【発明の詳細な説明】
イムノアッセイ及びＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用する
ための水溶性ポリマー
発明の背景
本発明は、一般的には、支持体上へアッセイ結合試薬を固定化するための方法
に関する。特に、本発明は、ポリマーを用いて固相支持体上へ試薬を固定化する
ための方法に関する。本発明はまた、水溶性ポリマーを利用してイムノアッセイ
又はＤＮＡハイブリタイセーションアッセイを実施するための方法にも関する。
本発明はまた、診断アッセイにおいて有用な固定化した試薬を有する固相支持体
にも関する。
発明の背景
in vitro臨床アッセイは、体液サンプル又は組織サンプル中の分析対象の量を
測定するのに使用することができる。該分析対象は、該サンプル中の他の成分か
ら識別されなければならない。分析対象は、該対象をその対象に対する特異的レ
セプター及び標識された反応体又は指示薬と反応させることによって、他のサン
プル成分から識別することかできる。分析対象を識別し及び／又は定量するため
に特異的レセプターを利用するアッセイは、しばしば特異的結合アッセイと呼ば
れている。
殆どの普通のレセプターは、内因子、葉酸結合性タンパク質、甲状腺結合性グ
ロブリンのような、抗体及び他のタンパク質を含む。これらのレセプターは、分
析対象又は該分析対象の類縁体に対する
特異的結合親和性を有する。該結合レセプターと分析対象は、しばしば一まとめ
にして結合対と呼ばれる。
他のレセプターとしては、ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖が含まれる。これらのレセプタ
ーは、ＤＮＡ二本鎖又はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの存在の検出において有用
である。in vitro診断アッセイを実施するための方式には、競合的、連続的、そ
してサンドイッチ方式がある。
in vitro診断アッセイ、そして特にイムノアッセイは、歴史的に、均質である
か不均質であるかとして分類されてきた。不均質系においては、アッセイ全体は
単一の、本質的に液相中で行われる。反応体、サンプル及び試薬（すなわち、標
識された反応物）は、サンプル液画分に含まれており、そして指示薬量のモニタ
リングは、レセプターの結合した材料と液中に遊離したままの材料との間の分離
をなんら行うことなく、実施される。物理的又は化学的信号が、結合した材料を
遊離の材料から識別する。
不均質イムノアッセイにおいては、遊離の材料の結合した材料からの物理的分
離が行われる。免疫化学的反応の結合対の一方の成分（例えば抗体）が、吸着又
は共有結合のような技術を用いてしばしば固相又は支持体に固定化される。他方
の反応体（例えは、分析対象及び支持体）は、通常、液の形で加えられる。これ
ら他の反応体が、固定化された結合相手と結合する。こうして、この固定化され
た結合対を含んだ固相か、液相から容易に分離されて、互いに他を含まない２つ
の画分をもたらす。指示薬のレベルが、次いでモニターされる。
均質イムノアッセイは、不均質アッセイに対して有利であると考
えられている。それらが完全に液相中において行われるからである。均質アッセ
イにおけるような全く溶液中で起こる反応は、不均質イムノアッセイよりも素早
く進行することが判明している。均質アッセイにおいては、レセプターは、静止
した固相に結合しておらず、溶液中を自由に動く。こうして、レセプターとその
結合相手との間の反応の速度は、より速い。例えば、Newman，D．and Price，C.
；Separation techniques，Principles and Practice of Immunoassay，Macmill
an Publisher Ltd.，1991；pp．78-95を参照のこと。加えて、均質アッセイは不
均質アッセイに比して少ないステップを有し、従って、不均質アッセイに比して
より迅速でより安価である。しかしながら、均質アッセイは、不均質アッセイ程
には自動化が容易でない。更には、一般に、均質アッセイの感度は、不均質アッ
セイの感度より低い。
不均質アッセイは、それらが一層容易に自動化に適合でき且つ通常均質アッセ
イよりも高い感度を有するという点において、均質アッセイによりも有利である
と考えられる。しかしながら、固相不均質アッセイは、非特異的結合、という固
有の不利益を有する。更には、レセプターを固相に直接に結合させると、レセプ
ターの運動が制限され、立体障害が増大され、こうしてレセプターとその結合相
手との間の反応が遅くなり得る。加えて、レセプターは、幾つかのタイプの共有
結合による結合の過酷な条件下では特に、変性、不活性化され又は破壊され得る
。
均質及び不均質アッセイシステムの結合が、米国特許第14,517,288号に記述さ
れている固相、放射状分配イムノアッセイ（ＲＰＩＡ）である（その全てを参照
によりここに導入する）。ＲＰＩＡは、
均質及び不均質アッセイに関わる問題の多くを克服し、しかも各々の利点の多く
を維持している。
