CN114761561B - 重组c反应蛋白 - Google Patents
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Abstract
在应用乳胶试剂的免疫测定中，提高CRP高浓度范围中的免疫测定的正确性。重组C反应蛋白，其为通过基因重组生产的C反应蛋白，该C反应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。
Description
技术领域
本发明涉及通过基因重组技术生产的C反应蛋白(C-reactive protein；下文也显示为“CRP”)及其用途。更详细地，涉及变换了CRP的N末端结构的重组CRP、和应用该重组CRP的校准品、管理血清、和通过抗体抗原反应的CRP的定量方法。
背景技术
CRP是与肺炎球菌荚膜的C多糖显示沉淀反应的蛋白，此外由于是急性期蛋白的一种也已知为代表性的炎症标记物。在感染病和炎症性疾病中，由于CRP的血中浓度显著增加、此外伴随病情恢复急剧减少，CRP的定量成为各种疾病的重症程度的判定、治疗经过观察时的指标。健康人的血中的CRP浓度通常是0.3mg/dL以下，但对于炎症和炎症性疾病的患者的情形，在短时间急增至数百至数千倍。因此，在样品中的CRP测定中，需要正确测定低浓度至高浓度的广范围浓度的CRP。
作为临床检查领域中的血中CRP浓度的定量法，有利用抗原抗体反应的测定方法，已知酶免疫测定法、发光免疫测定法、乳胶免疫比浊法、免疫色谱法等。尤其地，在这些测定方法中，乳胶免疫比浊法由于操作简便且通过分析装置的测定可自动化而广泛用于日常检查。在乳胶免疫比浊法中，从应用浓度已知的校准品的校准曲线定量CRP浓度，此外该校准曲线的正确性通过管理血清的测定保证。
在上述的校准品和管理血清中，使用从腹水等人体液纯化的天然型CRP，但存在混入CRP以外的血清成分、对血中CRP浓度的测定造成影响的风险。此外，在CRP的分离、纯化阶段，由于处理成为生物体原料的人体液，也有病原性的二次感染的风险，制备中的安全性也有问题。进一步，人体液中的CRP含量中有偏差，从稳定供给方面也有问题。另一方面，利用微生物等的重组CRP由于不以人体液为原料，不存在来自人的血清成分的混入和二次感染的风险，因此，如果可以构建通过基因工程技术的重组蛋白的稳定表达系统，可以稳定供给靶蛋白。
关于通过微生物的重组CRP的表达，已经报告应用大肠杆菌和酵母等的成功实例(专利文献1，非专利文献1)。但是，在通过乳胶免疫比浊法的重组CRP浓度的测定中，在CRP高浓度范围，存在检测到比实际的CRP浓度低的测定值的问题。因此，在校准品和管理血清等中使用重组CRP作为诊断药原料中，需要提高CRP高浓度范围中的测定的正确性。
多种蛋白通过翻译后修饰引起化学特性或结构的变换。作为翻译后修饰之一，有谷氨酰胺或谷氨酸的羧基与氨基通过产生分子内缩合反应变换为焦谷氨酸的焦谷氨酰化。动植物具有大量通过焦谷氨酰化修饰的焦谷氨酰肽，存在β-淀粉样蛋白、胶原蛋白、IgG2等蛋白。CRP也是焦谷氨酰肽。但是，据报告，重组CRP中混合N末端保持为谷氨酰胺的那种、和变换为焦谷氨酸的那种(非专利文献2)。关于这样的CRP的N末端结构与乳胶免疫比浊法中的抗体抗原反应的关联，迄今没有报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2000-14388号公报
非专利文献
非专利文献1：TOSHIO TANAKA et a1.，BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN.，295(2002)，p163-166
非专利文献2：临床检查，Vol.46，No.9，p973-981(2002年9月)
发明概述
发明要解决的问题
本发明的问题是，尤其在应用乳胶免疫比浊法的情形中，提高CRP高浓度范围中的测定的正确性。
用于解决问题的手段
本发明人鉴于上述情况进行深入研究，结果发现了通过变换重组CRP的N末端结构克服上述问题的方法。具体地，发现通过应用经完整MS测定、全部的55％以上的N末端被焦谷氨酰化的重组CRP，可正确测定CRP高浓度范围中的CRP浓度，从而完成本发明。
作为本发明的具体方式，如下所示。
第1项.重组C反应蛋白，其为通过基因重组生产的C反应蛋白，该C反应蛋白的55％以上的N末端被焦谷氨酰化。
第2项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的65％以上的N末端被焦谷氨酰化。
第3项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的75％以上的N末端被焦谷氨酰化。
