CN114196688B

CN114196688B - 在酵母中表达原核碱性磷酸酶

Info

Publication number: CN114196688B
Application number: CN202210118943.9A
Authority: CN
Inventors: 高山; 贝锦龙; 徐国峰; 杨珺; 汪和睦; 米东; 周浩; 魏东盛; 梁剑光; 李鑫
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Chongqing Hongfei Synthetic Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2042-02-08
Also published as: CN114196688A

Abstract

本发明涉及一种在酵母中表达原核碱性磷酸酶的方法，用以表达来自海科贝特菌(Cobetia marina)的碱性磷酸酶CmAP。该方法可以用于生产具有高比活力、高稳定性、高糖基化的重组碱性磷酸酶，提高其纯品的单位发酵液产量，并简化纯化工艺。

Description

在酵母中表达原核碱性磷酸酶

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及在酵母中表达原核碱性磷酸酶的方法，该方法可以用于生产具有高比活力、高稳定性、高糖基化的重组碱性磷酸酶，提高其纯品的单位发酵液产量，并简化纯化工艺。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,简称AP或ALP)是一类水解酶，可在核苷酸、蛋白质和生物碱等分子上去除磷酸基，即去磷酸化作用；同时，它也是一种重要的工业酶，其应用覆盖很多领域，最重要的一项应用就是检测和诊断试剂中的酶促发光。天然存在的碱性磷酸酶，无论来自原核或真核，比活力普遍不高(低于3,000U/mg)，哺乳动物的碱性磷酸酶的比活力要比大肠杆菌的高10到100倍，而比活力最高的是来自牛肠的碱性磷酸酶(APfrom the bovine intestine，简称bIAP)[1]。因此，早期大规模应用的碱性磷酸酶主要依靠从牛肠中提取，英国BBI公司(www.bbienzymeschina.com)的产品在市场中居于垄断地位。由于碱性磷酸酶在动物体内的含量低，导致了其生物提取方法的高成本，还会带来生物安全和伦理等问题。因此，在工业生产中，原有的生物提取方法逐渐为基因工程方法所替代。用于基因工程的常见的表达系统主要有大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物CHO细胞系。由于CHO细胞系难以提高表达量，大肠杆菌表达的重组碱性磷酸酶缺少糖基化，而糖基化是诊断试剂中的抗体偶联所必须的，罗氏公司(Roche)最终选择了毕赤酵母表达系统来生产重组bIAP，并成功地实现了糖基化和高比活力。

长期以来，罗氏公司的毕赤酵母重组bIAP在市场中，特别是诊断试剂市场中，居于绝对垄断地位。根据2005年的美国发明专利[1]，罗氏公司的毕赤酵母重组bIAP的比活力可以高达3,000U/mg(高活力碱性磷酸酶的标准)，通过特殊纯化工艺(专利只提到疏水加阳离子交换层析)可以达到7,000到10,000U/mg。然而，罗氏公司只公开了其毕赤酵母重组bIAP的编码基因的核苷酸序列，其纯品的单位发酵液产量和纯化工艺，特别是特殊纯化工艺等信息都没有公开。

当前，各国科研工作者从海洋微生物中找到了一些性能更加优越的天然碱性磷酸酶。特别是，俄罗斯科研工作者首次发现了来自盐单胞菌科(Halomonadaceae)科贝特属的海科贝特菌(Cobetia marina)的碱性磷酸酶CmAP，并提交了其基因序列(GenBank:DQ435608.1)，还在2005年报道了该酶的一些生化性质，其中包括14,580U/mg的比活力[2]。根据2018年的一篇综述[3]中的比较，CmAP是当前比活力最高的天然碱性磷酸酶(见图2)，而且其稳定性极高，应用价值极大。随后，日本科研工作者用大肠杆菌表达了重组CmAP，并于2012年报道了大肠杆菌重组CmAP的一些生化性质[4]。发现CmAP的俄罗斯科研工作者也用大肠杆菌表达了重组CmAP，并于2015年也报道了大肠杆菌重组CmAP的一些生化性质[5]。然而，俄罗斯与日本科研工作者的研究结果(特别是重组CmAP比活力方面)出现了严重的不一致，而后CmAP方面的研究和应用一直没有进展。由于海洋微生物的生存环境比较特殊(例如高盐)，其蛋白质的折叠往往需要特殊环境才能保证其分子功能，通过基因工程方法重组生产来自海洋微生物的酶很难保持其原有的活性。另外，碱性磷酸酶的某些特殊性质(例如最适pH在10以上)，也会给重组生产带来困难。因此，重组生产CmAP仍需要大量的基础性研究。

2015年，南开大学高山与广东省农科院贝锦龙等合作，在南开大学汪和睦老先生和南开大学阮吉寿教授指导下进行碱性磷酸酶的基础性研究。首先，通过对NCBI GenBank数据库的来自全部革兰氏阴性菌的碱性磷酸酶编码基因的生物信息学分析，初步判断日本科研工作者构建的大肠杆菌重组CmAP[4]没有使用大肠杆菌的信号肽，大部分都会形成包涵体，而俄罗斯科研工作者构建的大肠杆菌重组CmAP[5]的单位发酵液产量很低，再加上大肠杆菌重组CmAP因无糖基化修饰而无法用于诊断试剂，即使再优化(如低温诱导表达或包涵体复性)，其大规模生产的价值也很低。而后，南开大学高山等构建了大肠杆菌菌株验证了上述生物信息学分析的结果，并开始了汉逊酵母重组CmAP的基础性研究，主要包括：基于高深度PacBio测序获得了汉逊酵母HU-11菌株的全长基因组，根据公开的RNA-seq数据，精准地注释了全部基因；基于HU-11菌株的全长基因组和(外泌蛋白)蛋白组测序数据，分析了全部汉逊酵母外泌蛋白的性质，以及可能对(外泌)表达的重组CmAP的影响等。基于以上基础研究，最终得到以下结论：在毕赤酵母和汉逊酵母中以分泌方式表达重组CmAP可行，可以同时实现高比活力、高稳定性、高糖基化以及纯化工艺简单；关键的技术问题是作为细胞周质蛋白，重组CmAP的正确折叠的条件需要深入探索。2016年10月，南开大学高山和和睦健民公司杨珺等成功地在毕赤酵母和汉逊酵母中表达了有活性的重组CmAP，验证了项目的可行性。随后，又陆续提高了汉逊酵母重组CmAP的单位发酵液产量。

