JP3484540B2 - 可溶性サブミクロン粒子上に固定化した抗体による抗原の無作為検出 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、一般的には、固相上に特異的結合アッセイ
試薬を固定化するための方法に関する。特に本発明は、
水溶性ポリマーを用いて固相上に多数の試薬を固定化す
る方法に関する。本発明はまた、診断試験において有用
な多数の試薬を固定化させた固相支持体にも関する。

本発明の背景 in vitro診断アッセイは、体液サンプル又は組織サン
プル中に見出される分析対象の量を測定するために使用
することができる。該分析対象は、該サンプル中の他の
成分から識別されなければならない。分析対象は、その
分析対象に対する特異的レセプターと該分析対象を反応
させることによって、他のサンプル成分から識別し得
る。分析対象を識別して定量するために特異的レセプタ
ーを利用するアッセイは、しばしば、特異的結合アッセ
イと呼ばれる。

最も普通のレセプターは、抗体及び、内因子又は葉酸
結合タンパク質のような特異的結合性タンパク質であ
る。レセプターは、分析対象又は該分析対象の類縁体に
対する可逆的な特異的結合親和性を有することによって
特徴付けられる。ここで用いるものとして、「類縁体」
とは、一般的には、酵素、蛍光性分子その他の既知の標
識のような検出可能なマーカーを担持した、分析対象の
誘導体である。該類縁体は、分析対象とほぼ同じ特異性
及び親和性を以てレセプターに結合する能力を有する。

技術文献及び特許文献に記載されている不均質特異的
結合アッセイにおいては、その特異的結合反応のレセプ
ターその他のアッセイ試薬は、しばしば固相上に固定化
されている。これらの試薬の固定化は、結合した成分
（例えば、レセプターを介して固相に結合した分析対
象）を未結合の成分から分離するために必要である。

レセプター又は他の試薬を固相に固定化することので
きる種々の方法には、吸着、吸収又は共有結合により結
合が含まれる。しかしながら、そのようなアッセイにお
いて使用されている固相支持体の多くは、不活性でな
く、非特異的結合によってサンプルからタンパク質その
他の物質を取り込んでしまい得る。ガラスは比較的不活
性な基質ではあるが、固相結合アッセイにおいて使用す
るには不満足なものであることが一般に見出されてい
る。ガラス基質の不適当さについては、例えば、米国特
許第3,790,653号を参照。

しかしながら最近、試薬と該試薬に対する抗血清との
本質的に可溶性の免疫複合体を不活性のガラス繊維固相
支持体に固定化させるための手順が記述されている。こ
れらの手順は、米国特許第4,517,288号に開示されてお
り、参照によりここに導入する。

これらの免疫的固定化手順においては、可溶性の免疫
複合体は、少なくとも２つの免疫化学的に反応性の物質
を溶液中で相互に組み合わせることによって調製され
る。そのような免疫化学的に反応性の材料が少なくとも
一つは、問題の分析対象に対する免疫学的特性があるよ
うに選択される。例えば、もしもその可溶性の免疫複合
体が甲状腺刺激ホルモン（TSH）の検出のためのイムノ
アッセイにおいて使用するためのものであるならば、該
免疫複合体の一成分は、TSHに対する免疫化学的特異性
を求めて選択される。一つの典型例は、TSHに対し特異
性を有する抗体すなわち抗TSH抗体であろう。該免疫複
合体の第２成分は、該抗TSH抗体に対して向けられた抗
体調製物を含むことができよう。抗分析対象抗体（例え
ばマウス抗TSH抗体）に対する抗血清は、精製したマウ
スイムノグロブリンＧ（IgG）を宿主動物（例えばヤ
ギ）に注射し、その後マウスIgGに対する抗血清を収穫
することによって調製することができる。このマウス抗
TSH抗体及びマウスIgGに対するヤギ抗血清は、その後標
準原液とされる。

これらの原液を調製した後、各々の一部が緩衝化され
た培地中において組み合わされる。得られた免役複合体
（適当な量の緩衝液中の）は、その後、ガラス繊維フィ
ルターの限定された領域にスポットされる。代わりとし
て、該免疫複合体のこれら２つの成分を、別個の緩衝化
した溶液としてフィルターに適用しそしてその場におい
て反応させてもよい。双方の例において、免疫複合体を
適用する点が、該固相中における反応区域を規定する。
適用された免疫複合体は、ガラス繊維フィルター内の繊
維のベッドの間質内に吸着され捕獲される。適用の方法
としては、免疫複合体溶液の手作業の又は自動化された
ピペットによる、又はアッセイ分析機器を含む他の自動
化された装置による配付を含むことができる。固相への
免疫複合体の適用及び適当なインキュベーション時間の
後、制御された条件下に固相が乾燥され、それによっ
て、如何なる多くの固相特異的結合アッセイプロトコー
ルにおいても使用することのできる、安定な反応性の試
薬が得られる。

免疫的固定化は、種々のアッセイ方式において有用で
はあるが、多くの固有の欠点を有することが認識されて
いる。フィルター上の追加のイムノグロブリンの存在
（例えば、抗分析対象抗体に対する抗血清）は、タンパ
ク質性の又は他の生物学的材料の非特異的結合をもたら
し得る。これは、アッセイ感度を大きく低下させ得る。
更には、同一の又は異なった宿主動物の別個の免疫から
のIgG調製物の固有の変動性のため、IgG調製物の力価、
純度、特異性及び親和性におけるロット間変動に、製造
手順においては対処しなければならない。同様に、原液
中において免疫複合体が不均質に分布する傾向による、
固相試薬の製造における変動性に直面し得る。すなわ
ち、そのような免疫複合体は、実質的には可溶性である
ものの、完全に可溶性のままではなく、経時的に溶液か
ら幾らか沈殿し得る。原液を定期的に混合しても、重力
の影響、温度勾配その他の物理的影響が、固相試薬に適
用される溶液中に微妙な不均質性を引き起こし得る。

Starburst ^TMデンドリマー（The Dow Chemical Compa
nyによって製造されている）は、精密に規定された組成
を有し且つ精密に規定された分子量を有する、球状の又
は他の３次元形状のポリマーである。そのようなデンド
リマーは、内部及び外部の部分の適切な選択によって、
水溶性の巨大分子として合成することができる。参照に
よりここに導入する米国特許第4,507,466号及び第4,56
8,737号を参照のこと。デンドリマーは、種々の薬剤学
的材料と、並びに診断又は治療適用のために、当該接合
体を選ばれた身体位置へ導くよう機能し得る種々の標的
指向性分子と接合させることができる。例えば、WO 88
01178を参照のこと（参照によりここに導入する）。Sta
rburstデンドリマーは、腫瘍の治療及び診断のための放
射性標識された抗体の比活性を増大させるための手段と
して、抗体分子に合成ポルフィリン（例えば、ヘム、ク
ロロフィル）を共有結合によって接合させるのに使用さ
れてきた。Roberts,J.C.et al,“Using Starburst Dend
rimers as Linker Molecules to Radiolabel Antibodie
s,Bioconjug.Chemistry 1:305−308（1990）。