第4项.第1项记载的重组C反应蛋白，其中，该C反应蛋白的85％以上的N末端被焦谷氨酰化。
第5项.第1至4项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，重组C反应蛋白是通过细菌进行的重组蛋白。
第6项.第5项记载的重组C反应蛋白，其中，细菌是大肠杆菌。
第7项.第1至6项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白来自人。
第8项.第1至7项的任一项记载的重组C反应蛋白，其中，C反应蛋白由下述的(a)至(c)的任一种多肽组成：
(a)序列编号1或序列编号2记载的多肽，
(b)由在序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成，并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽，
(c)由与序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列的同一性是90％以上的氨基酸序列组成、并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽。
第9项.校准品，其包含第1至8项的任一项记载的C反应蛋白。
第10项.管理血清，其包含第1至8项的任一项记载的C反应蛋白。
第11项.定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用第9项记载的包含C反应蛋白的校准品。
第12项.定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用第10项记载的包含C反应蛋白的管理血清。
第13项.第11或12项记载的定量样品中的C反应蛋白的方法，其应用固定了抗C反应蛋白抗体的乳胶粒子，通过乳胶免疫比浊法进行。
发明效果
本发明的重组CRP可以提高通过乳胶免疫比浊法的CRP高浓度范围中的测定的正确性，用作管理血清或校准品中应用的诊断药用原料。
附图简述
[图1]是显示实施例3中进行重组CRP1的SDS-PAGE的结果的图。
[图2]是显示实施例3中进行重组CRP2的SDS-PAGE的结果的图。
[图3]是显示实施例5中进行放大各种CRP1的LC/MS的洗脱时间1.7～2.0分钟的平均的10价离子的谱的比较研究的结果的图。
[图4]是显示实施例5中进行放大各种CRP2的LC/MS的洗脱时间1.7～2.0分钟的平均的10价离子的谱的比较研究的结果的图。
用于实施发明的方式
(C反应蛋白的多肽)
本发明的重组CRP列举例如来自人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、山羊等的哺乳类的CRP。其中更优选来自人、狗或猫的CRP，进一步尤其优选来自人的CRP。
本发明的实施方式之一是由下述的(a)～(c)的任一种多肽组成的CRP：
(a)序列编号1或序列编号2记载的多肽。
(b)由在序列编号1或序列编号2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成，并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽。
(c)由与序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列的同一性是90％以上的氨基酸序列组成、并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽。
在上述(a)的多肽中，序列编号1或序列编号2是由206个氨基酸组成的成熟型CRP的氨基酸序列。在用革兰氏阴性菌等在菌体外表达本发明的重组CRP的情形中，可以赋予适合宿主的适当的分泌信号，该情形的氨基酸序列如序列编号3或序列编号4所示全长由227个氨基酸组成。其中，22位至227位的206个氨基酸相当于序列编号1或序列编号2的成熟型CRP，甲硫氨酸至21位是分泌信号的氨基酸序列。在菌体内表达本发明的重组CRP的情形中，可以除去分泌信号。
本发明的重组CRP不限于上述(a)，也可以是：
(b)由在序列编号1或序列编号2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成，并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽，或
(c)由与序列编号1或序列编号2所示氨基酸序列的同一性是90％以上的氨基酸序列组成、并且对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽。