多形汉逊酵母HU-11工程菌株(见参考文献[6])，来源于多形汉逊酵母三大基础菌株之一CBS4732。CBS4732是目前国内唯一一个大规模应用到医药领域的甲基营养型酵母菌株，大连汉信生物制药有限公司的汉逊酵母重组乙型肝炎疫苗的生产菌株HBsAgU35-16-9就来自CBS4732。HU-11和HBsAgU35-16-9都是南开大学汪和睦教授亲自构建的源自野生型菌株CBS4732的营养缺陷型菌株，前者是后者的升级版，具有更高的工业应用价值。经过10多年的不间断努力，有关HU-11菌株在外源基因导入，高效表达以及菌株稳定性等方面的研究已经达到国际先进水平。特别是，2007年，汉逊酵母重组水蛭素的单位发酵液产量提高到每升发酵液产出2克纯品(见参考文献[7])；2015年，汉逊酵母重组乙肝表面抗原的单位发酵液产量提高到每升发酵液产出400毫克纯品(见参考文献[8])。2015年，南开大学高山与汪和睦教授获得了HU-11菌株的高精度的全长基因组序列(NCBI GenBank：CP073033-40)，该基因组是第一个具有全长序列的酵母基因组，其质量超过了酿酒酵母参考基因组。全长基因组的公开，为进一步开发利用汉逊酵母以及提高相关疫苗安全性奠定了基础。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是发展一种高效且稳定的表达方法，用以在酵母中表达来自海科贝特菌(Cobetia marina)的碱性磷酸酶CmAP；该方法可以用于生产具有高比活力、高稳定性、高糖基化的重组碱性磷酸酶，提高其纯品的单位发酵液产量，并简化纯化工艺。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

技术方案的第一部分是提供一种重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列以源于海科贝特菌(Cobetia marina)的碱性磷酸酶CmAP的编码基因(即GenBank:DQ435608)为模板通过以下处理步骤得到：去除所述碱性磷酸酶CmAP的编码基因的5'端96个编码信号肽的核苷酸，再去除5'端6个核苷酸，对剩余1506个核苷酸(如SEQ ID NO:2所示)进行密码子优化；所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因可以在大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母中表达，优选的，在多形汉逊酵母中表达，以达到更高的单位发酵液产量。技术方案的第一部分还提供了一种酿酒酵母交配因子Alpha1的信号肽序列的编码基因，长度为267bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

技术方案的第二部分是提供一种表达载体pUC57-OGAPO1，该载体能使所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因在多形汉逊酵母中表达；所述表达载体pUC57-OGAPO1的构建如附图1所示，包括酵母表达大片段与pUC57质粒中限制性酶切位点Sac I和EcoR I(顺时针方向)之间的片段；所述酵母表达大片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，该大片段(顺时针方向)包括：包括多形汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因启动子、插入片段、多形汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因终止子、多形汉逊酵母自主复制序列(HARS)和酿酒酵母乳清酸核苷－5'－磷酸脱羧酶(URA3)基因。所述插入片段为不超过15kb长度的核苷酸序列，优选的，为包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，该插入片段(5'→3'方向)包括：编码酶切位点的6个核苷酸GTCGAC、所述酿酒酵母交配因子Alpha1的信号肽序列的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3)、所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1)、核苷酸TGAAGATCT和编码酶切位点的6个核苷酸GGATCC。

技术方案的第三部分是提供一种生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，包括以下步骤：

1克隆一种为在酵母中表达而进行了密码子优化的重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入不同的表达载体。其中，所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述表达载体来源于多形汉逊酵母或巴斯德毕赤酵母的表达载体，优选的，来源于表达载体pUC57-OGAPO1或表达载体pPIC9K。

2转化酵母细胞，涂板，得到全部转化子。其中，所述酵母细胞来源于多形汉逊酵母或巴斯德毕赤酵母，优选的，来源于多形汉逊酵母CBS4732菌株或巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株。

3转化子筛选。对步骤2得到的全部转化子进行三轮筛选：(1)随机挑选出300株单克隆转化子，以300株单克隆转化子和含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的表达载体为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物进行凝胶电泳，紫外成像，拍照，再用软件计算图片中所有条带的平均光密度值，然后将300株单克隆转化子对应条带的平均光密度值除以含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的表达载体对应条带的平均光密度值以得到300个目的基因相对拷贝数，根据目的基因相对拷贝数从大到小对300个菌株进行排序，选取约前30个菌株，进入第二轮筛选；(2)通过摇瓶发酵检测第一轮筛选得到的约30个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对约30个菌株进行排序，选取前3个菌株进入第三轮筛选。(3)通过30升发酵罐发酵检测第二轮筛选得到的3个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对3个菌株进行排序，选取第一个菌株作为酵母重组CmAP工程菌株用于日后生产重组碱性磷酸酶CmAP，剩余的两个作为备选菌株，3个菌株用液氮或-80冰箱保存。

4表达目的蛋白：(1)取一定量的步骤3选取的酵母重组CmAP工程菌株的菌液进行发酵，多形汉逊酵母的发酵方法采用中国发明专利CN101250530B(详见参考文献[7])中描述的方法，巴斯德毕赤酵母的发酵方法采用《毕赤酵母实验手册》中描述的方法(详见参考文献[9])；(2)发酵结束，发酵液离心，取上清，微滤上清液，超滤处理，获得浓缩液，最后以超滤方式置换浓缩液中的缓冲液。

