実証された。平均直径は、２〜４μｍであるのが
特に有利である。粒子の密度は、有利には≧１．１ｇ／
ｃｍ³であり、好適には１．１〜１．８ｇ／ｃｍ³の範囲
内である。殊に、公知の市販の赤血球−ゲル−イムノア
ッセイ（例えばDiaMed）に関して規定されている標準条
件で検出法を実施する場合には、密度は、有利には１．
１〜１．６ｇ／ｃｍ³の範囲内であり、最も有利には
１．１５〜１．４ｇ／ｃｍ³の範囲内である。

【００１４】本発明による方法で凝集試薬として使用さ
れる合成粒子は、有機ポリマー粒子又はコポリマー粒子
であるのが有利である。特に有利な材料は、スチレン及
びスチレン誘導体、例えばブロモスチレン及び殊にそれ
らのコポリマーである。本発明による凝集試薬に当ては
まる寸法範囲内の均一なポリマー粒子の製造は、当業者
に従来公知である（Arshady (1992): Suspension, emul
sion and dispersionpolymerization: A methodologica
l Survey. Colloid & Polymer Science 270,717-732; O
kubo 及び Shiozaki (1992): Production of micron-si
ze monodispense polymer particles by seeded polyme
rization utilizing dynamic swelling method with co
oling process. Polymer International 30, 469-47
4）。このような方法は、厳密に定義された物理的特性
を有する粒子を製造するために、通常、乳化重合及び分
散重合からなる組み合わせを使用する。

【００１５】本発明による方法で凝集反応を視覚的に検
出するために、色素、殊に水溶性色素を粒子中に組み込
むことができる。青色、黄色、緑色、黒色又は赤色に着
色された合成粒子は、視覚的判定のためには非常に好適
であることが明らかになる。本発明の特に有利な１実施
態様では、その特に良好な判定可能性の故に、赤色粒子
を用いて作業する。

【００１６】合成粒子の堅固性は、公知の工業的標準法
により、粒子の表面上に多数の異なるリガンドを固定す
ることを可能にする。その際、検定されるべき分析物と
結合可能であるリガンド分子を固定するのが合目的であ
る。リガンド分子を、吸着性、共有結合性又は高親和性
の相互作用を介して固定させることができる。共有結合
は、例えば表面上にある化学的反応性基を介して行うこ
とができる。このような基の例は、カルボキシル基、ア
ミノ基、アルデヒド基及びエポキシ基である。高親和性
相互作用を介する固定は、高親和性の結合対（Bindepaa
r）の２個のパートナー、例えばストレプタビジン（Str
eptavidin）又はアビジン／ビオチン、ハプテン／抗
体、糖類／レクチン等を介して行われる。これらの共有
結合性及び高親和性の相互作用を用いて、リガンド分
子、例えばペプチド、例えば合成されたペプチド、タン
パク質、例えば糖蛋白、リポタンパク、組み換えポリペ
プチド、免疫グロブリン、核酸、例えばＤＮＡ若しくは
ＲＮＡ、核酸類似体、糖類、例えば単糖類、二糖類、オ
リゴ糖類及び多糖類、脂質、ホルモン、代謝産物又は他
の生体物質を固定させることができる。その際、固定
は、制御により、結合されたリガンド分子の有利な最適
な配向を得るために、直接に又はリンカー（Linker）の
使用により行うことができる。

【００１７】しかしながら、同様に、純粋な吸着工程を
介するリガンド分子の固定も可能である。これは、例え
ば細胞膜、例えば赤血球、血小板若しくは白血球の膜、
細胞膜のフラグメント又は細胞若しくは病原体、例えば
ウィルス、細菌若しくは寄生体の溶解質に関して可能で
ある。着色された合成粒子を使用する場合には、膜を付
加的に着色することは不必要である。

【００１８】本発明による方法は、試験液中の分析物の
検出に関する。試験液としては、場合により希釈されて
いてもよい体液、例えば血液、血清、血漿、唾液又は尿
を使用するが有利である。本発明による方法のための試
験液の容量は、広い範囲で変動させることができ、微量
試験用には１〜２００μｌの容量を使用するのが有利で
ある。

【００１９】凝集試薬としては、本発明による方法では
記載の合成粒子を使用する。この粒子は、その表面上
に、特異的にかつ高い親和性で分析物と結合可能なリガ
ンド分子を有するのが有利である。凝集試薬は、通常、
分析物のための数個の結合部位を有し、それにより、分
析物及び凝集試薬から成る架橋された凝集複合体の生成
が可能になる。

【００２０】本発明による方法により検出可能な分析物
は、凝集試薬と特異的かつ高親和的に相互作用すること
ができる物質、例えば免疫反応により検定されうる抗原
若しくは抗体又はハイブリッド形成反応により検定する
ことができる核酸である。本発明の最初の有利な実施態
様は、試験液中の分析物として抗体、例えば病原体、例
えばウィルス（ＨＩＶ、肝炎ウィルス）、細菌若しくは
原虫に対する抗体、自己抗原に対する抗体、腫瘍に対す
る抗体又はアレルゲンに対する抗体の検出に関する。

【００２１】更に、本発明による方法により、抗体のク
ラス特異的な検出、例えばＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体と
の区別が可能であり、これは、例えば感染性疾患及び自
己免疫疾患の診断学では往々にして著しく重要である。

【００２２】他方で、本発明による方法により抗原、例
えば遊離抗原、例えば血清タンパク、代謝物、ホルモ
ン、媒介物質（Mediator）等又は担体に結合された抗
原、例えば細胞性血液型抗原等を検定することもでき
る。

【００２３】本発明による方法では、マトリックスを有
する反応容器を使用し、その結果、重力の作用の後に、
検定されるべき分析物と凝集試薬との間の凝集反応の定
性的又は半定量的検定が可能になる。重力の作用を、比
較的長い沈降により生じさせることもできるが、遠心分
離機を使用するのが有利であり、それというのも、既に
短時間の後に所望の沈降をもたらすことができるからで
ある。遠心分離時間及びｇ数に関する最適条件を、当業
者は難なく各分析系に関して算出することができる。こ
れらの条件は、殊に凝集試薬と分析物との間の凝集複合
体、未結合状態の反応混合物の成分及びその都度使用さ
れたマトリックスの性質により決定する。

【００２４】本発明による方法では、不活性な粒子形マ
トリックスを使用するのが有利である。他方で、例えば
ヨーロッパ特許第９６１０４２８．３号明細書に記載の
コンパクトマトリックス（kompakte Matrix）を使用す
ることもできる。

