JPH08114594A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の測定法よりも優れた測定感度を持つと
ともに、簡便に測定ができる酵素免疫測定法を提供す
る。 【構成】 酵素標識抗原と検体中の非酵素標識抗原とを
第一抗体へ競合結合させた後、前記第一抗体を固相担体
に第二抗体を介して結合させ、その後前記固相担体中の
前記酵素標識抗原の量を測定することよりなる酵素免疫
測定法において、前記第二抗体が、プロテインＡの一部
分を有するペプチド、又は、プロテインＧの一部分を有
するペプチドである酵素免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、薬物等の検体中の微量
成分を高感度に測定する酵素免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫測定法の分野では、従来から、
検体中の微量成分を高感度に測定するための種々の工夫
がなされている。例えば、薬物等の低分子量物質等を酵
素免疫測定法を用いて測定する場合には、「酵素免疫測
定法（第３版）」（株式会社医学書院、１９８７年）に
記載されている二抗体法が広く用いられている。

【０００３】この二抗体法では、まず、検体中の測定対
象物質が非酵素標識抗原として存在する液相中に酵素標
識抗原及び第一抗体を添加して液相で反応させ、第一抗
体に非酵素標識抗原と競合して結合した酵素標識抗原、
及び、第一抗体に結合していない酵素標識抗原が混在す
る液相を得た後、この液相にスチレンビーズ等の固相担
体に吸着させた第二抗体を加えて、第一抗体に結合した
酵素標識抗原を第二抗体を介して固相担体に吸着させ
る。液相中に遊離している第一抗体に結合していない酵
素標識抗原は、固相担体及び試験管を水洗することによ
り除去できる。

【０００４】ここで第一抗体とは測定対象物質である非
酵素標識抗原及び酵素標識抗原に対する抗体であり、第
二抗体とはこの第一抗体を抗原とする抗体であり、この
ような第二抗体としては、ヤギ等の動物から得られた免
疫グロブリンのほか、プロテインＡ、プロテインＧ等が
用いられている。二抗体法では、その後標識酵素に対す
る基質を加え、酵素反応によって生じた生成物量を測定
することにより、酵素標識抗原の量を測定する。

【０００５】この二抗体法においては、酵素標識抗原添
加時に検体中に測定対象物質である非酵素標識抗原が共
存しており、第一抗体との結合段階で両者が競合して結
合するので、非酵素標識抗原の存在量に応じて酵素標識
抗原の結合量が変化する。そこで、最終的に酵素標識抗
原を測定することにより、非酵素標識抗原の量を逆算し
て測定対象物質の量を算出することができるものであ
る。この二抗体法の改良については、特開昭５７−１８
４９７０号公報等に、種々の方法が提案されている。

【０００６】しかしながら、従来の方法で第二抗体とし
て使用されているのは、ヤギ由来の免疫グロブリン、プ
ロテインＡ、プロテインＧ等の高分子のタンパク質であ
ったので、固相担体表面に吸着できる第二抗体の量が制
限され、このため固相担体に吸着する酵素標識抗原又は
非酵素標識抗原の量も制限された。従って、微量成分の
高感度な測定が求められる分野では適切な手法とはいえ
なかった。また、ヤギ由来の免疫グロブリン等は、直接
生体から精製しなければならないので、安定供給が難し
い点にも問題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、従来の測定法よりも優れた測定感度を持つととも
に、簡便に測定ができる酵素免疫測定法を提供すること
を目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、酵素標
識抗原と検体中の非酵素標識抗原とを第一抗体へ競合結
合させた後、前記第一抗体を固相担体に第二抗体を介し
て結合させ、その後前記固相担体中の前記酵素標識抗原
の量を測定することよりなる酵素免疫測定法において、
前記第二抗体が、プロテインＡの一部分を有するペプチ
ド、又は、プロテインＧの一部分を有するペプチドであ
るところに存する。

【０００９】本発明で使用される第二抗体は、プロテイ
ンＡの一部分を有するペプチド、又は、プロテインＧの
一部分を有するペプチドである。上記プロテインＡ及び
上記プロテインＧは、免疫グロブリンに対して免疫反応
により特異的に吸着する性質を有するタンパク質であ
る。

