JP3655657B2 - アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、標識として比較的低分子の化合物と共にアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその標識されているアルカリフォスファターゼを試薬として用いることを特徴とする特異的結合測定法に関する。
本発明の特異的結合測定法は、比較的低分子の化合物で標識されると共にアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の測定対象物とが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗体に対して競合的に反応して結合することを利用する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
生物学的に活性を持ったり、臨床的に重要な薬物の測定法としては、特異的な結合反応を利用した測定法が開発されている。特に免疫学的な反応を利用する免疫測定法は、高い感度を有しており、微量の測定が可能であることから広く普及している。こうした測定において、当初は放射性の物質が標識として用いられ、測定を容易にするとともに高い検出感度を達成するために用いられてきた。
しかしながら、放射性の物質は、それ自体非常に危険であるなどのためそれを扱うための特別な施設とか、技術が要求され、さらに使用済み廃液の処理に於いて環境を汚染するなど大きな問題を抱えているので、それに代わる安全でかつ高い感度を実現できる標識の開発が求められている。そうした放射性物質の標識に代えて、酵素標識とか螢光標識などが開発されてきている。
【０００３】
最近では、化学ルミネセント現象を利用した特にアクリジニウム塩による標識が注目されてきている。アクリジニウム塩標識は、比較的高い光収量が得られ、さらにインジケーターに結合した抗体などの蛋白質によってはその化学ルミネセントが損なわれることが少ないことなど安定していることから、その標識剤としての開発が盛んに進められている。
例えば、特に甲状腺ホルモンの測定法としては、古くはＴＢＰに結合したＴ4 （またはＴ3 ）中のヨードを化学的に測定するタンパク結合ヨード法が用いられていたが、やがて放射性のＴ4 （またはＴ3 ）とＴＢＧとの結合を利用した競合タンパク結合分析法が用いられるようになった。さらに抗Ｔ4 抗体（または抗Ｔ3 抗体）を用いるラジオイムノアッセイが繁用されている。しかしながら、放射線標識は環境汚染などの問題があることから、最近では非放射性標識を用いたイムノアッセイの開発が求められ、酵素標識や螢光標識を用いたイムノアッセイ法の開発がなされてきている。こうした非放射性標識開発の一つとして、化学発光標識剤であるアクリジニウム基とＴ4 （またはＴ3 ）とを結合した試薬の開発が試みられている。
【０００４】
ところが、アクリジニウム塩標識は、水に難溶性であることから、比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物をアクリジニウム塩で標識すると、得られたアクリジニウム塩標識薬物である試薬は、水溶性が非常に劣ることとなり、試薬保存中や測定中に沈殿を生ずるとか、Ｂ／Ｆ分離の際にフィルターなどに非特異的に吸着されてしまうとか、測定に使用できるような濃度のものとすることが困難であったりするなどの問題がある。さらに臨床的な測定において普通に採用されることの多いｐＨ域で不安定であるという問題もある。また感度を高めたり、標識率を高めたり、例えば複数の標識を導入したりすると、得られた標識試薬の水溶解性が低下して、試薬として使用に耐えないとか、測定中に特異的結合反応に悪影響を与える恐れがでる、さらに分離処理などにおいてフィルターなどに吸着されてしまうなどの問題もある。
【０００５】
例えば、Ｔ4 （またはＴ3 ）誘導体とアクリジニウム塩とを直接結合させたものや、Ｔ3 （Ｔ4 ）誘導体とアクリジニウム塩とを低分子スペーサーを介して結合したものでは、
１．得られた結合物が疎水性であるため、非特異的吸着能が大きく、例えばＢ／Ｆ分離などにグラスフィルターなどを用いるとそれに非特異的に吸着してしまう２．溶液中での安定性が悪く、保存性が劣るばかりでなく、試薬としての信頼性に問題がある。例えば、中性〜弱アルカリ性の溶液中では不安定である。
３．抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体は、通常Ｔ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物を免疫原として産生されるが、こういったＴ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物により得られる抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体に対する親和性が低く測定の感度が悪いなどの問題があった。
【０００６】
さらにこうした結合物は、アクリジニウム標識に基づくアクリジニウム塩の化学発光を利用した免疫測定系には利用できるがその他の免疫測定系、例えば、酵素免疫測定系に応用するなどのことは一切できない。特に最近では、その場その場に応じ、酵素標識測定系とか、化学ルミネセント標識測定系など、一つの試薬を用いることで様々な角度及び感度などを利用して臨床測定することが求められたり、自動的に測定機器で測定処理するにも適したものが求められるが、これまで比較的低分子化合物からなるアクリジニウム標識を用いた系では、特にその水溶解性の観点で問題があり、さらに同時に酵素標識測定系を利用できるものがなかった。
【０００７】
例えば、Ｔ3 （Ｔ4 ）を測定する場合、その測定は、臨床の分野ではその病気などの治療を進めながら行う必要もあり、一つの試薬でその場その場の状況に応じた多様な測定手法に適用することが可能なものが求められるにも拘らず、従来はできなかった。
そこでこうした問題のない化学発光標識剤であるアクリジニウム塩による標識のなされた比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物からなる試薬を開発することが求められている。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者等は、特に測定の自動化を図るには、複数の測定系に利用が可能で、例えば、化学発光免疫測定法にも使用でき且つ酵素免疫測定法にも使用できるものが有利であること、及び試薬の安定性が求められること、さらには機器に使用しているフィルター類に非特異的な吸着を起こさないようなものが大切であるとの認識のもと、特異的結合反応利用測定系において用いることの出来る比較的低分子化合物などのアクリジニウム塩による標識でその水溶性に多大の影響をうけるものに関連した新規な試薬の開発に着手し、鋭意研究の結果本発明を完成したものである。
【０００９】
本発明は、標識として低分子化合物を有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその新規な標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートからなることを特徴とする特異的結合測定系用試薬並びにその試薬を用いることを特徴とする測定対象物の特異的結合測定法に関する。
本発明の測定対象物の特異的結合測定法は、比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物から成る群から選ばれたものを標識として有すると共にアクリジニウム塩を標識として有するところの標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の測定対象物とが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗体に対して競合的に反応して結合することを利用する。
【００１０】
本発明で使用される低分子化合物は、少なくとも１個のアクリジニウム塩標識の導入により、その水に対する溶解性に多大の影響を受けるものであり、複数のアクリジニウム塩標識を導入した場合には、１個のアクリジニウム塩標識の導入により比較的水に対する溶解性に於いて影響を受けることの少ないものも、次第に大きな影響を受けるであろうことは予測しうるところである。本発明では、アクリジニウム塩標識の導入により測定対象物の特異的結合測定法において何らかの実質的問題を生ぜしめることを解決しているかぎり、すべて本発明の対象低分子化合物と判断することができよう。
【００１１】
本発明で使用される低分子化合物は、例えば抗原、ハプテンなどの薬物を挙げることができ、生物学的重要性を持つ薬剤、臨床的重要性を持つ薬剤、代謝物質、ビタミン、ホルモン、ステロイド、核酸、糖類、毒物、生理活性物質、農薬、化学薬品などが挙げられる。
薬物としては、例えばホルモン薬、ビタミン剤、抗生物質、放射線増感剤、放射線防護剤、抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、抗炎症薬、駆虫薬、局所麻酔薬、抗真菌薬、抗アメーバ薬、抗トリコモナス薬、抗関節炎薬、抗喘息薬、抗血液凝固薬、抗糖尿病薬、抗高血圧症薬、冠血管拡張薬、脳血管拡張薬などの血管拡張薬、抗狭心症薬、血管新生阻害剤、カルシウム拮抗薬、カルモジュリン阻害剤、中毒治療薬、抗不整脈症薬、筋肉弛緩薬、抗脂肪血症薬、脳代謝改善薬、脳代謝賦活薬、学習・記憶障害改善薬、痴呆症薬などの脳機能改善薬、抗神経病薬、鎮痛薬、鎮静薬、抗不安薬、抗痙攣薬、抗躁うつ病薬、パーキンソン病治療薬などの中枢神経系作用薬、副作用軽減剤、酵素、ワクチンコンポーネント、トキソイド、抗毒素、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗癌剤効果増強剤、抗ウイルス剤、免疫増強剤、免疫調節剤、免疫回復剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
比較的低分子の薬物としては、モルフィン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジフェニルヒダントイン、カルバマゼピン、プリミドン、エトスクシミド、バルプロ酸、アセタゾールアミド、プロプラノロール、スルチアム、グルテチミド、クロナゼパム、ニトラゼパム、ジアゼパム、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブピバカイン、メピバカイン、リドカイン、プロカインアミド、キニジン、ジソピラミド、ジゴキシン、ジキトキシン、テオフィリン、アミトリプチリン、イミプラミン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ジブカイン、ストレプトマイシン、セファレキシン、スルファメトキサゾール、メソトレキサート、シクロスポリン、メチルプレドニゾロン、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール、テストステロン、１７−ＯＨ−プロゲステロン、ケモデオキシコール酸、サリチル酸、アセトアミノフェン、インドメタシン、アロプリノール、ハロペリドール、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、チロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ，Ｔ4 ）、３，５，３’−トリヨードチロニン（３，５，３’−ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ，Ｔ3 ）などが挙げられる。比較的低分子の薬物としては、特にはＴ4 やＴ3 などが挙げられる。
【００１３】
甲状腺ホルモンの過剰は、神経過敏、頻脈、脈圧増大、基礎代謝亢進、発育の促進、アドレナリンに対する感受性の増大を示すのに対し、その不足は成長発育の遅延、中枢神経系、精神機能の低下、循環系の異常をきたし、さらにコレステロール代謝に変化がおこるなど重要な生理的な変化をもたらす。したがって、血中に存在し、これらの生理活性に大きな影響を及ぼしている甲状腺ホルモンを正確に測定することは臨床医学上非常に重要と考えられている。
【００１４】
甲状腺ホルモンのうち、血中においてその生物学的活性などの理由により重要と考えられているのは、Ｔ4 と、Ｔ3 である。
これらチロキシン及び３，５，３’−トリヨードチロニンは、血中ではチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、チロキシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）、アルブミンという３種のチロキシン結合タンパク（ＴＢＰ）と大部分結合して存在しており、Ｔ4 の大部分（９９．９７％以上）はこれらＴＢＰと結合し、極く一部（０．０２％程度）が遊離型Ｔ4 （ｆｒｅｅ Ｔ4 ）として血中を循環して、実際に生物学的活性を示すのは、この遊離型Ｔ4 であるといわれている。こうして血中の総Ｔ4 濃度は、甲状腺からのＴ4 の分泌、血中での代謝、分解などのほか、血中のＴＢＰ濃度によっても変動しうる。Ｔ3 もＴＢＰと結合しているが、Ｔ4 よりもその結合はゆるやかで、血中Ｔ3 の約９９．７％程度がＴＢＰと結合していると言われ、遊離型Ｔ3 は血中Ｔ3 の約０．２〜０．３％程度と考えられている。Ｔ3 は、体内で容易にＴ4 から変換合成されている。