5采用两步法对步骤4获得的浓缩液进行纯化，包括：(1)阴离子交换层析，先用填料装柱，然后用缓冲液平衡层析柱，上样，再用缓冲液加NaCl溶液进行线性洗脱，最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液进入第二步纯化；(2)对第一步纯化选取的酶活最大的洗脱液进行分子筛层析，先用填料装柱，然后用缓冲液平衡层析柱，上样，再用缓冲液洗脱。最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液，以超滤方式浓缩，最终获得含有酵母重组CmAP的蛋白质溶液。

发明的有益效果

本发明提供的重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因、表达载体pUC57-OGAPO1以及汉逊酵母重组CmAP的生产方法，相较于已公开的其它酵母表达重组碱性磷酸酶的方法，可以达到的有益效果包括：

(1)本发明提出的生产汉逊酵母重组CmAP的方法，每升发酵液产出可达120毫克纯品，是目前已公开的单位发酵液产量最高的酵母表达原核碱性磷酸酶的方法；

(2)根据本发明生产的汉逊酵母重组CmAP，经常规方法纯化，比活力可达到2950U/mg，超过了毕赤酵母重组CmAP和毕赤酵母重组bIAP；

(3)根据本发明生产的汉逊酵母重组CmAP的糖基化水平超过毕赤酵母中重组bIAP的糖基化水平，因而可以减少偶联IgG抗体的使用比例，在制备发光试剂的应用中，相当于间接提高了酶的比活力。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验或生产的操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

附图说明

图1为表达载体pUC57-OGAPO1的特征示意图，表达载体pUC57-OGAPO1，包括酵母表达大片段与pUC57质粒中限制性酶切位点Sac I和EcoR I(顺时针方向)之间的片段，所述酵母表达大片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，该大片段(顺时针方向)包括：包括多形汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因启动子、插入片段(红色)、多形汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因终止子、多形汉逊酵母自主复制序列(HARS)和酿酒酵母乳清酸核苷－5'－磷酸脱羧酶(URA3)基因。

图2为三种碱性磷酸酶的SDS-PAGE电泳图，第1泳道(M)是蛋白质标记物，第2泳道是大肠杆菌重组CmAP(见实施例1)，第3泳道是毕赤酵母重组bIAP(见实施例1)，第4泳道汉逊酵母重组CmAP(见实施例3)，所有主带均加红色方框表示。

图3为转化子PCR产物凝胶电泳图，第1泳道(C)是含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的表达载体的PCR产物的条带，后面各泳道是初步筛选的34株菌株PCR产物的条带，泳道上的标号即菌株编号，各条带对应的PCR产物全部经Sanger测序验证含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因。

具体实施方式

实施例1.构建碱性磷酸酶检测体系

1.应用本发明提供的重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，制备一定量的大肠杆菌重组CmAP，用于调试各种检测设备与试剂，具体实施为：(1)克隆所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入表达载体pET-21a，转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，构建大肠杆菌重组CmAP工程菌株，其中，克隆所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入所述表达载体pET-21a的方式为：首先，合成包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，该插入片段(5'→3'方向)包括：核苷酸CAT、所述碱性磷酸酶CmAP的编码基因(即GenBank:DQ435608)的前102个核苷酸、所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)前1503个核苷酸、编码6个组氨酸的核苷酸CATCACCATCACCATCAC、编码两个终止密码子的核苷酸TAATAG和编码限制性酶切位点的核苷酸GGATCC；而后，通过限制性内切酶切割包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，再连接所述表达载体pET-21a；(2)取200微升已构建的所述大肠杆菌重组CmAP工程菌株的菌液，接种至一升LB培养基，用摇床培养(37℃220RPM)至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，37℃培养4小时后离心收菌；(3)重悬菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀经变性缓冲液溶解后再离心，取上清进行Ni柱亲和层析纯化，将洗脱液复性至缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，10％的甘油，pH＝7.0)中，浓缩后获得1毫升含有大肠杆菌重组CmAP的蛋白质溶液。

2.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带位于60kDa附近，如附图2所示，接近目的蛋白的大小(即58.8kDa)，因此，主带代表的是所述大肠杆菌重组CmAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述1毫升含有大肠杆菌重组CmAP的蛋白质溶液的浓度为1.5mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为80％。

3.碱性磷酸酶比活力的测定：采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上自动检测样品的酶活，仪器参数设定为：温度37℃，检测总时间10分钟，采样点38个，上样量为3微升，分析范围5-1500U/L；从所述1毫升含有大肠杆菌重组CmAP的蛋白质溶液(浓度为1.5mg/mL，纯度为80％)中取100微升样品，稀释20倍，进行酶活检测，重复检测三次，得到平均值1508U/L作为酶活检测值；根据公式“比活力＝酶活检测值*稀释倍数/(浓度*1000)”，最终确定所述大肠杆菌重组CmAP的比活力为1508*20/(1.5*1000)＝20.1U/mg。