本出願人は、固相へのアッセイ試薬の固定化を容易に
するために抗血清の代わりにデンドリマーを使用できる
ということを発見した。すなわち、デンドリマーは、抗
体のようなアッセイ試薬又は比較的小さい分子のような
アッセイ試薬にさえも、共有結合によって接合させるこ
とができ、次いでガラス繊維フィルター上に固定化させ
ることができる。免疫学的固定化に比較して、デンドリ
マー複合体を利用した固定化は、数多くの顕著な利点を
提供する。第１に、デンドリマーは、正確なポリマー化
学をもって生産されており、正確な分子サイズ、重量及
び表面組成を与える正確な数の世代を有するように設計
することができる。この均一且つ特徴づけられた化学の
故に、そのようなパラメータが、異なる製造ロットにわ
たって均一性を維持する。第２に、デンドリマーは、内
部及び表面組成に依存して、デンドリマー−試薬接合体
が溶液中にとどまり経時的に溶液の均質性を維持するよ
う可溶性であるように製造することができる。これは、
溶液中における免疫学的接合体の不均質な分布からくる
ロット間の不均一性を無くす。第３に、デンドリマーへ
の試薬の取り付けのための化学が十分に特徴づけられて
おり、抗血清及び抗体結合性物質の結合において固有で
ある変動を受けることがない。抗血清は、親和性、特異
性及びイムノグロブリン純度において変動するが、デン
ドリマー−試薬接合体の製造においてはそれらのいずれ
も起こらない。

これらの理由から、デンドリマーに基づく、実質的な
ロット間均一性を有する固相試薬が容易に製造される。
更には、デンドリマー接合体の原液又は市販溶液が実質
的な期間にわたって均一性を保持することから、市販の
アッセイ機器のユーザーが、これらの固相試薬を現場で
調製することが可能である。調製したばかりの固相支持
体の使用は、長期保存や貯蔵温度その他の貯蔵の変動要
因による変化のような、予め調製された固相支持体の配
付及び商業的使用に入り込んで来得る更なる変動要因を
更に排除する。

幾つかの特異的結合アッセイは自動化されている。現
在利用可能な自動化されたアッセイシステムの大半は、
しかしながら、各サイクルにおいてただ一つの分析対象
の検出しか許容しない。従って、１つより多くの分析対
象を分析するためには、同じサンプルの第２の分析対象
を試験し定量する前に、第１の分析対象のサイクルが完
了するのを待たなければならない。大半の自動化された
機器において、サイクル時間は通常少なくとも40分であ
る。代わりとしては、分析すべきサンプルを複数の試験
サンプルへと小分けして、所望の定量情報を得るために
同時に分析することもできよう。この第２のアプローチ
は、一層多量の患者サンプルを必要とするのみならず、
多量の分析装置を同時に操作するための更なる資本支出
をも必要とする。

限られた数の無作為アクセス酵素免疫測定法（EIA）
システムが、与えられたサンプル中の１つより多くの分
析対象を分析するために単位投与量という構想を利用し
ている。これらのシステムにおいては、固定化抗体、抗
体−酵素又は薬物−酵素接合体及び信号の発生に必要な
基質等のような必要な試薬の全てが単一の包装の中に一
緒に詰められており、各々の包装は、単一の分析に十分
な試薬を含んでいる。この単一包装システムは、バルク
の貯蔵及び包装に比して高価である。この追加の経費
は、例えば、アッセイに必要な各成分を各々に包装する
コスト、全ての試薬の最大の安定性を許容する包装材料
という特別の要件、及び各単位投与量のために必要な余
分な貯蔵スペース等を反映したものである。加えて、ア
ッセイの種々のステップにおけるインキュベーションに
必要な時間が、無作為アクセスアッセイシステムの場
合、結果を得るための全体時間を一層長いものにする。

本発明の要約 本発明は、サンプル中の少なくとも１つの分析対象の
濃度又はその存在を測定するための特異的結合アッセイ
を実施するための方法を含む。１つの規定された分析対
象特異性を有する複数のデンドリマー−試薬複合体を各
調製物が含むものである、少なくとも２つのデンドリマ
ー−試薬調製物が作られる。分析対象特異性は、各調製
物毎に異なっている。有効量の該組成物が、固相の限定
された領域に、該固相上に該デンドリマー−試薬複合体
の固定化が行われる条件下に適用される。これらのデン
ドリマー−試薬調製物は、固相支持体に加えられるに先
立って混合溶液を形成するために混ぜ合わせることがで
きる。サンプルが、結合条件下に該固相に適用される。
指示薬又は標識された特異的競合試薬の選ばれた量が、
この固相に加えられる。該固相に結合された指示薬又は
標識の量が測定され、サンプル中の少なくとも１つの分
析対象の濃度又は存在に相関づけられる。

本発明において使用させる複合体は、試薬に結合させ
たデンドリマーを含む。これらの試薬は、抗体又は抗体
フラグメント、特異的結合性タンパク質、又は分析対象
であってよいが、これらに限定されない。サンプル及び
指示薬は、該固相に同時に適用しても、順に適用しても
よい。

本発明は、異なった分析対象特異性を備えた少なくと
も２つの特異的結合アッセイ試薬を固相上に固定化する
ための方法を更に含む。これらの試薬は、抗体又は抗体
フラグメント、特異的結合性タンパク質又は分析対象で
あってよいが、これらに限定されない。これらの試薬
は、炭素−硫黄（Ｃ−Ｓ）結合の形成を含むがこれに限
定されない結合方法によって、デンドリマーに結合させ
られる。

本発明はまた、特異的結合アッセイにおいて使用する
ための固相組成物をも含む。該固相組成物は、圧縮され
た繊維のマットと、少なくとも２つのデンドリマー−試
薬調製物を含む分析対象結合成分とを含む。各調製物
は、１つの規定された分析対象特異性を有する複数のデ
ンドリマー−試薬複合体を含む。分析対象特異性は、各
調製物毎に異なっている。これらの試薬は、抗体又は抗
体フラグメント、特異的結合性タンパク質又は分析対象
であってよいが、これらに限定されない。これらの調製
物は、固相の限られた領域上に固定化される。該固相は
ガラス繊維フィルターであることができる。

本発明は更に、サンプル中の少なくとも１つの分析対
象の濃度又は存在を測定するための特異的結合アッセイ
を実施する方法に関する。デンドリマー−試薬複合体の
複数を各調製物が含み、各複合体が少なくとも２つの異
なった分析対象に対する特異性を有するものである、少
なくとも１つのデンドリマー−試薬調製物が作られる。
該デンドリマー−試薬調製物は、単一の分析対象に対し
て特異性を有する複数のデンドリマー−試薬複合体を含
むこともできる。該調製物またはそれらの調製物の有効
量が、固相の限られた領域に、該固相上への該デンドリ
マー−試薬複合体の固定化を実行する条件下に適用され
る。サンプルが、結合条件下に該支持体に適用される。
試薬又は標識された特異的競合試薬の選ばれた量が、該
固相に加えられる。該固相に結合した支持体又は標識の
量が測定され、サンプル中の少なくとも１つの分析対象
の濃度又は存在と相関づけられる。

上記の段落に記述された方法において使用される複合
体は、試薬に結合させたデンドリマーを含む。該試薬
は、抗体又は抗体フラグメント、特異的結合性タンパク
質又は分析対象であってよいが、これらに限定されな
い。サンプル及び指示薬は、固相に同時に適用すること
も、順に適用することもできる。