【００１５】
甲状腺にはいろいろな疾患があり、血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）が上昇するもの（例えば、パセドウ氏病など）、血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）が低下するもの（例えば、粘液水腫、クレチン症など）、血中Ｔ4 （またはＴ3 ）濃度は正常なままであるもの（例えば、単純性甲状腺腫など）など、その血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）量の測定は、これらの診断にあたり重要な検査の一つとなっている。
【００１６】
またクレチン症などでは、早期に発見、治療するためには全出生児の血中Ｔ4 （またはＴ3 ）を測定するなどの予防医学的な分野でも重要視されている。こうしたＴ4 （またはＴ3 ）測定にあたっては、総Ｔ4 （またはＴ3 ）はＴＢＧの増加（例えば正常妊婦など）やＴＢＧの減少（例えばネフローゼなど）でも変化するので血中遊離型Ｔ4 （またはＴ3 ）を測定することが求められている。こうした血中遊離型Ｔ3 （またはＴ4 ）は、ＴＢＰと複雑な平衡関係にあり、その量を正確に測定することは重要である。
【００１７】
こうして本発明の好適な一つの具体的態様は、標識として３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「Ｔ3 （またはＴ4 ）−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその新規な標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートからなることを特徴とするＴ3 （またはＴ4 ）測定系用試薬並びにその試薬を用いることを特徴とするＴ3 （またはＴ4 ）の特異的結合測定法に関する。
【００１８】
さらに本発明のＴ3 （またはＴ4 ）の特異的結合測定法は、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを標識として有すると共にアクリジニウム塩を標識として有するところの標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわちＴ3 （またはＴ4 ）−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の３，５，３’−トリヨードチロニンあるいはチロキシンとが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗Ｔ3 抗体（または抗Ｔ4 抗体）に対して競合的に反応して結合することを利用する。
チロキシン（Ｔ4 ）は３，５，３’−トリヨードチロニンよりもチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）への結合能が約２０倍大きいため、すでに結合しているトリヨードチロニン（Ｔ3 ）に大きな影響、例えばそれと置換するなどするし、トリヨードチロニン（Ｔ3 ）に較べ、チロキシン（Ｔ4 ）はチロキシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）の影響をより大きく受けることが知られているから、標識としては、３，５，３’−トリヨードチロニンの方が好ましく使用できる。
【００１９】
本発明で使用されるアルカリフォスファターゼ（「アルカリ性フォスファターゼ」ともいう）としては、例えばウシ小腸や大腸菌由来のものが挙げられるが、アルカリフォスファターゼは動物の組織、例えば骨、腸粘膜、腎臓、乳腺などに広く分布する。こうしたアルカリフォスファターゼは遺伝子組換え技術を利用して得られたものであることもできる。ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼ及び大腸菌由来アルカリフォスファターゼは本発明で好ましく使用される。
【００２０】
本発明で使用される低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、当該分野で汎用されている方法あるいはそれらを修飾改変した方法を用いることができ、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせて適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
例えば、Ｔ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせて適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
【００２１】
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができるが、例えば、グルタルアルデヒド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプトアセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−ヨードアセチルアミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミジル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル （ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなどが挙げられ、さらに６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、コハク酸等の活性エステル、トリアジンの活性エステル、スルホン酸エステル誘導体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
標識するにあたっては、本発明で使用される低分子化合物とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。例えば、Ｔ3 又はＴ4 とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。スペーサーとしては、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、アミド基などが挙げられる。このほか目的に応じ当該分野で広く知られたものの中から適宜選択して用いることができる。
一つの具体的な態様では、低分子化合物をコハク酸イミドなど活性化酸イミドなどで活性化した誘導体とした後、この活性化誘導体をアルカリフォスファターゼと反応させて標識することができる。なお、低分子化合物は必要に応じ保護基で保護されていることができる。
【００２３】
例えば、Ｔ3 誘導体をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などで活性化し、次にアルカリフォスファターゼと反応させて標識できる。反応にあたっては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）などの共存下にその処理を行うことができる。
Ｔ3 の誘導体あるいはＴ4 の誘導体としては、アセチル基などのアシル基でアミノ基が保護されたもの、Ｔ3 又はＴ4 にスペーサー残基の結合せしめられているものなど、Ｔ3 又はＴ4 のうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものなどが挙げられる。
【００２４】
標識アルカリフォスファターゼ中の標識低分子化合物の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。例えば低分子化合物標識は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度まで導入することができるが、その導入数が多いと、例えば抗体などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎる場合もある。好ましくは標識低分子化合物の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約１〜２個である。
代表的な例では、標識アルカリフォスファターゼ中の標識Ｔ3 又はＴ4 の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。例えば標識Ｔ3 は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度まで導入することができるが、その導入数が多いと、例えば抗体などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎる場合もある。好ましくは標識Ｔ3 の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約１〜２個である。
【００２５】
アクリジニウム塩でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、当該分野で汎用されている方法を用いることができ、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせてそれを適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができ、例えば、上記低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識するにあたって用いられるもの等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば１０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド塩をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などで活性化し、活性化アクリジニウムエステルとし、次にアルカリフォスファターゼと緩衝液中で反応させるなどして標識できる。反応にあたっては、ＥＤＣなどの共存下にその処理を行うことができる。
【００２６】
標識アルカリフォスファターゼ中の標識アクリジニウム塩の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。典型的な例では標識アクリジニウム塩は標識アルカリフォスファターゼ中に１０個程度まで導入することができるが、その導入数を増加させても、標識に基づくカウント数は増加するものの、非特異的吸着の増加は小さいことから、より高い感度を達成しうる。標識アクリジニウム塩の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約５個程度まででは、例えば標識Ｔ3 などの導入に不利な点はなく、適宜測定感度の高いものを選ぶことが可能である。
【００２７】
標識するにあたっては、アクリジニウム基とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。スペーサーとしては、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、アミド基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい脂環式基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい芳香族基などが挙げられる。このほか目的に応じ当該分野で広く知られたものの中から適宜選択して用いることができる。
本発明のコンジュゲートを製造するにあたっては、先ずアルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、つぎに得られたアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ（以下、単に「ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）を低分子化合物で標識し、低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。標識の順序は任意に選択することができ、例えば低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識し、つぎに得られた標識アルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。
【００２８】
より具体的な態様では、本発明のコンジュゲートを製造するにあたっては、先ずアルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、つぎに得られたアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート）をＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体で標識し、Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ4 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。同様に標識の順序は任意に選択することができ、例えばＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体でアルカリフォスファターゼを標識し、つぎに得られた標識アルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ4 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。