ＲＰＩＡの固相は、反応容器としても働く不活性のガラス繊維固相支持体であ
る。そのガラス繊維支持体は、非特異的結合が低い。レセプターは、該固相の限
られた領域に固定化されて反応区域を形成する。サンプル及び他の反応体（少な
くともそれらのうちの一方は標識されている）が、反応区域の固定化されたレセ
プターと反応するよう、加えられる。遊離の分析対象及び又は分析対象の類縁体
の、結合したものからの分離は、反応区域が未結合の材料を本質的に含まないよ
うにクロマトグラフィー分離によって達成され、反応区域内の標識された試薬量
かモニターされる。
ＲＰＩＡにおいては、固定化は免疫学的に達成される。一次抗体（すなわち分
析対象に対する抗体）が、得られる本質的に可溶性の免疫複合体がイムノアッセ
イにおいて十分な信号を与えるまで、二次抗体又は抗血清（すなわち該一次抗体
に対する抗体）に対して力価測定される。免疫学的固定化は、米国特許第4,517,
288号に記述されている。免疫学的固定化手順においては、本質的に可溶性の免
疫複合体が、ガラス繊維濾紙又は他の適当な固体支持体の限定された領域に適用
される。免疫学的固定化の方法は、あるタイプの共有結合による結合の、あの過
酷な条件を要しない。
しかしながら、免疫学的に固定化が達成される場合には、同一の又は異なった
宿主動物からの別々の免疫による抗血清調製物における差、力価、純度、特異性
及び親和性におけるロット間変動が、製造手順において考慮されなければならな
い。同様に、免疫複合体が本質的に可溶性ではあるものの、それは完全には可溶
性に留まって
おらず、あるものは経時的に溶液から析出し得る。原液の定期的混合によっても
、重力の影響、温度勾配その他の物理的影響が、その溶液が固相に適用されたと
きに微妙な不均質性を引き起こし得る。
こうして、特異的結合レセプターを結合させるための代わりの方法に対する需
要が存在する。
均質及び不均質アッセイの他の欠点の幾つかを克服している別の不均質法は、
反応が完全に溶液中で起こることを許容している。この方法は、固相として微粒
子を利用する。レセプターは、この微粒子上に固定化される。これらの微粒子は
、ラテックス微粒子であり、常磁性であってよい。これらの微粒子は、イムノア
ッセイに必要な他の成分をも含有する溶液に加えられる。免疫学的反応が起こっ
た後、この結合相手を担持した微粒子を他の反応体及び材料から分離することが
でき、遊離の又は結合した部分を、標識された反応体又は試薬を用いて測定する
ことができる。
しかしながら、微粒子は、反応中に溶液から沈殿してしまい得る。こうして、
粒子を懸濁させることの利点が失われる。更には、粒子は貯蔵中にも沈殿する。
こうして、粒子をサンプル管内へピペットで入れた場合、分配された粒子の数（
従って分配されたレセプターの数）は、サンプル間で均質ではない。これは、実
験の精度の乏しさをもたらす。加えて、タンパク質は、ラテックスのような疎水
性支持体に吸着／接合させたとき、しばしば生物学的活性の低下を示す。支持体
−タンパク質相互作用が、タンパク質の３次元構造を乱す可能性があり、且つ立
体障害が増大するからである。更には、レセプター：微粒子の調製に際して、粒
子が懸濁したままであるよ
う、反応容器はシェーカー・フラスコ又は超音波発器を必要とする。こうして、
追加のステッブ及び／又は装置が必要であり、それによりアッセイの変動性及び
コストを上昇させる。
こうして、分析対象を捕捉するのに支持体が使用されるがしかし溶液中におい
て均質な懸濁液に留まり、しかも結合対の形成の後は、患者サンプル及び他の材
料から容易に分離できるものであるアッセイに対する需要が存在する。
大分子量の不溶性ポリマーが、ゲルクロマトグラフィーにおいて専ら用いられ
てきた。これらのポリマー性の水不溶性担体は、ゲルカラムクロマトグラフィー
形態において使用できる水不溶性誘導体を与えるために、生物学的に活性のタン
パク質と連結されてきた。例えば、DE 2530247を参照。ポリエチレンマレイン酸
無水物（ＰＥＭＡ）のようなポリマーが、ＰＥＭＡにタンパク質を架橋させるこ
とによりタンパク質を不溶化するために使用されてきた。E.R．Centeno and A.H
．Sehon，The Use of Ethylene Maleic Anhydride for the Preparation of Ver satile Immunosorbents，
Immunochemistry，Vol．8，pp．887-900（1971）．
加えて、水不溶性複合体の酵素が生物学的活性を保持しているものである水不
溶性複合体を形成するために、酵素がＰＥＭＡに結合されてきた。Goldstein，L
.，Immobilized Enzymes The Coupling of Biologically Active Proteins to E thylene-Maleic Anhydride Copolymers of Different Anhydride Content
，Anal
ytical Biochemistry，Vol．50，pp．40-46（1972）．
水溶性複合体を形成するためにタンパク質がＰＥＭＡに結合されてきた。例え
