JPS6354932A - 安定な生物学的活性フッ素化合物エマルジョン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、小滴表面に特異的結合種の一方のメンバーを
有するフッ素化合物エマルジョンに関する。本発明の新
規なエマルジョンは診断用支持体として、葦次生物学的
反応の支持体として有用である。

発明の背景 抗ＭＣ／抗体アッセイおよび生物学的反応の九めの支持
体は通常、ラテックスビーズ、ペーパー、固定赤血球細
胞、ならびにデキストランおよびポリスチレンのような
不溶性ポリマーである。これらのアッセイおよび生物学
的反応においては、特異的結合種（以下、特異的結合種
）の少なくとも一方のメンバーが支持体上に固定化され
、ついで化学反応もしくは物理的操作またはその両者に
付して、最終的には、特異的結合種に対して特異的結合
種の他方のメンバーの（−時的ま之は永久的な）結合を
生じさせる。特異的結合種の２つのメンバーによるこの
カップリングは、その種の一方のサンプル中における存
在を、競合的アッセイ、免疫アッセイ、蛋白質結合アッ
セイの場合と同様に、定性的または定量的に検出するの
に有用である。同様に、特異的結合種の２つのメンバー
の結合は、種の一方に固有の性質、たとえば酵素的性質
をオリ用するのに使用することができる。

アッセイおよび反応システムを設計する場合常に問題に
なることは、特異的結合種を支持体上に、洗浄に抵抗し
て意図した化学的条件下に支持体上に残留するように固
定化することの困難性である。

別の問題は、特異的結合種の特性の消失、すなわち２つ
の種の結合の尚早な反転たとえば結合したメンバーの固
定化メンバーからの脱離または固定化メンバーおよび結
合メンバーの支持体からの脱離である。意図された使用
条件下における支持体の反応性が試験サンプル中の成分
の非特異的結合を生じることもしばしば問題になる。

マイクロカプセルを免疫応答アッセイにおける支持体と
して使用することが示唆されている。すなわち、英国特
許出願部２，０７９，９３７　Ａ号（１９８２年１月２
７日公告）および英国特許出願部２，０７９，９３６　
Ａ号（１９８２年１月２７日公告）にはいずれも、架橋
された壁材料を有するマイクロカプセルに油状核物質を
封入することが記載されている。抗原または抗体が結合
するための部位を有する官能基は架橋剤によって壁に付
着されている。

フッ化炭素エマルジョンかｉｎ　ｖｉｔｒｏ赤血球代用
物として使用できることも示唆されている。一部のフッ
化炭素エマルジョンは良好な酸素輸送特性を有し、非毒
性で完全に代謝されるようである。

他のフッ素化合物エマルジョンには、実験動物に対して
毒性を示し、代謝されず、消失しないものもある。Ｇｅ
ｙｓｒは、ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ第７巻、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｍ、Ｙ、、第１章’　Ｔｈｅ　Ｄｅ
ｓｉｇｎ　ｏｆ　ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＢｌｏｏｄ　５
ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ　”　（１９７６）および’Ｗｈ
ｏｌｅＡｎｉｍａｌ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　
Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ　Ｄｉｓｐｅｎｓｏ−ｒｓ”
　、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、
第２９巻、第５号、１７５８頁（１９７０）に、各種の
エマルジョンについて記載している。血清アルブミン、
ホスホリピド（レシチンを含む）、および界面活性剤比
とえばＰｌｕｒｏｎｉｃ　−Ｆ　６８　（Ｗｙａｎｄｏ
もｔｅ　Ｃｈｅ−ｍ１ｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｗｙａｎ
ｄｏｔｔｅ、　Ｍｉｃｈ　）が乳化剤として使用されて
きた。

人工血液として使用するためには、米国特許第４，４２
３，００７号に５ｌｏｖｉｔｅｒが、非抗原性リビド好
ましくは卵黄ホスホリピドまたはレシチンでコーティン
グされ次パーフルオ胃化合物の、水性メジウム中エマル
ジョンが示唆されている。彼は米国特許第４，３９７，
８７０号において、血流中での有効な小滴レベルの持続
は、レシチンコーティングの明らかな脱落および血流中
へのパーフルオロ化合物小滴表面の喜出によって短縮す
る。パーフルオロ化合物小滴のコーティングに用イラレ
るのと同じ物質で被覆され几小滴のエマルジョンを以前
に注入されたことがある患者への注入がすすめられてい
る。

’　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　
ｆｃ）ｒＰｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｏｆＢｒａｉｎ　＠、Ｎ
ａもｕｒｅ、　２１６　：　４５８　（１９６７年１１
月号）に、５ｌｏｖｉｔｅｒ　Ｆｉま２、Ｋｒｅｂｓ　
Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩緩衝液中８優ウシ血清アルブミン
の擬似血漿化合物中へのパーフルオロ化合物の分散を示
唆している。エマルジョンが生成し、沈殿したのち、ナ
ベでの可溶性蛋白質を洗い去った。沈殿した物質を分析
し來ところ、約５％の蛋白質を含有することが明らかに
され友。

人工血液の分野でも日本の研死者が活躍している。米国
特許第４，２５２，８２７号には、長期間にわ次）小滴
のサイズが変化するととなく維持される十分な安定性を
有し、デキストランおよびヒドロキシルエチルデンプン
のような血漿増量剤と混合可能なフルオロカーボン化合
物のエマルジョンが記載されている。これは有機メジウ
ム中に、炭素原子９〜１１個のパーフルオロカーボン、
炭素原子９〜１１個のパーフルオロ三級アミン、分子量
約２，０００〜２０，０００の界面活性剤、ホスホリピ
ドおよび少なくとも１檀の脂肪酸含有するエマルジョン
である。

血清蛋白質およびホスホリピドに対するパーフルオロ有
機化合物エマルジョンの影響については、ｖ、Ｖ、　０
ｂｒａｚｔｓｕｖらが’　Ｅｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓａｎｄ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｂｙ
　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｒｆｌｕｏｒ。

Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　’の標題で、Ｆ
ｔｏｒｕｇｌｅｒｏｄｒｙｅｌ　９８４、　１４７〜１
５２　（Ｒｕｄｅ）に報告している。

しかしながら、これらの著者が用いたプロトロールは明
瞭でない。彼らは平衡条件においてのみ、溶液から除去
された蛋白質およびホスホリピドの量を分析したようで
ある。彼らは、吸着された蛋白質およびホスホリぎドを
エマルジョン小滴から洗い落とすことを試みた実験につ
いては報告していない。彼らは、その疎水性表面による
蛋白質の結合の不可逆性および変性の特徴が、血中の蛋
白質の濃度をＰＦＯＣエマルジョンでの血液置換の結果
１どこまで低下させることができるかという問題を生じ
る。

発明の要約 本発明は、水性連続相とフッ素化合物小滴非連続相とを
有する安定なエマルジョンである。フッ素化合物小γ局
の表面には、その特異的結合能を失わせることなく、少
なくとも１種の特異的結合種が固定化されている。本明
細書において用いられる１特異的結合８［１の語は、特
異的結合種の一方のメンバーを指す。本発明のエマルジ
ョンは展進が容易で、しかも長期間にわたって驚くほど
安定である。このエマルジョンは、特異的結合能が失わ
れることなく、洗浄に耐えることかできる。

慣用の支持体に比ベフッ素化合物は生物学的分子に対し
て比較的に不活性なことから、広範囲の環境に使用する
のに理想的に適している。フッ素化合物小滴上に固定化
できる特異的結合種の代表例としては、抗原／抗体対の
一方のメンバーを挙げることができる。この場合、抗原
とは、天然もしくは合成の蛋白質、ペプチド、ポリサッ
カライド、リビド、核酸、有機ポリマー、これらの物質
の抗原性フラグメント、細繭もしくはウィルスのような
感染仲介体またはそれらの細胞表面の部分、薬剤、ホル
モンもしくは有機分子のようなハプテンおよびそれらの
配合物、訪導体；天然もしくは合成のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡの分子もしくはセグメント；ｓ累たとえばアルカリ
ホスファメーゼ、ペルオキシダーゼもしくはβ−ガラク
トシダーゼ、ルシ７エラーゼ、ウレアーゼ、またはその
他オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロ
リアーゼ、キナーゼもしくはりアーゼから選ばれる酵素
；その他の反応触媒：レクチン；糖；細胞表面マーカー
もしくは受容体；治療用物質比とえば薬物、植物抽出物
、ホルモンまたはそれらの代謝物：以上掲げたそれぞれ
についての特異的結合種の他のメンバー：その他の特異
的結合反応系の成分たとえば染料、螢光分子または特異
的反応系において、色、螢光、リン光、化学発光もしく
は他の検知可能生成物を産生ずる九めに使用できる成分
である。