4.作为下一步30升发酵(见实施例4)的预实验，小规模制备一定量的毕赤酵母重组bIAP，具体实施为：(1)克隆重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因进入表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母SMD1168细胞，构建毕赤酵母重组bIAP工程菌株，其中，所述重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；克隆所述重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因进入所述表达载体pPIC9K的方式为：首先，合成包含所述重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因的插入片段，该插入片段(5'→3'方向)包括：编码限制性酶切位点的核苷酸GAATTC、所述酿酒酵母交配因子Alpha1的信号肽序列的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)、所述重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)前1461个核苷酸、编码6个组氨酸的核苷酸CATCACCATCACCATCAC、编码两个终止密码子的核苷酸TAATAG和编码限制性酶切位点的核苷酸GGATCC；而后，通过限制性内切酶切割包含所述重组碱性磷酸酶bIAP的编码基因的插入片段，再连接所述表达载体pPIC9K；(2)取200微升已构建的毕赤酵母重组bIAP工程菌株的菌液，接种至200毫升BMGY培养基中，用摇床培养(28.5℃220RPM)至菌体OD₆₀₀为2-6，培养基更换为BMMY，加诱导剂(甲醇)后继续摇床培养(28.5℃220RPM)，之后每12小时加诱导剂一次，共诱导70小时，诱导剂加量为每100毫升总培养体积加1毫升甲醇(不灭菌)；(3)发酵结束，发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，取上清进行Ni柱亲和层析纯化，收集洗脱液，浓缩后获得3毫升含有毕赤酵母重组bIAP的蛋白质溶液。

5.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带分布在60kDa以上，如附图2所示，因存在糖基化而大于目的蛋白质的大小(即53.5kDa)，因此，主带代表的是所述毕赤酵母重组bIAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述3毫升含有毕赤酵母重组bIAP的蛋白质溶液的浓度为0.22mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为70％。

实施例2.通过筛选获得汉逊酵母重组CmAP工程菌株

1.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤1到2，克隆所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入表达载体pUC57-OGAPO1，转化酵母细胞，涂板，得到全部转化子。步骤1和2中所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；克隆所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入所述表达载体pUC57-OGAPO1的方式为：首先，合成包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；而后，通过限制性内切酶切割包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，再连接所述表达载体pUC57-OGAPO1；所述酵母细胞来自汉逊酵母HU-11菌株(详见参考文献[6])，该菌株已于2004年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.1218。

2.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤3，对步骤2得到的全部转化子进行第一轮筛选，共得到34个菌株，如附图3所示。步骤3中PCR扩增的上游引物为5'-CCACAGCACTTAAACACATCTCTGC-3'，下游引物为5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'。

3.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤3，通过摇瓶发酵检测第一轮筛选得到的34个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，进行第二轮筛选，具体实施为：(1)生长时相，向每个150毫升摇瓶加入一个菌株的200微升菌液和25毫升的生长培养基(含1g/100mL酵母提取物，2g/100mL大豆蛋白胨和2g/100mL葡萄糖)，用摇床(32℃200RPM)培养24小时，收集发酵液；(2)表达时相，发酵液离心(3000RPM5分钟)，去培养基，收细胞，加无菌水后离心，弃上清，接种至25毫升的表达培养基[含1.34g/100mL的YNB(含硫酸铵0.5g/100mL)培养基，PBS缓冲液(100mM，pH＝6)]，加诱导剂(甲醇)后继续摇床培养(32℃200RPM)，之后每12小时加诱导剂一次，共诱导96小时，诱导剂加量为每100毫升总培养体积加0.5毫升甲醇(不灭菌)；(3)发酵结束，发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，0.22微米微滤上清液，再用30kDa超滤处理，最终得到2毫升浓缩液，超滤处理后总体积不够2毫升的浓缩液，用去离子水补充到2毫升；(4)取10微升浓缩液，按一定比例稀释后，采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上检测浓缩液的酶活，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对34个菌株进行排序，选取前3个菌株，即3、10和81号，进入第三轮筛选。

4.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤3，通过30升发酵罐发酵检测第二轮筛选得到的3个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，进行第三轮筛选，具体实施为：(1)分别取200微升的第二轮筛选得到的3个菌株的菌液进行发酵，发酵方法采用中国发明专利CN101250530B(详见参考文献[7])中描述的方法；(2)发酵结束，取20升发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，0.22微米微滤上清液，再用30kDa超滤处理，最终得到2升浓缩液，超滤处理后总体积不够2升的浓缩液，用去离子水补充到2升；(3)取10微升浓缩液，按一定比例稀释后，采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上检测浓缩液的酶活，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对3个菌株进行排序，选取第一个菌株(即10号)作为所述汉逊酵母重组CmAP工程菌株用于日后生产重组碱性磷酸酶CmAP，剩余的两个作为备选菌株，3个菌株用液氮或-80冰箱保存。

实施例3.汉逊酵母重组CmAP的表达、纯化与鉴定

1.作为下一步30升发酵(见实施例4)的预实验，小规模制备一定量的汉逊酵母重组CmAP，具体实施为：(1)取200微升在实施例2中已构建的所述汉逊酵母重组CmAP工程菌株的菌液，接种至200毫升的生长培养基(含1g/100mL酵母提取物，2g/100mL大豆蛋白胨和2g/100mL葡萄糖)，用摇床(32℃200RPM)培养24小时，收集发酵液；(2)发酵液离心(3000RPM5分钟)，收细胞，加无菌水后离心，弃上清，再接种至200毫升的表达培养基[含1.34g/100mL的YNB(含硫酸铵0.5g/100mL)培养基，PBS缓冲液(100mM，pH＝6)]，加诱导剂(甲醇)后继续摇床培养(32℃200RPM)，之后每12小时加诱导剂一次，共诱导48小时，诱导剂加量为每100毫升总培养体积加0.5毫升甲醇(不灭菌)；(3)发酵结束，发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，0.22微米微滤上清液，再用30kDa超滤处理，最终获得20毫升浓缩液，再以超滤方式置换缓冲液为0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl溶液。

2.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤5，采用两步法在赛谱蛋白纯化仪SCG100-V2上对上一步获得的浓缩液进行纯化，具体实施为：(1)阴离子交换层析，先用填料DEAE Sepharose 6Fast Flow(Cytiva，USA)装柱，然后用5个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl)平衡层析柱，上样5个柱体积，再用5个柱体积的缓冲液加NaCl溶液(浓度0.05-0.5M)进行线性洗脱，最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液进入下一步纯化；(2)对第一步纯化选取的酶活最大的洗脱液进行分子筛层析，先用填料Sephacryl S-200HR(Sigma，USA)装柱，然后用2个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl加0.1M的NaCl)平衡层析柱，上样0.02个柱体积，上样液流速为10cm/h(截面积为5.13平方厘米)，温度为室温，再用2个柱体积的缓冲液以流速20cm/h洗脱。最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液，以超滤方式浓缩，浓缩后获得1毫升含有汉逊酵母重组CmAP的蛋白质溶液。