上述(b)的多肽中的“多个”的下限是2个。上限只要维持对抗C反应蛋白抗体的抗原性则数目没有限制，但需要在不显著损害氨基酸残基的蛋白的立体结构和对抗C反应蛋白抗体的抗原性的范围内。例如，相当于不足总氨基酸的20％的数目，优选相当于不足15％的数目，进一步优选相当于不足10％的数目，进一步优选相当于不足5％的数目，进一步优选相当于不足1％的数目。换言之，个数是例如41个以下，优选31个以下，进一步优选21个以下，进一步优选10个以下，进一步优选5个以下，进一步优选4个以下，进一步优选3个以下。
在上述(c)的多肽中，与上述(a)所示氨基酸序列的同一性优选80％以上。该同一性优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，更优选99％以上。
氨基酸序列的同一性可以应用市售的或通过电信回路(因特网)可利用的分析工具算出。在本发明中，通过在作为美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开的同源性检索程序的BLAST的网址中选择blastp应用默认(初始设置)的参数，算出同一性。
某多肽是否对抗C反应蛋白抗体具有抗原性以在后述“C反应蛋白的浓度测定方法”中是否能够引起乳胶粒子的凝集反应、测定CRP浓度判断。
对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的蛋白的变体及其基因可以利用例如TransformerMutagenesis Kit；Clonetech制、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit；Stratagene制、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit；Stratagene制、KOD-Plus-Mutagenesis Kit；东洋纺制等市售试剂盒和PCR法、通过改变编码序列编号1或序列编号2记载的氨基酸的碱基序列而得到。由得到的基因编码的蛋白的抗原性可以如下确认：例如，将得到的基因导入大肠杆菌制成转化体，培养该转化体生成蛋白，用后述“C反应蛋白的浓度测定方法”测定该转化体、该转化体的菌体破碎液或纯化的蛋白。
(C反应蛋白的DNA)
编码本发明的重组CRP的DNA列举编码来自例如人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、山羊等哺乳类的CRP的DNA。其中，更优选编码来自人、狗或猫的CRP的DNA，进一步优选编码来自人的CRP的DNA。
本发明的实施方式之一是由下述(d)～(f)的任一种DNA组成的CRP：
(d)编码上述(a)至(c)的任一种CRP的氨基酸序列的DNA，
(e)由序列编号5或序列编号6所示碱基序列组成的DNA，
(f)由在序列编号5或序列编号6所示碱基序列中一个或多个碱基被取代、缺失、插入和/或添加的碱基序列组成，并且编码对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽的DNA，
(g)由与序列编号5或序列编号6所示碱基序列的同一性是80％以上的碱基序列组成、并且编码对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽的DNA。
在上述(d)的DNA中，本发明的CRP的氨基酸序列是上述(a)～(c)的任一种所示的CRP的氨基酸序列。在本发明的DNA中，对于与前述氨基酸序列中的各氨基酸对应的密码子是多数的情形，其选择没有特别限制。具体地，示例由(e)序列编号5或序列编号6所示碱基序列组成的DNA。
另外，在如上述赋予分泌信号序列的情形中，可以应用序列编号7或序列编号8所示的DNA。序列编号7或序列编号8编码上述序列编号3或序列编号4的氨基酸序列所示CRP的全长中22位至227位的206个氨基酸是成熟型CRP、和甲硫氨酸至21位的相当于分泌信号的部分。
此外，本发明的DNA不限于上述，也可以是：
(f)由在序列编号5或序列编号6所示碱基序列中一个或多个碱基被取代、缺失、插入和/或添加的碱基序列组成，并且编码对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽的DNA，或
(g)由与序列编号5或序列编号6所示碱基序列的同一性是80％以上的碱基序列组成、并且编码对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽的DNA。