本発明の他の態様には、同一のエマルジョン小滴上に別
個の特異的結合種の組合せを固定化することが包含され
る。％異的結合珈の組合せとその特異的反応系の他の成
分を有するエマルジョンは、診断システムにおいてとく
に有用である。すなわち、抗原／抗体結合対の一方のメ
ンバーと、検知可能な生成物九とえば＃素、染料、螢光
分子もしくは化学発光試薬であるかそれを形成できる物
質を、エマルジョン小滴上に別個に固定化することがで
きる。多種の特異的結合種の固定化によ少、基質の存在
および１ｋを決定するのに使用できる酵素カスケードの
別個の成分の固定化が可能になる。

たとえば、同一のエマルジョン小滴に結合された酵素、
グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼによシ
グルコースが定量できる。

特異的結合種は、小滴／水相の界面に直接吸着させるこ
とによってフッ素化合物小滴上に固定化してもよい。ま
九、プライマー物質を使用してもよい。″プライマー物
質″とは特異的結合種をフッ素化合物小滴にカップリン
グさせる能力をもつ物質である。カップリング剤と特異
的反応が可能なアミン、カルボキシル、メルカプトまた
は他の官能基を有する天然ま之は合成ポリマー、および
高度に荷電し之ポリマーが好ましい。特異的結合種はプ
ライマー物質に共有結合させたのち、抱合体と非連続お
よび連続相の界面〈吸着させて固定化することもできる
。また、特異的結合種をプライマー物質に吸着させ、生
成した複合体を非連続および連続相の界面に吸着させて
もよい。水性連続相とフッ素化合物非連続相に、乳化剤
としてプライマー物質？用いてエマルジョンと形成させ
ても同じ結果が得られる。ついで生物学的活性な残基を
連続および非連続相の界面でプライマー物質に吸着また
は抱合させてもよい。

本発明のさらに別の態様には、フッ素化合物小滴中に１
染料”を導入する方法が包含される。本例ａ臀で使用さ
れる１染料１とは、分光光度法、・螢光法′または比色
法によって検知できる種を指す。

本発明の方法は、水性連続相とフッ素化合物非連続相を
有するｉｎ　ｖｉｔｒｏエマルジョンの提供を包含する
。フッ素化合物小滴上には少なくとも１種の特異的結合
種が固定化される。フッ素化合物小滴と固定化された特
異的結合種を、特異的結合種の特異的結合パートナ−を
含有する水溶液と、特異的結合種がそのパートナ−に結
合するのに十分な時間接触させる。この方法は、凝集ア
ッセイ、サンドインチもしくは可逆阻害酵素免疫アッセ
イもしくは放射免疫アッセイ、または蛋白質結合アッセ
イのような診断操作に使用するのが好ましい。

詳細な記述 本発明のエマルジョンは様々な材料から製造することが
できる。

各種のフッ素化合物液体が使用できる。適泊なフッ素化
合物液体には、直鎖状、分岐状もしくは脂環式パーフル
オ四カーざン、直鎖状、分岐状もしくは脂環式パーフル
オロ三級アミン、直鎖状、分岐状もしくは脂環式パーフ
ルオロエーテルおよびチオエーテル、クロロフルオロカ
ーボンならびに重合パーフルオロエーテル等が包含され
る。

５０％までの水素が置換された化合物も使用できるが、
パーハロ化合物が好ましい。とくに好ましい化合物はパ
ーフッ素化化合物である。本発明に有用なフッ素化合物
の例は、Ｋｅｌ−Ｆ■およびＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔｓ（
Ｘり（３Ｍ、　ｓｔ、　Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔ
ａ　）、ＦｒｅｏｎＢ■および５ｅｒｉｅｓ　Ｅ　（Ｄ
ｕｐｏｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｌａｗａｒｅ　）ならびにＦｏｍｂｌ　１４１１８
”　（Ｍｏｎ　ｔｅｄｉ　ｓｏｎ　。

Ｉｔａｌｙ）の商似で販売されているフッ素化合物のよ
うな市販の製品である。

フッ素化合物液体、すなわち大気圧下約２０°Ｃで液体
の物質を本発明のフッ素化合物のエマルジョンの製造に
使用できるが、多くの目的で、長期にわ之って安定なエ
マルジョンが好ましい。このようなエマルジョンを得る
ためには、沸点６０°Ｃ以上のフッ素化合物液体が好ま
しい。５０℃以上の沸点を有するフッ素化合物液体が好
ましく、約１００℃以上の沸点を有するフッ素化合物液
体がとぐに好ましい。

適当なフッ素化合物液体には、パーフルオロデカリン、
パーフルオロ−ｎ−ペンタン、パーフルオロモルホリン
、パーフルオロトリアミルアミン、パーフルオロジメチ
ルシクロヘキサン、パーフルオロジシクロヘキシルエー
テル、パーフルオロ−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、
パーフルオロ−ｎ−オクチルゾロミド、パーフルオロト
ＩＪ−ｎ−ブチルアミン、およびこれらの化合物と構造
的に類似し、部分的もしくは完全にノ１０デン化（少な
くとも一部のフッ素置換と包含する）または部分的もし
くは完全にパーフッ素化された化合物を挙げることかで
きる。

エマルジョンの形成を容易にする交めには、乳化剤、之
とえは界面活性剤を使用することができる。通常、フッ
素化合物液体のエマルジョンの形成を容易にするには、
水相界面活性剤が使用されてきた。！ライマー物質の１
種、たとえばアルブミン、ポリサッカライドおよびホス
ホリピドを乳化剤として使用することもできる。他の界
面活性剤、比とえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−６８、
−ｏ（ｃＨ２）２−ｏ−（ＣＨ２）２−０−と−０−（
ＣＨ２）３−０−（ＣＨ２）！！−０−のブロック共重
合体も使用できる。

適当な界面活性剤の例は、陰イオン活性剤としては、 Ｈａｍｐｏｓｙｌ”Ｌ３Ｑ　（Ｗ、Ｒ，Ｃ１ｒａｃｅ　
Ｃｏ、、　Ｎａ５ｈｕａ、ＮＨ）。

ドデシル硫酸ナトリウム Ａｅｒｏｓｏｌ　　４１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａ
ｎａｍｉｄＣｏ、ｒＷａｙｎｅ、ＮＪ）、Ａｅｒｏｓｏ
ｌ　２ＱＱ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｉｄ　Ｃ
ｏ＋）、ＬｉｐＯｐｒＯｔｅｏｌ”ＬＣＯ（Ｒｈｏｄｉ
ａ　　Ｉｎｃ、、Ｍａｍｍｏｔｈ、ＮＪ）。

８ｔａｎｄａｐ０１”５Ｈ１３５（Ｈｅｎｋｅｌ　Ｃｏ
ｒｐ、、Ｔｅａｎｅｃｋ、ＮＪ）、ＦｉｚｕｌＴＭｉ　
Ｑ−ｉ　２７　（Ｆｉｎｅｔｅｘ　Ｉｎｃ、　、　Ｅｌ
ｍｗｏｏｄ　Ｐａｒｋ。

ＮＪ）および ＣＹＣＩＯｐｏｌ”５ＢＦＡ３Ｑ（Ｃｙｃｌｏ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、。

Ｍｉａｍｉ、　ＦＬ）の商標で販売されている製品、両
性活性剤としては、 Ｄｅｒｉｐｈａｔ”　１７　Ｑ　（Ｈｅｎｋｅｌ　Ｃｏ
ｒｐ、入ＬｏｎｚａｉｎｅＴＭＪＳ　（Ｌｏｎｚａ、　
Ｉｎｃ、入ＭｌｒａｎＯＩＴＭＣ８Ｍ−８Ｆ　（Ｍｌｒ
ａｎＯＩ　Ｃｈｅｍｌｃａｌ　Ｃｏ、　ｐＩｎｃ、、　
Ｄａｙｔｏｎ、　ＮＪ入 ＡＩ！１ｐｈｏｔｅｒｇｅ”Ｗ２（Ｌｏｎｚａ＋　Ｉｎ
ｃ−人およびＡｍｐｈｏｔｅｒｇｅ””　２ＷＡＳ（Ｌ
ｏｎｚａ、　Ｉｎｃ、）の商標で販売されている製品、 非イオン活性剤としては１ 、　　ＴＭ ＰｌｕｒＯｎｌＣＦ−６８（ＢＡＳＦＷｙａｎｄｏｔｔ
ｅ、Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ。