ば、ペプシンはＰＥＭＡに結合されそしてポリマー：
タンパク質複合体は、結合したとき水溶性であり、その結合したタンパク質は、
生物学的活性を維持している。Lowenstein，H．et al.，The Use of Ethylene M aleic Anhydride for the Preparation of a Water-soluble Polyanionic Deriv ative of Pepsin．Preparation and Properties，
Acta Chem．Scand．B 28 No．
9；pp．1098-1100（1974）.を参照のこと。更には、水溶性複合体を形成するた
めのＰＥＭＡへのタンパク質の結合は、Shigenori E．et al.，Coupling of the Penicillium Duponti Acid Protease to Ethylene-Maleic Acid（1:1）Linear Copolymer．Preparation and properties
of the Water-Soluble Derivatives，
Biochimica et Biophys1ca Acta，445；pp．672-682（1976）及びNeumann，H．T wentyfold Increase in A1kaline Phosphatase Activity by Sequential Revers ible Activation of the Enzyme Followed by Coupling with a Copolymer of E thylene and Maleic Anhydride，
Applied BUlochemistry and Biotechnology Vo
l．11；pp．177-1189（1985）にも記述されている。
微粒子又は他の一次支持体マトリクスに代わるものとして、本発明は、レセプ
ターのための一次支持体マトリクスとしてのポリマーの使用を伴う。得られる共
有結合したポリマー：レセプターの複合体は、水溶性であるか又は懸濁可能であ
る。イムノアッセイ又はＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの当業者なら、
支持体として水溶性のレセプター結合ポリマーを通常選択しないであろう。いず
れも溶液又は懸濁液中にあるために、ポリマーに結合した材料の未結合の材料か
らの分離が困難だからである。しかしながら、ＲＰＩＡ技術による水溶性ポリマ
ー結合試薬の分離は、これらのポリマー
を使用することに途を開く。
発明の要約
本発明は、一次支持体マトリクスに特異的結合アッセイレセプター又は結合対
の片方を共有結合によって結合させることにより、固相支持体を調製する方法に
関する。該一次支持体マトリクスが（特異的結合レセプターを共有結合により結
合させてある）、次いで多孔性の固相支持体に固定化される。この固相支持体は
、二次支持体マトリクスとして働く。
この結合レセプターは、抗原又はそのフラグメント、抗体又はそのフラグメン
ト、ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖、タンパク質、ポリペプチド又は種々の生物反応性の
、非蛋白性の分子を包含するが、これらに限定されない。該一次支持体マトリク
スは、結合レセプターと反応することのできる官能基を有する又は有するよう誘
導体化させることのできる、ポリマーである。
このポリマー及び結合レセプターは、溶液中において共有結合により結合され
る。結合反応が起こるためには、ポリマーとレセプターとが結合溶液中に十分に
溶解しなければならない。加えて、結合レセプターは、その生物学的活性を保持
し又は取り戻すことができなければならない。この反応は、必要ならマグネチッ
クスターラーで穏やかに攪拌することができる。
この共有結合により結合されたポリマー：結合レセプターは、水性溶液に可溶
性である。本発明において有用なポリマーは、直線的基本骨格を有し、そして、
ポリエチレンマレイン酸無水物（ＰＥＭＡ）、ポリメチルメタクリレート及びポ
リエチレンイミン及びそれらの混合物を包含するが、それらに限定はされない。
不活性の支持体は、低い非特異的結合を有するよう且つ、毛管作用によって支
持体内に反応液を保持するに十分小さなすき間又はポアを支持体内に有するよう
に選択される。該支持体として有利なのは、ガラス又は合成繊維又は多孔性紙マ
ットのような圧縮された繊維のマットである。該支持体は、しかしながら、焼結
ガラス、セラミックス、合成スポンジ様材料等の、他の多孔性材料より構成され
てもよい。ガラス繊維支持体が、その不活性であることの故に好ましい。米国特
許第4,517,288号を参照のこと。水溶性ポリマー：結合レセプター複合体は、次
いで、特異的結合アッセイ複合体を形成するために該固相支持体に適用される。
該特異的結合アッセイ複合体は、ＲＰＩＡのようなアッセイ技術を用いて分析対
象の存在又は濃度を測定するために使用できる。
代わりとして、水溶性ポリマー：結合レセプター複合体は、反応が起こるのに