本発明はまた、異なった分析対象特異性を備えた特異
的結合アッセイ試薬を固相上に固定化するための方法を
も含む。各デンドリマー−試薬複合体が少なくとも２つ
の異なった分析対象に対する特異性を有するものである
デンドリマー−試薬複合体の複数を含んだ、少なくとも
１つのデンドリマー−試薬調製物が調製される。該デン
ドリマー−試薬調製物はまた、単一の分析対象に対する
特異性を有するデンドリマー−試薬複合体の複数を含ん
でもよい。該試薬は、抗体又はフラグメント、特異的結
合性タンパク質又は分析対象であってよいが、これらに
限定されない。これらの試薬は、炭素−硫黄（Ｃ−Ｓ）
結合の形成を含むがこれに限定されない結合方法によっ
て、デンドリマーに結合させられる。

本発明は、特異的結合アッセイにおいて使用するため
の固相組成物を含む。該固相組成物は、圧縮された繊維
よりなるマットを含む固相と、少なくとも１つのデンド
リマー−試薬調製物を含む分析対象結合成分とを含んで
いる。各調製物は複数のデンドリマー−試薬複合体を含
み、各複合体は、少なくとも２つの異なった分析対象に
対する特異性を有する。該デンドリマー−試薬調製物は
また、単一の分析対象に対する特異性を有する複数のデ
ンドリマー−試薬複合体を含むものであってもよい。該
試薬は、抗体又は抗体フラグメント、特異的結合性タン
パク質又は分析対象であってよいが、これらに限定され
ない。該調製物は、固相の限られた領域上に固定化され
る。該固相は、ガラス繊維フィルターであることができ
る。

本発明はまた、包装材と該包装材中のデンドリマー−
試薬調製物とを含む製品をも含む。該調製物は、１つの
規定された分析対象特異性を各複合体が有し該分析対象
特異性が各調製物毎に異なっているものである、複数の
デンドリマー−試薬複合体を含んでよい。代わりとして
は、該調製物は、デンドリマー試薬複合体の各々が少な
くとも２つの分析対象に対する特異性を有するものであ
る、複数のデンドリマー−試薬複合体を含んでよい。該
包装材は、該デンドリマー−試薬調製物が上述の特異的
結合アッセイ方法を実施する際に使用できるということ
を示すラベル又は能書を含む。

詳細な記述 本発明の固相支持体を調製するのに最も有用なデンド
リマーは、米国特許第4,507,466号に開示されているよ
うな「星形」形態を有する全体として球状の分枝のある
ポリマーである。この星形の形態は、各分枝が核又はコ
ア領域から放射するように構成した分枝のさせ方に由来
する。この多価のコアは、少なくとも２つの層又は世代
を通って延びている少なくとも２つの整然とした樹状
（木のような）分枝に共有結合により結合されている。
最も外側の層又は世代は、種々の他の分子と化学的に反
応性である官能基に終わるよう誘導体化されていてよ
い。従って、星形デンドリマーは、３つの顕著な建築的
特徴、すなわち（ａ）開始コアと、（ｂ）該開始コアに
対して放射状に取り付けられた反復単位より構成された
内部の層（世代）と、そして（ｃ）最も外側の世代に取
り付けられた末端官能基よりなる外部表面とを有する、
単一の分子アセンブリである。

デンドリマーのサイズ、形状及び反応性は、開始コア
と該デンドリマーを作り出す際に用いる世代数との選択
によって、及び各世代において用いられる反復単位の選
択によって、制御することができる。用いる世代数に応
じて、別々のサイズのデンドリマーが容易に得られる。
加えて、表面部分の全体又は一部分の化学的修飾が、特
定の診断的又は治療的操作のために適当な新しい表面官
能基を創り出すことができる。本発明において使用する
に適した、全体として球状のデンドリマー形態は、米国
特許第4,507,466号及び米国特許第4,568,737号に開示さ
れている。代わりとして、参照によりここに導入する米
国特許第4,694,064号に開示されているもののような非
球状の形態のデンドリマーが、本発明において使用する
のに適合し得る。好ましくは、それらのデンドリマー
は、アミンに終わる官能基を有する外側の官能化された
表面を有する。例えば、E5デンドリマーは、第５世代で
あり、エチレンジアミンコア粒子が128個のアミンに終
わる末端（表面）基及び28,826の分子量を有する。これ
らのアミンに終わる末端基は、通常のアッセイ条件下に
そのようなデンドリマーの表面に正味の正電荷を付与す
る。

デンドリマーの外側の官能化された表面に特異的結合
アッセイ試薬を取り付けるために、信頼でき且つ再現性
のある種々の方法が利用できる。例えば、スルホスクシ
ンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエー
ト（Sulfo−SIAB）で誘導体化したデンドリマーをスル
フヒドリル含有アッセイ試薬と一緒にすることによる、
炭素−硫黄（Ｃ−Ｓ）結合の形成によって、デンドリマ
ーに特異的結合試薬を取り付けることができる。代わり
として、炭素−窒素（Ｃ−Ｎ）結合又は炭素−酸素（Ｃ
−Ｏ）結合の形成によって特異的結合アッセイ試薬をデ
ンドリマーに取り付けることができる。米国特許出願第
08/021,928号を見よ（参照によりここに導入する）。デ
ンドリマー表面官能基は、アミノ末端基に加えて、ヒド
ロキシ、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、アリ
ル、ビニル、アミド、ハロ、ウレア、オキシラニル、ア
ジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スルホ
ナト、ホスホナト、イソシアナト及びイソチオシアナト
を含む。種々の既知の化学が、この広範な表面官能基と
共に使用でき、そのような官能基にアッセイ試薬を取り
付けるために使用できる。

出願人は、特異的結合アッセイ固相上に試薬を固定化
するためにデンドリマー−試薬複合体が使用できるとい
うことを発見した。そのような複合体は、イムノアッセ
イその他のアッセイにおける種々の固相の調製のために
有用である一方、本出願人は、ガラス繊維基質及び放射
状分配アッセイでの使用に、そのような複合体の特に有
用な適用を見出した。Giegel et al.,Clin.Chem.28:189
4−98（1982）及び米国特許第4,517,288号に開示されて
いるような放射状分配イムノアッセイは、全てのステッ
プが固相支持体の直接上において行われるアッセイ手順
である。抗体その他の試薬は、ガラス繊維濾紙の小さい
領域上に固定化される。検出すべき分析対象の既知量を
含んだ種々の較正標準、又はそのような分析対象を含有
しておりいる種々の未知のサンプルが、この固定化され
たレセプターと反応させられる。標識した類縁体その他
の標準試薬の適当な添加に続いて、洗浄液の適用によっ
て、該濾紙の中心領域から過剰の試薬が除去される。酵
素免疫測定法の場合には、この洗浄液は酵素のための基
質を含んでいてよく、これにより洗浄ステップと同時に
酵素反応を開始させてよい。好ましくは、該基質に対す
る酵素の作用は、蛍光信号を発生させる。次いで該中心
領域の一部分における酵素活性が、前記蛍光光度法によ
って定量される。アッセイ方式、すなわち、直接結合ア
ッセイ又は競合的アッセイに依存して、蛍光率は、サン
プル中の分析物の濃度に正比例又は反比例する。

上述のように、固相は比較的「不活性な」表面を提供
するが好ましい。すなわち、該表面は、生物学的材料に
対して、特にタンパク質性材料の無差別な吸着に関して
相対的に無反応性である必要がある。本発明の好ましい
具体例においては、固相の物理的形態は、該固相内の間
質又は孔が、反応液が毛細管現象で保持され輸送される
のに十分に小さいようなものである。他方、固相の孔又
は間質は、偽の陽性信号を生じ得る望ましくない成分を
保持する程に小さくてはならない。

