JP5786188B2 - 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
このためCRPは各種炎症のマーカーとして、感染症又は炎症等の疾患の診断のためにその測定が行われてきた。
現在では、抗CRP抗体との抗原抗体複合体を生成させる方法である、免疫比ろう法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法等が日常検査に広く利用されている。
CRP濃度は、炎症の大きさや程度、又はその改善と相関するため、その測定の臨床的意義は大きい。また、CRP濃度が正常域(0.3mg/dL以下)であっても、比較的高濃度の場合、冠動脈疾患を発症する可能性が高いことが報告され注目されている。
このため、試料中のCRPの測定においては、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することが要求されてきている。
(1) 試料中のC反応性蛋白質に対する特異的結合物質を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、該特異的結合物質と試料に含まれていたC反応性蛋白質との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のC反応性蛋白質を測定する方法において、該特異的結合反応の反応時に酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸及びメタクリル酸若しくはその誘導体又はそれらの塩から選択される少なくとも1種を存在させることを特徴とする、C反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法。
(2) 担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、前記(1)記載の測定範囲の拡大方法。
〔1〕C反応性蛋白質に対する特異的結合物質
本発明において、C反応性蛋白質に対する特異的結合物質とは、CRPに特異的な親和性を有し結合することができる物質であり、このようにCRPに特異的な親和性を有し結合することができる物質であれば特に限定はない。
また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。
本発明において、担体粒子は、前記のCRPに対する特異的結合物質を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
また、本発明における担体粒子としては、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子であることが好ましい。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、CRPに対する特異的結合物質と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解したCRPに対する特異的結合物質を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。
この場合のカルシウムイオン依存的にCRPに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にCRPに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合比率は、用いる各々の特異的結合物質や使用する担体の種類などの条件等により異なるため一概に言うことは出来ないが、例えば、両方の担体が同一濃度となるよう混合して用いること等を挙げることができる。
しかし、CRPに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたCRPとの複合体凝集物(凝集塊)を生成する程度、及びこの生成した複合体凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ(粒径)は、その平均径(平均粒径)が、0.01μm〜10μmであることが好ましく、0.04μm〜1μmであることがより好ましい。
また、本発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法において、担体粒子は、その大きさ(粒径)、材質、又は形状等が異なる2種類以上の担体を使用してもよい。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化されたCRPに対する特異的結合物質と、試料に含まれていたCRPとの、特異的結合反応が行われる測定反応時に、CRPに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において0.005〜1%(w/v)となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度のCRPに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。
本発明の測定試薬及び測定方法においては、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有又は存在させる。ここで、モノカルボン酸とは、分子中にカルボキシル基(−COOH)を1個持つ有機化合物であり、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸(ブタン酸)、乳酸、吉草酸(ペンタン酸)、イソ吉草酸、ピバル酸、2−メチルブタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、カプロン酸、安息香酸、フェニル酢酸(芳香族)などの飽和モノカルボン酸、アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸、リノール酸などの不飽和モノカルボン酸等を挙げることができる。
また、本発明におけるモノカルボン酸若しくはその誘導体の塩としては、例えば、リチウム、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどのアンモニウム塩、アルミニウム塩及び亜鉛塩等を挙げることができる。
本発明において、試料とは、CRPが存在する可能性があり、かつCRPの存在の有無、又は含有量(濃度)の測定を行おうとするものをいう。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、CRPが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
本発明の測定試薬は、CRPに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を含むCRPの測定試薬において、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有することを特徴とするものである。
そして、これらを本発明の試料中のCRPの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(W/V)が好ましく、特に0.01〜5%(W/V)が好ましい。
なお、本発明の試料中のCRPの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のCRPの測定に使用することができる。
また、本発明の試料中のCRPの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のCRPの測定に使用することもできる。
本発明における試料中のCRPの測定方法は、担体粒子に固定化された「CRPに対する特異的結合物質」と試料中に含まれていた「CRP」との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のCRPを測定する方法において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させるものである。
第1試薬:モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有する緩衝液
第2試薬:CRPを固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1〜30℃)又は微温(30〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい(例えば、37℃等)。
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1〜30℃)又は微温(30〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい(例えば、37℃等)。
そして、前記の静置の時間は、1分以上、10分以下の一定時間であることが好ましく、3分以上、5分以下の一定時間であることがより好ましい。
本発明における、C反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法は、試料中のCRPと、担体粒子に固定化したCRPに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することによる、試料中のCRPの測定において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させることによるものである。
この試料中のCRPの測定において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させることにより、その測定範囲を拡大し、試料中の低濃度から高濃度までのCRPを測定することができる。
また、本発明におけるC反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−1)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酢酸ナトリウムを含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、酢酸ナトリウム〔関東化学社〕を0mM、250mM、500mM及び1000mMの濃度となるように添加し、酢酸ナトリウム濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
(a)抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10%懸濁液0.094mLに、抗ヒトCRPモノクローナル抗体を0.04g/dLの濃度で6.7mM