必要な他の成分と溶液中で反応させることができる。反応混合物は、次いで固相
に適用され、そして遊離の画分が結合された画分から分離される。こうして、こ
の面は、基本支持体としてポリマーを用いてイムノアッセイ又はＤＮＡハイブリ
ダイゼーションアッセイを実施する手段である。
水溶性のポリマー：結合レセプター複合体の使用は、分析対象の捕捉が溶液中
で起こることを許容する。更には、ＲＰＩＡによるこの水溶性ポリマー結合レセ
プターの分離は、サンプルからの該水溶性ポリマーを分離する便利な方法を提供
する。該ポリマーは一次支持体マトリクスとして機能し、そしてガラス繊維のよ
うな固体の不活性な多孔性支持体は、二次支持体として機能する。
図面の記述
図１は、水溶性ポリマーＰＥＭＡへのタンパク質の固定化を示す。
図２は、ＤＮＡ二本鎖又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの存在を検出する際に
有用な試薬を調製するための方法を示す。
発明の詳細な記述
本発明の固相診断アッセイ支持体を調製する方法において、特異的結合アッセ
イレセプターが、複合体を形成させるために、直線的骨格を有するポリマーに共
有結合によって結合される。得られる複合体は水溶性か又は懸濁可能である。次
に、有効量のこの複合体を、不活性の固体支持体の限られた領域に加える。
本発明の別の面はまた、直線的な骨格を有するポリマーと、多孔性の固相に固
定化した該ポリマーに共有結合により結合させた特異的結合アッセイレセプター
とを含む特異的結合アッセイ複合体である。この結合アッセイレセプター：ポリ
マー複合体は、本質的に水溶性である。
本発明の特異的結合レセプターは次のものを含むが、しかしそれらに限定され
ない。すなわち、抗体及びそのフラグメント及び、内因子、甲状腺結合性グロブ
リン及び葉酸結合性タンパク質のような他のタンパク質レセプター及びそれらの
フラグメント、抗原、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ
鎖である。更には、この特異的結合レセプターは、ポリマーと結合させたときに
その生物学的活性を維持し又は取り戻すことができなけれはならない。それは、
結合溶媒中に十分に溶解性でなければならず、そして最終のポリマー：特異的結
合試薬が、水性溶液中に可溶性又は懸濁可能でなければならない。溶解性は、表
から又はルーチンな実験を
用いて決定することができる。
本発明のポリマーは、直線的な骨格を有し、そして鎖状でもまた分枝していて
もよい。該ポリマーとしては、ポリエチレンマレイン酸無水物（ＰＥＭＡ）、ポ
リメチルメタクリレート、及びポリエチレンイミン又はそれらの組み合わせが含
まれるが、それらに限定はされない。好ましいポリマーは、少なくとも水性溶液
に僅かに可溶性又は懸濁可能であり、最も好ましいポリマーはＰＥＭＡである。
ＰＥＭＡは水性溶液に僅かに可溶性である。これらのポリマーは、該ポリマーと
特異的結合レセプターとの反応が起こることを許容する溶媒に可溶性でなければ
ならない。好ましい結合溶媒は、該反応に好ましいｐＨを有する緩衝化された水
性溶液である。
結合反応は、ＳＩＡＢのような既知の結合試薬を利用して行うことができる。
好ましい一具体例においては、結合試薬は可溶性のカルボジイミドである。最も
好ましい具体例においては、結合反応は、結合試薬の添加の必要なしに水性溶液
中で行われる。例えば、ＰＥＭＡは、水性溶液中約７より大きいｐＨにおいて特
異的結合レセプターのアミノ基と反応する。そのような水性溶液としては、リン
酸緩衝食塩液、ＴＲＩＳ及び他の生物学的緩衝液が含まれる。例えば、Friefeld
er D.，Physical Biochemistry pp．122-125，W.H．Freeman and Company（1982
）を参照のこと。
ＰＥＭＡとタンパク質との反応は、可溶性材料が確認できなくなったとき完了
している。１時間で一般に十分である。反応混合物は、通常僅かに粘性である。
この可溶性複合体は、必要な時まで貯蔵することができる。この水溶性複合体は
、経時的に可溶性のままでありそして安定である。好ましくは、この複合体は、
少なくとも１
年間は貯蔵してよくそしてその可溶性及び反応性が保持される。
この特異的結合アッセイ複合体の調製は、水溶性の共有結合により結合させた
結合レセプター：ポリマー複合体を、第２の緩衝液（以下スポット緩衝液という
）内へ移し替えることを必要とし得る。このスポット緩衝液は、アッセイ成分と
非反応性であるように選択される。例えば、Friefelder D.，Physical Biochemi stry
pp．122-125，W.H．Freeman and Company（1982）を参照のこと。この緩衝
液のｐＨは約5.0乃至9.0である。生理学的ｐＨが最適である。好ましい緩衝剤は
ＴＲＩＳである。緩衝液の濃度は、約20〜200ｍＭ、好ましくは30〜100ｍＭ及び
最も好ましくは約50ｍＭである。
スポット緩衝液は、ＢＳＡのような担体タンパク質を含有することができる。
担体タンパク質の好ましいパーセント数は、約０乃至４％、最も好ましくは約0.