3.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带分布在60kDa以上，如附图2所示，因存在糖基化而大于目的蛋白质的大小(即54.1kDa)，因此，主带代表的是所述汉逊酵母重组CmAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述1毫升含有汉逊酵母重组CmAP的蛋白质溶液的浓度为1.4mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为84％。从附图2中可以看到，汉逊酵母重组CmAP的电泳条带的面积大于毕赤酵母重组bIAP的电泳条带的面积，证明了汉逊酵母重组CmAP的糖基化水平大于毕赤酵母重组bIAP的糖基化水平。

实施例4.汉逊酵母重组CmAP的性能评估

1.根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤4到5，生产一定量的汉逊酵母重组CmAP，用于酶比活力等指标的测定和性能评估。步骤4具体实施为：(1)取200微升在实施例2中已构建的所述汉逊酵母重组CmAP工程菌株的菌液，用30升发酵罐(百伦，上海)进行发酵，发酵方法采用中国发明专利CN101250530B(详见参考文献[7])中描述的方法；(2)发酵结束，取20升发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，0.22微米微滤上清液，再用50kDa超滤处理，获得2升浓缩液，最后以超滤方式置换缓冲液为0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl溶液。步骤5具体实施为：(1)阴离子交换层析，先用填料Q Sepharose 6Fast Flow(Cytiva，USA)装柱，然后用5个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl)平衡层析柱，上样5个柱体积，再用5个柱体积的缓冲液加NaCl溶液(浓度0.05-0.5M)进行线性洗脱，最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液进入下一步纯化；(2)对第一步纯化选取的酶活最大的洗脱液进行分子筛层析，先用填料Sephacryl S-100HR(Sigma，USA)装柱，然后用2个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl加0.1M的NaCl)平衡层析柱，上样0.02个柱体积，上样液流速为10cm/h(截面积为5.13平方厘米)，温度为室温，再用2个柱体积的缓冲液以流速20cm/h洗脱。最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液，以超滤方式浓缩，浓缩后获得1升含有汉逊酵母重组CmAP的蛋白质溶液。

2.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带分布在60kDa以上，如附图2所示，因存在糖基化而大于目的蛋白质的大小(即54.1kDa)，因此，主带代表的是所述汉逊酵母重组CmAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述1升含有汉逊酵母重组CmAP的蛋白质溶液的浓度为2.4mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为90％。

3.碱性磷酸酶活力的测定：采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上自动检测样品的酶活，仪器参数设定同实施例1；从所述1升含有汉逊酵母重组CmAP的蛋白质溶液(浓度为2.4mg/mL，纯度为90％)中取100微升样品，稀释5000倍，进行酶活检测，重复检测三次后，得到平均值1416U/L作为酶活检测值；根据公式“比活力＝酶活检测值*稀释倍数/(浓度*1000)”，最终确定所述汉逊酵母重组CmAP的比活力为1416*5000/(2.4*1000)＝2950U/mg。

4.为与汉逊酵母重组CmAP进行性能对比，制备一定量的毕赤酵母重组CmAP，具体实施为：(1)克隆重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母SMD1168细胞，构建毕赤酵母重组CmAP工程菌株，其中，所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；克隆所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入所述表达载体pPIC9K的方式为：首先，合成包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，该插入片段(5'→3'方向)包括：编码限制性酶切位点的核苷酸GAATTC、所述酿酒酵母交配因子Alpha1的信号肽序列的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3)、所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1)、核苷酸TGAAGATCT和编码酶切位点的6个核苷酸GGATCC；而后，通过限制性内切酶切割包含所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的插入片段，再连接所述表达载体pPIC9K；(2)取200微升已构建的毕赤酵母重组CmAP工程菌株的菌液，用30升发酵罐(百伦，上海)进行发酵，发酵方法采用《毕赤酵母实验手册》中描述的方法(详见参考文献[9])；(3)发酵结束，取20升发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清，0.22微米微滤上清液，再用50kDa超滤处理，获得2升浓缩液，最后以超滤方式置换缓冲液为0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl溶液。然后，根据本发明提供的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法的步骤5，对上一步获得的浓缩液进行纯化，具体实施为：(1)阴离子交换层析，先用填料Q Sepharose 6Fast Flow(Cytiva，USA)装柱，然后用5个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl)平衡层析柱，上样5个柱体积，再用5个柱体积的缓冲液加NaCl溶液(浓度0.05-0.5M)进行线性洗脱，最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液进入下一步纯化；(2)对第一步纯化选取的酶活最大的洗脱液进行分子筛层析，先用填料Sephacryl S-100HR(Sigma，USA)装柱，然后用2个柱体积的缓冲液(0.02M浓度pH＝8.6的Tris-HCl加0.1M的NaCl)平衡层析柱，上样0.02个柱体积，上样液流速为10cm/h(截面积为5.13平方厘米)，温度为室温，再用2个柱体积的缓冲液以流速20cm/h洗脱。最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液，以超滤方式浓缩，浓缩后获得1升含有毕赤酵母重组CmAP的蛋白质溶液。

5.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带分布在60kDa以上，因存在糖基化而大于目的蛋白质的大小(即53.5kDa)，因此，主带代表的是所述毕赤酵母重组CmAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述1升含有毕赤酵母重组CmAP的蛋白质溶液的浓度为1.3mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为90％。