【００２５】マトリックスは、不活性の粒子形マトリッ
クスが有利である。「不活性」という特徴により、その
マトリックスが分析物又は凝集試薬と非特異的に反応し
てはならないということが該当することになる。マトリ
ックスとしては、市販で（例えば Merck、Pharmacia、B
io-Rad、Tosohaas の）液体クロマトグラフィー用に得
られる粒子を使用するのが有利である。特定の例は、セ
ファデクス（Sephadex：登録商標）、セファロース（Se
pharose：登録商標）、セファクリル（Sephacryl：登録
商標）、ビオ−ゲル（Bio-Gel：登録商標）又はトーヨ
ーパール（Toyopearl：登録商標）である。それらは、
架橋ポリマー又はコポリマー、例えばアガロース、ポリ
アクリルアミド、ポリデキストラン、スチレン／ジビニ
ルベンゾール又はポリメタクリレートをベースとする製
品である。同様にガラス小球が該当する。マトリックス
の粒子の粒径は、１０〜２００μｍであるのが有利であ
る。同様に、例えばピエルス（Pierce）社又はファルマ
シア（Pharmacia）社から得られるような、既に検出試
薬、例えば抗体が結合されているマトリックスが該当す
る。当業者は、簡単な予備実験により、粒子が特定の検
出法に使用可能であるかどうかを決定することができ
る。

【００２６】本発明による方法の結果の解釈は、反応混
合物への重力の作用の後に、ａ）強い凝集の場合には、検定されるべき分析物及び凝
集試薬からなる反応生成物は、マトリックス中に貫入で
きないか又はごく僅かにのみ貫入することができ、ｂ）弱い凝集の場合には、反応混合物は、マトリックス
中に貫入するが、それは完全に貫通することができず、ｃ）凝集が無い場合には、反応容器中に入れられている
成分はマトリックスを実質的に完全に貫通することがで
きるというようなことである。

【００２７】本発明による方法の有利な１実施態様で
は、凝集試薬として異なる２種又は数種の合成粒子を用
いて作業する。相互に連想される異なる病気が存在する
からであり、その場合、従来の試験方法を用いると、さ
し当たりいわゆるスクリーニングを実施しなければなら
ず、その際に、被験者がこの群に属する病気に対する抗
体を保有しているかどうか確認される。被験者の試験さ
れた体液がスクリーニング試験で陽性の場合には、それ
を従来の方法では第２工程法で、いわゆる鑑別試験にか
けなければならず、その際に、次いで、抗体がその群の
病気の何れに対しているか確認される。この種の方法の
典型例は、ＨＩＶ診断である。スクリーニングで、ＨＩ
Ｖ特異的抗体が存在するかどうか確認される。鑑別試験
で、これがＨＩＶ−Ｉに対しているか、ＨＩＶ−ＩＩに
対しているか又はＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩに対して
いるかが確認される。

【００２８】本発明による方法では、異なる２種の合成
粒子を用いて作業することができ、これらは、寸法、
形、密度及びたわみ性に関しては異なっていないが、異
なる着色、例えば赤色及び青色を有し、かつ表面リガン
ドが異なって付けられているのが有利である。これらの
異種の合成粒子から、各種類を同じ割合で有する均質な
懸濁液を生成するので、この懸濁液を個別試験用と同様
に使用することができる。次いで、生じる結果を下記の
ように解釈することができる：両方の検定されるべき分
析物が試験液中に存在する場合には、遠心分離の後に、
マトリックス上に又はマトリックスの上方の領域に赤色
及び青色の帯が生じる。１種のみの分析物が含有されて
いる場合には、マトリックスの上方の領域に、相応する
色を有する帯を検出することができ、他方で、別の色を
有する合成粒子は、マトリックスを貫通し、その下方に
位置する。第１の分析物も第２の分析物も試験液中に含
有されていない場合には、マトリックスの下に両方の合
成粒子から成る層が形成される。無論、相応して、異な
る色を有する異なる３種又は数種の合成粒子を、相応す
る数のパラメーターを同時に鑑別するために使用するこ
ともできる。

【００２９】本方法の実施のために、ゲル凝集試験での
使用に好適である自体任意の反応容器を使用することが
できる。反応容器の容量は、５０μｌ〜２ｍｌであるの
が有利である。反応容器は、試薬を取り入れるための漏
斗が備えられているのが有利である。有利な１実施態様
では、一緒に１つのカード又はディスク上に配置されて
いる数個の反応容器からの装置を使用する。１つのカー
ド又はディスク上に存在するこれらの反応容器は、同じ
分析物の検出用か又は異なる分析物の検出用であってよ
い。

【００３０】例えば、本発明による方法を実施するため
に、ディアメッド（DiaMed）社から血液型分析用に販売
されているカードを使用することができ、そのカード上
には、微量反応容器６個が配置されている。同様に、オ
ルト（Ortho）社及びディアガスト（Diagast）社の製品
を使用することもできる。

【００３１】反応混合物への重力の作用は、これに好適
な遠心分離機中で反応容器を遠心分離にかけることによ
り行われる。従って、本発明による方法の有利な１実施
態様では、固定的に調節されたパラメーター（ｔ＝１０
分、ｖ＝８５ｇ）を有する、市販で得られるディアメッ
ドＩＤ−遠心分離機１２ＳＩＩを用いて作業す
る。

【００３２】しかしながら、本発明のもう一つの有利な
実施態様では、基礎にある反応の動力学を特に考慮す
る、変更された遠心分離法で作業することもできる。こ
れは、特に、弱い反応の反応強化に反映する。

【００３３】更に、本発明による方法の特定の実施態様
に関しては、第２の抗体、例えばいわゆる群特異的抗
体、例えば抗ＩｇＧを含有するマトリックスを用いて作
業するのが有利である。その際、反応容器中で２相性反
応が生じる。第１の反応は、陽性反応で合成粒子上のリ
ガンド分子、例えば抗原が、試料中の分析物、例えば抗
原特異的抗体と反応する場合に反応室中で行われる。そ
の際、既に異なる合成粒子との間での架橋が生じること
があるが（凝集）、これは、ＩｇＧ反応の場合には、往
々にして非常に弱い凝集物をもたらすにすぎない。マト
リックス中に存在する第２抗体は、既に形成された凝集
複合体の更なる架橋により、特異的な反応強化の所望の
効果をもたらす。