此外，在将编码本发明的CRP的DNA整合到大肠杆菌等来源生物以外的宿主、表达本发明的CRP的情形中，为了提高表达效率，可以适合宿主生物的密码子使用变更碱基序列。
在上述(f)的DNA中，“多个”的下限是2个。上限只要维持该DNA编码的多肽对抗C反应蛋白抗体的抗原性则数目没有限制，但需要在不显著损害氨基酸残基的蛋白的立体结构和对抗C反应蛋白抗体的抗原性的范围内。例如，相当于不足改变前的多肽的全部氨基酸的20％的数目，优选相当于不足15％的数目，进一步优选相当于不足10％的数目，进一步优选相当于不足5％的数目，进一步优选相当于不足1％的数目。换言之，个数是例如124个以下(相当于全部氨基酸的20％的碱基数)，优选93个以下(15％)，更优选62个以下(10％)，更优选31个以下(5％)，更优选20个以下，更优选15个以下，更优选10个以下，更优选5个以下，更优选4个以下，进一步优选3个以下。
在上述(g)的DNA中，与序列编号5或序列编号6所示碱基序列的同一性优选80％以上。更优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上。
碱基序列的同一性可以应用市售的或通过电信回路(因特网)可利用的分析工具算出。在本发明中，通过在作为美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开的同源性检索程序的BLAST的网址中选择blastn应用默认(初始设置)的参数，算出同一性。
对于某DNA是否编码对抗C反应蛋白抗体具有抗原性的多肽，可以将该DNA整合到市售表达载体，用适当的宿主表达，通过后述“C反应蛋白的浓度测定方法”中是否能够引起乳胶粒子的凝集反应、测定CRP浓度来判断得到的多肽对抗C反应蛋白抗体的抗原性。
(C反应蛋白的制备方法)
本发明的其它实施方式是整合了上述DNA的载体、包含该载体的转化体、或包含培养该转化体的制备重组CRP的方法。本发明的重组CRP可以通过将该基因插入适当的载体配制重组载体、用该重组载体转化适当的宿主细胞配制转化体、培养该转化体而容易地进行。
作为载体，只要可以在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞内保持复制或自律增殖则没有特别限定，包括质粒载体和噬菌体载体、病毒载体等。重组载体的配制没有特别限定，可以按照常规方法进行，例如，可以通过在这些载体中应用适当的限制酶和连接酶、或按需要进一步地接头或衔接子DNA连接本发明的CRP的基因而容易地进行。此外，若是应用如Taq DNA聚合酶的如在扩增末端添加一个碱基的DNA聚合酶扩增制备的基因片段，可通过TA克隆与载体连接。
此外，作为宿主细胞，只要是确立了重组表达系统的那种则没有特别限制，优选列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌、酵母等微生物以及昆虫细胞、动物细胞、高等植物等。更优选列举微生物，尤其优选列举大肠杆菌(例如K12株、B株等)。转化体的配制没有特别限定，可以按常规方法进行。在宿主是大肠杆菌的情形中，应用大肠杆菌C600、大肠杆菌HB101、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21等，作为载体，列举pBR322、pUC19、pBluescript、pQE、pET等作为实例。在宿主是酵母的情形中，列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为优选实例。作为载体，列举pAUR101、pAUR224、pYE32等。在宿主是丝状真菌的情形中，例如，可以示例米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等。
如果将得到的转化体在与其宿主细胞相应的适当培养条件培养规定时期，本发明的重组CRP通过整合的基因表达，在转化体中蓄积。
转化体中蓄积的本发明的重组CRP可以未纯化原样应用，但优选使用纯化的那种。作为该纯化方法，没有特别限定，例如，可以通过将培养后的转化体或其培养物在适当的缓冲液中匀浆、通过超声处理和表面活性剂处理等得到细胞提取液、适当组合从中分离纯化蛋白中常规利用的分离技术进行。作为这样的分离技术，列举盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的差异的方法、透析、超滤、凝胶过滤、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等利用分子量的差异的方法、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法、应用磷酸胆碱固定化柱的亲和色谱等利用特异亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性的差异的方法、等电点电泳等利用等电点的差异的方法等，但不限于这些。例如，可以通过经Sephadex凝胶(GE Healthcare Bioscience制)等凝胶过滤、DEAE Sepharose CL-6B(GE Healthcare Bioscience制)、Octyl Sepharose CL-6B(GE Healthcare Bioscience制)等柱色谱分离、纯化，得到纯化标本。