【００２９】
本発明においては特異的結合反応にあずかる特異的結合反応体としては、例えば抗体などが挙げられるが、特異的結合反応することのできるものであれば特に制限はない。抗体は常法により得ることができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じて、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスなどを免疫するなどして得たり、モノクローナル抗体であることもでき、これらは単独でもあるいはこれらを組合せて用いることも任意にできる。これら抗体は、必要なら、ペプシン、パパインなどの酵素で消化して、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂとして使用してもよい。抗Ｔ3 モノクローナル抗体または抗Ｔ4 モノクローナル抗体としては、好ましくはマウスミエローマ細胞を用いて細胞融合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもない。本発明で用いられる抗体としては、抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体を好ましく用いることができるが、測定対象に合わせて各種の抗体が特に限定されることなく用いることができる。抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体は、好ましくは、Ｔ3 またはＴ4 を適当なキャリア・タンパク質、例えばアルブミン、ＴＢＧなどとコンジュゲートを形成したものを抗原として用いて免疫することにより得られる。
【００３０】
特異的結合反応試薬は、Ｂ／Ｆ分離を容易にするために、固相化することができる。
本発明において特異的結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応体は、必要に応じて、固定化用担体に固定しておき、この固相化担体を、分析対象としての試料と接触させ、こうして固定担体に固定された特異的結合をなす該反応体と、分析試料中の標識低分子化合物等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した標識低分子化合物を検知することにより行うことができる。
例えば、特異的結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応体は、必要に応じて、固定化用担体に固定しておき、この固相化担体を、分析対象としての甲状腺ホルモンを含有する試料と接触させ、こうして固定担体に固定された抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体あるいは該反応体と、分析試料中の標識Ｔ3 またはＴ4 等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した標識Ｔ3 またはＴ4 を検知することにより行うことができる。
【００３１】
ここで用いることが出来る不溶性又は固体の担体としては、固相化用担体として広く知られたものが挙げられ、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、テフロン、ポリアセタール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体等のポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂など合成樹脂、寒天、アガロース、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、紙、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシルセルロースなどのセルロースエステルあるいは混合セルロースエステル、デキストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿など、重合アミノ酸、多糖等の天然あるいは合成の修飾あるいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素などの高分子、それらの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、アルミナ、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸バリウム、硫酸マグネシウムなどから選ばれたものであり、粒子、微粒子、膜、ビーズ、チューブ、プレート、マイクロプレート、マイクロタイター・ウェル、マイクロチューブ、ストリップ等の形状のものがある。さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などが挙げられる。
【００３２】
固相化の方法としては、当該分野で汎用されている方法を用いることができ、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学的結合あるいはそれらを組み合わせて適用して行うことができる。
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができるが、例えば、上記標識化に用いられる結合剤などが挙げられる。
【００３３】
本発明においては、酵素免疫測定系などを利用する場合、例えば、検知用試薬として、ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフェート、ＮＡＤＰ、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などを用いることができる。また化学発光免疫測定法では、測定時に発光反応剤、例えば過酸化水素、例えば約０．０１％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターなどを用いて測定を行うことができる。
【００３４】
アクリジニウム塩としては、当該分野で汎用されていたり、通常の当業者に知られたものの中から選択することができ、例えば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号公報、特開平１−２６１４６１号公報、英国特許明細書第１，４６１，８７７号、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載のアクリジニウム塩などが挙げられる。
特に、特開昭６３−１１２５６４号公報、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１０−アルキルまたは１０−（３−スルフォプロピル）−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム−９−カルボキサミド塩などは代表的な化学発光標識として挙げられる。
【００３５】
本発明の測定法においては、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、さらには界面活性剤などを共存させるなどして用いることもでき、それに用いる測定用試薬は保存剤などを加えて保存されてあるものであることができる。
緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナトリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＡ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＡ）液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独で用いることができるし、任意に二種以上を配合しても用いることができる。
【００３６】
保存剤としては、例えばナトリウムアジド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどからなる群から選ばれたものを添加することができる。これらは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの範囲で添加することができる。
【００３７】
本発明においては、試薬は単一の容器あるいは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて用いるようになっていてもよい。
本発明の測定では、好ましくは上記のようにして製造されたＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体で標識され且つアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォスファターゼと抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体とを用いて、被検体試料中の遊離のＴ3 またはＴ4 を測定する。さらには、被検体試料をフロセミド〔４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）−５−スルファモイルアントラニル酸〕、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）などで前処理し、ＴＢＰとの結合を解離することにより、総Ｔ3 またはＴ4 の測定も可能である。ＡＮＳと同様な目的で使用されるものとしては、３−（４−アニリノ−１−ナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（ＡＮＮＤＳ）、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、ナフタレンスルホン酸、チメロサール、５，５−ジフェニル−２−チオヒダントイン、ジアゼパム、サリチル酸ナトリウム、プロクロルペラジンなどが挙げられる。測定方法は、例えば、被検体試料を抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体と反応せしめ、次に一定量の標識アルカリフォスファターゼを添加し、抗体に結合した標識アルカリフォスファターゼ量、又は遊離の標識アルカリフォスファターゼの量を、化学発光を利用した免疫測定検知法あるいは酵素免疫測定検知法を適用して測定すればよい。
【００３８】
本発明の測定にあたり、抗体、被検体試料、標識アルカリフォスファターゼの添加順序には特に制限はなく、被検体試料を抗体と標識アルカリフォスファターゼのどちらと先に反応させるか、あるいは同時に反応させるか、また途中でＢ／Ｆ分離を行うか否かなど、適宜必要に応じ行うことが出来る。
本発明で用いられる測定対象試料検体としては、特に全血、血清、血漿などを好適に用いることが出来、特には血清、血漿が好ましく使用される。
【００３９】
【実施例】
次に実施例を示して、本発明を更に具体的に説明する。特に本実施例では低分子化合物の一つとしてＴ3 又はＴ4 を取り上げ、Ｔ3 又はＴ4 特異的結合測定について本発明の理解を助けるべく説明するが、本発明はこれに限定されることのないのは言うまでもない。
実施例１
ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造
１０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド２ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド５．７５ｍｇ及び９．６ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エステルのＤＭＦ液５μｌを、０．１％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルジメチルアミノ〕−１−プロパン−スルホン酸（ＣＨＡＰＳ）含有の０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）ｐＨ８．０中のウシ小腸アルカリフォスファターゼと反応させた。室温で約１０分間攪拌後、セントリコン−３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０；アミコン社製）を使用して濃縮洗浄を行い、そして１０ｍＭのＰＢＳ（０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．３）緩衝液に交換した。その後セファデックスＧ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマシア社製）で精製を行った後、再びセントリコン−３０を使用して濃縮を行い、シリカゲルを担体とした高速液体クロマトグラフィーで精製し、ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得た。この時高速液体クロマトグラフィー精製を行わなくともほとんど不純物は存在しない。