6.碱性磷酸酶比活力的测定：采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上自动检测样品的酶活，仪器参数设定同实施例1；从所述1升含有所述毕赤酵母重组CmAP的蛋白质溶液(浓度为1.3mg/mL，纯度为90％)中取100微升样品，稀释2500倍，进行酶活检测，重复检测三次，得到平均值1176U/L作为酶活检测值；根据公式“比活力＝酶活检测值*稀释倍数/(浓度*1000)”，最终确定所述毕赤酵母重组bIAP的比活力为1176*2500/(1.3*1000)＝2,261U/mg。

7.为与汉逊酵母重组CmAP进行性能对比，制备一定量的毕赤酵母重组bIAP，具体实施为：(1)取200微升在实施例1中已构建的所述毕赤酵母重组bIAP工程菌株的菌液，用30升发酵罐(百伦，上海)进行发酵，发酵方法采用《毕赤酵母实验手册》中描述的方法(详见参考文献[9])；(2)发酵结束，取20升发酵液离心(4200RPM10分钟)，取上清进行Ni柱亲和层析纯化，收集洗脱液，再进行分子筛层析(方法同实施例3)，收集洗脱液，浓缩后获得1升含有毕赤酵母重组bIAP的蛋白质溶液。

8.碱性磷酸酶的鉴定以及浓度和纯度的测定：上一步获得的蛋白质溶液的SDS-PAGE电泳显示，唯一的主带分布在60kDa以上，因存在糖基化而大于目的蛋白质的大小(即53.5kDa)，因此，主带代表的是所述毕赤酵母重组bIAP；用Bradford方法(碧云天，上海)测定所述1升含有毕赤酵母重组bIAP的蛋白质溶液的浓度为1.1mg/mL；用高效液相色谱(HPLC)测定其纯度为90％。

9.碱性磷酸酶比活力的测定：采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701上自动检测样品的酶活，仪器参数设定同实施例1；从所述1升含有所述毕赤酵母重组bIAP的蛋白质溶液(浓度为1.1mg/mL，纯度为90％)中取100微升样品，稀释2500倍，进行酶活检测，重复检测三次，得到平均值916U/L作为酶活检测值；根据公式“比活力＝酶活检测值*稀释倍数/(浓度*1000)”，最终确定所述毕赤酵母重组bIAP的比活力为916*2500/(1.1*1000)＝2,081U/mg。

10.根据本发明生产的汉逊酵母重组CmAP的比活力可以达到2,950U/mg，单位发酵液产量达到每升发酵液产出120mg纯品(纯度为90％)，每升发酵液可以产出374,400U的总活力；而作为对照的毕赤酵母重组CmAP的比活力可以达到2261U/mg，单位发酵液产量达到每升发酵液产出65mg纯品(纯度为90％)，每升发酵液可以产出146,965U的总活力。目前已公开的性能最高的酵母表达碱性磷酸酶是罗氏公司的毕赤酵母重组bIAP(详见背景技术)。我们采用本领域的常规方法，表达并纯化了毕赤酵母重组bIAP，其比活力可以达到2,081U/mg，单位发酵液产量达到每升发酵液产出55mg纯品(纯度为90％)，每升发酵液可以产出114,455U的总活力。因此，根据本发明生产的汉逊酵母重组CmAP的性能超过了毕赤酵母重组CmAP和毕赤酵母重组bIAP。

参考文献

1.Rainer M,Johann PT,Frank G,Werner H,Stephan G,Hellmut E,Thomas K,Bettina B(2003)Expression of alkaline phosphatase in yeast.US Patent:US006884602B2(26,April,2005).

2.E.Y.Plisova,L.A.Balabanova,E.P.Ivanova,V.B.Kozhemyako,V.V.Mikhailov,E.V.Agafonova and V.A.Rasskazov,A Highly Active AlkalinePhosphatase from the Marine Bacterium Cobetia.Marine Biotechnology,2005.7(3):p.173-178.

3.S.Sharifian,A.Homaei,S.K.Kim and M.Sattari,Production of newfoundalkaline phosphatases from marine organisms with potential functions andindustrial applications.Process Biochemistry,2017.64(1):p.103-115.

4.E.Nasu,A.Ichiyanagi and K.Gomi,Cloning and expression of a highlyactive recombinant alkaline phosphatase from psychrotrophic Cobetiamarina.Biotechnology letters,2012.34(2):p.321-328.

5.V.Golotin,L.Balabanova,G.Likhatskaya and V.Rasskazov,Recombinantproduction and characterization of a highly active alkaline phosphatase frommarine bacterium Cobetia marina.Marine Biotechnology,2015.17(2):p.130-143.

6.汪和睦等.一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用[P].中国发明专利:CN100347287C，申请日：2004-09-30.

7.汪和睦等.一种重组水蛭素编码基因与应用[P].中国发明专利:CN101250530B，申请日：2008-03-31.

8.汪和睦等.一种基于重组汉逊酵母的高剂量乙型肝炎疫苗[P].中国发明专利:CN105797151A，申请日：2016-03-25.

9.James M.Cregg..Pichia protocols.Methods in Molecular Biology.2007,Totowa:Humana Press.