(C反应蛋白的N末端环化方法)
本发明的重组CRP是全部的55％以上的N末端被焦谷氨酰化的重组CRP，具体地，是计算出N末端环化率是55％以上的重组CRP。
在本发明中，“N末端环化率”是表示重组CRP中的N末端被焦谷氨酰化的重组CRP的比率的指标，按后述“C反应蛋白的N末端环化率测定方法”算出。在用后述“C反应蛋白的N末端环化率测定方法”测定的情形中，期望N末端环化率保持为重组CRP的55％以上、优选60％以上、更优选65％以上、更优选70％以上、更优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上。
在本发明中，“N末端”指除去分泌信号序列的成熟型CRP的N末端，具体地，序列编号1或序列编号2所示的氨基酸序列中1位(或序列编号3或序列编号4的22位)的谷氨酰胺、或1位的谷氨酰胺产生分子内缩合反应后的焦谷氨酸。1位的谷氨酰胺通过实施环化处理变换为焦谷氨酸。
在本发明中，“环化处理”是促进CRP从上述N末端为谷氨酰胺的状态(下文称为“未环化型”)向上述N末端为焦谷氨酸的状态(下文称为“环化型”)变换的处理，可以选择酶学或非酶学方法的任一。作为酶学方法，例如，可以通过在适当温度使谷氨酰胺基环化酶反应进行，但酶和温度条件不限于这些。非酶学方法需要设定缓冲液的种类、pH、处理温度、处理时间、CRP浓度等，但只要是不对CRP、未环化型CRP和环化型CRP造成不利影响的条件即可，没有特别限定。下文显示一个实例。
作为环化处理中应用的缓冲液，示例醋酸缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液等Good缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液，硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。pH条件优选pH7～pH12的范围，进一步优选pH7～pH10。温度条件优选4℃～55℃，进一步优选37℃～50℃。CRP浓度优选0.1mg/dL～500mg/dL，进一步优选10mg/dL～300mg/dL。反应时间优选30分钟～4周，进一步优选16小时～3周。
(C反应蛋白的浓度测定方法)
在本发明中，CRP浓度测定用以下的条件进行。该CRP浓度测定方法是固定了抗C反应蛋白抗体的乳胶粒子与被检样本中的CRP(被检物质)产生抗原抗体反应、根据该乳胶粒子的凝集反应的程度测定CRP浓度的方法。另外，对于本发明中称为“CRP浓度”的情形，具体地，除非特别记载，意味着用以下方法测定的值。
<试剂>
·Denka生研公司制CRP乳胶X2“生研”R1试剂(缓冲液)
·Denka生研公司制CRP乳胶X2“生研”R2试剂(乳胶(抗人CRP多克隆抗体(兔)结合乳胶)悬浮液)
·Denka生研公司制CRPX2标准液H
<测定样本>
测定样本是CRP溶液，按需要用20mM Tris-HCl缓冲溶液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙；pH7.5)稀释后使用。此外，在配制为特定的CRP浓度的情形中，以Bradford蛋白测定中定值的蛋白浓度为基准，确定稀释倍率。
<测定方法>
对上述的测定样本、上述的R1试剂和上述R2试剂，用下述条件，应用日立7180型自动分析装置，测定样本中的CRP浓度(mg/dL)。CRP浓度通过式(I)算出。
样本：2.2μL
R1试剂：120μL
R2试剂：120μL
测定方法：2端点法(18-34)
主波长：546nm
副波长：800nm
[数学式1]
CRP浓度(mg/dL)
＝{测定值(测试)-测定值(空白)}×CRP溶液的稀释率…(I)
在本发明中，对于判断CRP高浓度范围下的重组CRP对乳胶试剂的反应性是否改善的方法，用上述方法测定的天然型人CRP的CRP高浓度范围下的CRP浓度值与各种重组CRP中CRP高浓度范围下的CRP浓度值的偏差是5％以下的情形判断为反应性被改善。在本发明中，CRP高浓度范围指CRP浓度10～30mg/dL的范围，但不特别限于此。
(C反应蛋白的N末端环化率测定方法)