5％である。最も好ましい具体例においては、スポット緩衝液は、界面活性剤、
好ましくはフッ素化した界面活性剤を含む。好ましい界面活性剤はZonyl FSN（E
.I．Dupont & Co.，カタログ番号CH7152S）である。界面活性剤のパーセント数
は、好ましくは約０乃至１％、最も好ましくは0.1％である。
固体支持体は、不活性であり従って非特異的結合が低く且つ、毛管現象によっ
て反応液が該支持体中に保持されるに十分な、支持体内のすき間又はポアを有す
るように選ばれる。該支持体として有利なのは、ガラス又は合成繊維のマット又
は多孔性紙マットのような、圧縮した繊維のマットである。該支持体は、焼結し
たガラス、セラミックス、又は合成のスポンジ様材料のような、他の多孔性材料
で構成されていてもよい。ガラス繊維支持体が、その不活性であることから好ま
しい。米国特許第4,517,288号を参照のこと。ガラス
繊維の表面は、該複合体の電荷と反対の正味電荷を担持してよく、これは固定化
を助けるであろう。最も好ましい具体例においては、固相は、Giegel et al.，R adial Partition Immunoassay，
Clin．Chemistry 28：1894-1898（1982）に記述
されているような、約１インチの正方形の形（「タブ」〕に切られスナップ嵌め
式プラスチック・アセンブリーにはめ込まれた、ＧＦ／Ｆガラス繊維紙（Whatma
ｎ Inc.）である。
この水溶性又は懸濁性複合体の有効量が、この固相支持体に適用される。この
複合体の有効量は、有効なアッセイ信号を分析対象の関係範囲にわたって生み出
す濃度である。例えばｈＣＧのためのサンドイッチアッセイにおいては、該複合
体は、ポリマーに結合させた、ｈＣＧに対する抗体であろう。該複合体の連続希
釈液（例えば、１：10、１：100 、１：1000、１：10000等）が調製され、各溶
液の部分量がタブの限定された領域、反応区域に固定化される。
各特異的結合アッセイ複合体は、Giegel et al.，Clin Chem．28:1894-98（19
82）に開示されているようにして、放射状分配イムノアッセイを用いて評価する
ことができる。検出すべき既知量の分析対象を含有する種々の溶液（例えば較正
標準）が、該反応区域において該固定化されたレセプターと反応させられる。指
示薬（標識された反応体）の適当な添加に続いて、過剰の試薬が洗浄液によって
該反応区域から除去される。標識（例えば蛍光、色、放射性）の量が定量され、
そして信号出力が、各希釈において各較正標準について発生される。該較正標準
からの信号出力によって明らかにされるところにより、有効な信号及び範囲を与
える希釈が選択される。
特異的結合アッセイ複合体の所望の量は、適当な希釈を用いて調製される。好
ましい具体例においては、該ポリマー複合体は、反応区域を形成するためにタブ
のほぼ中央に適用される。これに続く全ての反応は、この反応区域において起こ
る。非常に好ましい一具体例においては、その後の全ての反応体を該反応区域の
ほぼ中央に適用することによって、反応液量は最小限にそして分離効率は最大限
となる。
この特異的結合アッセイ複合体は、該市販の製品の末端ユーザーによって調製
することも、製造業者によって調製することもできる。もしもその手順が製造業
者によって実施されるのならば、お客へは完成されたタブが出荷され、そのタブ
が特異的である生物学的材料を分析するのに、使用することができる。
本発明の該レセプター：ポリマー複合体は、適当な固相に一端固定化されると
、種々の生物学的材料の分析のための広範な種々の分析プロトコールにおいて使
用することができる。例えば、固定化された複合体は、治療薬、天然の又は合成
のステロイド、ホルモン、抗体、ＤＮＡ鎖及び他の関係分析物の存在について、
血液、尿又は他の体液からの分析対象物につきアッセイするのに有用であろう。
こうして、やはり開示されているのは、サンプル中の分析対象の存在又は濃度
を測定するための特異的結合アッセイを実施するための方法であって、
ａ）該分析対象に対する特異性を有する特異的結合レセプターを、直線的な
基本骨格を有するポリマーに共有結合により結合させ、
ｂ）該共有結合により結合させた特異的結合レセプター：ポリマーの有効量
を、多孔性固相へ、当該多孔性固相への該共有結合によって結合させた特異的結
合レセプター：ポリマーの固定化を実行する条件下に接触させ、
ｃ）免疫学的結合条件下に該サンプル及び指示薬を該多孔性固相へ適用し、
ｄ）該多孔性固相へ免疫学的に結合された指示薬の量を測定し、そして
ｅ）該指示薬の量を該サンプル中の該分析対象の存在又は濃度に相関づける
こと