ＭＩ）、 ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＦ−１２７（ＢＡＳＦ　Ｗｙａｎ
ｄｏｔｔｅ入ＢｒｉｊＴＭ３５（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｄ；　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）、Ｔｒｉｔｏ
ｎ”Ｘ−１１００（Ｒｏｈ　＆　Ｈａａｓ　Ｃｏ、、　
ｐｈｉｌａｄｅｌ−ｐｈｉａ　、ＰＡ入 ＢｒｉｊＴＭ５２（ＩＣＩ　　Ａｍｅｒｉｃａｓ入５ｐ
ａｎ””２０（ＩＣＩ　Ａｍ５ｒｉｃａｓ）、ＴＭ Ｇｅｎｅｒｏｌ　　　１２２Ｅｓ（Ｈｅｎｋｅｌ　　Ｃ
ｏｒｐ、）、Ｔｒｉｔｏｎ”　Ｎ−４２（Ｒｏｈｍ　＆
　Ｈａａｓ　Ｃｏ、）、Ｔｒｉｔｏｎ”　Ｎ−ｉ　Ｑ　
ｉ　（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　Ｇｏ、）、Ｔｒｉｔｏ
ｎ”ＸＸ−４Ｑ５（Ｒｏｈ　＆＋　Ｂａａｓ　Ｃｏ、）
、Ｔｗｅｅｎ”　８５　（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ）
　、およびＢｒ１ｊ　ＴＭ５６　（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉ
ｃａｓ）の商標で販売されている製品がめる。

これらの界面活性剤は、単独でまたは配合して０．１０
〜ｓ、ｏｘｔ％全エマルジョンの安定化の補助に用いら
れる。

乳化するフッ素化合物液体に可溶性のフッ素化界面活性
剤も使用できる。適当なフッ素化合物界面活性剤として
は、パーフッ素化アルカン酸たとえばパーフルオロヘキ
サン酸およびパーフルオロオクタン酸、そのアミドアミ
ン誘導体たとえばＣ６Ｆ、　、、Ｃ０ＮＨ（ＣＨ２）、
Ｎ（ＣＨ，、）　２および１．１−ジヒドロパーフルオ
ロアルコール九トエば１，１−ジヒドロパーフルオロ−
ｎ−オクタツールを挙げることができる。これらの界面
活性剤は、一般には０．０１〜５．０重量％、好ましく
は０．１〜１．０１被チ使用される。

その他の適当なフッ素化合物界面活性剤には、パーフッ
素化アルコールリン酸エステルおよびその塩；パーフッ
素化スルホンアミドアルコールリン酸エステルおよびそ
の塩；バーフッ素化アルキルスルホンアミドアルギレン
四級アンモニウム塩；Ｎ、Ｎ−（カルボキシル置換低級
アルキル）パーフッ素化アルキルスルホンアミド；なら
びにそれらの混合物がある。本明細書で用いられるＵパ
ーフッ素化１の語は、界面活性剤が少なくとも１個のパ
ーフッ素化アルキル基を含有することを意味する。

２１！ａなパーフッ素化アルコールリン酸エステルには
、モノおよびビス（ＩＨ，ＩＨ，２Ｈ，２Ｈ−パーフル
オロアルキル）ホスフェートのジェタノールアミン塩の
遊離酸を包含する。“ＺｏｎｙｌＲＰ　”　（Ｅ、１．
　Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ
、。

Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｄｅｌ、）の商品名で市販さ
れているリン酸塩は公知方法により、相轟する遊離酸に
変換される。適当なパーフッ素化スルホンアミドアルコ
ールホスフェートエステルは、［１％許第３，０９４，
５４７号に記載されていて、一般式％式％） Ｌ式中、Ｒは水素１次は１〜約１２個の炭素原子好【し
くけ１〜６１ｆＩの炭素原子を有するアルキル基であシ
、Ｒ′は炭素原子２〜１２個好ましくは２〜８個を有す
るアルキレン橋基であシ、Ｒｆはパー　７　ｋオロ脂肪
族ＣｎＦ２　ｎ＋１もしくはパーフルオロ脂環式ｃｎＦ
、、ｎ−□（ｎは１〜１８、好ましくは６〜１２の整数
である）であり、ｍは１〜６の整数である〕で示される
。モノ、ジおよびトリエステルはいずれも有用であるが
、ジエステルがとくに市販品を容易に入手しやすい。逼
轟なパーフッ素化スルホンアミドアルコールホスフェー
トエステルおよびこれらの塩には、パーフルオロ−ｎ−
オクチル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチルホスフェー
ト、ビス（パーフルオロ−Ω−オクチル−Ｎ−エチルス
ルホンアミドエチル）ホスフェート、ビス（パーフルオ
ロ−ｎ−オクチル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）
ホスフェートのアンモニウム塩、ビス（パーフルオａデ
シル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）ホスフェート
およびビス（パーフルオロヘキシル−Ｎ−エチルスルホ
ンアミドエチルホスフェートが含有される。

好ましい処方では、リン酸緩衝食塩水中水性界面活性剤
としてＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−６８、フッ素化合物界
面活性剤としてパーフルオロアミドアミンおよびパーフ
ルオロジヒドロアルコールを使用する。

フッ素化合物エマルジョンは、プライマー物質を用いま
たは用いないで調製することができる。

適当なプライマー物質には、蛋白質たとえばアルブミン
（たとえばウシ血清アルブミンおよびオパルプミン）、
カゼイン、全血清たとえば正常ヒト血清、フィブリノー
ゲン、コラーダン、合成ポリ（アミノ酸）之とえばポリ
（リジン−フェニルアン二ン）およびポリリジンが包含
される。リジン含量の高いプライマー物質は、カップリ
ング反応に高い活性を示すエマルジョン小滴を生じる。

リジンと疎水性アミノ酸たとえばアラニンまたはフェニ
ルアツニンを１＝１比に有する共重合体をプライマー物
質として使用すると、カップリング反応に利用されるア
ミノ基の濃度がきわめて高くなる。これらのりシンー疎
水性アミノ酸共重合体は、疎水性残基かフッ素化合物流
動相と相互作用して強力に吸着される。しかしなから、
場合によっては、共重合体単ａをプライマー物質として
使用すると、特異的結合種とのカップリング反応中にエ
マルジョン小滴の架橋を生じる。ウシ血清アルブミンお
よび共重合体の混合物では架橋の問題は軽減されるが、
カップリングできる特異的結合種の量も減少する。他の
適当なプライマー物質には、高度に荷電した天然または
合成のポリマー九とえば荷電ポリサッカライド、たとえ
ばヘパリン、デキストラン硫酸、ＤＩＭＡ（米国特許第
４，２１０，７２２号に開示されているエポキシド化ボ
リブメジェンのジメチルアミン附加物〕、プロタミン硫
酸、核酸等が包含される。

本発明のエマルジョンは様々の技術によって製造できる
。ひとつの方法は、フッ素化合物液体と、安定なプライ
マー物質または特異的結合ｆｊｌを含有する水溶液との
混合物の超音波処理がある。一般的に、これらの混合物
は界面活性剤を包含する。

乳化する混合物を冷却すること、界面活性剤の浦度を最
小にすること、および食塩含有緩衝液で緩衝化すること
は、特異的結合性およびプライマー物質のカップリング
能の両者の保持を最大にする。

これらの方法は、吸着されたプライマー物質または特異
的結合種の単位あたシ高い活性を有する優れたエマルジ
ョンを与える。

フッ素化合物小滴上をコーティングするプライマー物質
または特異的結合性の濃度を高くすることを所望の場合
は、混合物を超音波処理時に加熱すること、混合物はイ
オン強度を比較的に低くすること、水浴液は中等度から
低い−とすることが必要である。イオン強度が低すぎ、
−が低すぎ、また加熱が強すぎると、特異的結合種の特
異的結合性またはプライマー物質のカップリング相の一
部減成ま迄は完全喪失を招くことがある。乳化条件の注
意深い制御と変動によってプライマー物質または特異的
結合種の性質を至適化し、高濃度のコーティングを達成
することができる。ウシ血清アルブミンがｆ２イマー物
質である場合には、イオン強度、…および温度の変動は
とくに価値のあることが明らかにされている。

得られたエマルジョンの質は、通常の技術によシ、たと
えば肉眼的観察、比濁法、コールタ−カウンター測定ま
次は分光分析法によって評価できる。エマルジョン成分
中に適当なインディケータ−几とえば染料または螢光ま
たは化学発光マーカーが含まれている場合ＫＦｉ、これ
らの物質の性質によってエマルジョン小滴を観察するこ
とができる。有用なエマルジョンの平均小滴直径には広
い幅がある。たとえば小さい方は０．０１ミクロンから
、大きい場合は５００ミクロンであってもよい。