【００４０】
実施例２
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造
２０ｍｇのＮ−アセチル−Ｔ3 をＤＭＦ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド４ｍｇ及び８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エステルのＤＭＦ液１２μｌを、５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸液（ｐＨ７．４）中の実施例１で得られたＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート及びトリエチルアミン、ＤＭＦを含む反応液に添加し、室温で１８時間反応させた。得られた液をセファデックスＧ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマシア社製）で精製した後、シリカゲルを担体とした高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｎ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得た。なお、高速液体クロマトグラフィーでの精製をしていないものも、使用することは可能である。
【００４１】
実施例３
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの安定性
実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートについて安定性を見た。比較としてＴ3 標識アクリジニウム（Ｔ3 −Ａｃｒ・コンジュゲート）を用いた。Ｎ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート及び対照Ｔ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートは、以下の希釈用緩衝液で希釈した。
希釈用緩衝液Ａ：
０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ3 、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2 及び３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ６．３）
希釈用緩衝液Ｂ：
０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ3 、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2 及び３％のＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
標識試料の希釈液を約２〜８℃及び約４５℃に２日間及び８日間保存し、ついでグラスファイバーメンブラン（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐａｎｙ製）に添加付着させ、次に発光反応剤、例えば約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。
結果を第１表に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
本発明のＴ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートは、溶液中での安定性が改善されていることが確かめられた。
【００４４】
実施例４
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートのグラスファイバーメンブラン上への非特異的吸着性試験及び抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体との反応性試験
グラスファイバーメンブラン（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐａｎｙ製）にそれぞれ実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。比較としてＴ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートを用いた。こうして非特異的吸着反応量（ＮＳＢ）を求めた。
【００４５】
次にＴ3 又はＴ4 とウシチログロブリンとの共有結合体で免疫したヤギから得られた抗Ｔ3 血清又はヒツジから得られた抗Ｔ4 血清をラテックス微粒子に結合させ、固相化抗Ｔ3 抗体粒子又は固相化抗Ｔ4 抗体粒子試薬とした。この固相化抗Ｔ3 抗体粒子又は固相化抗Ｔ4 抗体粒子をグラスファイバーメンブラン上に添加し、次いでそれぞれ実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し約３８℃で２０分間反応させた後、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。比較としてＴ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートを用いた。こうして抗体との反応性を求めた。
得られた結果を、グラスファイバーメンブラン上に標識試料の希釈液３０μｌに約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加えた時に得られる値（トータル・カウント）と比較した。
非特異的吸着反応率（ＮＳＢ％）＝ＮＳＢ／トータル・カウント
反応率（％）＝抗体との反応性／トータル・カウント
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
本発明のＴ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートは、疎水性物質であるグラスファイバーメンブランとの間で非特異的吸着反応が減少し、抗Ｔ3 抗体や抗Ｔ4 抗体に対し優れた親和力を有することが確かめられた。
【００４８】
実施例５
遊離Ｔ3 又はＴ4 の化学発光免疫測定法
遊離Ｔ3 を含有するヒト血漿５０μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ3 抗体粒子溶液３０μｌを添加し、約３８℃で約２０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、約３８℃で約１０分間インキュベーション処理する。５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５０μｌを添加処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。同様に遊離Ｔ4 を含有するヒト血清に実施例４の固相化抗Ｔ4 抗体粒子溶液を添加して測定する。
結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
実施例６
遊離Ｔ3 又はＴ4 の酵素免疫測定法
遊離Ｔ3 を含有するヒト血漿７５μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ3 抗体粒子溶液５０μｌを添加し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１２５μｌを加え、約３４℃で約３０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液６０μｌを添加し、約３４℃で約３分間インキュベーション処理する。５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１ｍＭの４−メチルウベリフェリルホスフェートを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０μｌを添加処理してから、約３４℃で約１０分間インキュベーション処理する。酵素反応を停止後、励起を３６０ｎｍの波長で行い、４５０ｎｍの波長で測定をおこなった。
【００５１】
同様に遊離Ｔ4 を含有するヒト血清２５μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ4 抗体粒子溶液３０μｌを添加し、トリス−塩酸緩衝液１７０μｌを加え、約３４℃で約１０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液５０μｌを添加し、約３４℃で約２０分間インキュベーション処理する。同様に螢光の測定を行う。
結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、得られたコンジュゲートは親水性であるため、非特異的吸着性が減少せしめられており、例えばＢ／Ｆ分離などに用いられるグラスフィルターなどに非特異的に吸着してしまうことが少なく、さらに溶液中での安定性が良好で、その保存性に優れ、試薬としての信頼性が高い。特に例えば、中性〜弱アルカリ性の溶液中でも比較的安定で優れた測定系を構築できる。代表的な例では、本発明のコンジュゲートは、通常繁用されるＴ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物を免疫原として産生される抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体に対する親和性が比較的良好で、測定の感度を高めることができる。さらに本発明の試薬は、アクリジニウム標識に基づくアクリジニウム基の化学発光を利用した免疫測定系にも、酵素免疫測定系などにも応用することができ、一つの試薬でその場その場の状況に応じた多様な測定手法に適用することが可能となり、特に測定の自動化を図るのに優れている。
【産業上の利用分野】
本発明は、標識として比較的低分子の化合物と共にアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその標識されているアルカリフォスファターゼを試薬として用いることを特徴とする特異的結合測定法に関する。
本発明の特異的結合測定法は、比較的低分子の化合物で標識されると共にアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の測定対象物とが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗体に対して競合的に反応して結合することを利用する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
生物学的に活性を持ったり、臨床的に重要な薬物の測定法としては、特異的な結合反応を利用した測定法が開発されている。特に免疫学的な反応を利用する免疫測定法は、高い感度を有しており、微量の測定が可能であることから広く普及している。こうした測定において、当初は放射性の物質が標識として用いられ、測定を容易にするとともに高い検出感度を達成するために用いられてきた。
しかしながら、放射性の物質は、それ自体非常に危険であるなどのためそれを扱うための特別な施設とか、技術が要求され、さらに使用済み廃液の処理に於いて環境を汚染するなど大きな問題を抱えているので、それに代わる安全でかつ高い感度を実現できる標識の開発が求められている。そうした放射性物質の標識に代えて、酵素標識とか螢光標識などが開発されてきている。
【０００３】
最近では、化学ルミネセント現象を利用した特にアクリジニウム塩による標識が注目されてきている。アクリジニウム塩標識は、比較的高い光収量が得られ、さらにインジケーターに結合した抗体などの蛋白質によってはその化学ルミネセントが損なわれることが少ないことなど安定していることから、その標識剤としての開発が盛んに進められている。
例えば、特に甲状腺ホルモンの測定法としては、古くはＴＢＰに結合したＴ4 （またはＴ3 ）中のヨードを化学的に測定するタンパク結合ヨード法が用いられていたが、やがて放射性のＴ4 （またはＴ3 ）とＴＢＧとの結合を利用した競合タンパク結合分析法が用いられるようになった。さらに抗Ｔ4 抗体（または抗Ｔ3 抗体）を用いるラジオイムノアッセイが繁用されている。しかしながら、放射線標識は環境汚染などの問題があることから、最近では非放射性標識を用いたイムノアッセイの開発が求められ、酵素標識や螢光標識を用いたイムノアッセイ法の開発がなされてきている。こうした非放射性標識開発の一つとして、化学発光標識剤であるアクリジニウム基とＴ4 （またはＴ3 ）とを結合した試薬の開発が試みられている。
【０００４】
ところが、アクリジニウム塩標識は、水に難溶性であることから、比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物をアクリジニウム塩で標識すると、得られたアクリジニウム塩標識薬物である試薬は、水溶性が非常に劣ることとなり、試薬保存中や測定中に沈殿を生ずるとか、Ｂ／Ｆ分離の際にフィルターなどに非特異的に吸着されてしまうとか、測定に使用できるような濃度のものとすることが困難であったりするなどの問題がある。さらに臨床的な測定において普通に採用されることの多いｐＨ域で不安定であるという問題もある。また感度を高めたり、標識率を高めたり、例えば複数の標識を導入したりすると、得られた標識試薬の水溶解性が低下して、試薬として使用に耐えないとか、測定中に特異的結合反応に悪影響を与える恐れがでる、さらに分離処理などにおいてフィルターなどに吸着されてしまうなどの問題もある。