を含む方法である。
好ましい一具体例においては、該指示薬は、標識された分析対象、標識された
分析対象類縁体又は標識された第２の、抗体のような結合レセプターである。実
質的に、溶出溶媒で洗浄することにより又は当該分野で既知の他の手段により、
実質的に全ての未結合の反応体を除去することができる。
液体サンプル及び標識された反応体は、同時に又は順次に適用することができ
る。競合的アッセイの好ましい一具体例においては、液体サンプル及び標識され
た反応体は、同時に加えられ、そして該標識された反応体は、標識された分析対
象又は分析対象の類縁体である。該標識された分析対象と、該液体サンプル中に
存在する全ての分析対象とが、該ポリマー：結合レセプター複合体上の限られた
数の結合部位を求めて競合する。連続的アッセイの好ましい一具体例においては
、該分析対象を含有する疑いのある液体サンプルが、固相支持体と反応させられ
る。次いで、第２のステップにおいて、
標識された分析対象又は標識された類縁体の過剰量が加えられる。
サンドイッチアッセイの好ましい一具体例においては、液体サンプル及び標識
された反応体が順次に加えられる。サンドイッチアッセイの非常に好ましい一例
においては、液体サンプルは標識された反応体より前に加えられる。標識された
反応体は、該複合体の結合レセプターのそれとは異なった部位において該分析対
象に特異的である第２の結合レセプターである。標識の量は、該分析対象の量に
正比例する。
標識された反応体は、直接的に又は間接的に標識することができる。該標識さ
れた反応体の標識のタイプは、色素原性、蛍光測定的、放射測定的、化学定量的
、発光測定的、電位測定的又は酵素的であってよいが、これらに限定されない。
好ましい一具体例においては、ポリマー複合体は、反応区域を形成するために
該多孔性の固体支持体（最も好ましくはガラス繊維である）の限定された領域に
適用される。洗浄ステップを含むその後の全ての反応は、該反応区域において起
こる。いつ又はどのようにして試薬又はサンプルが導入されるか、ということは
重要でない。しかしながら、該多孔性固相の一部において全ての反応体が共存す
ることが必要である。
もしも標識が酵素によるならば、洗浄ステップにおいて用いられる溶出溶媒は
また該酵素に対して特異的な基質を含むことができる。代わりとしては、基質は
後の段階で加えられてもよい。最も好ましい一具体例においては、反応体を該反
応区域の実質的に中央に導入することによって、試薬の液量は最小限とされ未結
合のものからの結合したものの分離は最大とされる。添加される試薬の液量は固
相のサイズに依存するが、約150μＬ未満の液量が好ましい。
代わりの一具体例においては、サンプル中の分析対象の存在又は濃度を測定す
るための特異的結合アッセイを実施するための方法は、
ａ）水溶性の、共有結合により結合させた特異的結合レセプター：ポリマー
の水性溶液の有効量を準備し、
ｂ）該特異的結合レセプター：ポリマーに免疫学的結合条件下に該サンプル
を加え、
ｃ）多孔性固相に、免疫学的条件下にステップｂ）の反応混合物の部分量を
適用し、
ｄ）該多孔性固相に、免疫学的結合条件下に試薬を適用し、
ｅ）該固相に免疫学的に結合した指示薬量を測定し、そして
ｆ）該サンプル中の分析対象の存在又は量に該指示薬量を相関づけること
を含む。
別の代わりの一具体例においては、サンプル中の分析物の存在又は量を測定す
るための特異的結合アッセイを実施するための方法は、
ａ）水溶性の、共有結合により結合させた特異的結合レセプター：ポリマー
（ここに該ポリマーは直線的な基本骨格を有する）の水溶液の有効量を準備し、
ｂ）該特異的結合レセプター：ポリマーに、免疫学的結合条件下にサンプル
及び指示薬を加え、
ｃ）多孔性固相に、免疫的条件下にステップｂ）の反応混合物の部分量を適
用し、
ｄ）該多孔性固相に免疫学的に結合した指示薬の量を測定し、そして
ｅ）該サンプル中の該分析対象の存在又は濃度に該指示薬量を相関づけるこ
と
を含む。
該代わりの方法の好ましい具体例において、該指示薬は標識された分析対象、
標識された分析対象類縁体又は標識された、抗体のような第２の結合レセプター
である。実質的に、未結合の反応体の全てが、溶出溶媒による洗浄によって又は
当該分野において既知の他の方法によって、除去できる。
該標識された反応体は、直接的に又は間接的に標識されていてよい。該標識さ
れた反応体の標識は、色素原性、蛍光測定的、放射測定的、化学定量的、発光測
定的、電位測定的、又は酵素的であってよいが、それに限定はされない。
好ましい具体例においては、該ポリマー複合体は、反応区域を形成させるため
に該多孔性の固相支持体（最も好ましくは、ガラス繊維である）の限定された領