【００３４】２０分にすぎない合計試験時間で、本発明
により記載の試験システムは、公知のシステムと比べて
重要な時間節約を可能にする。凝集試薬として、固定さ
れているか又は固定されていない赤血球をベースとする
試験システムと比べて、付加的な利点は、合成粒子のは
るかにより長い耐久性及び出発物質のより良好な均一性
にある。

【００３５】試験システムを相応に準備した場合には、
実施は簡単であり、かつ結果を明確に判定することがで
き、その結果、試験を医療助手が実施することもでき
る。使用は非常に簡単であり、それというのも、それ
は、ただ２つのピペット操作工程からなるからである。
更に、アキュムレータにより駆動される遠心分離機及び
渦動発生装置（Vortex-Geraet）を用いると、検定は堅
固な実験設備外で電気接続なしに簡単に実施可能であ
る。少ない量の試料、洗浄工程がないこと及び使用後の
反応の反応容器を密封する可能性により、職員が潜在的
な感染性物質と接触するのができるかぎり短時間である
こと及び潜在的な感染性廃棄物の最大限の管理がもたら
されている。

【００３６】本発明のもう一つの対象は、≦５μｍ、有
利に１〜５μｍ、特に有利に２〜４μｍの平均直径及び
≧１．１ｇ／ｃｍ³、有利に１．１〜１．８ｇ／ｃｍ³、
特に有利に１.１５〜１．４ｇ／ｃｍ³の密度を有し、表
面上にリガンド分子が例えば共有結合性、吸着性又は高
親和性の相互作用により固定されている合成粒子であ
る。粒子は、着色されているのが好適である。これらの
粒子を、凝集試薬として凝集試験で、有利にはゲル凝集
試験で使用することができる。

【００３７】本発明の更にもう一つの対象は、試験液中
の分析物の検出用試薬キットであり、これは、ａ）不活性マトリックス、有利には粒子形マトリックス
が入っている反応容器少なくとも１個、及びｂ）表面上にリガンド分子が固定されている合成粒子少
なくとも１種を含む。

【００３８】特定の種類の本発明による検定法では、反
応混合物に洗浄剤を添加するのが有利である。好適な洗
浄剤の例は、イオン性洗浄剤、例えばＳＤＳ、又は非イ
オン性洗浄剤、例えばトリトン（Triton）Ｘ−１００及
びツウィーン（Tween）２０である。更に、ムチンの添
加が有利であることもある。洗浄剤及び／又はムチンの
添加により、懸濁液中又はゲル通過の間の粒子の均一性
を改良することができる。これは、陰性反応の際のより
完全な沈降をもたらす。

【００３９】同様に反応を、還元剤、例えばスルフヒド
リル試薬、例えば２−メルカプト−エタノール、ジチオ
トレイトール若しくは亜ジチオン酸ナトリウム又は他の
還元剤、例えばトリブチルホスフィンの添加の下で実施
するのが合目的であることが実証されうる。還元剤によ
り、例えばＩｇＭ−抗体により惹起されるような不所望
な非特異的反応を低減させることができる。

【００４０】更に、特定の試験では、遠心分離条件の変
更により試験結果の改良を達成することができる。これ
は、殊に、受容体、例えば第２抗体で被覆されたマトリ
ックスを使用する試験で通用する。遠心分離条件の有利
な変更は、インターバル遠心分離、即ち第１の遠心分離
工程、次いで休止、次いで第２の遠心分離を含む。

【００４１】場合により、遠心分離を数回の休止工程を
おいて実施することができる。第１の遠心分離工程は、
１分まで、有利には３０秒までの時間での短い遠心分離
工程であるのが有利である。次いで、休止を行い、これ
は、例えば１〜１０分又は約５分であってよい。引き続
いて、より長い時間及び場合によりより高いｇ数の第２
遠心分離工程を行う。

【００４２】下記の例及び図により、本発明の特別な観
点を詳述する。表しているのは：図１：本発明による方法での陽性、弱い陽性及び陰性反
応で生じる結果、図２：試験実施の図式、図３：マトリックスが抗ＩｇＧ−抗体を含有する微量反
応容器中で生じる反応：ａ）反応室中、及びｂ）マトリックスの緩衝上澄み（Pufferueberstand）中
又はマトリックス中、図４：１反応容器中の異なる２種の分析物（Ａ１及びＡ
２）に関する鑑別診断の図式的結果：ａ）患者試料１、Ａ１に関して抗体陽性；ｂ）患者試料２、Ａ２に関して抗体陽性；ｃ）試料３（患者１及び２の血清の混合物）、Ａ１及び
Ａ２に関して抗体陽性；ｄ）患者試料４、Ａ１及びＡ２に関して抗体陰性、及
び図５：第１表中で関連づけられている反応帯域の図式。
帯域０は：粒子が遠心分離の後に陰性反応に関して望ま
しい沈降を形成することを意味する。帯域５は：ゲルマ
トリックスの貫通なしを意味する。

【００４３】

【実施例】

１．ゲル試験では機能しない、技術水準の合成粒子を用
いる実験（比較例）試験実施：通常、固体粒子１０％（ｗ／ｖ）の濃度にあ
る市販により得られる有色合成粒子の懸濁液を、１０ミ
リモルＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）（Sigma P 4417）、
０．１％ツウィーン−２０（Sigma P 7949）（ｖ／ｖ）
で洗浄し、同溶液中で固体粒子０．１５％の濃度に調節
した。

【００４４】この懸濁液から、それぞれ２５μｌを微量
反応小管中にピペットで入れ、第１表に記載の条件下で
沈降させた。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【表２】

【００４７】２．好適な合成粒子の製造下記の例で使用される合成粒子を分散重合で製造した
が、それというのも、この方法は一般的に１〜５μｍの
範囲内の粒子を製造するのに最も好適であるからであ
る。第１の工程で、ポリスチレンから成るベース粒子を
合成した（２ａ）。その後に、このベース粒子をスチレ
ン／ブロモスチレンとの共重合により増大させて高密度
粒子にした（２ｂ）。引き続く第３工程で、着色を行っ
た（２ｃ）。