固相は、ガラス又は合成繊維又は比較的不活性なセル
ロース性材料等のような、圧縮された繊維でできたマッ
トより構成されるのが有利である。固相はまた、焼結ガ
ラス、セラミックス及び合成のポリマー性材料等のよう
な他の多孔性の構造より構成されていてもよい。ガラス
繊維濾紙は、不活性であるという特性のために、及びア
ッセイ試薬の定量的保持に十分な量に本発明の可溶性複
合体を吸着する能力のために、本発明に好ましい固体支
持体である。ガラス繊維の表面は、正味の負の電荷を担
持し得、それはアッセイ条件下に実質的に正に荷電した
表面を有するデンドリマー（すなわち、アミン末端表面
基を有するデンドリマー）の吸着を容易にする。

本発明のデンドリマー−試薬複合体は、適当な固相に
一旦吸着されると、種々の生物学的材料の分析のための
広範な種々の分析プロトコールで使用することができ
る。デンドリマー−レセプター複合体は、治療薬、天然
又は合成のステロイド、ホルモン、酵素、抗体その他の
問題の分析対象の存在についての、血液又は尿のイムノ
アッセイのために有用であろう。

そのようなプロトコールで分析することのできる治療
剤としては、ジゴキシン、ジランチン、フェノバルビタ
ール、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジンその他
が含まれるが、これらに限定されない。前述の仕方で調
製された固相はまた、コルチゾル、アルドステロン、テ
ストステロン、プロゲステロン及びエストリオール等の
ようなステロイド又はフェリチンのような血清タンパク
質の検出のためのイムノアッセイにおいても使用でき
る。ホルモンレベルもまた、本発明の固相複合体の使用
によって測定可能である。これらのホルモンとしては、
テトラヨードサイロニン及びトリヨードサイロニンのよ
うな甲状腺ホルモン及び甲状腺刺激ホルモン（TSH）、
インスリン、コルチコトロピン、ガストリン、アンジオ
テンシン、及びプロアンジオテンシン等のようなペプチ
ドホルモン、サイロトロピン、レブテオトロピン、ソマ
トトロピン及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）の
ようなポリペプチドホルモンが含まれるが、これらに限
定されない。本発明の複合体の他の適用には、代謝に関
連する比較的小さい分子（すなわち、葉酸）のアッセ
イ、感染性疾患に関連したポリペプチド抗原及び抗体
（すなわち、HIV、肝炎、CMV、梅毒、ライム病因子その
他の夥しい数の感染性因子に関連した抗原及び抗体）の
アッセイが含まれる。

レセプターのようなアッセイ試薬は、SIAB結合を介し
て又は他の方法によってデンドリマーに取り付けること
ができ、次いでガラス繊維フィルターのような固相材料
に適用することができる。好ましい一具体例において
は、Baxter Diagnostics Inc.によって販売されている
「タブ」が、Whatman Inc.によって販売されているGF/F
ガラス濾紙と、以下に論ずるスナップ嵌合プラスチック
部品とから構成されている。通常、デンドリマー−試薬
複合体は、適当な緩衝液に入れてそのようなタブの中心
領域に適用される。通常、そのような緩衝剤は、界面活
性剤、分析対象不含血清アルブミン及びアジ化ナトリウ
ムのような保存剤を含む必要がある。デンドリマー複合
体溶液の部分量がブランクタブの中心にスポットされ、
次いで熱によってオーブン乾燥される。冷却後、タブを
冷蔵保存してよい。

代わりの一具体例においては、デンドリマー自体を固
相として形成してもよい。デンドリマーを適当な溶媒に
溶解させて適当な固体表面に噴霧その他の方法で適用し
てよい。溶媒の乾燥により、デンドリマーは濃縮されて
薄いフィルム又はフィラメントになり単離することがで
きる。代わりとしては、そのような薄いフィルムは、特
異的結合アッセイにおいて使用されるチューブその他の
容器の内部表面を被覆するのに使用することができる。
抗体のようなアッセイ試薬は、噴霧材料の適用及びその
後の乾燥時間の前にでも後にでも、そのようなデンドリ
マー凝固物に結合させることができる。

本発明のデンドリマー試薬複合体／固相調製物は、種
々の特異的結合アッセイ方式に適用される。例えば、種
々の直接結合アッセイを、これらの試薬によって行うこ
とができる。そのようなアッセイにおいては、抗体又は
結合性タンパク質のようなレセプターが、デンドリマー
に共有結合により結合されて固相上に固定化される。固
定化されたデンドリマー−レセプター複合体は、問題の
分析対象を含んだサンプルと接触させられる。固定化さ
れたレセプターによる該分析対象の結合に続いて、固相
は洗浄され、次いで指示薬と接触させられる。本発明の
文脈において術後「指示薬」は、標識された接合体を意
味する。該接合体は、アッセイ方式に依存して、抗体、
抗体フラグメント、結合性タンパク質又は分析対象を含
み、そして標識は、該接合体に直接又は間接的に連係す
る蛍光性の、酵素的な、比色の、放射性の又は他の標識
分子である。標識は、基質と接触することにより蛍光を
発生する酵素的化合物を含んでよい。例えばTijssen,
P.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molec
ular Biology,Practice and Theory of Enzyme Immunoa
ssay,pp.173−219（Chapter 10）及びpp.329−384（Cha
pter 14）（Elsevier Science Publishers,アムステル
ダム、オランダ、1985年）に開示されているように、指
示薬が固体支持体上に存在する程度は、未知の分析対象
の量に相関づけることができる。

このデンドリマー／試薬複合体はまた、競合的アッセ
イ方式においても使用することができる。そのような方
式においては、固定化されたレセプターその他の、選ば
れた分析対象に対する特異性を備えた分子を含んだ固相
が、そのような分析対象を含んでいると仮定されたサン
プルと、そして特異的な競合的試薬と接触させられる。
該特異的な競合的試薬は、分析対象の標識された類縁体
であってよい。この具体例においては、該標識された類
縁体は、固相に固定化されたレセプターに対する結合を
求めてサンプルの分析対象を競合する。代わりの一具体
例においては、分析対象を固相に結合させ、サンプルと
そして特異的競合試薬、例えば該分析対象に対する標識
されたレセプターと接触させることができる。この方式
においては、サンプル中の分析対象は、標識されたレセ
プターとの結合を求めて固相上の分析対象と競合する。
両具体例において、洗浄後に固相に結合している標識の
量が、サンプル中の分析対象のレベルの指標を提供す
る。すなわち、固相に結合した標識量は、サンプル中の
分析対象の量に反比例する。

デンドリマー−試薬接合体及び種々の他の結合試薬を
固相に適用し、洗浄し、そして該固相に結合した指示薬
の量を読み取るために、種々の機器が利用できる。好ま
しい一具体例においては、固相は上述のガラス繊維フィ
ルタータブを含み、そして機器は、Baxter Diagnostics
Inc.から入手できるStratus Immunoassay Systemを含
む。この機器は、Giegel et al.,Clin.Chem.28:1894−9
8（1982）によって記述されているバッチ処理卓上機器
である。該機器は、放射状分配イムノアッセイ方式にお
いてタブを処理するのに適合させてあり、該方式もま
た、Giegel et al.に記述されている。該機器は、サン
プル、接合体及び基質洗浄液のための液体ディスペンサ
を含む。マイクロプロセッサ制御されたステッパモータ
が、試薬の部分量を吸引して配付する。このディスペン
サの全てのタイミング及び動作面は、該分析装置内のプ
ログラムルーチンによって予め定められている。該機器
はまた、タブ輸送システム、温度モニターを備えた加熱
プレート、サンプル及び試薬液体ポンプ、読み取りステ
ーション、データ処理、及びタブ処分のための手段をも
含む。品質管理のために、該機器のマイクロプロセッサ
制御プログラムは、参照電圧、温度及び配付設定及び限
定外値についてのフラッグ等のような、特に重要な作動
条件を定期的に検証する。