小滴の大きさは乳化技術や化学成分の変更で制御し、変
動させることができる。

エマルジョンの製造へのｍ音波の応用は許容されるが、
小滴サイズの分布にある程度の変動性が認められる。エ
マルジョンを製造する別法とじては、水溶液、プライマ
ー物質または特異的結合性フルオロカーボン液体、およ
び（加えるのであれば）界面活性剤を含有する混合物の
高圧流を生成させ、各成分が互いに衝突して小滴サイズ
の分布が狭く、小滴サイズの小さいエマルジョンを産生
させる方法がある。好ましいエマルジョンの製造には、
　ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒＴＭ装置（Ｍｉｃｒｏ
ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ。

Ｎｅｗｔｏｎ、　Ｍａｓｓ）が使用できる。この装置は
、超音波ま友は他の慣用方法によって製造された小滴の
処理にも有用である。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ”
装ｆｌＫ小滴流を供給すると、小滴のサイズの分布が狭
く、小滴サイズの小さいエマルジョンが生成する。

特異的結合性は、直接吸着または化学的カップリングに
よってフッ素化合物小滴表面上に固定化することができ
る。直接吸着によって固定化できる特異的結合種の例に
は、抗体、プロティンＡおよび酵素が包含される。この
ようなエマルジョンの製造に際しては、エマルジョンの
形成前に特異的結合性を水相に懸濁もしくは溶解させる
か、ま比、特異的結合性はエマルジョンの形成後に添ん
し、室ｍ　（２５°Ｃ）で、ｐ）ｌ　７．０　ノ緩衝液
（通常はリン酸緩衝食塩水）中において１２〜１８時間
インキュベートする。

特異的結合種をプライマー物質にカップリングさせる場
合鉱、慣用のカップリング技術が使用される。特異的結
合種は、本技術分野において公知の方法を使用して、カ
ップリング剤によシ、プライマー物質に共有結合させて
もよい。代表的なカップリング剤としては、カルボジイ
ミドたとえば１−エチル−３−（３−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩または１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミドメチル−ｐ−トルエンスルホボートｅ挙げることが
できる。その他の適当なカップリング剤としては、アル
デヒドカップリング剤すなわチ、エチレン性不飽和結合
を有するアクロレイン、メタクロレインもしくは２−ブ
チナール、ま几は複数個のアルデヒド基を有するグルタ
ルアルデヒド、プロパンジアールもしくはブタンジアー
ルかある。他のカップリング剤には、２−イミノチオ２
ン塩酸塩、二官能性Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエス
テル、たとえばジスクシニミジルスベレート、ジスクシ
ニミジルタータレート、ビス〔２−（スクシニミドキシ
力ルポニルオキシ）エテル〕スルホン、ジスクシニミジ
ルプロビオネート、エチレンクリコールビス（スクシニ
ミジルスクシネート）；ヘテｎ二官能性試薬たとえばＮ
−（５−ｙｓ）ビー２−ニトロベンゾイルオキシ）スク
シニミド、ｐ−アシドフェニルプロミド、ｐ−アジドフ
ェニルクリオキゾール、４−フルオロ−３−二トロフェ
ニルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−７ジ
ドベンゾエート、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロ
キシスクシニミドエステル、メチル−４−アジドフェニ
ルグリオキゾール、４−フルオロー６−二トロフェニル
アシド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アシドベ
ンゾニーｔｌＪｆ ３、３−トリフルオロゾロビオネート、Ｎ−スクシニミ
ジル−６　−　（　４’−アジド−２′−二トロフェニ
ルアミノ）ヘキサノエート、スクシニミジル４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート、スクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート、Ｎ−スクシニミジル（４−アシドフェニル
ジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシニミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネ−）、Ｎ−　（　４−７
ジドフエニルチオ）フタラミド：ホモニ官能性試薬之と
えば、ｉ，ｓ−ジフルオロ−２．４−ジニトロベンゼン
、４、４′−ジフルオロ−３，６′−ジニトロジフェニ
ルスルホン、４．４’−ジインチオシアノ−２，２′ー
シスルホン酸スチルベン、ｐ−フ二二レンシインチオシ
アネート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロ
フェニルエステル）、４．４’１７チオビスフエニルア
ジド、エリスリトールビスカルボネート、および二官能
性イミドエステルたとえば、ジメチルアシビミデート塩
酸塩、ジメチルスベリミデート、およびジメチル６、３
′−ジチオビスプロビオニミデート塩酸塩が包含される
。特異的結合橿のプライマー物質への共有結合は、上述
の試薬により、慣用のよく知られた方法、たとえば、水
溶液中、中性の…、２５℃以下の温度で１時間から一夜
処理して生成される。

ある徨の応用に際しては、本発明のエマルジョンは、分
光光度法、螢光法または比色法で検知できる染料をフッ
素化合物小滴中に導入することにより、さらに有用にす
ることができる。たとえば凝集終末点は、フッ素化合物
小滴が着色していた方が肉眼で親察しやすい。この目的
に有用な適箔な染料は、フッ素化液体を着色させるのに
十分この液体に可溶性の染料である。好ましい染料はパ
ーフッ素化液体に可解性である。このような染料は通常
、１種または２種以上の可溶化基たとえばハロゲン化側
鎖または好ましくはパーフッ素化エーテル側鎖たとえば
パーフルオロアルキシもしくはパーフルオロアルキルエ
ーテル側鎖まｆｃはバーフッ素化壌弐基を有する。適箔
な染料の例としては、九とえば、米国特肝第３，２　８
　１，４　２　６号に記載されているようなパーフルオ
ロアルキル化フタレイン、フタロシアニン、ローダミン
およびキノフタレイン染料がある。この時計と参照され
たい。

この特許に記載されている代表的な染料は、チオインジ
ゴ（桃）、ピランスロン（橙）、バイオランスロン（１
１１２）、イソバイオランスロン（紫）およびテイアー
ズ・ブルー、パーフルオロアルキル基によって置換され
之鋼フタロシアニン、パーフルオロアルキル基で置換さ
れたメチルレッド類縁体 がある。その他の適当なパーフルオロアルキル−β−ジ
ケトンランタニド複合体、九とえば（式中、Ｒｆおよび
Ｒｆｌはパーフルオロアルキルまたはパーフルオロアリ
ールである）などである。

可溶性染料は、乳化前に乳化すべきフッ素化合物液体中
に、単に混合して必要に応じて加熱して溶解する。また
、可解性染料の添加と乳化は、標準的な乳化技術たとえ
ば超音波および自動化フレンチプレスＦＡ　−０７８型
（ＳＬＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｉｎｃ、、　（Ｊｒｂａｎａ、　工１１．製）を用いて
達成される機械的乳化によって同時に実施することもで
きる。

染料ハ、エマルジョンの生成後にエマルジョンに６≦加
してもよいが、この操作は、プライマー物質や％異的結
合檎が障害物として作用するのでもつと難しくなる。

別個の小滴に異なる染料を組合せることによシ、任意の
色のエマルジョンを製造できる可能性がある。次とえば
抗体−抗原凝集反応によって１つの色の小滴を選択的に
除去すると、エマルジョンの見かけの色に変化を生じる
。抗原−抗体反応によって計量棒に付着する染色小滴を
利用すれば、計量棒上に着色を生じさせることができる
。これらのアプローチはいずれも、多くの免疫アッセイ
の之めの容易に識別できる質的終末点を生成させる可能
性を含んでいる。

染料前駆体を使用することもできる。友とえば色素形成
物質が小滴の表面と会合して適当な物質とカップリング
して染料を形成する（１１珂の色素カップリング法）。

これは上述のパーフルオロアルキルメチルレッド物質を
産生するのに用いられるジアゾ塩の使用によシ達成でき
る。

本発明のその他の態様は、エマルジョンの使用方法を含
めて以下の実施例によシさらに詳細に説明するが、この
実施例は本発明を限定するものではない。

例　　１ 標準方法でのフッ素化合物エマルジョンの生成と比較す
るために、第１表に示したフッ素化合物液体それぞれを
、水浴で冷却したロゼツトセル中５分間超音波処理して
乳化した。各フッ素化合物液体（１００μｌ）を、界面
活性剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８を０．５Ｘ量チ
含有しＰＨ７にリン酸で緩衝化した食塩水Ｉ　Ｄｄ中に
１容量チの濃度で分散させた。