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 在酵母中表达原核碱性磷酸酶

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcaagaacg tcattctgat gattggagac ggcatggggc cccagcaagt tggcatgctg 60

gagacatacg ccaaccgtgc gccagattcg atctatcaag gaagatcgac ggcactctac 120

cagctggcta aggaaggcgt ggtgggcgct tcgttgactc accctgaaga cgccgtggtt 180

gtggattcgg cctgctccgc gactcagctc tcgacgggta tcttcaccgg cggagaggtg 240

atcggcatcg attccgaggg taaccgggtg gaaaccgtcc ttgagcttgc caaacgagtc 300

ggcaaggcca ccggattggt gtccgatacg cgcctgaccc acgcgactcc ggcggccttc 360

gccgctcacc agccgcatag atctctggag aatgccattg ccgaagacat gctcatgact 420

ggaccggacg tcatgctgtc gggcggattg agacacttcg tgccatactc cgtctctgag 480

cctggagaaa gcgcgggctc ggtcgagacg ctgatgcaag gtgcctggtc gccaacctcc 540

aagaggaagg atgaacgaaa cctgctccag gaagctgcag accaaggcta tggactcgcc 600

tttacgagag atcagatggc cgcactcaac ggcaccaagg tacttggact cttcgccaac 660

tcgggtatgg cggatggtat cagctttaga gatagccatg acgacccaca gagacagcag 720

cctacccttc atgagatgac ccaaaaagca ctgtccatgc ttgaacagga tgacgatggt 780

ttctttctta tggtcgaggg tggccagatc gactgggccg ctcattccaa cgatgctggc 840

accatgctca atgaactgat caagttcgat gaggccgtgc aaggtgtctt tgactgggcc 900

cgagaccgag acgatacaat tatcctggtt acggccgacc atgagacggg agcattcggc 960

ttctcttatt ccagcgccaa tctccctgca gcgcagaaga aatccggccc tgccttcgca 1020

gaccaggact acgctcccaa tttcaacttt ggtgacttct cgattcttga ctctctctat 1080

gagcagaagc agacctacta cgagctgctc tctgactttg aggctcttcc acaaggtgag 1140

agaacacctg ctcgcttgat ggcggctgtc aacggcaact ctgatttcca gattaccgaa 1200

gcccaggcag ctgaagtact cgccaacaag cccaacccct accacgtgga cggacattct 1260

tacctcgggg tcagcgaggt tcctgcagtt cacgactttg acgcattctt cccctacaac 1320

gatagaggca acctgcttgc gcgggcattg gctacacagc aaaataccgt ctgggggact 1380

ggtacgcaca cccacacgcc agttaacgtc tttgcatggg ggccagccaa cgacatcttg 1440

ccagtctctt ccatcctgca ccactccgag atcggacaat accttaagac agttgtagcg 1500

aagtaa 1506

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA

<213> 海科贝特菌(Cobetia marina)

<400> 2

atcaagaatg tcattctgat gattggcgat ggcatggggc cccagcaggt tggcatgctg 60

gagacatacg ccaatcgtgc gccggattcg atatatcaag ggcgttcgac ggcactctac 120

cagctggcga aggaaggcgt ggtgggcgct tcattgactc accctgaaga tgccgtggta 180

gtggattcgg cctgttcagc gactcagctc tcgacgggta tcttcaccgg gggcgaggtg 240

atcggcatag attcagaggg taatcgggtg gaaaccgtcc tcgagcttgc caaacgagtc 300

ggcaaggcca ccggattggt gtccgatacg cgcctgaccc acgcgactcc ggcggccttc 360

gccgcccacc agccgcatcg ttcactggaa aatgccattg ccgaagacat gctcatgact 420

gggccggatg tcatgctgtc gggagggttg cgtcacttcg tgccatactc cgtcagtgag 480

ccgggggaaa gcgcgggcag tgtcgagacg ctgatgcaag gtgcctggtc gccaacctcc 540

aagcgcaagg atgaacgaaa tctgctccag gaagctgcag atcaaggcta tgggctagcc 600

tttacgcgtg atcagatggc cgcactcaat ggcaccaagg tattggggct attcgccaac 660

tcgggtatgg cggatggtat cagctttcga gatagccatg atgacccaca gcgtcagcag 720

ccgaccctgc atgagatgac ccaaaaagca ctgtcaatgc ttgaacagga tgatgatggt 780

ttctttttga tggtcgaggg tggccagatc gactgggccg cgcattccaa tgatgcgggc 840

accatgctca atgaactgat caagttcgat gaggccgtgc aaggtgtctt tgactgggcg 900

cgagaccgag acgatacaat aatcctggta acggccgacc atgagacggg agcattcggc 960

ttcagttatt ccagcgccaa tttaccggca gcgcagaaga aatcaggccc tgcattcgca 1020

gatcaggatt acgctcccaa tttcaatttt ggtgacttct cgattctgga cagtctctat 1080

gagcagaagc agacctatta cgagctgctc agtgatttcg aggcactacc gcaaggtgag 1140

cgcacaccgg ctcgcttgat ggcggctgtc aatggcaata gtgacttcca gattaccgaa 1200

gcccaggcag ctgaagtact ggccaacaag cccaacccct atcatgtgga tggacatagt 1260

tacctcgggg tcagcgaggt gccggcagtt cacgacttcg acgccttctt cccctataac 1320

gatcgcggca acctgctggc gcgggcattg gcgacacagc aaaacaccgt ctgggggact 1380

ggtacgcaca cccatacgcc agtcaacgtc tttgcatggg ggccagccaa cgacatcttg 1440

ccggtctctt ccatcctgca ccattccgag ataggacagt atctgaagac agtggtagcg 1500

aagtaa 1506

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagattcc cttccatctt taccgccgtg ctgttcgcag cctcttccgc cctggccgct 60

ccagttaata ccacgacaga ggacgagacc gctcagatcc ccgctgaggc cgtcatcggt 120

tactctgacc ttgagggaga cttcgacgtg gctgttttgc cattttccaa ctcgactaat 180

aatggacttc tgttcatcaa caccactatt gcctcgattg ccgcgaaaga agagggcgtc 240

agcctcgaga aaagagaggc cgaggcc 267

<210> 4

<211> 4914

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattcccat tctatgaggc catctcgacg gtgttccttg agtgcgtact ccactctgta 60