本発明において、出願人は、少なくとも２つの異なっ
た分析対象に対する特異性を備えたデンドリマー−試薬
複合体の集団を含んだ固相を開発した。すなわち、該固
相は少なくとも２つの異なったデンドリマー−試薬調製
物を含み、各調製物は、選ばれた１つの分析対象に対す
る特異性を有する。更には、該調製物中の該デンドリマ
ー−試薬複合体は、複数の分析対象の分析に有用な反応
区域を形成するために、該固相の限定された領域におい
て混ぜ合わされる。

本発明は、比較的経費のかかる個別包装及び比較的長
いアッセイ時間を含む現在利用可能な無作為アクセスシ
ステムにおける幾つかの欠点を克服する。本発明は、複
数の分析対象の分析に有用である。パネルの各テストが
臨床症状の種々のステージの指標であるパネルテストを
用いる特別の診断のために患者のサンプルをアッセイす
る場合には、本発明の混合溶液は特に有用である。例え
ば、心臓パネルは、クレアチニンキナーゼアイソザイム
MB（CKMB）、トロポニン、ミオグロビン及びジゴキシン
についての試験を必要とするであろうし、癌マーカーパ
ネルは、癌胎児性抗原（CEA）、α−フェトプロテイン
（AFP）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）につい
てテストするであろう。

本発明は、以下の説明的具体例を参照することによっ
て更に理解されようが、それらは純粋に模範例であり、
請求の範囲に記述されている本発明の真の範囲を限定す
るものと解してはならない。

実施例１ 固相支持体（タブ）の調製 この実験において用いられた固相支持体は、共にBaxt
er Diagnostics Inc.によって販売されているStratus
分析機器又はStratus II分析機器とともに使用されて
いる「タブ」を含む。これらのタブは、Giegel et al.,
Radial Partition Immunoassay,Clin.Chem.28:1894−98
（1982）に開示されているように、１インチ（2.5cm）
幅のGF/Fガラス濾紙ロール（Whatman Inc.）と、スナッ
プ嵌合式プラスチックタブ部品とから組み立てられてい
る。適切な濃度のデンドリマー溶液、抗体溶液又は他の
タンパク質又は対照溶液が、スポット用緩衝液中に作ら
れる。該スポット用緩衝液組成物は、特定の実験上の又
は製造上のパラメータを受け入れるよう変化させてよ
い。通常、このスポット用緩衝液は、例えば、20mM〜20
0mMのトリス（pH7.0〜9.0）、濃度範囲0.1％〜1.0％のZ
onyl FSN（E.I.DuPont DeNemours ＆ Co.,カタログ番
号CH 7152S）のような非イオン性界面活性剤、0.5％〜1
0.0％の牛血清アルブミン（BSA）、及び0.1％のアジ化
ナトリウムを含むがこれに限定されない適当な緩衝剤よ
りなる。好ましくは、このスポット用緩衝液は、30〜10
0mMのトリス（pH7.0〜8.5）、0.1％〜0.5％のZonyl FS
N、1.0％〜3.0％のBSA及び0.1％のアジ化ナトリウムを
含む。最も好ましくは、このスポット用緩衝液は、50mM
のトリス（pH8.0）、0.1％のZonyl FSN、2.0％のBSA及
び0.1％のアジ化ナトリウムを含む。フッ素化した界面
活性剤（例えば、3Mカタログ番号FC 171及びFC 170C）
その他の当業者に知られた適当な界面活性剤を、Zonyl
FSNの代わりに用いてもよい。

選ばれた１つの溶液の部分量76μが、ブランクタブ
の中心上にスポットされ、タブはついで80〜90℃にてオ
ーブン乾燥される。冷却後、タブは、使用時まで２〜８
℃にて貯蔵してよい。タブ上への溶液のスポットは、ピ
ペット装置を用いて手で行ってもよく、また自動化され
た製造手順により行ってもよい。代わりとして、タブ
は、Stratus II機器自体によって、タブの中心に原液
の選ばれた部分量を適用するための機器パラメータの適
切なプログラミングに従って、スポットし処理してもよ
い。

実施例２ 誘導体化したデンドリマーへの抗体の結合のための一般
的手順 約２重量％（約４×10¹⁷個の粒子を含有）のE5デンド
リマー（Michigan Molecular Institute,Midland,ミシ
ガン州より。エチレンジアミンのコア、第５世代、推定
直径70Å）を含有する水溶液に、５分の１体積の0.5Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）を加えた。該溶液のpH
を7.6に調節した。調製したばかりの20mg/mのsulfo−
SIAB（Pierce）溶液を、絶えず混合しつつ、該デンドリ
マー溶液に、約10乃至25:1のモルチャレンジ比（sulfo
−SIAB:デンドリマー）で加えた。この混合物を、30℃
にて１時間インキュベートし、次いで調製したＧ−25カ
ラム上に負荷して0.1M酢酸ナトリウム（pH4.5）で溶出
させた。280nmにおける吸収によって観察されるものと
して該カラムから溶出された最初のピークが、該誘導体
化されたデンドリマーを含んでいる。該誘導体化された
デンドリマーを含んだ溶液を収集し、使用まで12時間以
内の時間氷浴中に貯蔵するか、又は最長２週間まで−10
℃にて凍結貯蔵した。

還元緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム−5.0mM EDTA、p
H6.0）中の望みの抗体の5.0mg/mの溶液を調製し、そ
して37℃にて10分間インキュベートした。該還元緩衝液
中にジチオスレイトール（DTT）を11.4mg/mの濃度に
溶解させた。このDTT溶液を、該抗体溶液に、該抗体溶
液の1/9に等しい液量だけ加え、次いで37℃にて更に１
時間インキュベートした。過剰のDTTは、調製しておい
たＧ−25カラムに該溶液を通し該還元緩衝液で溶出する
ことによって除去した。プールしたIgG−SH含有タンパ
ク質画分を、ヨードアセチル化デンドリマーと結合させ
るまで２〜８℃にて貯蔵した。

このヨードアセチル化デンドリマー溶液と該還元され
た抗体溶液（デンドリマーの抗体に対するモルチャレン
ジ比3:1）とを配合し、次いでこのデンドリマー／抗体
溶液を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.6）で緩衝液交換し
た。この混合物をタンパク質濃度5.0mg/mに調節し、
２〜８℃にて16時間インキュベートした。過剰のチオー
ル基は、反応混合物の1m当たり、N,N−ジメチルホル
ムアミド（DMF）中の10mg/mのＮ−エチルマレイミド
溶液20μの添加によって不活性化した。得られた反応
混合物を、室温にて１時間インキュベートした。このデ
ンドリマーに結合した抗体複合体の調製は、調製したゲ
ル濾過カラム（IBF−SepracoからのAcA−44）上で行
い、10mMのリン酸ナトリウム、2.7mMのKC1、120mMのNaC
l及び0.1％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（pH7.
4）（PBS）で溶出した。このカラムから溶出してくる主
ピークを収集し、0.22μｍフィルターで濾過し、そして
２〜８℃にて貯蔵した。BCAテスト（Pierce Chemical C
ompany）を用いてタンパク質濃度を測定した。