【０００５】
例えば、Ｔ4 （またはＴ3 ）誘導体とアクリジニウム塩とを直接結合させたものや、Ｔ3 （Ｔ4 ）誘導体とアクリジニウム塩とを低分子スペーサーを介して結合したものでは、
１．得られた結合物が疎水性であるため、非特異的吸着能が大きく、例えばＢ／Ｆ分離などにグラスフィルターなどを用いるとそれに非特異的に吸着してしまう２．溶液中での安定性が悪く、保存性が劣るばかりでなく、試薬としての信頼性に問題がある。例えば、中性〜弱アルカリ性の溶液中では不安定である。
３．抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体は、通常Ｔ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物を免疫原として産生されるが、こういったＴ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物により得られる抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体に対する親和性が低く測定の感度が悪いなどの問題があった。
【０００６】
さらにこうした結合物は、アクリジニウム標識に基づくアクリジニウム塩の化学発光を利用した免疫測定系には利用できるがその他の免疫測定系、例えば、酵素免疫測定系に応用するなどのことは一切できない。特に最近では、その場その場に応じ、酵素標識測定系とか、化学ルミネセント標識測定系など、一つの試薬を用いることで様々な角度及び感度などを利用して臨床測定することが求められたり、自動的に測定機器で測定処理するにも適したものが求められるが、これまで比較的低分子化合物からなるアクリジニウム標識を用いた系では、特にその水溶解性の観点で問題があり、さらに同時に酵素標識測定系を利用できるものがなかった。
【０００７】
例えば、Ｔ3 （Ｔ4 ）を測定する場合、その測定は、臨床の分野ではその病気などの治療を進めながら行う必要もあり、一つの試薬でその場その場の状況に応じた多様な測定手法に適用することが可能なものが求められるにも拘らず、従来はできなかった。
そこでこうした問題のない化学発光標識剤であるアクリジニウム塩による標識のなされた比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物からなる試薬を開発することが求められている。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者等は、特に測定の自動化を図るには、複数の測定系に利用が可能で、例えば、化学発光免疫測定法にも使用でき且つ酵素免疫測定法にも使用できるものが有利であること、及び試薬の安定性が求められること、さらには機器に使用しているフィルター類に非特異的な吸着を起こさないようなものが大切であるとの認識のもと、特異的結合反応利用測定系において用いることの出来る比較的低分子化合物などのアクリジニウム塩による標識でその水溶性に多大の影響をうけるものに関連した新規な試薬の開発に着手し、鋭意研究の結果本発明を完成したものである。
【０００９】
本発明は、標識として低分子化合物を有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその新規な標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートからなることを特徴とする特異的結合測定系用試薬並びにその試薬を用いることを特徴とする測定対象物の特異的結合測定法に関する。
本発明の測定対象物の特異的結合測定法は、比較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物から成る群から選ばれたものを標識として有すると共にアクリジニウム塩を標識として有するところの標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の測定対象物とが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗体に対して競合的に反応して結合することを利用する。
【００１０】
本発明で使用される低分子化合物は、少なくとも１個のアクリジニウム塩標識の導入により、その水に対する溶解性に多大の影響を受けるものであり、複数のアクリジニウム塩標識を導入した場合には、１個のアクリジニウム塩標識の導入により比較的水に対する溶解性に於いて影響を受けることの少ないものも、次第に大きな影響を受けるであろうことは予測しうるところである。本発明では、アクリジニウム塩標識の導入により測定対象物の特異的結合測定法において何らかの実質的問題を生ぜしめることを解決しているかぎり、すべて本発明の対象低分子化合物と判断することができよう。
【００１１】
本発明で使用される低分子化合物は、例えば抗原、ハプテンなどの薬物を挙げることができ、生物学的重要性を持つ薬剤、臨床的重要性を持つ薬剤、代謝物質、ビタミン、ホルモン、ステロイド、核酸、糖類、毒物、生理活性物質、農薬、化学薬品などが挙げられる。
薬物としては、例えばホルモン薬、ビタミン剤、抗生物質、放射線増感剤、放射線防護剤、抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、抗炎症薬、駆虫薬、局所麻酔薬、抗真菌薬、抗アメーバ薬、抗トリコモナス薬、抗関節炎薬、抗喘息薬、抗血液凝固薬、抗糖尿病薬、抗高血圧症薬、冠血管拡張薬、脳血管拡張薬などの血管拡張薬、抗狭心症薬、血管新生阻害剤、カルシウム拮抗薬、カルモジュリン阻害剤、中毒治療薬、抗不整脈症薬、筋肉弛緩薬、抗脂肪血症薬、脳代謝改善薬、脳代謝賦活薬、学習・記憶障害改善薬、痴呆症薬などの脳機能改善薬、抗神経病薬、鎮痛薬、鎮静薬、抗不安薬、抗痙攣薬、抗躁うつ病薬、パーキンソン病治療薬などの中枢神経系作用薬、副作用軽減剤、酵素、ワクチンコンポーネント、トキソイド、抗毒素、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗癌剤効果増強剤、抗ウイルス剤、免疫増強剤、免疫調節剤、免疫回復剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
比較的低分子の薬物としては、モルフィン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジフェニルヒダントイン、カルバマゼピン、プリミドン、エトスクシミド、バルプロ酸、アセタゾールアミド、プロプラノロール、スルチアム、グルテチミド、クロナゼパム、ニトラゼパム、ジアゼパム、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブピバカイン、メピバカイン、リドカイン、プロカインアミド、キニジン、ジソピラミド、ジゴキシン、ジキトキシン、テオフィリン、アミトリプチリン、イミプラミン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ジブカイン、ストレプトマイシン、セファレキシン、スルファメトキサゾール、メソトレキサート、シクロスポリン、メチルプレドニゾロン、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール、テストステロン、１７−ＯＨ−プロゲステロン、ケモデオキシコール酸、サリチル酸、アセトアミノフェン、インドメタシン、アロプリノール、ハロペリドール、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、チロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ，Ｔ4 ）、３，５，３’−トリヨードチロニン（３，５，３’−ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ，Ｔ3 ）などが挙げられる。比較的低分子の薬物としては、特にはＴ4 やＴ3 などが挙げられる。
【００１３】
甲状腺ホルモンの過剰は、神経過敏、頻脈、脈圧増大、基礎代謝亢進、発育の促進、アドレナリンに対する感受性の増大を示すのに対し、その不足は成長発育の遅延、中枢神経系、精神機能の低下、循環系の異常をきたし、さらにコレステロール代謝に変化がおこるなど重要な生理的な変化をもたらす。したがって、血中に存在し、これらの生理活性に大きな影響を及ぼしている甲状腺ホルモンを正確に測定することは臨床医学上非常に重要と考えられている。
【００１４】
甲状腺ホルモンのうち、血中においてその生物学的活性などの理由により重要と考えられているのは、Ｔ4 と、Ｔ3 である。
これらチロキシン及び３，５，３’−トリヨードチロニンは、血中ではチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、チロキシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）、アルブミンという３種のチロキシン結合タンパク（ＴＢＰ）と大部分結合して存在しており、Ｔ4 の大部分（９９．９７％以上）はこれらＴＢＰと結合し、極く一部（０．０２％程度）が遊離型Ｔ4 （ｆｒｅｅ Ｔ4 ）として血中を循環して、実際に生物学的活性を示すのは、この遊離型Ｔ4 であるといわれている。こうして血中の総Ｔ4 濃度は、甲状腺からのＴ4 の分泌、血中での代謝、分解などのほか、血中のＴＢＰ濃度によっても変動しうる。Ｔ3 もＴＢＰと結合しているが、Ｔ4 よりもその結合はゆるやかで、血中Ｔ3 の約９９．７％程度がＴＢＰと結合していると言われ、遊離型Ｔ3 は血中Ｔ3 の約０．２〜０．３％程度と考えられている。Ｔ3 は、体内で容易にＴ4 から変換合成されている。
【００１５】
甲状腺にはいろいろな疾患があり、血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）が上昇するもの（例えば、パセドウ氏病など）、血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）が低下するもの（例えば、粘液水腫、クレチン症など）、血中Ｔ4 （またはＴ3 ）濃度は正常なままであるもの（例えば、単純性甲状腺腫など）など、その血中総Ｔ4 （またはＴ3 ）量の測定は、これらの診断にあたり重要な検査の一つとなっている。
【００１６】
またクレチン症などでは、早期に発見、治療するためには全出生児の血中Ｔ4 （またはＴ3 ）を測定するなどの予防医学的な分野でも重要視されている。こうしたＴ4 （またはＴ3 ）測定にあたっては、総Ｔ4 （またはＴ3 ）はＴＢＧの増加（例えば正常妊婦など）やＴＢＧの減少（例えばネフローゼなど）でも変化するので血中遊離型Ｔ4 （またはＴ3 ）を測定することが求められている。こうした血中遊離型Ｔ3 （またはＴ4 ）は、ＴＢＰと複雑な平衡関係にあり、その量を正確に測定することは重要である。
【００１７】
こうして本発明の好適な一つの具体的態様は、標識として３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「Ｔ3 （またはＴ4 ）−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその新規な標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートからなることを特徴とするＴ3 （またはＴ4 ）測定系用試薬並びにその試薬を用いることを特徴とするＴ3 （またはＴ4 ）の特異的結合測定法に関する。
【００１８】
さらに本発明のＴ3 （またはＴ4 ）の特異的結合測定法は、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを標識として有すると共にアクリジニウム塩を標識として有するところの標識されているアルカリフォスファターゼ、すなわちＴ3 （またはＴ4 ）−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の３，５，３’−トリヨードチロニンあるいはチロキシンとが、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗Ｔ3 抗体（または抗Ｔ4 抗体）に対して競合的に反応して結合することを利用する。
チロキシン（Ｔ4 ）は３，５，３’−トリヨードチロニンよりもチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）への結合能が約２０倍大きいため、すでに結合しているトリヨードチロニン（Ｔ3 ）に大きな影響、例えばそれと置換するなどするし、トリヨードチロニン（Ｔ3 ）に較べ、チロキシン（Ｔ4 ）はチロキシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）の影響をより大きく受けることが知られているから、標識としては、３，５，３’−トリヨードチロニンの方が好ましく使用できる。
【００１９】