域に適用される。その後の全ての反応は、洗浄ステップも含め、該反応区域にお
いて行われる。もしも該標識が酵素的であるならば、洗浄ステップにおいて用い
られる溶出溶媒はまた、該酵素に対し特異的な基質を含有していてよい。代わり
として、該基質は後のステップで加えることもできる。
該固相に指示薬が存在する程度は、例えばTijssen，P.，Laboratory Techniqu es in Biochemistry and Molecular Biology
，Practice and Theory of Enzyme
Immunoassay，pp．173-210（Chapter 10）及びpp．329-384（Chapter 14），Els
evier Science Publishers，
Amsterdam，The Netherlands（1985）に開示されているように、未知の分析物の
量と相関付けることができる。
好ましい一具体例においては、ポリマー複合体は、反応区域を形成するために
該固体支持体のほぼ中央に適用される。その後の全ての反応は、該反応区域にお
いて行われる。非常に好ましい一具体例においては、反応体を該反応区域の実質
的に中央に導入することによって、試薬液量が最小限とされ且つ未結合の画分か
らの結合した画分の分離は最大となる。加えられる試薬の液量は、固相のサイズ
に依存する。しかしながら約150μＬ未満の液量が好ましい。
該可溶性又は懸濁可能性ポリマーの電荷は、もしも、形成された該水溶性複合
体の固定化が吸着によるものであるならば、重要な因子であろう。すなわち、正
に帯電した複合体（例えばPEMA:HBC抗体複合体）は、負に帯電した化合物に比し
て、ガラス繊維マトリクスに対して有意に大きい吸着度を示す。水素結合もまた
、複合体の固定化においてある役割を果たす。加えて、ポリマーの平均分子量は
、得られた複合体が固相の反応区域内に捕捉されて留まるに十分に大きくなけれ
ばならないが、しかし分離効率を低下させるほどに大きくてはならないないとい
う点において、水溶性ポリマーを選択するに際して重要であり得る。
本発明は、以下の説明的具体例（純粋に典型例であり添付の請求の範囲に記述
された本発明の範囲を限定するものと解してはならない）を参照して一層理解さ
れよう。
実施例１
総コア抗ＨＢｃを検出するためのイムノアッセイにおける
ＰＥＭＡの調製及び使用
１．ポリエチレンマレイン酸無水物への組換えＢ型肝炎ウイルス
・コア抗原（ｒＨＢｃ）の接合
795μＬの0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ7.8に、80μｇの組換えＢ型肝炎コア抗原
（分子量＝21,000）（205μＬ）及び12ｍｇ（乾燥粉末）のポリエチレンマレイ
ン酸無水物（平均分子量＝80,000）（Polysciences，Inc.カタログ番号2308）を
加えた。この懸濁液を室温にて１時間攪拌した。接合体（ＰＥＭＡ−ｒＨＢｃ）
を、その後２〜８℃にて貯蔵した（図１を参照）。
II．ＰＥＭＡ−ｒＨＢｃ固相の調製
Ａ．選ばれた固相は、紙マトリクス、Whatman type GF/Fガラスマイクロフィ
ルター紙であった。
ナトリウムを含有するｐＨ7.5のトリス緩衝液を用いて、接合体ＰＥＭＡ−ｒＨ
Ｂｃの種々の希釈液を調製した。反応区域を形成させるため、該紙マトリクス上
へ希釈されたＰＥＭＡ−ｒＨＢｃ接合体の76μＬの部分量をピペットすることに
より、このＰＥＭＡ−ｒＨＢｃの希釈液を該紙の中央に固定化した。このコア抗
原紙を直ちに約75℃にて約５分間乾燥し、２〜８℃にて貯蔵した。
III．非接合のＰＥＭＡ及びｒＨＢｃの調製
溶液が粘稠になるまで、ｐＨ7.8の0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬ中にお
いて、12ｍｇのＰＥＭＡを加水分解した。次いで、40μＬの0.39ｍｇ／ｍＬのｒ
ＨＢｃ原液を、ｒＨＢｃの最終濃度約80μｇ／ｍＬとなるように、この加水分解
したＰＥＭＡの150μＬに加えた。この混合物を上記の通りに処理した。
IV．非接合のＰＥＭＡ及びｒＨＢｃ対照固相の調製
Ａ．選ばれた固相は、紙マトリクス、Whatman type GF/Fガラスマイクロフィ
ルター紙であった。
ナトリウムを含有するｐＨ7.5のトリス緩衝液を用いて、非接合のＰＥＭＡ−ｒ
ＨＢｃの種々の希釈液を調製した。反応区域を形成させるため、該紙マトリクス
上へ希釈されたＰＥＭＡ−ｒＨＢｃ非接合混合物の76μＬの部分量をピペットし
た。この対照紙を、直ちに約75℃にて約５分間乾燥させ、２〜８℃にて貯蔵した
。