【００４８】２ａ．ベース粒子の重合実施：１−ヘキサデカノール（Aldrich 25,874-1）６０
ｇ、ポリビニルピロリドン４００００（ＰＶＰ）（Aldr
ich 85,656-8）２１６ｇ、蒸留スチレン（Aldrich S497
-2）１７４４ｇ及び工業用アルコール剤（Banners IMS
99）１０２６１ｇを、（撹拌機、水コンデンサ及び窒素
ガスによる処理装置（Stickstoff-Begasung）を装備さ
れた）２０リットル丸底フラスコ反応器に量り入れた。
撹拌速度を３５〜４０ｒｐｍに調節した。混合物を室温
で１６時間ガスで処理した。続いて、温度を７０℃まで
高めた。次いで、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（Fi
sons A/9050/50）１７.４ｇを反応混合物に添加し、そ
の際、白いエマルジョンが形成された。更に２４時間の
後に、反応混合物を室温まで冷却させた。生じる粒子を
メタノール中で遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を繰
り返すことにより洗浄し、最後の洗浄工程の後に０．１
％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Fisons S/5200/53）溶液中に再分
散させた。このバッチから直径２．３μｍを有する単分
散ポリスチレン粒子１５７３ｇが生じた。

【００４９】２ｂ．「高密度」粒子の製造実施：（例２ａにより製造された）２．３μｍ粒子の１
０％（ｗ／ｖ）懸濁液１１８．３ｇ及びポリビニルアル
コール（Harco 26-88）（ＰＶＡ）（５％ｗ／ｖ）溶液
２５０ｇを、（撹拌機、水コンデンサ及び窒素ガスによ
る処理装置を装備された）１リットル丸底フラスコ反応
器に量り入れ、撹拌速度を２５０ｒｐｍに調節した。過
酸化ベンゾイル（Aldrich 22,887-7）１．５ｇを４−ブ
ロモスチレン（Avocado 17896）２１．６ｇ中に溶かし
た。この溶液を０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液２５０ｍ
ｌ中に乳化させた。次いで、このブロモスチレンエマル
ジョンを丸底フラスコ反応器に添加した。３時間の後
に、１％（ｗ／ｖ）重クロム酸ナトリウム（Fisons S/3
560/60）溶液１２５ｇを反応容器に添加し、温度を７０
℃に高めた。更に１６時間の後に、温度を８０℃に高
め、更に３時間反応させた。その後に、反応混合物を室
温まで冷却させた。生じる粒子を、水中で繰り返し遠心
分離することにより洗浄すると、直径３．１μｍの粒子
２６．９８ｇの収量が生じた。この粒子のポリマーブロ
モスチレンの名目含有率は、６５％（ｗ／ｖ）であっ
た。水中でのこの粒子の１％（ｗ／ｖ）懸濁液の沈降速
度は、５．７ｍｍ／時であったし、理論上の密度は１．
２８ｇ／ｃｍ³である（第２表を参照）。

【００５０】この方法により、同じ直径であるが、ブロ
モスチレン／スチレンの異なる比率を有し、ひいては異
なる高さの密度を有する異なる粒子を重合させた（第２
表）。

【００５１】

【表３】

【００５２】２ｃ．高密度粒子の着色実施：スダンＩＶ（赤色）：（２ａ、２ｂに記載されているよ
うに製造された）直径３．１μｍを有する合成高密度粒
子の１０％（ｗ／ｖ）懸濁液２００ｇ、ポリビニルアル
コール（Harco 26-88）の５％（ｗ／ｖ）溶液１１．６
ｇ、メタノール（Hammond）４０ｇ及び水２４０ｇを、
（ＰＴＦＥ−撹拌機、水コンデンサが装備された）１リ
ットル丸底フラスコ反応器に量り入れた。色素スダンＩ
Ｖ（Kodak 112 6150）０．４ｇをジクロロメタン（Fiso
ns D/1852/25）３０ｇ中に溶かし、この溶液を０．５％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液２５０ｍｌ中に乳化させた。次い
で、ジクロロメタンエマルジョンを室温で反応器中に入
れた。４時間の後に、生じる赤色粒子のエマルジョンを
２リットルビーカーに入れた。ジクロロメタンをできる
だけ早く蒸発させるために、懸濁液の表面を撹拌下で窒
素ガスで処理した。蒸発を最大にするために、懸濁液を
付加的に軽く加温した。生じる赤色粒子を、水中で繰り
返し遠心分離することにより洗浄した（１０００ｒｐ
ｍ、５分）。赤色粒子は、１９．８ｇの収量であった。

【００５３】フェロ（Ferro）ＦＷ１２６３（青
色）：（２ａ、２ｂに記載されているように製造され
た）直径３．１μｍを有する合成高密度粒子の１０％
（ｗ／ｖ）懸濁液５０ｇ、ポリビニルアルコール（Harc
o26-88）の５％（ｗ／ｖ）溶液２．９ｇ及び水６０ｇ
を、（ＰＴＦＥ−撹拌機、水コンデンサが装備された）
１リットル丸底フラスコ反応器に量り入れた。色素フェ
ロＦＷ１２６３（Ferro Normandy Plastics Ltd, Wes
tgate, Aldridge, GB）０．１８４ｇをジクロロメタン
（Fisons D/1852/25）７．５ｇ中に溶かし、この溶液を
０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液６２．５ｍｌ中に乳化さ
せた。次いで、ジクロロメタンエマルジョンを室温で反
応器中に入れた。２時間の後に、生じる青色粒子のエマ
ルジョンを５００ｍｌビーカーに入れた。ジクロロメタ
ンをできるだけ早く蒸発させるために、懸濁液の表面を
撹拌下で窒素ガスで処理した。蒸発を最大にするため
に、懸濁液を付加的に軽く加温した。生じる青色粒子
を、水中で繰り返し遠心分離することにより洗浄した
（１０００ｒｐｍ、５分）。青色粒子は４．８ｇの収量
であった。

【００５４】３．粒子表面の官能化及びストレプタビジ
ン化（Streptavidinisierung）ａ）アルデヒド粒子の製造：（２ａ〜ｃに記載されてい
るように製造された）赤色３．１μｍ高密度粒子の部分
標本１ｍｌ（１７．１％）（ｗ／ｖ）を、１５ｍｌ遠心
分離機小管に入れ、遠心分離により超純粋な（18 MegOh
m）水で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ、５分）。この
ようにして洗浄された粒子に、１０ミリモルＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４、ＮａＮ₃ ０．０５％）中の牛血清アルブミ
ンの溶液（２．６７ｍｇ／ｍｌ）（Sigma A9647）１５
ｍｌを添加し、室温で４時間撹拌した。粒子を、遠心分
離により水１５ｍｌで４回洗浄した（１０００ｒｐｍ、
５分）。次いで、粒子を水１０ｍｌ中に再懸濁させ、
１．７％（ｗ／ｖ）の濃度にした。この懸濁液の部分標
本０．５ｍｌに、水３．７５ｍｌを添加し、０．２％
（ｗ／ｖ）懸濁液を得た。これに、水中の２％グルタル
アルデヒド溶液４．２５ｍｌを添加し、反応混合物を室
温で１時間撹拌した。粒子を遠心分離により水１５ｍｌ
で４回洗浄した（１０００ｒｐｍ、５分）。