本発明で使用されるアルカリフォスファターゼ（「アルカリ性フォスファターゼ」ともいう）としては、例えばウシ小腸や大腸菌由来のものが挙げられるが、アルカリフォスファターゼは動物の組織、例えば骨、腸粘膜、腎臓、乳腺などに広く分布する。こうしたアルカリフォスファターゼは遺伝子組換え技術を利用して得られたものであることもできる。ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼ及び大腸菌由来アルカリフォスファターゼは本発明で好ましく使用される。
【００２０】
本発明で使用される低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、当該分野で汎用されている方法あるいはそれらを修飾改変した方法を用いることができ、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせて適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
例えば、Ｔ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせて適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
【００２１】
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができるが、例えば、グルタルアルデヒド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプトアセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−ヨードアセチルアミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミジル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル （ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなどが挙げられ、さらに６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、コハク酸等の活性エステル、トリアジンの活性エステル、スルホン酸エステル誘導体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
標識するにあたっては、本発明で使用される低分子化合物とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。例えば、Ｔ3 又はＴ4 とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。スペーサーとしては、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、アミド基などが挙げられる。このほか目的に応じ当該分野で広く知られたものの中から適宜選択して用いることができる。
一つの具体的な態様では、低分子化合物をコハク酸イミドなど活性化酸イミドなどで活性化した誘導体とした後、この活性化誘導体をアルカリフォスファターゼと反応させて標識することができる。なお、低分子化合物は必要に応じ保護基で保護されていることができる。
【００２３】
例えば、Ｔ3 誘導体をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などで活性化し、次にアルカリフォスファターゼと反応させて標識できる。反応にあたっては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）などの共存下にその処理を行うことができる。
Ｔ3 の誘導体あるいはＴ4 の誘導体としては、アセチル基などのアシル基でアミノ基が保護されたもの、Ｔ3 又はＴ4 にスペーサー残基の結合せしめられているものなど、Ｔ3 又はＴ4 のうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものなどが挙げられる。
【００２４】
標識アルカリフォスファターゼ中の標識低分子化合物の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。例えば低分子化合物標識は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度まで導入することができるが、その導入数が多いと、例えば抗体などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎる場合もある。好ましくは標識低分子化合物の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約１〜２個である。
代表的な例では、標識アルカリフォスファターゼ中の標識Ｔ3 又はＴ4 の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。例えば標識Ｔ3 は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度まで導入することができるが、その導入数が多いと、例えば抗体などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎる場合もある。好ましくは標識Ｔ3 の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約１〜２個である。
【００２５】
アクリジニウム塩でアルカリフォスファターゼを標識するにあたっては、当該分野で汎用されている方法を用いることができ、例えば共有結合などの化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせてそれを適用して行うことができる。共有結合により化学的に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができ、例えば、上記低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識するにあたって用いられるもの等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば１０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド塩をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などで活性化し、活性化アクリジニウムエステルとし、次にアルカリフォスファターゼと緩衝液中で反応させるなどして標識できる。反応にあたっては、ＥＤＣなどの共存下にその処理を行うことができる。
【００２６】
標識アルカリフォスファターゼ中の標識アクリジニウム塩の数は、通常１個以上で十分である。これらの数は、通常平均値として示される。典型的な例では標識アクリジニウム塩は標識アルカリフォスファターゼ中に１０個程度まで導入することができるが、その導入数を増加させても、標識に基づくカウント数は増加するものの、非特異的吸着の増加は小さいことから、より高い感度を達成しうる。標識アクリジニウム塩の数は、標識アルカリフォスファターゼ中に約５個程度まででは、例えば標識Ｔ3 などの導入に不利な点はなく、適宜測定感度の高いものを選ぶことが可能である。
【００２７】
標識するにあたっては、アクリジニウム基とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導入することもできる。スペーサーとしては、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、アミド基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい脂環式基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい芳香族基などが挙げられる。このほか目的に応じ当該分野で広く知られたものの中から適宜選択して用いることができる。
本発明のコンジュゲートを製造するにあたっては、先ずアルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、つぎに得られたアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ（以下、単に「ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」という。）を低分子化合物で標識し、低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。標識の順序は任意に選択することができ、例えば低分子化合物でアルカリフォスファターゼを標識し、つぎに得られた標識アルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。
【００２８】
より具体的な態様では、本発明のコンジュゲートを製造するにあたっては、先ずアルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、つぎに得られたアクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート）をＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体で標識し、Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ4 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。同様に標識の順序は任意に選択することができ、例えばＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体でアルカリフォスファターゼを標識し、つぎに得られた標識アルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ4 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。
【００２９】
本発明においては特異的結合反応にあずかる特異的結合反応体としては、例えば抗体などが挙げられるが、特異的結合反応することのできるものであれば特に制限はない。抗体は常法により得ることができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じて、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスなどを免疫するなどして得たり、モノクローナル抗体であることもでき、これらは単独でもあるいはこれらを組合せて用いることも任意にできる。これら抗体は、必要なら、ペプシン、パパインなどの酵素で消化して、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂとして使用してもよい。抗Ｔ3 モノクローナル抗体または抗Ｔ4 モノクローナル抗体としては、好ましくはマウスミエローマ細胞を用いて細胞融合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもない。本発明で用いられる抗体としては、抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体を好ましく用いることができるが、測定対象に合わせて各種の抗体が特に限定されることなく用いることができる。抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体は、好ましくは、Ｔ3 またはＴ4 を適当なキャリア・タンパク質、例えばアルブミン、ＴＢＧなどとコンジュゲートを形成したものを抗原として用いて免疫することにより得られる。
【００３０】
特異的結合反応試薬は、Ｂ／Ｆ分離を容易にするために、固相化することができる。
本発明において特異的結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応体は、必要に応じて、固定化用担体に固定しておき、この固相化担体を、分析対象としての試料と接触させ、こうして固定担体に固定された特異的結合をなす該反応体と、分析試料中の標識低分子化合物等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した標識低分子化合物を検知することにより行うことができる。
例えば、特異的結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応体は、必要に応じて、固定化用担体に固定しておき、この固相化担体を、分析対象としての甲状腺ホルモンを含有する試料と接触させ、こうして固定担体に固定された抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体あるいは該反応体と、分析試料中の標識Ｔ3 またはＴ4 等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した標識Ｔ3 またはＴ4 を検知することにより行うことができる。
【００３１】