これらの溶液は１日後および７日後に、小滴のサイズを
、沈降量の記録によって評価した。小滴のサイズは定性
ベースで、１日後および７日後に４００倍、暗野照明で
測定した。

低沸点パーフルオロカーボンｐｃ−７８およびＦ’Ｃ−
８８ｅらびにクロロフルオロカーボンＦｒｅｏｎ　１１
３およびＫｅｙ　−１１は、その他の物質の場合よりも
、質的に劣るエマルジョンを形成した。フッ素化化合物
中に窒素または酸素が存在すると、この群内の物質では
エマルジョンの安定性は上昇し、小滴サイズは低下した
。

第１表　パーフッ素化液体 １、　デカリン（Ｐ　Ｐ　−５：　ＤｕＰｏｎｔ　）２
、　　ｎ−ペンタンＣＩｌ′ｅ−８８：　３Ｍ）五　七
ルホリン（ＦＣ−７８：３Ｍ） ４、トリーｎ−アミルアミン（ＥＦＣ−７０：３Ｍ）５
、　ジメチルシクロヘキサン（ＩＰＣ−８２：３Ｍ）６
、　ポリエーテルＸ　−２（ＤｕＰｏｎｔ　）ｌ　ポリ
エーテルＥ　−５（ＤｕＰｏｎｔ　）ａ　Ｋｅｌｒｐ−
１ｃ５Ｍ） （Ｃ２−（ＣＦ２−ＣＣ４ＥＦ２）−Ｃｔ）２　７オム
プリン（ＥＦｏｍｂｌｉｎ　）　Ｌ　Ｓ　（Ｍｏｎｔａ
ｄｉａｏｎ　）（−０ＣＦｌ−ＣＦ、）ｍ−０−（ＣＦ
２−０）ｍＣｔＦ３ １０．７Ｌ／オｙ　１１５　（Ｄｕｇｏｕｔ　）（Ｃｔ
３ＣＣ１ｌＦ３） １１、ソシクロヘキシルエーテル（ＤＣ’Ｅ　）１２、
オクチルゾロミド（ＯＢ） １３、トリーｎ−ジチルアミン（ＦＣ−４３二３Ｍ）１
４．０−８環状エーテル（ＦＣ−７５二３Ｍ）例　　２ パーフルオロ−ｎ−オクタン酸またはパーフルオロアミ
ドアミン、ＣγＩＰ１５Ｃ（Ｏハ旧（ＣＨａ）４Ｎ−（
Ｃ）Ｔｓ九からなるフッ素化合物界面活性剤を、例１の
ようにしてエマルジョンを作成する前に第１表の各フッ
素化合物液体に溶解した。パーフルオロ酸含有フッ素化
合物は例１に記載の界面活性剤緩衝液中、０．０５〜０
．１チウシ血清アルゾミン（ＢＳＡ　）溶液とともに乳
化し、パーフルオロアミドアミン含有フッ素化合物は０
．０５チＤ工私溶液中で乳化した。

これらのエマルジョンについても例１に記載したのと同
様に、小滴のサイズと沈降を評価した。第１表に掲げた
各フッ素化合物は、これらのフルオロカーボンおよびポ
リマー界面活性剤で、エマルジョンとして分散させるの
に成功した。これらのエマルジョンは、例１において界
面活性剤を加えないで調製したエマルジョンに比べて安
定で６ｆｆ。

一般に小滴サイズは小さいようであった。

例　　６ 例２で調製したエマルジョンについて、分散したフッ素
化合物の量、小滴の表面に結合したＢＳＡまたはＤ工Ｍ
Ａの量、および生成した小滴のサイズを分析した。この
分析の前にエマルジョンは、飽和硫酸アンモニウム溶液
の容量比１：１での添加、沈殿の遠心分離、沈殿の新鮮
な緩衝液−界面活性剤溶液への再懸濁によって遊離蛋白
質から分離した。ついで、３０，０００）１，１５分間
の遠心分離および新鮮な緩衝液−界面活性剤溶液への再
懸濁をさらに２回反復した。

これらのエマルジョンのフッ素化合物含量は、０７−１
０１充填、６フイート×０．１２５インチカラム上、が
スクロマトグラフイー分析によって定量し念。フッ素化
合物含量は、既知量のＦＣ−４３′ｔ−注入して作成し
た標準曲線と比較して求めた。イオン焔検知器（Ｆより
）の応答が乳化されたフッ素化合物の種類によって幾分
変動するので、フッ素化合物含量の計算値も同様に変動
した。

エマルジョン小滴表面上のＢＳＡおよびＤ工ＭＡの量ハ
、クーマシーゾル−〇−２５０を用いるＢｒａｄｆｏｒ
ｄ法に従い、既知量のＢＥＩＡおよびＤ工ＭＡＫよって
作成した標準曲線を使って測定した。

エマルジョン小滴のサイズは顕微鏡検査（４００倍、暗
野照明〕によって調べ、作成１日後および７日後に数字
の評点で評価した。エマルジョン小滴は、一定のサイズ
のポリスチレンラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　）と比較して、大きさがほぼ２００，３３
０，４６０，８００，１，２００または２，５００　ｎ
ｍ以上をそれぞれ評点１，２゜３．４，５．　　または
６にＲ属させて評価した。各サンプルについて代表的な
顕微鏡野を用い、特定のサイズ範囲の小滴の数にその大
きさの値を乗じた。エマルジョンについての最終評点は
、これらのサイズ評点の総計を小滴の総数で除した値と
した。エマルジョンのサンプルで、実質的な数の小滴が
フランジ状に凝集している場合は、エマルジョンは凝集
と記録し、それ以上の評価は実施しなかった。

これらのエマルジョンの分析結果および顕微鏡試験によ
って評価された評点ｔ−第２表に示す。このデータは、
有意な量０ＢＯＡ　’！たけＤエムが乳化後の小滴表面
上に存在すること、そしてそれは新鮮な緩衝液−界面活
性剤による反復況浄によっても除去されないことを示し
ている。フッ素化合物に結合しているＢＳＡまたはＤ工
ＭＡの測定値（η／フッ素化合物エマルジョンゴ〕は、
フッ素化合物かへテロ原子（窒素または酸素）ｔ−有す
るＶＣ−４３ｔ　　ＬＦＣ−７５，ｘ−２ｔ　ｚ−５お
よびＤＣＩＣノ分散液においてもつとも大きかった。ま
た、すべての処方において、Ｂ８ＡはＩＨＭＡより多量
に結合している。

サイズのデータは、ＢＳＡで調製されたエマルジョンは
小滴がクランプ状に凝集する傾向を示し、一方、Ｄエム
エマルジョンにはその傾向を認めないことを示している
。さらに、７日後の一部のエマルジョンの評点の変化は
、これらのプレバレージョンでは、特定の処方における
より安定なサイズ分布に動力学的に近づいていることを
示唆している。

例　　４ ０．５重！−％のパーフルオロオクタン酸もしくはパー
フルオロアミドアミンを例１におけるように含有するＥ
ＦＣ−４３を１容量チ、ならびに０．５　！Ｊｉ：％の
Ｋｍｅｒｓｔ　２４　Ｑ　Ｑ、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−
１［Ｉ　Ｑ。

Ｔｗｅｅｎ　４　Ｑ、　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｐ　−８５
，Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−３８（非イオン界面活性剤
）、ラウリン酸。

Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−２００、Ｅｍｅｒｓｏｌ　６４３
４　（陰イオン界面活性剤Ｌ　Ｍｉｒａｎｏｌ　Ｃ２Ｍ
　−Ｓ　Ｆ　（両性界面活性剤）またはＣｌ０Ｆ’２１
Ｓ（０）２ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｃｔ（陽イオンフッ素化
合物界面活性剤）を含有するリン酸緩衝食塩水を含むｐ
ｉ（６，５〜８．５の混合物を超音波処理して、各種の
水性界面活性剤でエマルジョンを調製した。超音波処理
の前に、ＢＳＡ（最終潰ｉ　０．５　％　）をパーフル
オロ酸混合物に、Ｄエム（最終濃度０．５％）をパーフ
ルオロアミドアミン混合物に加えた。

エマルジョンは調裏後１日、４日および７日に、例１，
２および６に上述したようにして、沈降およびエマルジ
ョン不ｍサイズを評価した。非イオン性および両性の水
性界面活性剤で調製したエマルジョンは、陰イオン性ま
たは陽イオン性界面活性剤で調製したエマルジョンに比
べて優れていた。