【００５５】ｂ）ストレプタビジン粒子の製造（２ａ〜ｃに記載されているように製造され、３ａに記
載されているように官能化された）赤色３．１μｍ高密
度粒子８ｍｇの懸濁液を、水４ｍｌ中に再懸濁させ、超
音波水槽（Sonomatic von Langford Ultrasonics, Birm
ingham, GB）中で１分間インキュベートした。次いで、
５０ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．２５）４
ｍｌを添加し、次いでストレプタビジン水溶液（４ｍｇ
／ｍｌ）１ｍｌを添加した。超音波水槽中で更に２分間
の後に、直ちにアセテート緩衝液中の５０ミリモルシ
アンホウ水素化ナトリウム（Aldrich 15,615-9）溶液１
ｍｌを添加した。この混合物を、軽い振盪下で１晩にわ
たり室温でインキュベートした。粒子を遠心分離により
水１５ｍｌで３回洗浄し（１０００ｒｐｍ、５分）、１
０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４）５．３３ｍｌ中に再懸
濁させ、その結果、粒子濃度を０．１５％（ｗ／ｖ）に
調節した。

【００５６】ｃ）ポリリシン粒子の製造水１ｍｌ中の（２ａ〜ｃに記載されているように製造さ
れ、３ａに記載されているように官能化された）赤色
３．１μｍ高密度粒子５００ｍｇの懸濁液に、５０ミリ
モル酢酸ナトリウム（ｐＨ３．２５）４ｍｌを添加し
た。次いで、水中の１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リシン
（Sigma P 2636）溶液４ｍｌを添加した。アセテート緩
衝液中の５０ミリモルシアンホウ水素化ナトリウム１
ｍｌを添加する前に、反応混合物を超音波水槽中で４分
間インキュベートした。混合物を、軽い振盪下で１晩に
わたり室温でインキュベートした。粒子を遠心分離によ
り水で３回洗浄し（１０００ｒｐｍ、５分）、１０ミリ
モルＰＢＳ（ｐＨ７．４）３３３ｍｌ中に再懸濁させ、
その結果、粒子濃度を０．１５％（ｗ／ｖ）に調節し
た。

【００５７】４．官能化粒子へのリガンドの結合ａ）高親和性結合ビオチニル化された抗原の溶液０．１ｍｌを、エッペン
ドルフ−ミクロ小管（Eppendorf-Mikroroehrchen）中の
（２ａ〜ｃに記載されているように製造され、例３ａ、
３ｂに記載されているようにストレプタビジン化され
た）赤色３．１μｍ高密度粒子の０．１５％（ｗ／ｖ）
懸濁液１ｍｌに添加し、振盪下で３０分間インキュベー
トした。未結合の抗原を、２回の遠心分離（１０００ｒ
ｐｍ、５分）及び上記緩衝液１ｍｌとの再懸濁により洗
浄除去し、その結果、粒子懸濁液の最終濃度は再び０．
１５％（ｗ／ｖ）であった。

【００５８】ｂ）非共有性結合（２ａ〜ｃ及び３ａ、３ｃに記載されているように製造
された）赤色３．１μｍ高密度ポリリシン粒子の０．１
５％懸濁液５００μｌに、１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ
７．４）中の２０μｇ／ｍｌｄｓＤＮＡ（Sigma D 15
01）溶液１０μｌを添加した。段階８で５秒間の渦動工
程（Vortex-Schritt）（Bender & Hobein,Vortex Genie
2）の後に、軽い撹拌下で室温で１２時間インキュベー
トした。懸濁液を遠心分離により１０ミリモルＰＢＳ
（ｐＨ７．４）１ｍｌで２回洗浄し（１０００ｒｐｍ、
５分）、改めて１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４）５０
０μｌ中に再懸濁させた。

【００５９】５．ゲルマトリックスの緩衝組成微量反応容器中のゲルマトリックスは、下記の水性の緩
衝環境にある：５ミリモルＫＨ₂ＰＯ₄（Merck 487
3）／Ｎａ₂ＨＰＯ₄（Merck 6580）、１５０ミリモル
ＮａＣｌ（Fluka 71381）、０．０２４％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＮ₃（Fluka 71290）、１．８７５％（ｖ／ｖ）アルブ
ミン（Miles 81-177）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ
（Fluka 03685）、１．３ミリモルトリス（Merck 838
2）、１．２５ミリモルＮ−アセチル−Ｌ−システイ
ン（Merck 12422）、０．０２５％（ｗ／ｖ）ムチン（S
igma M 1778）。更に、ゲルマトリックスは、試験に依
存して異なる量の抗ヒトグロブリンを含有してもよい。

【００６０】６．シャーガス抗体試験（合成ペプチドの
高親和性結合）ａ）抗原：合成ペプチドＡｇ−２、ＴｃＤ及びＴｃＥ
は、ＡｌｔａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Birmingham, U
K）に由来する。

【００６１】ｂ）結合：（２ａ〜ｃに記載されているよ
うに製造され、例３ａ、３ｂに記載されているように官
能化及びストレプタビジン化された）赤色３．１μｍ高
密度粒子の０．１５％（ｗ／ｖ）懸濁液各１ｍｌを、
公知技術により、ビオチニル化されたリシンを用いて付
加的に抗原配列（Antigen-Sequenz）に合成され、ＲＰ
−ＨＰＬＣを介して同様に公知技術により純度＞９０％
に精製された、ＴｃＤ２ｎｇ、Ａｇ−２３５ｎｇ及
びＴｃＥ２８２ｎｇと結合させた。このために、ペプ
チドからＨ₂Ｏ中の１０倍の原液（１ｍｌ当たりＴｃＤ
２０ｎｇ、Ａｇ−２３５０ｎｇ、ＴｃＥ２８２０
ｎｇ）を用意した。次いで、結合のために、ペプチド溶
液各１容量を、合成粒子の０．１５％（ｗ／ｖ）懸濁
液１０容量に添加し、素早く混ぜた。次いで、反応混
合物を室温で軽い振盪下で３０分間インキュベートし
た。その後に、粒子懸濁液を、１０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上澄みをデカントし、１０ミリモルＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。粒子の最終的な濃度
は、懸濁液中で再び０．１５％（ｗ／ｖ）であった。こ
のように感作された粒子を４℃で貯蔵した。