HEPES緩衝液〔pH7.0(20℃)〕に混和した液0.5098mLを加え、5℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に1.0%BSAを含む5mMグリシン緩衝液〔pH9.5(20℃)〕を加え懸濁し、37℃で7日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液で波長585nmにおける吸光度が25.0ODとなるように懸濁した。
そして、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗CRP抗体を固定化したラテックス粒子の0.800%懸濁液として調製した。
これを抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
なお、抗CRPモノクローナル抗体としては、市販のマウス抗CRPモノクローナル抗体(日本バイオテスト研究所社;クローン:CRB−019)を使用した。
前記(a)で調製した抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の1mLと、0.05%アジ化ナトリウム水溶液の9mLとを混合し、0.080%の「抗CRP抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第2試薬とした。
(1)試料希釈液の調製
4%(w/v)BSA、2.7mM塩化カルシウム・2水和物、100mM塩化ナトリウム及び15mMアジ化ナトリウムを含有する50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH7.6〕を調製して、試料希釈液とした。
遺伝子組み換え体CRP(オリエンタル酵母工業社製)を、前記(1)の試料希釈液で希釈することにより、次のCRP濃度の試料をそれぞれ調製した。
また、前記(1)で調製した試料希釈液を、CRP濃度0mg/dLの試料とした。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
(a)測定は、日立−7180形自動分析装置(日立製作所社製)を使用して行った。
まず、測定用セル(キュベット)に、前記2の(2)の試料1〜7の3μLを添加した。
次に、これらの測定用セル(キュベット)に、前記1の(1)の第1試薬の100μLを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗CRP抗体と、前記の試料に含まれていたCRPとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
なお、この吸光度差は試料に含まれるCRPの量(濃度)に比例したものである。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図1に示した。
なお、この図1において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図1から明らかなように、第1試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−2)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、プロピオン酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、プロピオン酸〔和光純薬社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、プロピオン酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例1の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図2に示した。
なお、この図2において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図2から明らかなように、第1試薬にプロピオン酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度50mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にプロピオン酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−3)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酪酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、酪酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、酪酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例1の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図3に示した。
なお、この図3において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図3から明らかなように、第1試薬に酪酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に酪酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−4)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、乳酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、乳酸〔和光純薬社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、乳酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例1の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図4に示した。
なお、この図4において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図4から明らかなように、第1試薬に乳酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に乳酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−5)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、アクリル酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、アクリル酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、アクリル酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例1の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図5に示した。
なお、この図5において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図5から明らかなように、第1試薬にアクリル酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にアクリル酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−6)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、メタクリル酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、メタクリル酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、メタクリル酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例1の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図6に示した。
なお、この図6において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図6から明らかなように、第1試薬にメタクリル酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にメタクリル酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−7)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酢酸ナトリウムを含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、酢酸ナトリウム〔関東化学社〕を0mM、250mM、500mM及び1000mMの濃度となるように添加し、酢酸ナトリウム濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
(a)抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Aの調製
平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10%懸濁液0.094mLに、抗ヒトCRPモノクローナル抗体を0.05g/dLの濃度で6.7mM
MMES緩衝液〔pH5.0(20℃)〕に混和した液0.5098mLを加え、5℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に1.0%BSAを含む5mMグリシン緩衝液〔pH9.5(20℃)〕を加え懸濁し、37℃で7日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液で波長585nmにおける吸光度が25.0ODとなるように懸濁した。
そして、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗CRP抗体を固定化したラテックス粒子の0.80%懸濁液として調製した。
これを抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Aとした。
なお、抗CRPモノクローナル抗体としては、カルシウムイオン非依存的にCRPに結合する抗体である、市販のマウス抗CRPモノクローナル抗体(日本バイオテスト研究所社;クローン:CRB−030)を使用した。