在本发明中，重组CRP的N末端环化率测定用以下条件进行。本测定方法是通过质谱分析测定未环化型CRP的谱与环化型CRP的谱的10价的各离子强度、根据各离子强度算出未环化型CRP与环化型CRP的比率的方法。本发明中“未环化型CRP的谱”指符合分子量23045的谱，此外，“环化型CRP的谱”指符合分子量23027的谱。另外，对于本发明中称为“CRP的N末端环化率”的情形，具体地，除非特别记载，意味着用以下方法测定的值。
<测定样本>
测定样本是CRP溶液，按需要用超纯水稀释后使用。
<测定方法>
对上述测定样本，用下述条件，应用LC/MS装置，测定样本中的未环化型CRP的谱与环化型CRP的谱。
LC条件
装置：Waters制ACQUITY UPLC
柱：Waters制Mass PREP Micro Desalting Column 20μm，2.1×5mm
流动相：A水/甲酸混合液(1000∶1)，B IPA/ACN/甲醇/甲酸混合液(500∶300∶200∶1)
柱温度：50℃
注入量：5μL
MS条件
装置：BRUKERDALTONICS制microOTOF
离子化法：ESI正(positive)
<N末端环化率的算出方法>
应用用上述测定方法得到的各CRP谱的洗脱时间1.7～2.0分钟的平均谱的10价的各离子强度(intensity)，算出未环化型CRP与环化型CRP的比率的方法。本发明的“比率”指以未环化型CRP与环化型CRP两种离子强度的总和为100的情形的环化型CRP的离子强度的比率，通过下述的式(II)算出。
[数学式2]
N末端环化率(％)
＝环化型CRP的离子强度/(未环化型CRP的离子强度+环化型CRP的离子强度)×100 …(II)
以下通过实施例具体说明本发明。另外，本发明不特别限定于实施例。
实施例1突变的导入和转化体的获得
(1)突变的导入
以连接了来自大肠杆菌的碱性磷酸酶分泌信号序列(ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC)与序列编号5或序列编号6的来自人的成熟型CRP序列的序列编号7或序列编号8的人工合成基因为模板，应用序列编号9、10的引物，扩增CRP基因。序列编号9是正向引物，序列编号10是反向引物。本引物中分别添加限制酶位点NdeI、或限制酶位点BamHI。通过加入扩增的基因片段、和用制限酶NdeI与BamHI切割的载体质粒pBluescript KSN(+)、In-Fusion Reaction Mix(Takara Bio制)温育，构建质粒。如此，获得设计为可以大量表达CRP基因、包含序列编号7的重组质粒pBKSN_CRP1和包含序列编号8的重组质粒pBKSN_CRP2。
(2)转化体的获得
应用(1)中构建的质粒，转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109株感受态细胞(东洋纺制)，在SOC培养基中37℃培养1hr后，在LB琼脂培养基(包含葡萄糖1.0％、氨苄青霉素50μg/mL)中展开，获得作为菌落的该转化体。将用pBKSN_CRP1的导入得到的转化体命名为大肠杆菌JM109(pBKSN_CRP1)。此外，将用与上述同样的方法用pBKSN_CRP2的导入得到的转化体命名为大肠杆菌JM109(pBKSN_CRP2)。
实施例2大肠杆菌中的CRP基因的表达
将实施例1中获得的转化体大肠杆菌JM109(pBKSN_CRP1)的菌落接种至试验管内灭菌的5mL的LB液体培养基(包含葡萄糖1.0％、氨苄青霉素100μg/mL)，在37℃培养16小时。将得到的培养液作为种子培养液，接种至放入10个2L容量的坂口烧瓶的500mL的LB液体培养基(包含甘油0.5％、氯化钙0.05％、IPTG 1mM、氨苄青霉素50μg/mL)，以摇动数180rpm在30℃培养24小时。自培养结束通过离心分离收集菌体，悬浮于20mM Tris-HCl缓冲液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙、pH7.5)后，用法式压榨机(Niro Soavi制)破碎，进一步进行离心分离，作为粗纯化液1得到上清液。此外，以与上述同样的方法从大肠杆菌JM109(pBKSN_CRP2)也获得粗纯化液2。
实施例3重组CRP的纯化