【００１０】上記プロテインＡの一部分を有するペプチ
ドとは、プロテインＡを構成するアミノ酸配列のうち、
当該プロテインＡの活性を発現する部位（アクティブサ
イト）を含有するペプチド断片を意味する。上記プロテ
インＡの一部分を有するペプチドは、プロテインＡに比
べてはるかに小さい分子量を有しているにもかかわら
ず、第一抗体を抗原とした場合の抗体として、その免疫
反応における親和力はプロテインＡと比較して遜色がな
い。上記プロテインＡの一部分を有するペプチドは、単
量体であっても多量体であってもよく、例えば、プロテ
インＡの免疫グロブリン結合性ペプチド等が挙げられ
る。

【００１１】上記プロテインＧの一部分を有するペプチ
ドとは、プロテインＧを構成するアミノ酸配列のうち、
当該プロテインＧの活性を発現する部位（アクティブサ
イト）を含有するペプチド断片を意味する。上記プロテ
インＧの一部分を有するペプチドは、プロテインＧに比
べてはるかに小さい分子量を有しているにもかかわら
ず、第一抗体を抗原とした場合の抗体として、その免疫
反応における親和力はプロテインＧと比較して遜色がな
い。上記プロテインＧの一部分を有するペプチドは、単
量体であっても多量体であってもよく、例えば、プロテ
インＧの免疫グロブリン結合性ペプチド等が挙げられ
る。

【００１２】本発明の酵素免疫測定法は、第二抗体とし
て上記プロテインＡの一部分を有するペプチド、又は、
上記プロテインＧの一部分を有するペプチドを用いるこ
と以外は、従来の二抗体法による酵素免疫測定法をその
まま適用することができる。本発明の酵素免疫測定法に
おける第一抗体は特に限定されず、例えば、測定対象物
質をウサギ等の動物に注射し、体内に生成した測定対象
物質に対する免疫グロブリンを精製することにより得る
ことができる。本発明の酵素免疫測定法の測定対象物質
が薬物である場合には、酵素標識抗原を作成するにあた
っては、当該薬物をマレイミド等のリガンドを介して酵
素と結合させて標識化することができる。

【００１３】

【作用】本発明で使用されるプロテインＡの一部分を有
するペプチド又はプロテインＧの一部分を有するペプチ
ドは、従来使用されている免疫グロブリン、プロテイン
Ａ等と比較して、分子量が小さく、立体障害が少ないの
で、例えば、スチレンビーズ等の固相担体表面に、より
多量に吸着する。その結果、上記固相担体に、上記第二
抗体を介して上記第一抗体に結合した上記酵素標識抗原
が、より多量に吸着できるようになり、吸着した、より
多量の上記酵素標識抗原上の標識酵素及び上記標識酵素
に対する基質との酵素反応からは、より多量の生成物が
得られるので、測定感度が向上し、測定対象物質がより
微量であっても正確な測定が可能となる。

【００１４】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００１５】実施例１ 標識酵素にはβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）を使用し、その基質であ
る４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（以下「４−ＭＵＧ」という）が、酵素による加水分解
の結果生成した４−メチルウンベリフェリルを蛍光法に
て測定する方法を採用した。また、測定対象物質である
非酵素標識抗原は、解熱鎮痛剤であるインドメタシンを
用いた。

【００１６】酵素標識インドメタシンは、以下の手順に
従って調製した。インドメタシン５．４ｍｇ（１５．１
μｍｏｌ）を２００μｍｏｌの無水ジメチルホルムアミ
ドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０ｍ
ｇ／５０μｌ無水ジメチルホルムアミド溶液）及び１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド（３．２ｍｇ／１００μｌ無水ジメチルホルム
アミド溶液）を加え、遮光室温にて７０分間攪拌するこ
とにより、活性化インドメタシンを得た。

【００１７】この活性化インドメタシンをβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ溶液（２００μｇ／１ｍｌ、０．１Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液）に滴下し、遮光室温にて２時間反応
した後、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．８、０．１
Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液含有）にて、
４℃で２日間透析した。得られたβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼとインドメタシンのコンジュゲートを結晶化し、−
２０℃でグリセロール溶液として保存した。