ここで用いることが出来る不溶性又は固体の担体としては、固相化用担体として広く知られたものが挙げられ、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、テフロン、ポリアセタール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体等のポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂など合成樹脂、寒天、アガロース、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、紙、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシルセルロースなどのセルロースエステルあるいは混合セルロースエステル、デキストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿など、重合アミノ酸、多糖等の天然あるいは合成の修飾あるいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素などの高分子、それらの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、アルミナ、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸バリウム、硫酸マグネシウムなどから選ばれたものであり、粒子、微粒子、膜、ビーズ、チューブ、プレート、マイクロプレート、マイクロタイター・ウェル、マイクロチューブ、ストリップ等の形状のものがある。さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などが挙げられる。
【００３２】
固相化の方法としては、当該分野で汎用されている方法を用いることができ、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学的結合あるいはそれらを組み合わせて適用して行うことができる。
化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができるが、例えば、上記標識化に用いられる結合剤などが挙げられる。
【００３３】
本発明においては、酵素免疫測定系などを利用する場合、例えば、検知用試薬として、ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフェート、ＮＡＤＰ、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などを用いることができる。また化学発光免疫測定法では、測定時に発光反応剤、例えば過酸化水素、例えば約０．０１％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターなどを用いて測定を行うことができる。
【００３４】
アクリジニウム塩としては、当該分野で汎用されていたり、通常の当業者に知られたものの中から選択することができ、例えば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号公報、特開平１−２６１４６１号公報、英国特許明細書第１，４６１，８７７号、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載のアクリジニウム塩などが挙げられる。
特に、特開昭６３−１１２５６４号公報、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１０−アルキルまたは１０−（３−スルフォプロピル）−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム−９−カルボキサミド塩などは代表的な化学発光標識として挙げられる。
【００３５】
本発明の測定法においては、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、さらには界面活性剤などを共存させるなどして用いることもでき、それに用いる測定用試薬は保存剤などを加えて保存されてあるものであることができる。
緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナトリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＡ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＡ）液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独で用いることができるし、任意に二種以上を配合しても用いることができる。
【００３６】
保存剤としては、例えばナトリウムアジド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどからなる群から選ばれたものを添加することができる。これらは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの範囲で添加することができる。
【００３７】
本発明においては、試薬は単一の容器あるいは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて用いるようになっていてもよい。
本発明の測定では、好ましくは上記のようにして製造されたＴ3 又はその誘導体あるいはＴ4 又はその誘導体で標識され且つアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォスファターゼと抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体とを用いて、被検体試料中の遊離のＴ3 またはＴ4 を測定する。さらには、被検体試料をフロセミド〔４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）−５−スルファモイルアントラニル酸〕、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）などで前処理し、ＴＢＰとの結合を解離することにより、総Ｔ3 またはＴ4 の測定も可能である。ＡＮＳと同様な目的で使用されるものとしては、３−（４−アニリノ−１−ナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（ＡＮＮＤＳ）、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、ナフタレンスルホン酸、チメロサール、５，５−ジフェニル−２−チオヒダントイン、ジアゼパム、サリチル酸ナトリウム、プロクロルペラジンなどが挙げられる。測定方法は、例えば、被検体試料を抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体と反応せしめ、次に一定量の標識アルカリフォスファターゼを添加し、抗体に結合した標識アルカリフォスファターゼ量、又は遊離の標識アルカリフォスファターゼの量を、化学発光を利用した免疫測定検知法あるいは酵素免疫測定検知法を適用して測定すればよい。
【００３８】
本発明の測定にあたり、抗体、被検体試料、標識アルカリフォスファターゼの添加順序には特に制限はなく、被検体試料を抗体と標識アルカリフォスファターゼのどちらと先に反応させるか、あるいは同時に反応させるか、また途中でＢ／Ｆ分離を行うか否かなど、適宜必要に応じ行うことが出来る。
本発明で用いられる測定対象試料検体としては、特に全血、血清、血漿などを好適に用いることが出来、特には血清、血漿が好ましく使用される。
【００３９】
【実施例】
次に実施例を示して、本発明を更に具体的に説明する。特に本実施例では低分子化合物の一つとしてＴ3 又はＴ4 を取り上げ、Ｔ3 又はＴ4 特異的結合測定について本発明の理解を助けるべく説明するが、本発明はこれに限定されることのないのは言うまでもない。
実施例１
ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造
１０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド２ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド５．７５ｍｇ及び９．６ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エステルのＤＭＦ液５μｌを、０．１％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルジメチルアミノ〕−１−プロパン−スルホン酸（ＣＨＡＰＳ）含有の０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）ｐＨ８．０中のウシ小腸アルカリフォスファターゼと反応させた。室温で約１０分間攪拌後、セントリコン−３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０；アミコン社製）を使用して濃縮洗浄を行い、そして１０ｍＭのＰＢＳ（０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．３）緩衝液に交換した。その後セファデックスＧ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマシア社製）で精製を行った後、再びセントリコン−３０を使用して濃縮を行い、シリカゲルを担体とした高速液体クロマトグラフィーで精製し、ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得た。この時高速液体クロマトグラフィー精製を行わなくともほとんど不純物は存在しない。
【００４０】
実施例２
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造
２０ｍｇのＮ−アセチル−Ｔ3 をＤＭＦ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド４ｍｇ及び８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エステルのＤＭＦ液１２μｌを、５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸液（ｐＨ７．４）中の実施例１で得られたＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート及びトリエチルアミン、ＤＭＦを含む反応液に添加し、室温で１８時間反応させた。得られた液をセファデックスＧ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマシア社製）で精製した後、シリカゲルを担体とした高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｎ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得た。なお、高速液体クロマトグラフィーでの精製をしていないものも、使用することは可能である。
【００４１】
実施例３
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの安定性
実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートについて安定性を見た。比較としてＴ3 標識アクリジニウム（Ｔ3 −Ａｃｒ・コンジュゲート）を用いた。Ｎ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート及び対照Ｔ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートは、以下の希釈用緩衝液で希釈した。
希釈用緩衝液Ａ：
０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ3 、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2 及び３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ６．３）
希釈用緩衝液Ｂ：
０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ3 、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ2 及び３％のＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
標識試料の希釈液を約２〜８℃及び約４５℃に２日間及び８日間保存し、ついでグラスファイバーメンブラン（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐａｎｙ製）に添加付着させ、次に発光反応剤、例えば約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。
結果を第１表に示す。
【００４２】
【表１】
本発明のＴ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートは、溶液中での安定性が改善されていることが確かめられた。
【００４４】
実施例４
Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートのグラスファイバーメンブラン上への非特異的吸着性試験及び抗Ｔ3 抗体または抗Ｔ4 抗体との反応性試験