【００６２】ｃ）試験実施：４ａに記載のように感作さ
れた合成粒子の０．１５％（ｗ／ｖ）懸濁液を、超音波
水槽中で５分間処理した。次いで、各２５μｌを、抗ヒ
トグロブリン含有（０．５％、ｖ／ｖ）ゲル懸濁液で予
め満たされたミクロ小管６個を有するカード（例５を参
照：ＩＤ−カード、DiaMed, Cressier sur Morat）に入
れた。引き続いて、患者の血清又は血漿１．５μｌを添
加した。室温で１０分間のインキュベーションの後に、
特別にミクロ小管用に開発された遠心分離機（ID-Centr
ifuge12 S II, DiaMed, Cressier sur Morat）中で８５
ｇで１０分間遠心分離した。結果は、遠心分離の直後に
判定することができる。

【００６３】ｄ）判定：陽性の結果は、ゲル上の又はゲ
ル中に１〜２ｍｍ貫入した明確な帯として検出可能であ
る。ゲル全体上に分布した凝集物も、陽性反応を示して
いる。陰性反応は、容器の底に沈降した合成粒子の明確
な沈降物から認識することができ、ゲル中又はゲル上の
帯は、この場合には存在しない。

【００６４】７．内蔵リーシュマニア症抗体試験（組み
換え抗原の高親和性結合）ａ）抗原：ＣｏｒｉｘａＩｎｃ．（シアトル、USA）
の組み換え抗原ｒＫ３９ｂ）ビオチニル化及び結合：１０ミリモルトリス（ｐ
Ｈ８．０）中の組み換え抗原ｒＫ３９（０．６ｍｇ／ｍ
ｌ）１ｍｌを、１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Si
gma P 4417）に対して４℃で透析し、次いで、プラディ
スク（Puradisc）２５ＡＳ膜フィルター（Whatma
n）を通して濾過した。ビオチニル化を、スルホ−ＮＨ
Ｓ−ビオチン（Pierce 21217）を用いて行った。１０ミ
リモルＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のｒＫ３９の部分標本５
００μｌ（３００μｇ）に、１ｍｇ／ｍｌスルホ−Ｎ
ＨＳ−ビオチン水溶液１７．５μｌを加えた。反応混合
物を室温で１５０分間インキュベートした。次いで、ビ
オチニル化されたｒＫ３９を、ＫｗｉｋＳｅｐ−脱塩カ
ラム（Pierce）を用いて遊離ビオチンから分離した。溶
離を１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＮａＮ₃ ０．
０５％）を用いて行った。

【００６５】次いで、（２ａ〜ｃに記載されているよう
に製造され、例３ａ、３ｂに記載されているように官能
化及びストレプタビジン化された）赤色３．１μｍ高密
度粒子の０．１５％（ｗ／ｖ）懸濁液各１ｍｌを、ビ
オチニル化されたｒＫ３９１６０ｎｇと結合させた。こ
のためにＨ₂Ｏ中の１０倍の原液（１ｍｌ当たりｒＫ３
９１６００ｎｇ）を製造した。次いで、本来の結合を
例６ｂに記載のように行った。

【００６６】ｃ）試験実施：試験実施は、例６における
試験実施と同じであり、この場合には、ｒＫ３９で感作
された合成粒子の懸濁液を用いて作業する。

【００６７】ｄ）判定：例６と同様。

【００６８】８．Ｂ型肝炎表面抗原試験（単クローン抗
体の高親和性結合）ａ）抗体：Ｂ型肝炎表面抗原に対する単クローン抗体
（ＭＡｂ）ＭＩＨ９７０１は、両方の亜型ａｄ及びａｙ
を検出し、ＭｅｄｉｘＢｉｏｔｅｃｈ（Walchwil、ス
イス）に由来した。

【００６９】ｂ）ビオチニル化及び結合：３ｍｇ／ｍｌ
ＭＩＨ９７０１溶液２００μｌを、０．１モル酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて１ｍｌに希釈
し、同緩衝液に対して４℃で１晩にわたり透析した。生
じるＭＡｂ溶液の部分標本９００μｌに、水中の氷冷２
０ミリモルメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液９００μｌ
を添加し、反応混合物を暗所で０℃で２０分間インキュ
ベートした。反応を１０％（ｗ／ｖ）グリセリン溶液１
１μｌの添加により停止させた。ＭＡｂを、Ｋｗｉｋｓ
ｅｐ−脱塩カラムを介するクロマトグラフィー工程によ
り、残りの反応成分から分離した。その際、０．１モル
アセテート緩衝液（ｐＨ５．５）で溶離した。溶離後
のＭＡｂの容量は２．７ｍｌであった。これに、ジメチ
ルスルホキシド（Sigma D 8418）中のＥＺ−リンクビ
オチン−ＬＣ−ヒドラジド（Pierce 21340）の５０ミリ
モル溶液２７０μｌを添加し、軽い振盪下で室温で２時
間インキュベートした。次いで、反応混合物を、４℃で
１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＮａＮ₃ ０．０５
％）に対して透析し、次いで、０．２μｍプラディスク
ＡＳフィルター（Whatman）を通して濾過した。Ｋ
ｗｉｋｓｅｐ−脱塩カラムを用いて、最終的な脱塩工程
を１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＮａＮ₃ ０．０
５％）に対して実施した。

【００７０】このようにしてビオチニル化されたＭＡｂ
を、同じＰＢＳ緩衝液中で３５μｇ／ｍｌに調節する。
次いで、（２ａ〜ｃに記載されているように製造され、
３ａ、３ｂに記載されているように官能化及びストレプ
タビジン化された）赤色３．１μｍ高密度粒子の０．１
５％（ｗ／ｖ）懸濁液１ｍｌに、希釈されたＭＡｂ溶
液１００μｌを添加した。この反応混合物を、軽い振盪
下で室温で３０分間インキュベートした。次いで、粒子
を、遠心分離により同緩衝液で３回洗浄した（１０００
ｒｐｍ、５分）。