对实施例2中获得的粗纯化液1，应用PierceTM p-Aminophenyl PhosphorylCholine Agarose(Thermo SCIENTIFIC制)进行亲和纯化。将用实施例2中使用的缓冲液20mM Tris-HCl缓冲液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙、pH7.5)平衡的前述树脂与粗纯化液混合吸附的树脂用前述缓冲液洗涤，用20mM Tris-HCl缓冲液(0.14M氯化钠、2mM EDTA2mM、pH7.5)洗脱，获得重组CRP溶液1。该溶液进一步应用中空纤维膜通过加水浓缩除去EDTA，同时置换为实施例2中使用的缓冲液20mM Tris-HCl缓冲液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙、pH7.5)，进一步用离心超滤过滤器(Merck制)浓缩至适当浓度，得到纯度高的重组CRP1。应用获得的重组CRP1进行SDS-PAGE的结果示于图1。其结果，成功提高纯度至SDS-PAGE中无法检测出不纯蛋白的水平。此外，用与上述同样的方法从粗纯化液2也得到纯度高的重组CRP2。关于得到的CRP2进行SDS-PAGE的结果示于图2。与CRP1同样，成功提高纯度至SDS-PAGE中无法检测出不纯蛋白的水平。
实施例4重组CRP的N末端环化处理
将实施例3中获得的重组CRP1在37℃加温8天，获得重组CRP的N末端通过焦谷氨酰化环化的环化型重组CRP1。环化处理中使用实施例2中使用的缓冲液20mM Tris-HCl缓冲液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙、pH7.5)，CRP浓度在300mg/dL实施。此外，用与上述同样的方法，从重组CRP2获得环化型重组CRP2。
实施例5N末端环化率的测定
将实施例3中获得的重组CRP1与重组CRP2、实施例4中获得的环化型重组CRP1和环化型重组CRP2、和作为阳性对照的天然型人CRP(Yashraj制)在超纯水中配制为CRP浓度150mg/dL的CRP溶液，用如上述的LC/MS条件测定(参考表1)。将在重组CRP1的各样品的质谱中、洗脱时间1.7～2.0分钟的平均的10价的离子放大，示于图3。
m/z 2305.45显示未环化型CRP的谱，此外，m/z 2303.74显示环化型CRP的谱。在天然型人CRP中，环化型CRP的谱显著显示。另一方面，在实施例3中获得的重组CRP1中显示，未环化型CRP的谱比环化型CRP的谱高。与之相对，实施例4中获得的环化型重组CRP1显示环化型CRP的谱比未环化型CRP的谱明显高。通过实施例4的N末端环化处理，显示CRP的焦谷氨酰化被促进。此外，在重组CRP2与环化型重组CRP2中，也得到如图4所示的同样结果。
[表1]
| 时间(分钟) | 流速(mL/分钟) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 0.40 | 5 |
| 0.50 | 0.40 | 5 |
| 0.51 | 0.16 | 5 |
| 2.00 | 0.16 | 95 |
| 2.10 | 0.40 | 5 |
| 2.70 | 0.40 | 95 |
| 2.80 | O.40 | 5 |
| 3.40 | 0.40 | 95 |
| 3.50 | 0.40 | 5 |
| 4.00 | 0.40 | 5 |
在实施例3中获得的重组CRP1与重组CRP2、实施例4中获得的环化型重组CRP1与环化型重组CRP2、和天然型人CRP中，以用上述LC/MS条件测定的未环化型CRP的谱与环化型CRP的谱的10价的各离子强度为基础，根据各离子强度从未环化型CRP与环化型CRP的比率用上述式(II)算出CRP的N末端环化率。重组CRP1、环化型重组CRP1和天然型人CRP的N末端环化率示于表2。对于实施例4中获得的环化型重组CRP1，对加温第1天、第3天、第6天、第8天获得的环化型重组CRP1，通过上述式(II)算出N末端环化率。此外，重组CRP2、环化型重组CRP2和天然型人CRP的N末端环化率示于表3。对于实施例4中获得的环化型重组CRP2，对加温第1天、第3天、第6天、第8天获得的环化型重组CRP2，通过上述式(II)算出N末端环化率。
在天然型人CRP中，N末端环化率是95％，显示全部的95％是环化型CRP。另一方面，在实施例3中获得的重组CRP1与重组CRP2中，显示N末端环化率40％和环化型CRP仅存在为全部的一半以下。与之相对，对于实施例4中获得的环化型重组CRP1和环化型重组CRP2，伴随加温时间变长，显示环化型重组CRP的比例有增加的倾向，加温第1天N末端环化率42％、加温第3天N末端环化率54％、加温第6天N末端环化率67％、加温第8天N末端环化率78％。
[表2]
| 样品 | N末端环化率(％) |
| 实施例3重组CRP1 | 40 |
| 实施例4环化型重组CRP1加温第1天 | 42 |
| 实施例4环化型重组CRP1加温第3天 | 54 |