グラスファイバーメンブラン（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐａｎｙ製）にそれぞれ実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。比較としてＴ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートを用いた。こうして非特異的吸着反応量（ＮＳＢ）を求めた。
【００４５】
次にＴ3 又はＴ4 とウシチログロブリンとの共有結合体で免疫したヤギから得られた抗Ｔ3 血清又はヒツジから得られた抗Ｔ4 血清をラテックス微粒子に結合させ、固相化抗Ｔ3 抗体粒子又は固相化抗Ｔ4 抗体粒子試薬とした。この固相化抗Ｔ3 抗体粒子又は固相化抗Ｔ4 抗体粒子をグラスファイバーメンブラン上に添加し、次いでそれぞれ実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し約３８℃で２０分間反応させた後、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。比較としてＴ3 −Ａｃｒ・コンジュゲートを用いた。こうして抗体との反応性を求めた。
得られた結果を、グラスファイバーメンブラン上に標識試料の希釈液３０μｌに約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加えた時に得られる値（トータル・カウント）と比較した。
非特異的吸着反応率（ＮＳＢ％）＝ＮＳＢ／トータル・カウント
反応率（％）＝抗体との反応性／トータル・カウント
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
本発明のＴ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートは、疎水性物質であるグラスファイバーメンブランとの間で非特異的吸着反応が減少し、抗Ｔ3 抗体や抗Ｔ4 抗体に対し優れた親和力を有することが確かめられた。
【００４８】
実施例５
遊離Ｔ3 又はＴ4 の化学発光免疫測定法
遊離Ｔ3 を含有するヒト血漿５０μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ3 抗体粒子溶液３０μｌを添加し、約３８℃で約２０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、約３８℃で約１０分間インキュベーション処理する。５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５０μｌを添加処理しながら、ルミノメーターを用いて測定する。同様に遊離Ｔ4 を含有するヒト血清に実施例４の固相化抗Ｔ4 抗体粒子溶液を添加して測定する。
結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
実施例６
遊離Ｔ3 又はＴ4 の酵素免疫測定法
遊離Ｔ3 を含有するヒト血漿７５μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ3 抗体粒子溶液５０μｌを添加し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１２５μｌを加え、約３４℃で約３０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液６０μｌを添加し、約３４℃で約３分間インキュベーション処理する。５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１ｍＭの４−メチルウベリフェリルホスフェートを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０μｌを添加処理してから、約３４℃で約１０分間インキュベーション処理する。酵素反応を停止後、励起を３６０ｎｍの波長で行い、４５０ｎｍの波長で測定をおこなった。
【００５１】
同様に遊離Ｔ4 を含有するヒト血清２５μｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ4 抗体粒子溶液３０μｌを添加し、トリス−塩酸緩衝液１７０μｌを加え、約３４℃で約１０分間インキュベーション処理し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ3 −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液５０μｌを添加し、約３４℃で約２０分間インキュベーション処理する。同様に螢光の測定を行う。
結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
【発明の効果】
本発明によれば、得られたコンジュゲートは親水性であるため、非特異的吸着性が減少せしめられており、例えばＢ／Ｆ分離などに用いられるグラスフィルターなどに非特異的に吸着してしまうことが少なく、さらに溶液中での安定性が良好で、その保存性に優れ、試薬としての信頼性が高い。特に例えば、中性〜弱アルカリ性の溶液中でも比較的安定で優れた測定系を構築できる。代表的な例では、本発明のコンジュゲートは、通常繁用されるＴ3 （Ｔ4 ）−高分子複合物を免疫原として産生される抗Ｔ3 （Ｔ4 ）抗体に対する親和性が比較的良好で、測定の感度を高めることができる。さらに本発明の試薬は、アクリジニウム標識に基づくアクリジニウム基の化学発光を利用した免疫測定系にも、酵素免疫測定系などにも応用することができ、一つの試薬でその場その場の状況に応じた多様な測定手法に適用することが可能となり、特に測定の自動化を図るのに優れている。
Claims (14)
- アルカリフォスファターゼに抗原またはハプテンである低分子化合物が化学的に結合せしめられていると共に標識としてアクリジニウム塩を有する該アルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- アルカリフォスファターゼにスペーサーを介して結合している低分子化合物及び標識としてのアクリジニウム塩を有する請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- （１）アクリジニウム塩をアルカリフォスファターゼと反応させ、得られた標識としてアクリジニウム塩を有するアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、低分子化合物と反応させるか、又は（２）低分子化合物とアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートをアクリジニウム塩と反応させることにより得られた請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- （１）アクリジニウム塩をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、低分子化合物とＮＨＳ及びＥＤＣの存在下で反応させるか、又は（２）低分子化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、アクリジニウム塩とＮＨＳ及びＥＤＣの存在下で反応させることにより得られた請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- 低分子化合物が、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものである請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- アルカリフォスファターゼにスペーサーを介して結合している、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたもの及びアクリジニウム塩を有する請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- （１）アクリジニウム塩をアルカリフォスファターゼと反応させ、得られた標識としてアクリジニウム塩を有するアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものと反応させるか、又は（２）３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものとアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートをアクリジニウム塩と反応させることにより得られた請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- （１）アクリジニウム塩をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものとＮＨＳ及びＥＤＣの存在下で反応させるか、又は（２）３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、得られたアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを、アクリジニウム塩とＮＨＳ及びＥＤＣの存在下で反応させることにより得られた請求項１記載のアルカリフォスファターゼ・コンジュゲート。
- （１）標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼに、抗原またはハプテンである低分子化合物を化学的に結合せしめるか、又は（２）抗原またはハプテンである低分子化合物が化学的に結合せしめられているアルカリフォスファターゼを、アクリジニウム塩で標識することを特徴とする低分子化合物を有すると共にアクリジニウム塩を標識として有する標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートの製造方法。
- （１）標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼに、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものを化学的に結合せしめるか、又は（２）３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものが化学的に結合せしめられているアルカリフォスファターゼを、アクリジニウム塩で標識することを特徴とする３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する請求項９記載の標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートの製造方法。
- 低分子化合物が化学的に結合せしめられていると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを試薬として用いることを特徴とする低分子化合物の特異的結合測定試薬。
- ３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものと共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートを試薬として用い、トリヨードチロニンまたはチロキシンの特異的結合測定試薬であることを特徴とする請求項１１記載の低分子化合物の特異的結合測定試薬。
- 測定されるべき検体試料中の低分子化合物を特異的結合反応を利用して測定する方法において、検体試料を（１）低分子化合物が化学的に結合せしめられていると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲート及び（２）低分子化合物と特異的に結合反応をする反応体と接触せしめ、上記（１）の標識アルカリフォスファターゼの活性もしくはアクリジニウムの活性を検知して測定の指標とすることを特徴とする低分子化合物の特異的結合測定方法。
- 測定されるべき検体試料中のトリヨードチロニンあるいはチロキシンを特異的結合反応を利用して測定する方法であって、検体試料を（１）３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン、アシル基でアミノ基が保護された３，５，３’−トリヨードチロニン、アシル基でアミノ基が保護されたチロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンにスペーサー残基の結合せしめられているもの、及びそのうちに共有結合を可能にせしめる基を導入してあるものから成る群から選ばれたものが化学的に結合せしめられていると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲート及び（２）トリヨードチロニンあるいはチロキシンと特異的に結合反応をする反応体と接触せしめ、上記（１）の標識アルカリフォスファターゼの活性もしくはアクリジニウムの活性を検知して測定の指標とし、かつトリヨードチロニンまたはチロキシンの特異的結合測定方法であることを特徴とする請求項１３記載の低分子化合物の特異的結合測定方法。
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