平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10%懸濁液0.094mLに、抗ヒトCRPモノクローナル抗体を0.04g/dLの濃度で6.7mM
HEPES緩衝液〔pH7.0(20℃)〕に混和した液0.5098mLを加え、5℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に1.0%BSAを含む5mMグリシン緩衝液〔pH9.5(20℃)〕を加え懸濁し、37℃で7日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液で波長585nmにおける吸光度が25.0ODとなるように懸濁した。
そして、これを0.05%アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗CRP抗体を固定化したラテックス粒子の0.80%懸濁液として調製した。
これを抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Bとした。
なお、抗CRPモノクローナル抗体としては、カルシウムイオン依存的にCRPに結合する抗体である、市販のマウス抗CRPモノクローナル抗体(日本バイオテスト研究所社;クローン:CRB−019)を使用した。
前記(a)で調製した抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Aの0.25mLと、前記(b)で調製した抗CRP抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Bの1.0mLとを0.05%アジ化ナトリウム水溶液の8.75mLと混合した。
これを第2試薬とした。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、第2試薬として前記1の(2)の第2試薬を用い、前記実施例2の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図7に示した。
なお、この図7において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図7から明らかなように、第1試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−8)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、プロピオン酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、プロピオン酸〔和光純薬社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、プロピオン酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例7の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例7の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図8に示した。
なお、この図8において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図8から明らかなように、第1試薬にプロピオン酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にプロピオン酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−9)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酪酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、酪酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、酪酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例7の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例7の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図9に示した。
なお、この図9において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図9から明らかなように、第1試薬に酪酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に酪酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−10)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、乳酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、乳酸〔和光純薬社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、乳酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例7の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例7の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図10に示した。
なお、この図10において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図10から明らかなように、第1試薬に乳酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬に乳酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−11)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、アクリル酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、アクリル酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、アクリル酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例7の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例7の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図11に示した。
なお、この図11において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図11から明らかなように、第1試薬にアクリル酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にアクリル酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
(本願発明の試料中のCRPの測定試薬及び測定方法の効果の確認−12)
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、メタクリル酸を含有する本願発明のCRPの測定試薬を用いて試料中のCRPの測定を行い、その効果を確認した。
(1)第1試薬の調製
1%(w/v)BSA、250mM塩化ナトリウム、20mM塩化カルシウム・2水和物及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕を調製した。ここに、メタクリル酸〔ナカライ社〕を0mM、50mM、100mM及び200mMの濃度となるように添加し、メタクリル酸濃度の異なる4種類の第1試薬とした。
前記実施例7の1の(2)の記載の通りに、第2試薬を調製した。
(1)試料希釈液の調製
前記実施例1の2の(1)の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
前記実施例1の2の(2)の記載の通りに、次の各試料を調製した。
(a)試料1: 0mg/dL
(b)試料2: 0.08mg/dL
(c)試料3: 0.4mg/dL
(d)試料4: 2.0mg/dL
(e)試料5: 10.0mg/dL
(f)試料6: 50.0mg/dL
(1)測定手順
第1試薬として、前記1の(1)の第1試薬を用い、前記実施例7の3の(1)の記載の通りに試料中のCRPの測定を行い、各試料における測定値(吸光度差)を得た。
前記(1)において、試料中のCRPの測定を行って得られた吸光度差を、図12に示した。
なお、この図12において、横軸は試料中のCRP濃度(mg/dL)を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×10,000〕(主波長570nm、副波長800nm)を表す。
図12から明らかなように、第1試薬にメタクリル酸を含有させない場合(0mM)には、試料中のCRP濃度10mg/dLまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第1試薬にメタクリル酸を含有させない場合には、試料中のCRP濃度が10mg/dL以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のCRPを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
Claims (2)
- 試料中のC反応性蛋白質に対する特異的結合物質を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、該特異的結合物質と試料に含まれていたC反応性蛋白質との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のC反応性蛋白質を測定する方法において、該特異的結合反応の反応時に酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸及びメタクリル酸若しくはその誘導体又はそれらの塩から選択される少なくとも1種を存在させることを特徴とする、C反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法。
- 担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、請求項1記載の測定範囲の拡大方法。
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