実施例３ 抗−hTSH抗体（CA2）のデンドリマーとの結合 約60mgの抗−hTSH（CA2）抗体を含んだ約12mの腹水
を、Ｑ−Sepharoseカラム（1.0×13.0cm）上で、20mMト
リス（pH8.5）と20mMトリス/0.3MのNaCl（pH7.0）を用
いて精製し、54mgの精製抗体タンパク質を得た。CA2
は、American Type Culture Collection（ATCC）に受託
番号1437のもとに寄託されている。35mgのタンパク質を
含有するこの抗体溶液を、等しい液量の結合緩衝液（Bi
o−Rad）で希釈し、そしてProtein Aカラム（1.0×6.5c
m,Bio−Rad AffiPrep）上に、該抗体を該カラムに吸収
させそして結合したタンパク質を、0.1Mの酢酸ナトリウ
ム−0.1Mの塩化ナトリウム（pH5.0）によって溶出させ
ることによって精製して、溶液中の抗体26.0mgを得た。

E5デンドリマーは、上の実施例２において論じられて
いる一般的手順に従って、ヨードアセチル化した。20倍
モル過剰のsulfo−SIABを該水溶性デンドリマーに加え
た。各デンドリマー粒子には、約2.5個のヨードアセチ
ル基が組み込まれた。

上の実施例２に示されている一般的手順に従って0.1M
リン酸ナトリウム−5.0mMのEDTA（pH6.5）中のDTT（4.5
mg/mの0.23m）で、該抗体溶液（5.0mg/mの2.0m
）を37℃にて１時間還元した。還元緩衝液中Ｇ−25カ
ラム上で脱塩した後、生成物は、１個のIgG当たり約10
個のスルフヒドリル基の存在を示した。

この還元された抗体を、次いで、上の実施例２に示さ
れている一般的結合手順に記述されているようにして、
1:3のモル比で、ヨードアセチル化デンドリマーと結合
させた。最終生成物を、Superdex 200（1.6×60.0cm、P
harmacia）カラムを用いてFPLCにより、又はPBS中AcA−
44カラムを用いることにより、精製した。最終の精製後
生成物におけるデンドリマーの抗体に対する化学量論
は、1.0±0.3であることが判明した。

実施例４ 抗CKMB抗体のデンドリマーとの結合 該抗体（Conan,American Type Culture Collection受
託番号HB8939）の精製は、上記実施例２に記述されてい
るようにしてＱ−Sepharose上で行い、約65％の収率を
与えた。デンドリマー当たり約2.5個のヨードアセチル
基を導入するために、E5デンドリマーを20倍モル過剰の
sulfo−SIABでチャレンジした。還元緩衝液中における
Ｇ−25カラム上での脱塩の後、生成物は、IgG1個当たり
約8.5のスルフヒドリル基の存在を示した。誘導体化さ
れたE5と還元されたIgGとの結合は、hTSHの場合につき
記述した（実施例３）ようにして行われた。最終生成物
の精製は、精製したAcA−44カラム上で行い、PBSで溶出
させた。

実施例５ 抗T4抗体のデンドリマーとの結合 誘導体化されたE5の還元された抗体（Medix Biochem,
カタログ番号MIT 0501）との結合は、実施例２に示され
た結合のための一般的手順に記述されているようにして
行った。還元されたIgGは、IgG1個当たり約7.8個のスル
フヒドリル基の存在を示した。複合体の精製は、AcA−4
4カラム上で行い、複合体はPBSで溶出させた。

実施例６ 数種のデンドリマー結合抗体の混合溶液の調製 ３つのデンドリマー結合抗体、すなわちCKNB、hTSH及
びT4に対する抗体を含んだ混合デンドリマースポット緩
衝液を調製した。最適なデンドリマースポット希釈液
は、50mMのトリス、0.1％v/vのZonyl FSN、及び0.18％
w/vの未変性E5よりなった（pH8.0）。この希釈液を、３
つのE5複合体混合物のために使用した。T4−E5複合体の
ためのスポット緩衝液と最適濃度は、それを他の２つの
分析対象複合体（hTSH及びCKMB）と混合する前に先ず最
適化させた。T4複合体希釈液の調合物は、他の２つの複
合体の存在を伴わずにT4−E5を用いて最適化させること
が必須であった。デンドリマースポット緩衝液中におけ
る各複合体の最終の作業濃度は、T4−E5については0.56
μg/m、hTSH−E5については10μg/mそしてCKMB−E5
については10μg/mと決定した。従って、デンドリマ
ースポット希釈液中において、この最適の作業濃度の３
倍の各複合体の2m溶液を調製した。すなわち、T4−E5
については1.68μg/m、CKMB−E5については30μg/m
そしてhTSH−E5については30μg/m。これらの溶液を
一つに混合し、終夜インキュベートとし、そしてStratu
s II分析装置で試験した。

実施例７ Stratus II による３つのタイプのデンドリマー結合抗
体の混合物の評価 デンドリマーに結合した特異的抗体の原液を、50mMの
トリス、0.1％v/vのZonyl FSN、0.18％w/vの無変性E5
を含有する溶液（pH8.0）（スポット緩衝液）中に、未
変性のデンドリマーにつき約0.02〜0.15％の既知濃度に
なるよう希釈した。この溶液の一定量を、上の実施例１
に記述されているようにしてタブ上にスポットした。直
接的特異的結合アッセイを、分析対象としてのCKMB、hT
SH又はT4の較正された又は可変のサンプル量を利用して
実施した。較正標準の既知量又はサンプルと混合物をタ
ブに適用した。適当な時間の後、特異性アルカリ性ホス
ファターゼ接合物及び基質洗浄液を該タブに順に適用
し、こうして発生した信号を、Giegel et al.,Clin.Che
m.28:1894−98（1982）に記述されているようにしてStr
atus 機器中における前面蛍光光度法によって測定し
た。T4の検出のためには、アミノナフタリンスルホン酸
を含有する遊離緩衝液によってサンプルを前インキュベ
ーションし、次いでデンドリマー結合抗体溶液と混合し
た。残りのステップについては、一般のアッセイ手順に
従った。

Giegel et al.において記述されている放射状分配ア
ッセイ方式を、全ての実験において使用した。較正標準
溶液A,B,C,D,E及びＦは、通常のヒト血清中又は、BSA、
安定化剤及び保存剤としての0.1％のアジ化ナトリウム
を含んだトリス緩衝液（pH7.5）中に調製した。hTSHに
ついての較正標準溶液のためのA,B,C,D,E及びＦは、そ
れぞれ、０、0.25、0.75、３、12及び50μIU/mの濃度
を含み、CKMBのための較正標準溶液は、それぞれ、0.
0、4.80、11.60、26.90、61.10及び127.80ng/mの濃度
を含み、T4のための較正標準溶液は、それぞれ、0.0、
2.5、5.0、10.0、15.0及び25.0μg/dの濃度を含ん
だ。