例　　５ ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水中０．５〜１．０！ｉ％のＣ
，ＩＦｌ、Ｃ０２Ｅ（１ｃ含有する１０容量チのＦＣ−
４３と、界面活性剤として０．０５重量％のＴｗｓｅｎ
　２　Ｑまたは０．１Ｘ量チのｃ、　？１．Ｃｏ２Ｈの
いずれかを周込てエマルジョンを調製した。生成したエ
マルジョンを、例６に記載した遠心分離と再懸濁操作を
用いて洗浄した。これらのエマルジョンのサンプルＱ、
５ｔｎｉに、アルカリホスファターゼ（８１ｇｍａ■Ｔ
型）１たはプロティンＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏｍｐａｎ７　）を加え、０．５〜１８時間イ
ンキュベートした。このエマルジョンを再び上述の操作
で洗浄したのち、アルカリホスファターゼ活性は色素産
生基質、ｐ−ニトロフェニルホスフェートで、フロティ
ン人については免疫グログリンＧ　（工ｇＧ　）の凝集
で、定量した。これらの定量結ＪＮ、は各特異的結合種
について陽性であって、このような物質がエマルジョン
小滴に吸着され、その活性を維持していることを示して
いる。

例　　６ 末端エステル官能基 ＣＨ３０２ＣＣｒ２０−（ＣＩＦ１２ＣＦ２０）７（Ｃ
Ｆ２０）１４−ＣＥＰｚＣＯ２ＣＨ３（ＣＩＦ、Ｏおよ
びＣ’ＥＦ２ＣＦ’、Ｏ単位はランダムに分布している
）ｔ−有するパーフルオロエーテルポリマー０．５重量
％を加え、パーフルオＣ！酸の代わりにＴＰｃ−４５中
、例４と同様にしてエマルジョンをｎ製した。例５と同
様にしてアルカリホスファターゼを加え、エマルジョン
小滴に吸着することを同様に確認し念。

例　　７ ＣｙＦｘ５０（０）ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（ＣＨ３）
３　オヨびｃ？？１ｓｃＨ２０ＦＩそれぞれ０．１〜０
．５Ｘ量チを、第６表に掲げた一連の蛋白質、合成ポリ
アミノ酸、およびポリサッカライドの溶液中に含有し、
さらに１〜５容量チのＦ’Ｃ−４３を含む溶液でエマル
ジョンを調製し九。エマルジョンは、ＦＣ−４３混合物
の超音波処理、２ｘ量チのＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−（
５８含有リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７）の等容量の添加、
ついで３０、ＤＯＯｇで１５分間遠心分離による洗浄後
ＥＳＡを含まない新鮮な界面活性剤−緩衝液への再懸濁
を３＠反復した。

得られたエマルジョンを、下記の方法Ａ、　　Ｃ。

Ｅまたは？のいずれかを用いてアルカリホスファターゼ
とカンプリングした。各原料について、エマルジョン小
滴上にアルカリホスファターゼ活性が回収され、これは
その原料が小滴表面に吸着されたことおよびそれが酵素
抗体もしくは抗原の固定化に洞用できることを示して込
る。装造された各エマルジョンは、サンプル中の抗原ま
たは抗体の存在もしくは濃度または両者を検知するのに
適当である。フィブリノーゲンおよびオパルデミンで製
造したエマルジョンは処理操作中に凝集する傾向を示し
たが、他の物質については容認できるエマルジョンｋ　
与Ｌ　ｆｒ：、。

第　　３　　表 フッ素化合物エマルジョン−生物分子の配合物の製造に
使用した原料 クシ血清アルジミン　　　　０．５〜１０７または０カ
ゼイン　　　　　　　　　２〜１０　１２ゼラチン　　
　　　　　　　２〜１０　　１コラーゲン　　　　　　
　　１．８〜３．６６オバルブミン　　　　　　　２〜
５１ 正常ヒト血清　　　　　　　２〜１０　　５フイデリノ
ーダン　　　　　　１　　　１１プロタミン硫酸　　　
　　　　０．５〜２．０　４または０ポリ（リジン）０
．５〜１．０　４または０ポリ（フェニルアラニン−リ
ジン）　　　０．５　　　４Ｊたは０ポリ（アラニン−
リジン）　　　０．５　　４’！たけ０ヘパリン　　　
　　　　　　１．０４ デキストラン硫酸　　　　　　１．０４例　　８ 水相にＢｓＡ′ｔ−用い例７と同様にしてエマルジョン
を調表し、例７と同様に洗浄した。このエマルジョンを
取り、抗体、抗−ＢＳＡを加え、混合してエマルジョン
の凝集を生じさせると、エマルジョンの光学密度に変化
（増加）が起こった。この方法を用りて、抗体の存在を
検出し、分光光度肝で作成した標準曲線によフ抗体を半
定量的に測定した。この結果から、ＢＳＡはエマルジョ
ン小滴の表面に強固に結合し、抗原として活性であるこ
とが確証された。

例　　９ 例８で裂遺し洗浄したエマルジョンを取り、フルオレス
セイン標識抗−ＢｓＡと混合して、エマルジョン小滴の
凝集を生成させた。これらのクランプは螢光顕微鏡で螢
光を発し、抗体はエマルジョン小滴の架橋、凝集に作用
していることを示した。

この結果から、ＢＢＡはエマルジョン小滴ＶＣきわめて
強固に結合して、抗原として活性であることが確証され
た。

例１０ ０．５Ｘ量チポリ（フェニルアラニン−リジン）溶液申
告０．１重量％のＣ？Ｆ１５ＣＨ２０ＨおよびＣｔ　１
！′ｌｓＣＣ０）ＮＨ−（ＣＨ２）　４Ｎ（ＣＨ５）ｚ
　またはＣ７ｔＦ１５Ｃ（０）ＮＨ−Ｃ６Ｈ４Ｎ（ＣＨ
３）　ｘを含有させ、ｐｃ−４３の１容量慢を用い、Ｐ
ＨＯ、ロゼツトセル９５分間超音波処理してエマルジョ
ンを製造した。超音波処理後、２．０重量４　Ｐｌ、ｕ
ｒｏｎｉｃ　Ｆ　−６５および０．２Ｘ量チドリ工タノ
ールアミン含有リン酸緩衝食塩水の等容量を加えてエマ
ルジョンを安定化した。この分散液を例７０操作によっ
て洗浄し、以下に記述するいずれかの方法で特異的結合
種とカップリングさせた。

エマルジョンとのカップリングが成功した物質、これら
の反応に使用した方法を第４表に示す。これらの物質は
単独または組合せてカップリングさせた。後者の場合、
同じエマルジョン小滴上に別個の特異的結合活性が有効
に回収された。原料は市販品を用いた。すなわち、グル
コースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、　Ｖ型）、ワサげペ
ルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、　　■型）、アルカリホ
スファターゼ（８１ｇｍａ＊　　■Ｔ型）、β−がラク
トシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、グレード■）、小麦胚芽アグ
ルチ２ン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｖｕ１ｇａｒｉｓレクチ
ン、　　Ｂｉｇｍａ　）、　　ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌ
ｕｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓレクチン、　　＋３１ｇｍａ　
）　、プロティンＡ　（ｓｌｇｍａ　）　、　　ウサギ
抗ヤギエｇＧ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　ａｎｄ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ　）　、　
？ウス抗ｈＣＧ　（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　＃モノクロナ
ール〕、ウサイ抗−ＨＥＬＰ　（Ｓｉｇｍａ　）　＊ヤ
ヤエｇＧ　（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅ
ｓ　）　、　　ｈＣＧ　（Ｓｉｇｍａ　）　、　ルミノ
ール（Ｓｉｇｍａ）およびＤＬ−サイロキシン（Ｓｉｇ
ｍａ　）である。

カッシリングさせたエマルジョンは、固定化された物質
について、公知の方法によυ、たとえば酵素については
製造業者の指示する定量操作により、抗体についてはそ
の抗原との凝集反工６によムレクチンは赤血球凝集によ
り、プロティンＡは工ｇＧの結合およびその抗原との反
応によシ、ルミノールは過酸化物およびペルオキシダー
ゼとの反応により、その固定化を評価した。物質の組会
せをエマルジョンにカップリングした場合は、各成分に
ついて別個の定量を実施した。