【００７１】ｃ）試験実施：試験実施は、例６と同様で
あるが、下記の差異を有する：ｉ）ＭＡｂＭＩＨ９７０１で感作された合成粒子の懸
濁液を用いて作業した。

【００７２】ii）ゲルマトリックスは、抗ヒトグロブリ
ンを含有しなかった。

【００７３】ｄ）判定：例６と同様。

【００７４】９．抗−ｄｓＤＮＡ抗体に関する試験（ｄ
ｓ−ＤＮＡの非共有結合）ａ）抗原：２重鎖（ｄｓ）−ＤＮＡ（タイプＩ）は、Ｓ
ｉｇｍａに由来した（D-1501）。

【００７５】ｂ）結合：（２ａ〜ｃ及び３ａ、３ｃと同
様に製造された）赤色３．１μｍ高密度粒子の０．１５
％（ｗ／ｖ）懸濁液５００μｌに、１０ミリモルＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍｌｄｓＤＮＡ（Si
gma D 1501）１０μｌを添加した。段階８で５秒間の渦
動工程（Bender & Hobein, Vortex Genie 2）の後に、
軽い振盪下で室温で１２時間インキュベートした。この
懸濁液を、遠心分離により１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ
７．４）１ｍｌで２回洗浄し、１０ミリモルＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）５００μｌ中で再懸濁させた。粒子の最終的
な濃度は再び０．１５％（ｗ／ｖ）であり、感作粒子を
４℃で保存した。

【００７６】ｃ）試験実施：例６と同様。

【００７７】ｄ）判定：例６と同様。

【００７８】１０．ＨＩＶ１／ＨＩＶ２抗体鑑別試験
（異なる色を有するがその他の物理的特性は同じであ
る、異なって感作された２種の合成粒子の使用）ａ）抗原：ＡｌｔａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Birmingh
am, UK）のＨＩＶ−１ｇｐ４１及びＨＩＶ−ｇｐ３６
−からの合成ペプチド配列（Peptide-Sequenz）ｂ）例６と同様にして、０．１５％（ｗ／ｖ）粒子懸濁
液各１ｍｌをｇｐ−４１ペプチド７２ｎｇ及びｇｐ
３６ペプチド４０ｎｇと結合。（２ａ〜ｃに記載され
ているように製造され、例３ａ、３ｂに記載されている
ように官能化及びストレプタビジン化された）赤色粒子
を、ＨＩＶ−２特異性ペプチド（ｇｐ３６からの抗原配
列）で感作し、（２ａ〜ｃに記載されているように製造
され、例３ａ、３ｂに記載されているように官能化及び
ストレプタビジン化された）青色粒子を、ＨＩＶ−１特
異性ペプチド（ｇｐ４１からの抗原配列）で感作した。

【００７９】ｃ）試験実施例６と同様であるが、次の差異を有する：赤色粒子の懸
濁液及び青色粒子の懸濁液各１０μｌを、ミクロ小管
の反応室中にピペットで入れた。次いで、患者の血清
２．５μｌを添加した。

【００８０】ｄ）判定ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陽性の結果は、ゲル上の又はゲ
ル中に１〜２ｍｍ貫入した明確な赤色／青色帯として検
出可能となった。この場合には、粒子の沈降はなかっ
た。ＨＩＶ−１抗体陽性の結果は、ゲル上の又はゲル中
に貫入した青色帯を示すが、赤色粒子は、反応容器の底
に沈降物を形成した。ＨＩＶ−２抗体陽性の結果は、逆
の様相を示した。ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陰性の結果
は、微量反応容器の底での明確な赤色−青色沈降物から
認識することができる。

【００８１】１１．非ＩｇＭ抗体の特異的検出ａ）抗原：Ｓ．アウレウス（S. aureus）プロテイン
Ａは、Ｓｉｇｍａに由来し（P 6650）；ヤギ抗ヒト
ＩｇＭ抗体（μ鎖特異性）−ビオチン結合体（Konjuga
t）Ｆ（ａｂ）₂フラグメントは、Ｓｉｇｍａに由来した
（B 2641）。

【００８２】ｂ）ビオチニル化及び結合：プロテインＡ
のビオチニル化を例８に記載されているのと同様に行っ
た。ビオチニル化された抗ＩｇＭ抗体を、１０ミリモル
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、１バッチ中では４０μｇ／
ｍｌ３．１μｍ高密度粒子（１．５％、ｗ／ｖ）に調
節し、もう１つ別のバッチでは、１μｇ／ｍｌ粒子
（０．１５％ｗ／ｖ）に調節し、ビオチニル化プロテイ
ンＡは、１ｕｇ／ｍｌ粒子（０．１５％ｗ／ｖ）の濃
度に調節した。その際、（２ａ〜ｃに記載されているよ
うに製造され、例３ａ、３ｂに記載されているように官
能化及びストレプタビジン化された）赤色３．１μｍ高
密度粒子の懸濁液各１ｍｌに、ビオチニル化された抗
ＩｇＭ抗体を有するそれぞれ１０倍に濃縮された溶液
（４００μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）又はプロテイ
ンＡを有する１０倍に濃縮された溶液（１０μｇ／ｍ
ｌ）１００μｌを添加した。

【００８３】この反応混合物を、軽い振盪下で室温で３
０分間インキュベートした。次いで、粒子を、遠心分離
により同じ緩衝液で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ、５
分）。

【００８４】ｃ）試験実施抗ＩｇＭで感作された粒子１ｍｌを、１０００ｒｐｍで
５分間遠心分離し、上澄みを除去した。健常者の血清の
１対１０の希釈液２０μｌを添加した。血清のＩｇＭ抗
体を吸着させるために、段階８での５秒の渦動の後に、
反応混合物を軽い振盪下で室温で３０分間インキュベー
トした。改めて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後
に、上澄みを取った。次いで、（例６に記載と同様の）
抗ＩｇＧ含有カードに、下記のようにピペットで入れ
た：場所１：プロテインＡ粒子（１μｇ／ｍｌ）２５μｌ場所２：プロテインＡ粒子（１μｇ／ｍｌ）２５μｌ場所３：抗ＩｇＭ粒子（１μｇ／ｍｌ）２５μｌ場所４：抗ＩｇＭ粒子（１μｇ／ｍｌ）２５μｌ。

【００８５】場所１及び場所３に、それぞれ、１対１０
に希釈された吸着前の血清５μｌを入れ、場所２及び４
に、それぞれ、１対１０に希釈された吸着後の血清５μ
ｌを入れた。室温で１０分間のインキュベーションの後
に、特別にミクロ小管用に開発された遠心分離機（ID-C
entrifuge 12 S II, DiaMed, Cressier sur Morat）中
で８５ｇで１０分間遠心分離した。