| 实施例4环化型重组CRP1加温第6天 | 67 |
| 实施例4环化型重组CRP1加温第8天 | 78 |
| 天然型人CRP | 95 |
[表3]
| 样品 | N末端环化率(％) |
| 实施例3重组CRP2 | 40 |
| 实施例4环化型重组CRP2加温第1天 | 42 |
| 实施例4环化型重组CRP2加温第3天 | 54 |
| 实施例4环化型重组CRP2加温第6天 | 67 |
| 实施例4环化型重组CRP2加温第8天 | 78 |
| 天然型人CRP | 95 |
实施例6通过乳胶试剂的CRP浓度测定
将牛血清白蛋白(Sigma制)在超纯水中稀释为0.1、0.2、0.4、和0.75mg/mL，配制标准液。在各标准液60μL中添加蛋白测定浓缩染料试剂(BioRad制)600μL和超纯水2.4mL，在室温静置5分钟后测定595nm的吸光度。根据上述595nm的吸光度的测定值和牛血清白蛋白浓度制成校准曲线。将实施例3中获得的重组CRP1与重组CRP2、实施例4获得的环化型重组CRP1与环化型重组CRP2、和天然型人CRP在超纯水中稀释为适当浓度，用与标准液同样的试剂、条件配制，测定595nm的吸光度。根据各种CRP的测定值由上述校准曲线算出蛋白浓度。以上述蛋白浓度为基础，用20mM Tris-HCl缓冲溶液(0.14M氯化钠、2mM氯化钙、pH7.5)稀释为蛋白浓度1mg/dL、5mg/dL、10mg/dL、30mg/dL，配制CRP溶液。
对于上述各CRP溶液的CRP浓度，以Denka生研制CRP-乳胶X2的缓冲液作为第1试剂、抗人CRP多克隆抗体(兔)结合乳胶悬浮液作为第2试剂，组合前述第1试剂与第2试剂，应用日立7180型自动分析装置测定依赖于CRP浓度的粒子凝集块的形成。具体地，在前述各CRP溶液2.2μL中加入第1试剂120μL在37℃加温5分钟后，加入第2试剂120μL搅拌。在主波长546nm、副波长800nm测定其后5分钟的伴随凝集形成的吸光度变化(ΔmAbs)。
表4显示实施例3中获得的重组CRP1、实施例4中获得的环化型重组CRP1的测定值、和相对于天然型人CRP的测定值的各浓度的相对值。此外，表4中也显示实施例5中算出的各种CRP的N末端环化率。进一步，实施例3中获得的重组CRP1、实施例4中获得的环化型重组CRP1和天然型人CRP的测定值示于表5。与上述同样，表6中显示实施例3中获得的重组CRP2、实施例4中获得的环化型重组CRP2的测定值、和相对于天然型人CRP的测定值的各浓度的相对值。此外，表6中也显示实施例5中算出的各种CRP的N末端环化率。进一步，实施例3中获得的重组CRP2、实施例4中获得的环化型重组CRP2和天然型人CRP的测定值示于表7。
根据表4和表6，确认在N末端环化率40％、42％的重组CRP1和重组CRP2中，10mg/dL和30mg/dL的点中与天然型人CRP的测定值的相对值是89～94％以及测定值中有6～11％的偏差。另一方面，在N末端环化率54％、67％、78％的环化型重组CRP1和环化型重组CRP2中，10mg/dL和30mg/dL的点中与天然型人CRP的测定值的相对值是95～104％以及与测定值的偏差抑制在5％以内。根据本结果显示，在N末端环化率是55％以上的环化型重组CRP1与环化型重组CRP2中，在10mg/dL与30mg/dL的CRP高浓度范围，与天然型人CRP的偏差也可以抑制在5％以内。
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
产业上的可利用性
本发明的CRP作为在CRP高浓度范围的反应性优异的乳胶试剂中应用的诊断药原料，在医疗、诊断领域中尤其有用。
Claims (6)
1.重组C反应蛋白在制备用于定量样品中的C反应蛋白的校准品中的用途，其中，
所述重组C反应蛋白为通过基因重组生产的C反应蛋白，所述C反应蛋白由序列编号1或序列编号2记载的多肽组成，所述C反应蛋白的65％以上的N末端被焦谷氨酰化。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述C反应蛋白的75％以上的N末端被焦谷氨酰化。
3.权利要求1所述的用途，其中，所述C反应蛋白的85％以上的N末端被焦谷氨酰化。
4.权利要求1至3的任一项所述的用途，其中，重组C反应蛋白是通过细菌进行的重组蛋白。
5.权利要求4所述的用途，其中，细菌是大肠杆菌。
6.权利要求1至3的任一项所述的用途，其中，C反应蛋白来自人。
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2020
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