第　４　表 フッ素化合物エマルジョンにカンプリングさせた物質物
　　　質　　　　　　　　　　　　　　　　方　法グル
コースオキシダーゼ　　　　　Ａ、Ｃ，に、Ｆ’ワサビ
ペルオキシダーゼ　　　　Ｅ、Ｆ、エアルカリホス７ア
ターゼ　　　　Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｇ、Ｈβ−がラクトシ
ダーゼ　　　　　　人 小麦胚芽アグルチニン　　　　　　Ａ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓレクチン（ＰＨ
Ａ）　　Ａ抗ワサビペルオキシダーゼ　　　　人 ヤギ免疫グロブリンＧ（工ｇ　Ｇ）　　　　Ｃｅ烏Ｇ抗
−ヤヤニｇＧ　　　　　　　　　　　Ａ、Ｇサイロキシ
ン（Ｔ−４）　　　　　　　Ｄルミノール　　　　　　
　　　　　　　Ｄヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ、
）　　Ｃ，Ｇ、１抗−ｈＣＧ　　　　　　　　　　　Ｃ
、ＧプロティンＡ　　　　　　　　　　　Ａ方法Ａ カルボジイミド法１ ２　％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−６８および０．２チ
ドリ工タノールアミン含有リン酸緩衝食塩水（ｐ８７．
０　）中エマルジョン（１〜２容量チ）２Ｍに、カップ
リングする物質０．０５〜ｉ、ｏ　ｌＲｇを水溶液（０
，１〜１０１１０１ｌ１９７として加え、ついでカルボ
ジイミド試薬（一般的には１−（３−（ＮｊＮ−ジメチ
ルアミノ）プロピルクー３−エチルカルボジイミド、２
ダ／ａ水）１００〜５００μｌを加えた。この混合物を
室温で１〜２時間混合し、１．０Ｍグリシンおよび１０
％エタノールアミン各０．５ｊ！Ａｔ−加え、さらに２
時間混合した。カップリングさせたエマルジョンは１２
，９００．！ｉ’で６０分間遠心分離した。

上澄液を捨て、エマルジョンのベレットを新鮮な界面活
性剤緩衝液に再懸濁した。この遠心分離と再懸濁の操作
をさらに２回くシ返した。生成したエマルジョンはその
ママ使用した。

方法Ｂ エマルジョンにカップリングさせる物質を、カルボジイ
ミド試薬溶液（方法Ａの場合と同じンによシ、室温で３
０〜６０分間活性化した。カルボジイミド試薬の割合は
一般に２〜５倍モル過剰とした。過剰の試薬の除去には
、３回緩衝液を変えて室温での２〜６時間透析または濾
液１０容量での透析膜濾過で通常十分であった。この活
性化浴液をついでエマルジョン２　ｔｎｌに加え、混合
物を室温で２〜６時間攪拌した。方法Ａの場合と同様に
、グリシンおよびエタノールアミンを加えて活性化した
基を覆い、カップリングしたエマルジョンを方法Ａに記
載したと同様にして単離した。

方法Ｃ グルタルアルデヒド法１ ２％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ’　−６８および０．２チ
ドリエタノールアミン含有ｐＨ７，０のリン酸緩衝化食
塩水中のエマルジョン２ｍｌに、エマルジョンにカップ
リングさせる物質０．０５〜１．０９の水溶液（０，１
〜１０ダ／コ〕と、同時に１チグルタルアルデヒドモノ
マー溶液（Ｂｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ−ｐグ
レード■〕１００〜５００μｌ！を加えた。ついでこの
混合物を室温で３０〜６０分混合した。１０チエタノー
ルアミン５００μｌを加えて反応を停止させ、２〜１８
時間混合した。水素化ホウ素ナトリウムの２１ｖ／ｍｌ
水溶液（新たに調製）５００μＪＴｈ加え、混合物をさ
らに３０分間攪拌した。遠心分離および再懸濁による洗
浄は方法人の場合と同様に実施した。

方法り 界面活性剤含有緩衝液中のエマルジョン２−の表面ｔ−
２５０μｊの１ｃｓグルタルアルデヒドモノマー溶液と
６００分間反応せて活性化し、ついで界面活性剤含有緩
衝液に対して４℃で１８時間、緩衝液を６回変えて透析
した。次にエマルジョンにカップリングすべき物質の水
溶液をエマルジョンに加え（０，０５〜１．０？）、１
８時間攪拌した。

ｉｏｓエタノールアミン５００μｌｔ−加えてカップリ
ング反応を停止させ、方法Ａに記載した操作によってエ
マルジョンを回収した。

方法Ｅ カップリングすべき物質の溶液ｋ　０．３　Ｍ炭酸水素
ナトリウム中に約５ダ／　ｔｎｌ溶解しくｐ８８．１）
、０．６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１１Ａｌ！と５分
間反応させて活性化し、ついで０．１６Ｍエチレングリ
コール溶液１ゴを３０分間で加えた。次に反応混合物を
、０．０１Ｍ炭酸水素ナトリウムに対して大規模に透析
した。活性化された物質１００〜２００μ！ヲエマルジ
ヨン２　ｔｎｌ　Ｉｃ加え、ついで水素化シアノホウ素
ナトリウム（１００Ｉｖ／ｍｌ）　１００　μｉを加え
、混合物を２時間攪拌した。未反応活性化基を、１０％
エタノールアミン１００μｚとｉ時間ついで１１ｎ９の
水素化ホウ素ナトリウムとさらに３０分反応させて遮閉
した。方法ＡＫ記載した遠心分離および再懸濁操作によ
って、カンプリングしたエマルジョンを回収した。

方法？ 界面活性剤含有緩衝液中エマルジョン２ｒｒＬＩ！とカ
ツブリングすべき物質０．０５〜１．０ダに、Ｃ１，（
１７６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（ｐＨ７）　２００μ！
および水素化シアノホウ素ナトリウム（１００Ｒ９／ｌ
１ｌ）１００μ／ｌ−加え、混合物を１時間攪拌した。

過剰の試薬を０．１６Ｍエチレングリコール２００μｊ
および１０慢エタノールアミン２００μｊと１時間反応
させ、カップリングしたエマルジョンを方法Ａの遠心分
離および再懸濁操作によって精製した。

方法Ｇ 二官能性酸性１ 界面活性剤含有緩衝液中エマルジョン２ｄとエマルジョ
ンにカップリングさせる物質０．０５〜１．０ダの混合
物に、新たに調製したビス（Ｎ−ヒトミキシスクシニミ
ジル）テレフタル酸ＯＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶
液（１０（１１９／Ｉ’ｌｌ　）　１００μｌを加え、
混合物を１８時間攪拌した。残った試薬はついで、１Ｍ
グリシン５００μｌと１０％エタノールアミン５００μ
ｌと２時間反応させた。

ついで、方法Ａの場合と同様にして遠心分離し新鮮な緩
衝液に再懸濁して単離した。

方法Ｈ 界面活性剤含有緩衝液中エマルジョン２ｄに、エマルジ
ョンにカップリングする物質０．０５〜１．０ダを加え
た。環化できない二官能性有機酸たとえば７−ｆ−／Ｌ
’ｌ！”！たはテレフタルｉ！１１１０１ｎ９とカルボ
ニルシイミダゾールのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミｒ溶
液（１０＃／ｌｕ）　１００　／ＪＡ’　を予ａ６１５
分間反応させた混合物の１００μｌを取シ、混合物を２
時間攪拌した。過剰の試薬を１Ｍグリシンおよび１０チ
エタノールアミン各５００μｊと２時間反応させた。次
にカップリングしたエマルジョンを方法Ａにおけると同
様に遠心分離および再懸濁で単離した。

方法ニ シアネート法 界面活性剤含有緩衝液中エマルジョン２ばとエマルジョ
ンにカップリングさせる物質０．０５〜１．０りの混合
物に、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド中ｐ−ニトロ
フェニルシアネー）溶？’ｌｌ［（１０Ｉｎ９／　ｍ’
　）　１００　ｐｉ　ｔ　ｍ　Ｌ、反応混合物’ｋ　Ｍ
Ｉ　ＭＡ　７３０分間攪拌した。反応の進行に従って、
反応によｆｆ’ｌＥ成したｐ−ニトロフェノールのため
黄色を呈した。混合物をついで方法ＡＫおけると同様に
遠心分離、再懸濁して精製した。

例１１ エマルジョン金側７の場合と同様にして調製し、これを
上述の方法Ｅ（過ヨウ素酸法１）によってグルコースオ
キシダーゼとワサビペルオキシダーゼの混合物にカップ
リングさせた。生成したエマルジョンをグルコースとペ
ルオキシダーゼの基質に暴露すると、存在するグルコー
ス量に比例して発色が認められた。０．０５　Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液中０−ジアニシジン（０，００２１Ｍ）
、−５，１とエマルジョン１ａｚ６たジ５０〜５００η
のグルコースを含有する対照溶液を用い、５［］［］ｎ
ｍにおける吸収とグルコース濃度の標準曲線をプロット
すると、このエマルジョンを用いてグルコース濃度の定
量が可能であった。