アッセイは、Stratus II機器により、選ばれた較正
標準（又はサンプル）の132μの前インキュベートさ
れた混合物の76μ及びE5−結合抗体の38μを吸引し
ブランクタブ上に放出することによって行った。適当な
アルカリ性ホスファターゼ接合体（0.75μg/m）の20
μが、次いで各タブ上に放出された。Stratus 機器
の基質プローブが、次いで70μの基質洗浄液（1.0mM
のリン酸４−メチルウンベリフェリル、アルカリ性ホス
ファターゼ阻害剤、安定化剤、青色染料、界面活性剤及
び0.1％のアジ化ナトリウムを含有するpH9.0のトリス緩
衝液）を吸引し、20μ及び50μを順にタブに放出し
た。第２の基質洗浄液を放出して直ぐに、当初の蛍光率
を読み取り、機器の記憶装置に記憶した。

リン酸メチルウンベリフェリル基質に対するホスファ
ターゼの作用によって発生した蛍光の量がStratus 機
器によって検出され、単位時間当たりの電圧で表した
「率」へと変換され、それが表においてmV/分（「Strat
us率」）として与えられている。Stratus率は、蛍光の
強度の尺度であり、それは今度は、タブの反応性部分に
結合した分析対象の量の尺度である。

Stratus 機器の作動に際して、個々の較正標準の蛍
光率が測定され、それらの値が、マイクロプロセッサメ
モリの記憶位置へ送られる。全ての較正標準を測定した
後、プログラムは、測定されたデータ点に次の方程式に
示された形で数学的関係を当てはめるものであるマルチ
パス線形回帰ルーチンを用いて、「ロッドバード（Rodb
ard）」パラメータA,B,C,及びＤを計算する（Davis,S.
E.et al.,J.Immunoassay 1:15−25（1980）） Ｒ＝｛（Ａ−Ｄ）／〔１＋Ｂ（X/C）〕＋Ｄ｝ ここに、Ｒは、蛍光率、そしてＸは対応する濃度であ
る。該方程式は、種々のイムノアッセイ系において卓越
した当てはめを与えることの報告されている一般化され
たシグモイド曲線である。得られた、記憶装置に記憶さ
れているA,B,C及びＤパラメータに基づいて、機器は、
アッセイサンプルについての濃度読み取り値を提供す
る。

表１は、全較正動作からのデータを示す。Stratus
システムの感度内において、これら３つの分析対象につ
いての率は、非特異的デンドリマー結合抗体の存在によ
っては影響を受けなかった。この結論は、３つの正常ヒ
ト血清に基づく対照について得られた結果によって確認
された（表１）。これらの対照は、正常なヒト血清に特
定の分析対象の既知レベルをスパイクすることによって
調製した。これら３つの対照は、較正曲線の３つの異な
った部分における分析対象濃度を代表する。

表２は、単一タイプのデンドリマー結合抗体を含んだ
溶液による又は、３つのタイプのデンドリマー結合抗体
の混合物を含んだ溶液による、単一のサンプルの検出に
ついての比較データを示す。２つのヒト血清に基づく対
照の1:1混合物を含んだサンプルが調製された。これら
３つの分析対象の各々の検出された濃度は、デンドリマ
ー結合抗体溶液が単一のタイプのデンドリマー結合抗体
しか含んでいなくても又は該抗体溶液がデンドリマー結
合抗体の混合物を含んでいても、非常に近似していた。

実施例８ Stratus II による２つのタイプのデンドリマー結合抗
体の混合物の評価 ２つのデンドリマー結合抗体、すなわちCKMB及びhTSH
に対する抗体の混合溶液を調製した。デンドリマースポ
ット緩衝液は、8.9％w/vのBSA、0.45％v/vのZonyl FSN
及び0.089％w/vのE5よりなるものであった（pH8.0）。
これら２つの抗体混合物についての最終の作業濃度は、
E5−CKMB複合体については10μg/m、そしてE5−hTSH
複合体については10μg/mであった。この溶液の一定
量を、上記実施例１に記述されているようにしてタブ上
にスポットした。直接的特異的結合アッセイを、上記実
施例７におけると同様にして、CKMB又はhTSHの較正され
た又は可変のサンプル量を用いて実施した。表３は、完
全較正動作からのデータを示す。Stratus システムの
感度範囲内において、これら２つの分析対象についての
率は、非特異的デンドリマー結合抗体の存在によっては
影響を受けなかった。

実施例９ 複数特異性デンドリマーの調製 個々の粒子が１つより多くのタイプの抗体に結合した
ものであるデンドリマーを調製した。以下は、個々のデ
ンドリマー粒子が抗CKMB及び抗hTSH抗体又は抗CKMB、抗
hTSH及び抗T4抗体に結合されているものである抗体結合
デンドリマーの生産のための手順である。これらのデン
ドリマーは、上記実施例２において論じられている一般
的手順に従ってヨードアセチル化される。20乃至50倍モ
ル過剰のsulfo−SIABが、該水溶性デンドリマー溶液に
加えられる。各デンドリマー粒子には、約６乃至10個の
ヨードアセチル基が導入される。

1:1比（重量による）の精製された抗CKMB及び抗hTSH
抗体の混合物を、上記実施例２に記述されている一般的
手順に従って、還元緩衝液中において、DTTによって、3
7゜において１時間還元した。抗CKMB、抗hTSH及び抗TR
の結合のために、これら３つの抗体の、質量比18:18:1
での混合物が、還元に先立って利用される。調製された
Ｇ−25カラム上での脱塩及び反応緩衝液で溶出の後、生
成物は、IgG1個当たり約10個のスルフヒドリル基の存在
を示すであろう。

この還元された抗体混合物は、次いで、上記実施例２
に示された一般的な結合手順に記述されているように、
1:5乃至1:10の比で、該ヨードアセチル化されたデンド
リマーに結合させられる。最終製品溶液中に存在する過
剰な未結合の抗体は、AcA−34（又は同等物）カラムを
用いることによって又は、PBS中においてSuperdex 200
（Pharmacia）カラムを用いたFPLCによるゲル濾過精製
によって除去される。IgG−E5を含んだ画分はプールさ
れ、そしてタンパク質濃度がBCAアッセイによって定量
される。結合のために抗T4、抗CKMB及び抗hTSHの混合物
が使用される場合には、デンドリマー結合抗体溶液は、
50mMトリス、0.1％FSN、0.1％アジド（pH8.0）中に20.6
mg/mに希釈され、そしてStratus IIによって試験さ
れる。抗CKMB及び抗hTSH抗体の混合物により調製される
デンドリマー結合抗体溶液は、試験及び貯蔵用に、50mM
トリス、２％BSA、0.1％FSN、及び0.1％アジド（pH8.
0）中に20μg/mに希釈される。

上記の手順は、特定のアッセイ条件に適するように修
正することができる。より高世代のデンドリマー及びCO
OH又はSH末端官能基を使用することができる。代わりと
して、E5その他のデンドリマーの２量体とした又は重合
させた形態をも用いることができる。更には、ヨードア
セチル化のレベルは、種々の試薬の関連した結合条件を
最適にするために容易に調節することができる。

前記の詳細な記述は、本発明のよりよい理解のために
のみ提供されており、いくらかの修正は添付の請求の範
囲の精神及び範囲から逸脱することなく当業者に明らか
であるから、そこから不必要な限定を読み取ってはなら
ない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファーズリ，チャールス アメリカ合衆国27510ノースカロライナ、 カルボロ、ノースエステスドライブナン バー13エム 306 (72)発明者 リン，スペンサー アメリカ合衆国33071フロリダ、コーラ ルスプリングス、サウスウエストワンハ ンドレッドアンドトゥエンティースウェ イ 111 (72)発明者 シン，プラタップ アメリカ合衆国33193フロリダ、マイア ミ、サウスウエストシックスティーナイ ンスストリート 15111 (56)参考文献 特開 平３−231152（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−506314（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／003774（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/545 G01N 33/552