【００１８】第一抗体として用いる抗血清は、以下の手
順に従って調製した。インドメタシン５．４ｍｇ（１
５．１μｍｏｌ）を２００μｍｏｌの無水ジメチルホル
ムアミドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（２．０ｍｇ／５０μｌ無水ジメチルホルムアミド溶
液）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（３．２ｍｇ／１００μｌ無水ジ
メチルホルムアミド溶液）を加え、遮光室温にて７０分
間攪拌することにより、活性化インドメタシンを得た。

【００１９】この活性化インドメタシンを窒素下で乾固
し、再度１００μｌ無水ジメチルホルムアミド溶液とし
た後、牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）溶液
（１０ｍｇ／１ｍｌ、０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、
ｐＨ９．２）に滴下し、遮光室温にて２時間反応した。
更に、蒸留水にて４℃で２日間透析し、結晶化した。得
られたＢＳＡとインドメタシンのコンシュゲート０．５
ｍｇを雄のウサギに注射し、更に、４週間後コンジュゲ
ート０．２ｍｇを注射した。１週間後、ウサギより採血
し、その血清を５６℃で３０分間加熱することにより、
得られた抗血清を−２０℃で保存した。

【００２０】測定は、以下の手順に従って行った。各濃
度のインドメタシン含有ヒト血漿１００μｌに０．１Ｍ
リン酸緩衝溶液（０．１Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マグネシ
ウム水溶液含有、ｐＨ７．０）９００μｌを加え攪拌の
後、１００℃で加熱処理を行うことにより、除タンパク
した。この上清１００μｌに４℃下でβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとインドメタシンのコンジュゲート５０μｌ及
び抗血清５０μｌを加え、攪拌の後、４℃で１８時間静
置した。

【００２１】この試料溶液に０．１Ｍリン酸緩衝溶液
（０．１Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液含
有、ｐＨ７．０）２００μｌを加えた後、あらかじめプ
ロテインＡの免疫グロブリン結合性ペプチド溶液（０．
０１Ｍリン酸緩衝溶液、０．１Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マ
グネシウム水溶液、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナ
トリウム水溶液含有、ｐＨ７．０）で４８時間浸漬後、
０．１％ＢＳＡ溶液（リン酸緩衝溶液、０．１Ｍ食塩
水、１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液含有、ｐＨ７．０）
でブロッキングしたポリスチレンビーズを加え、１５℃
で４時間反応を行った。

【００２２】しかる後に、ポリスチレンビーズを０．１
Ｍリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マグネ
シウム水溶液含有、ｐＨ７．０）で数回洗浄することに
より、ビーズに結合していないβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼとインドメタシンのコンジュゲートを除去した。この
ポリスチレンビーズを０．３ｍＭの４−ＭＵＧ含有０．
１Ｍリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ食塩水、１ｍＭ塩化マグ
ネシウム水溶液含有、ｐＨ７．０）３００μｌに加え、
３７℃で２時間酵素反応を行った。０．１Ｍ炭酸ナトリ
ウム溶液を２ｍｌ加え反応を停止させた後、酵素反応に
より、４−ＭＵＧから生成した４−メチルウンベリフェ
リルの蛍光強度（励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ）を
測定した。試料を各濃度３サンプルずつ調製及び測定し
て、３つの測定値の平均を各濃度での測定結果とした。
その結果を表１に示した。

【００２３】比較例１ 第二抗体に天然型プロテインＡ
を用いたこと以外は、実施例１と同様にして行った。そ
の結果を表１に示した。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【発明の効果】本発明の酵素免疫測定法は上述の構成よ
りなるので、従来の測定法よりも優れた測定感度を持つ
とともに、簡便に測定ができ、微量成分の高感度な測定
に好適に利用できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素標識抗原と検体中の非酵素標識抗原
   とを第一抗体へ競合結合させた後、前記第一抗体を固相
   担体に第二抗体を介して結合させ、その後前記固相担体
   中の前記酵素標識抗原の量を測定することよりなる酵素
   免疫測定法において、前記第二抗体が、プロテインＡの
   一部分を有するペプチド、又は、プロテインＧの一部分
   を有するペプチドであることを特徴とする酵素免疫測定
   法。