例１２ ０．２　Ｘｔ　％ティア−ズブルー（パーフルオロアル
キル化＃！７りａシアニン染８）の？ｃ−４５ｃＰ溶液
を用いて、０．５！量９６　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　−
１５（３および２ｍｇｔ　／　ｍｌ　ＢＢＡ含有含有リ
ン酸緩衝食塩水中パーフルオロトリープチルアミン１〜
１０容量チのエマルジョンを調製した。分散は、水冷ロ
ゼツトセル９５〜１０分間超音波処理によって行った。

エマルジョンをついで、３０，０００ｇでの遠心分離つ
いで新たＩＣＣ裏表たＢＡＡを含まない緩衝界面活性剤
溶液に再懸濁する操作に３回付し、洗浄した。得られた
プレバレージョンは強く着色していて、ベックマン分光
光度計６５型で測定すると、吸収極大は６１０から６１
２　ｍｍにわずかにシフトしていた。

例１６ パーフルオロトリーｎ−グチルアミン中ｃ８Ｆ　１？ｓ
ｏ、−ｃ　、Ｉ（４ＨｍＮＣ６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）　、の
溶液を用いて、Ｑ　、５　Ｍ３１　％　Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ　Ｆ　−６８および２１ｎ９／　ｒｔＬＩ　ＢＳＡ含
有リン酸緩衝食塩水中パーフルオロ）リ−ｎ−ブチルア
ミン１〜１０容量チのエマルジョンを調製した。分散は
、水冷ロゼツトセル９５〜１０分間超音波処理によって
行った。エマルショアｆついで３０，０００．Ｆでの遠
心分離ついで新鮮な、ＢＳＡを含まない緩衝界面活性剤
溶液に再懸濁する操作に３回付して精製した。洗浄した
エマルジョンは黄色に着色していたが、溶液のｐＨを２
〜４の範囲に変化させると赤色に変化した。エマルジョ
ンを３０，０００　＆で遠心分離すると上澄液から色は
完全に消失するので色はエマルジョン小滴に伴うもので
あった。

上記の赤色のエマルジョンを取シ、例１２の青色エマル
ジョンと割合を１＝１から１：５（容址比）に変えて合
すると数種の色調の紫色のエマルジョンが生成した。水
溶液のｐＨを変えると、上記混合エマルジョンの色調は
紫色から緑色に変化した。

例１４ マウス免疫グロブリン（工ｇ　、　　Ｃａｐｐｅｌ　Ｌ
ａｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ　、　Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌ
ｅ　、　Ｆ　Ａから購入）　２ＩＩ９’！に０．１５　
Ｍ食塩水溶液に溶解し、グルタルアルデヒドを加えて１
．２５重量係溶液とした。室温に２時間量いたのち、活
性化した工ｇ　−２Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｆ　−２（Ｂｉｏ
Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｒｌｃｈｍｏ
ｎｄ、　　ＣＡから購入）上クロマトグラフィーに付し
、過剰のグルタルアルデヒドを除去した。活性化した工
ｇ１グを、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ９，０）中側７から
のＢＳＡエマルジョン１ｒｔｔｌと合した。混合物を２
４時間放置したのち、エマルジョンを洗浄して非結合工
ｇを除去し、このエマルジョンについて＠　Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｋｚｐｅｒｉｍｅｎｔａユ　エｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ　　”　ｐＤ、Ｍ、　Ｗｅｉｒ　１１１
％　第１巻、１９．１〜１９．５頁、１１ａｃｋｗｅｌ
ｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ
　（ｌ　９７３　）の記載に従って毛管免疫拡散法によ
シ、抗−ウシ血清アルブミンおよび抗−マウス免疫グロ
ブリンに対する免疫反応性を試験した。評価の結果を第
５表に示す。抗体の溶液を相当する抗血清と混合すると
、抗原は抗体と結合し、条件が適当であれば、反応物質
は肉眼で容易ｆｃ認めることができる沈殿性もしくは毛
状の凝集を形成する。

第５表 ルジョン　　ヨン　　　　ルジョン 例１５ 例７で得られたフッ素化合物エマルジョンのサンプルを
、ｆ？ｔａｎｆｏｒｄ　ＭｅｄヱｃａｌＢｕｌｌｅｔｉ
ｎ　１３　ｒ２９０〜２９１に記載の方法で製造した５
ｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕａ　Ａ−炭水化物と、例１４
の方法で抱合させた。遊離５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　Ａ菌体がフッ素化合物エマルジョン結合５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　Ａ−炭水化物混合物の凝集を工ｇＭモ
ノクロナール抗体の存在下に阻害する能力を試験した。

フッ素化合物エマルジョン−結合５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　Ａ−炭水化物、その抗体および各Ｓ＠度の遊＠
　Ｂｔ、ｒｅｐｔｏｃｏａｃａａ　Ａ菌体を配合し、約
２０℃で６０分間イ７キ：″ゝ−トし１凝集を観察した
。凝集を０〜＋４で評価した。０はは小滴の凝集の阻害
なし、＋４は小滴の凝集を完全に阻害である。結果を第
６表に示す。結果は、この方法が１０５個／ばのレベル
で菌体を検知できることを示している。

第　　６　　表 １　　　　　　１０８４　＋ ２　　　　　　１０７　　　　　　４　＋３　　　　　
１０６．３＋

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）水性連続相およびフッ素化合物小滴非連続相を有
   し、フッ素化合物小滴上には特異的結合種の少なくとも
   １種が固定化されているエマルジョンからなり、このエ
   マルジョンは特異的結合種の結合パートナーと接触する
   ことが可能であり、特異的結合種はウシ血清アルブミン
   またはレシチンではないことを特徴とする特異的結合反
   応用の支持体。
2. （２）特異的結合種は、抗原／抗体対（この場合、抗原
   は、天然もしくは合成の蛋白質、ペプチド、ポリサッカ
   ライド、リピド、核酸、有機ポリマー、これらの物質の
   抗原性フラグメント、感染仲介体、ハプテン；レクチン
   ；ＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメント；酵素；細胞表面
   マーカー、細胞表面受容体；治療用物質；治療用物質の
   代謝物；エンドトキシン；以上掲げた任意の物質の特異
   的結合パートナーおよび以上掲げた任意の物質の配合物
   もしくは誘導体である）の一方のメンバーよりなる群か
   ら選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の生物学的活性
   エマルジョン。
3. （３）特異的結合種は、連続相と非連続相の界面に吸着
   されることによりフッ素化合物小滴上に固定化される特
   許請求の範囲第１項に記載の生物学的活性エマルジョン
   。
4. （４）フッ素化合物小滴非連続相はさらにプライマー物
   質を含有し、特異的結合種は連続相と非連続相の界面に
   おいてプライマー物質に抱合される特許請求の範囲第１
   項に記載の生物学的活性エマルジョン。
5. （５）プライマー物質は、カップリング剤と特異的反応
   が可能なアミン、カルボキシル、メルカプトもしくは他
   の官能基を有する天然および合成ポリマー、ならびに高
   度に荷電した天然および合成ポリマーよりなる群から選
   ばれる特許請求の範囲第４項に記載の生物学的活性エマ
   ルジョン。
6. （６）プライマー物質は、アルブミン、カゼイン、全血
   清、フィブリノーゲン、コラーゲンならびに天然および
   合成のポリ（アミノ酸）および荷電ポリサッカライドよ
   りなる群から選ばれる特許請求の範囲第５項に記載の生
   物学的活性エマルジョン。
7. （７）フッ素化合物小滴非連続相は、フッ素化合物に可
   溶性で水性連続相には不溶性の着色物質で染色される特
   許請求の範囲第１項に記載の生物学的活性エマルジョン
   。
8. （８）水性連続相とフッ素化合物小滴非連続相からなり
   、フッ素化合物小滴は染色を包含するエマルジョン。
9. （９）（ａ）水性連続相、フッ素化合物小滴非連続相お
   よびフッ素化合物小滴上に固定化された特異的結合種を
   有するエマルジョンを￥ｉｎ　ｖｉｔｒｏ￥に準備し、
   （ｂ）フッ素化合物小滴および固定化特異的結合種を、
   特異的結合種の特異的結合パートナーを含有する水性溶
   液と、結合が可能な十分の時間接触させることを特徴と
   する￥ｉｎ　ｖｉｔｒｏ￥特異的結合操作方法。