V．加水分解されたＰＥＭＡの調製
溶液が粘稠になるまで、ｐＨ7.8の0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬ中にお
いて、12ｍｇのＰＥＭＡを加水分解した。この混合物を上記Ｉの通りに処理した
。
VI．加水分解されたＰＥＭＡ対照固相の調製
Ａ．選ばれた固相は、紙マトリクス、Whatman type GF/Fガラスマイクロフィ
ルター紙であった。
ナトリウムを含有するｐＨ7.5のトリス緩衝液を用いて、加水分解されたＰＥＭ
Ａの種々の希釈液を調製した。該紙マトリクス上へ、希釈された加水分解された
ＰＥＭＡの76μＬの部分量をピペットした。この対照紙を、直ちに約75℃にて約
５分間乾燥させ、２〜８℃にて貯蔵した。
VII．固相の評価
固相の評価は、Baxter Diagnostics Inc．より入手可能なStratu
ァターゼ接合体の１：200希釈液の約40μＬが、調製された紙又は
タブの各々の種々の希釈の反応区域に加えられた。短いインキュベーション（約
５分）の後、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートを含有する約70μＬの
基質／洗浄液を、該タブに適用した。この溶液は、未結合の接合体を除去し且つ
蛍光信号を形成するために該酵素と反応するように加えられた。蛍光信号の変化
を、約20秒間モニターする。この信号は、単位時間当たりのボルトとして表され
る（分当たりミリボルトすなわちｍｖｍ）。この信号は、反応区域内の接合体の
量に関係している。各希釈液は３回に評価される。加えて、タブの外観を紫外線
下に目視する。明るい濃いスポットは、固定化か起こったことを示している。結
果を表１に示す。
ＰＥＭＡ−ｒＨＢｃを含有するタブの反応区域は、濃い、明るい同心のスポット
を有した。ＰＥＭＡ及びＨＢｃ混合物を含有するタブ
は、蛍光性ではあったが、その蛍光は拡散しており縁において最も明るく、固定
化が起こらなかったことを示している。
実施例２
I．陽性ＨＢｃサンプルのアッセイ
ＰＥＭＡ−ｒＨＢｃをIIBに記述した緩衝液で１：93.3に希釈した。50μＬの
ＰＥＭＡ−ｒＨＢｃを、50μＬのＨＢｃ−ＡＬＰ接合体及び50μＬの対照又は患
者サンプルと混合した。混合物を、室温にて約15分間インキュベートした。サン
プル及び対照をアッセイす
、反応区域の中央に加え、そして約37℃にて約５分間インキュベートした。次に
、約1.0ｍＭの４−メチルウンベリフェリルフォスフェート、アルカリ性ホスフ
ァターゼ阻害剤、安定化剤及び界面活性剤を含有するｐＨ9.0の基質溶液約70μ
Ｌを、該反応区域の中央に約20μＬ及び50μＬの２つの増分で加えた。反応区域
中の基質に対するアルカリ性ホスファターゼの作用によって発生された蛍光の量
を、分析装置で約20秒間モニターした。この信号は、単位時間当たりのボルト数
で表される（分当たりのミリボルトすなわちｍｖｍ）。この信号は、反応区域中
の接合体の量と関係している。陰性サンプルは、陽性サンプルよりも高い価を有
していた。結果を表２に示す。阻害のパーセント数は、式：％阻害＝100％−（
平均サンプル／平均陰性対照）×100％によって計算された。サンプル結果は、
対照方法の％阻害と比較される。
実施例３
ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ
図２は、１）ＰＥＭＡのような水溶性ポリマーに固定化したＤＮＡと２）酵素
標識反応体としてアルカリ性ホスファアーゼ：Ｔ432タンパク質（ｇ32ｐ）接合
体とを用いた、ＤＮＡ二本鎖又はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの存在を検出する
のに有用な試薬の調製の方法を示す。Ｇ32ｐは、一本鎖ＤＮＡに特異的に結合す
るファージタンパク質である。ハイブリダイゼーションのステップに続いて、St
の試験ＤＮＡから分離された。該酵素によって触媒された反応から得られた信号
は、試験ＤＮＡの濃度に反比例する。ハイブリダイゼーション反応においてｇ32
ｐ：アルカリ性ホスファターゼをプローブとして用いることのあり得べき利点は
、それが如何なるＤＡＮハイブリダイゼーションアッセイにも役立つことである
。こうして、最近開発されているＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイとは対
照的に、各アッセイのために新たな接合体を調製する必要がない。しかしながら
、ＤＮＡハイブリッドは、ビオチン化ｇ32ｐ及びアビジンで標識した酵素（例え
ばアルカリ性ホスファターゼ）によってもまた検出できよう。