【００８６】ｄ）判定：両方の検査小管１及び３が、例
６の記載と同様な明確な陽性反応を示した。試験バッチ
２及び４のうち、２は、小管１のとは異ならない陽性反
応を示したが、場所４では、粒子は反応容器の底に沈降
物を形成し、従って陰性反応を示した。即ち、この試験
で特異的に非ＩｇＭ抗体反応を検出することができた。

【００８７】１２．合成粒子用の改良遠心分離ａ）抗原及び結合：例６と同様の合成ペプチドの由来及
び結合ｂ）試験実施：通常例６の記載と同様に、感作合成粒子２５μｌ及び次いで
血清／血漿５μｌを、予め用意したミクロ小管のインキ
ュベーション室にピペットで入れた。室温で１０分間の
インキュベーションの後に、ミクロ小管に好適な遠心分
離機（ID-Centrifuge 12 S II, DiaMed, Cressier sur
Morat）中で８５ｇで１０分間遠心分離した。

【００８８】改良後例６の記載と同様に、感作合成粒子２５μｌ及び次いで
血清／血漿５μｌを、予め用意したミクロ小管のインキ
ュベーション室にピペットで入れた。室温で５分間のイ
ンキュベーションの後に、カードを改良ＩＤ−遠心分離
機（DiaMed, Cressier sur Morat）に入れ、下記の特別
プログラムで運転した：１）５秒間の遠心分離、３０ｇ２）５分間の休止、０ｇ３）１０分間の遠心分離、８５ｇ。

【００８９】ｃ）判定判定を例６の記載と同様に行った。抗ＩｇＧ含有ゲルマ
トリックスを扱う試験では、特に、弱い陽性の結果の一
般的な強化が観察される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による方法での陽性、弱い陽性及び陰性
反応で生じる結果を示す図。

【図２】試験実施の図式。

【図３】マトリックスが抗ＩｇＧ−抗体を含有する微量
反応容器中で生じる反応を示す図。

【図４】１反応容器中の異なる２種の分析物に関する鑑
別診断の結果の図式。

【図５】反応帯域の図式。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロデリックエヌホッブスイギリス国チェシャーチェスターヴィクトリアロード 41 (72)発明者グレアムマーゲッツイギリス国シュロプシャーシュルースベリーサンドーンクレッセント 137 (72)発明者マイケルジェイマーシャルイギリス国シュロプシャーオスウェストリーパークホールパーククレッセント２ (72)発明者マークジェイジェイロバーツイギリス国シュロプシャーシュルースベリーコプトーンオークフィールドロード 65

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験液を凝集試薬及び不活性マトリック
スと接触させ、反応混合物に重力を作用させ、分析物と
凝集試薬との反応を検定する、凝集により試験液中の分
析物を検出する方法において、凝集試薬として合成粒子
を使用し、該粒子がマトリックスに対して実質的に赤血
球のように挙動するように該粒子の直径及び密度を選択
することを特徴とする、凝集による試験液中の分析物の
検出法。
【請求項２】合成粒子が平均直径≦５μｍを有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】合成粒子が１〜５μｍの範囲内の平均直
径を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】合成粒子が２〜４μｍの範囲内の平均直
径を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】合成粒子が密度≧１．１ｇ／ｃｍ³を有
する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】合成粒子が１．１〜１．８ｇ／ｃｍ³の
範囲内の密度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】合成粒子が１．１５〜１．４ｇ／ｃｍ³
の範囲内の密度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】有機ポリマー又はコポリマーから成る合
成粒子を使用する、請求項１から７のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項９】スチレン又はスチレン誘導体から成る合
成粒子を使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】着色された粒子を使用する、請求項１
から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】赤色に着色された粒子を使用する、請
求項１０に記載の方法。
【請求項１２】粒子の表面上に、検定されるべき分析
物と結合可能であるリガンド分子が固定されている、請
求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】リガンド分子が、吸着性、共有結合性
又は高親和性の相互作用を介して固定されている、請求
項１２に記載の方法。
【請求項１４】粒子の表面上に、ペプチド、タンパク
質、核酸、核酸類似体、糖類、脂質、ホルモン又は代謝
産物が、吸着性又は高親和性の相互作用を介して固定さ
れている、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】粒子の表面上に、細胞膜、細胞膜のフ
ラグメント又は細胞若しくは病原体の溶解質が、吸着性
相互作用により結合されている、請求項１２又は１３に
記載の方法。
【請求項１６】分析物の検定を免疫反応により行う、
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】分析物が抗体である、請求項１６に記
載の方法。
【請求項１８】抗体をクラス特異的に検出する、請求
項１７に記載の方法。
【請求項１９】分析物が抗原である、請求項１６に記
載の方法。
【請求項２０】分析物の検定を核酸ハイブリッド形成
反応により行う、請求項１から１５のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項２１】粒状マトリックスを使用する、請求項
１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】マトリックス粒子の平均直径が１０〜
２００μｍの範囲内である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】数種の分析物を同時に検定し、その
際、各分析物に異なって着色された凝集試薬を使用す
る、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】反応混合物が洗浄剤又は／及びムチン
を含有する、請求項１から２３のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項２５】反応混合物が還元剤を含有する、請求
項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】反応混合物への重力の作用は遠心分離
を含む、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項２７】遠心分離を複数の間隔をおいて実施す
る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】合成粒子において、平均直径≦５μｍ
及び密度≧１．１ｇ／ｃｍ³を有し、該粒子の表面上に
リガンド分子が固定されていることを特徴とする合成粒
子。
【請求項２９】２〜４μｍの平均直径及び１．１５〜
１．４ｇ／ｃｍ³の密度を有する、請求項２８に記載の
粒子。
【請求項３０】着色されている、請求項２８又は２９
に記載の粒子。
【請求項３１】請求項２８から３０のいずれか１項に
記載の粒子を凝集試薬として凝集試験で使用すること。
【請求項３２】試験液中の分析物の検出用試薬キット
において、該キットが、ａ）不活性マトリックスが入っている反応容器少なくと
も１個、及びｂ）請求項２８から３０のいずれか１項に記載の合成粒
子少なくとも１種を含むことを特徴とする、試験液中の
分析物の検出用試薬キット。
【請求項３３】数個の反応容器が１つのカード又はデ
ィスク上に配置されている、請求項３２に記載の試薬キ
ット。