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】サンプル中の１以上の分析対象の濃度又は
   存在を測定するための特異的結合アッセイを実施するた
   めの方法であって、 （ａ）間隙又は孔を有する多孔質固相の限定された領域
   へサンプルを適用するステップであって、該限定された
   領域は各自が固定化前に特異的結合アッセイ試薬へ共有
   結合により連結されたデンドリマーよりなる少なくとも
   ２つのタイプの固定化したデンドリマー／試薬複合体の
   有効量を有し、前記試薬は前記デンドリマー／試薬複合
   体のタイプ毎に異なる規定された分析対象特異性を有
   し、前記サンプルは前記１以上の分析対象の前記試薬へ
   の結合が実行される条件下で適用され、前記デンドリマ
   ー／試薬複合体が固定化された前記固相も間隙又は孔を
   有し； （ｂ）１以上の標識された接合体の選択された量を、前
   記接合体の各自が前記分析対象の対応する１つへの結合
   が実行される条件下で前記限定された領域へ適用するス
   テップ； （ｃ）前記限定された領域上の前記対応する分析対象へ
   結合した前記接合体の各自の量を測定するステップ；お
   よび （ｄ）前記結合した接合体の各自の量を前記サンプル中
   の前記対応する分析対象の濃度又は存在と関連づけるス
   テップ； よりなる方法。
2. 【請求項２】前記試薬は、抗体、抗体フラグメント、特
   異的結合性タンパク質及び分析対象よりなる群から選ば
   れる請求項１の方法。
3. 【請求項３】前記限定された領域は２つのタイプのデン
   ドリマー／試薬複合体を有する請求項１の方法。
4. 【請求項４】前記限定された領域は３つのデンドリマー
   ／試薬複合体を有する請求項１の方法。
5. 【請求項５】前記サンプルと前記標識接合体とは同時に
   前記固相へ適用される請求項１の方法。
6. 【請求項６】サンプル中の１以上の分析対象の濃度又は
   存在を測定するための特異的結合アッセイを実施するた
   めの方法であって、 （ａ）間隙又は孔を有する多孔質固相の限定された領域
   へサンプルを適用するステップであって、該限定された
   領域は各自が固定化前に特異的結合アッセイ試薬へ共有
   結合により連結されたデンドリマーよりなる少なくとも
   ２つのタイプの固定化されたデンドリマー／試薬複合体
   の有効量を有し、前記試薬は前記デンドリマー／試薬複
   合体のタイプ毎に異なる規定された分析対象特異性を有
   し、前記サンプルは前記１以上の分析対象の前記試薬へ
   の結合が実行される条件下で適用され、前記デンドリマ
   ー／試薬複合体が固定化された前記固相も間隙又は孔を
   有し； （ｂ）各自が前記分析対象の１つに対応する１以上の標
   識された特異的競合試薬の選択された量を、前記競合試
   薬の各自が前記複合体の少なくとも１つへの結合が実行
   される条件下で前記限定された領域へ適用するステッ
   プ； （ｃ）前記限定された領域上の前記複合体へ結合した前
   記競合試薬の各自の量を測定するステップ；および （ｄ）前記結合した競合試薬の量を前記サンプル中の前
   記対応する分析対象の濃度又は存在と相関づけるステッ
   プ； よりなる方法。
7. 【請求項７】前記特異的競合試薬は、前記分析対象の標
   識された類縁体である請求項６の方法。
8. 【請求項８】前記特異的競合試薬は、前記分析対象に対
   する標識されたレセプターである請求項６の方法。
9. 【請求項９】前記試薬は、抗体、抗体フラグメント、特
   異的結合タンパク質及び分析対象よりなる群から選ばれ
   る請求項６の方法。
10. 【請求項１０】複数の特異的結合アッセイ試薬を固相に
    固定化するための方法であって、 （ａ）各自が固定化前に特異的結合アッセイ試薬へ共有
    結合により連結されたデンドリマーよりなる少なくとも
    ２つのタイプのデンドリマー／試薬複合体であって、前
    記試薬は前記デンドリマー／試薬複合体のタイプ毎に異
    なる規定された分析対象特異性を有する少なくとも２つ
    のデンドリマー／試薬複合体を調製するステップ；およ
    び （ｂ）前記少なくとも２つのタイプのデンドリマー／試
    薬複合体の有効量を間隙又は孔を有する多孔質固相に、
    該固相の限定された領域上への前記デンドリマー／試薬
    複合体の固定化が実行される条件下で加えるステップよ
    りなり、前記固相は前記デンドリマー／試薬複合体を加
    えた後も隙間又は孔を保持していることを特徴とする方
    法。
11. 【請求項１１】前記少なくとも２つのタイプのデンドリ
    マー／試薬複合体は、前記固相に加えられる前に混合さ
    れる請求項10の方法。
12. 【請求項１２】前記試薬は、抗体、抗体フラグメント、
    特異的結合タンパク質及び分析対象よりなる群から選ば
    れる請求項10の方法。
13. 【請求項１３】前記デンドリマーへの前記試薬の共有結
    合連結は、SIAB標識された部分をスルフヒドリル含有部
    分へ結合することによるＣ−Ｓ結合による請求項10の方
    法。
14. 【請求項１４】特異的結合アッセイにおいて使用するた
    めの固相組成物であって、 （ａ）間隙又は孔を有する多孔質固相；および （ｂ）前記固相の限定された領域に固定化された少なく
    とも２つのタイプのデンドリマー／試薬複合体よりな
    り、 前記デンドリマー／試薬複合体の各自は特異的結合試薬
    へ共有結合により連結されたデンドリマーよりなる分析
    対象結合成分を含み、前記試薬は前記デンドリマー／試
    薬複合体のタイプ毎に異なる規定された分析対象特異性
    を有し、前記固相組成物は間隙又は孔を有することを特
    徴とする組成物。
15. 【請求項１５】前記試薬は、抗体、抗体フラグメント、
    特異的タンパク質及び分析対象よりなる群から選ばれる
    請求項14の固相組成物。
16. 【請求項１６】前記分析対象結合成分は２つのタイプの
    前記複合体を含んでいる請求項14の固相組成物。
17. 【請求項１７】前記分析対象結合成分は３つのタイプの
    前記複合体を含んでいる請求項14の固相組成物。
18. 【請求項１８】前記固相は圧縮した繊維のマットよりな
    る請求項14の固相組成物。
19. 【請求項１９】前記固相はガラス繊維フィルターである
    請求項14の固相組成物。
20. 【請求項２０】包装材と該包装材中の少なくとも２つの
    タイプのデンドリマー／試薬複合体よりなり、前記デン
    ドリマー／試薬複合体の各自は特異的結合アッセイ試薬
    へ共有結合により連結されたデンドリマーよりなり、前
    記試薬は前記少なくとも２つのタイプのデンドリマー／
    試薬複合体毎に異なる規定された分析対象特異性を有
    し、前記包装材は前記デンドリマー／試薬複合体の前記
    タイプが請求項１または６の方法において使用できるこ
    とを示すラベル又は能書を含んでいる包装製品。