gcgactggac atctccagac tgggcttgct gtgctggatg caccaattaa ttgttgccgc 120

atgcatcctt gcaccgcaag tttttaaaac ccactcgctt tagccgtcgc gtaaaacttg 180

tgaatctggc aactgagggg gttctgcagc cgcaaccgaa cttttcgctt cgaggacgca 240

gctggatggt gtcatgtgag gctctgtttg ctggcgtagc ctacaacgtg accttgccta 300

accggacggc gctacccact gctgtctgtg cctgctacca gaaaatcacc agagcagcag 360

agggccgatg tggcaactgg tggggtgtcg gacaggctgt ttctccacag tgcaaatgcg 420

ggtgaaccgg ccagaaagta aattcttatg ctaccgtgca gtgactccga catccccagt 480

ttttgcccta cttgatcaca gatggggtca gcgctgccgc taagtgtacc caaccgtccc 540

cacacggtcc atctataaat actgctgcca gtgcacggtg gtgacatcaa tctaaagtac 600

aaaaacgtcg acatgagatt cccttccatc tttaccgccg tgctgttcgc agcctcttcc 660

gccctggccg ctccagttaa taccacgaca gaggacgaga ccgctcagat ccccgctgag 720

gccgtcatcg gttactctga ccttgaggga gacttcgacg tggctgtttt gccattttcc 780

aactcgacta ataatggact tctgttcatc aacaccacta ttgcctcgat tgccgcgaaa 840

gaagagggcg tcagcctcga gaaaagagag gccgaggcca tcaagaacgt cattctgatg 900

attggagacg gcatggggcc ccagcaagtt ggcatgctgg agacatacgc caaccgtgcg 960

ccagattcga tctatcaagg aagatcgacg gcactctacc agctggctaa ggaaggcgtg 1020

gtgggcgctt cgttgactca ccctgaagac gccgtggttg tggattcggc ctgctccgcg 1080

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aaccgggtgg aaaccgtcct tgagcttgcc aaacgagtcg gcaaggccac cggattggtg 1200

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tctctggaga atgccattgc cgaagacatg ctcatgactg gaccggacgt catgctgtcg 1320

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ctccctgcag cgcagaagaa atccggccct gccttcgcag accaggacta cgctcccaat 1920

ttcaactttg gtgacttctc gattcttgac tctctctatg agcagaagca gacctactac 1980

gagctgctct ctgactttga ggctcttcca caaggtgaga gaacacctgc tcgcttgatg 2040

gcggctgtca acggcaactc tgatttccag attaccgaag cccaggcagc tgaagtactc 2100

gccaacaagc ccaaccccta ccacgtggac ggacattctt acctcggggt cagcgaggtt 2160

cctgcagttc acgactttga cgcattcttc ccctacaacg atagaggcaa cctgcttgcg 2220

cgggcattgg ctacacagca aaataccgtc tgggggactg gtacgcacac ccacacgcca 2280

gttaacgtct ttgcatgggg gccagccaac gacatcttgc cagtctcttc catcctgcac 2340

cactccgaga tcggacaata ccttaagaca gttgtagcga agtaatgaag atctggatcc 2400

ccctcgcgga cttgccagat tctaaggaga cgtggaagga cataccgctt ttgagaagcg 2460

tgtttgaaaa tagttctttt tctggtttat atcgtttatg aagtgacgag atgaaaagct 2520

gaaatagcga gtataggaaa atttaatgaa aattaaatta aatattttct taggctatta 2580

gtcaccttca aaatgccggc cgcttctaag aacgttgtca tgatcgacaa ctacgactcg 2640

tttacctgga acctgtacga gtacctgtgt caggagggag ccaatgtcga ggttttcagg 2700

aacgatcaga tcaccattcc ggagattgag cagaagcttc ccgcgactcg gcgttcactt 2760

tcgagctatt atcaacgccg gaatacgtca gaaacagccg tgccccaggg accagaaagc 2820

ctactggtga gtatgttctt tcgtgtgatt tttccgagga tgagaacgac gataacgagc 2880

acaactcgga gtcggaggac acgcttattg cgttgaacgc agccaacatc agcaggctgt 2940

caagactgag tatggccaca gagctggatt tctcggcctc atactcaaag acgtttagta 3000

aactccgtct gccagaaatt gctgacgagg atgtataata atagatgaat tacgaacaat 3060

tgtagttcaa aaaaatttag taacaatatt gtgtagatga cagatttgct gaaaccagtg 3120

aactccaata aaccactcac cgctacccaa gagaaacaga tcagagtgct agggcttgtt 3180

tcagagtact acaacgttta ccagatgctt gagcaagttc tcaaacgcgg gtttgtcgtc 3240

ctgcagcccg cgactcggcg ttcactttcg agctattatc aacgccggaa tacgtcagaa 3300

acagccgtgc cccagggacc agaaagccta ctggtgagta tgttctttcg tgtgattttt 3360

ccgaggatga gaacgacgat aacgagcaca actcggagtc ggaggacacg cttattgcgt 3420

tgaacgcagc caacatcagc aggctgtcaa gactgagtat ggccacagag ctggatttct 3480

cggcctcata ctcaaagacg tttagtaaac tccgtctgcc agaaattgct gacgaggatg 3540

tataataata gatgaattac gaacaattgt agttcaaaaa aatttagtaa caatattgtg 3600

tagatgacag atttgctgaa accagtgaac tccaataaac cactcaccgc tacccaagag 3660

aaacagatca gagtgctagg gcttgtttca gagtactaca acgtttacca gatgcttgag 3720

caagttctca aacgcgggtt tgtcgtcggt acctttcaat tcatcatttt ttttttattc 3780

ttttttttga tttcggtttc cttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg aacagaagga 3840

agaacgaagg aaggagcaca gacttagatt ggtatatata cgcatatgta gtgttgaaga 3900

aacatgaaat tgcccagtat tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct gcaggaaacg 3960

aagataaatc atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt 4020

tgctgccaag ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga 4080

tgttcgtacc accaaggaat tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt 4140

actaaaaaca catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct 4200

aaaggcatta tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat 4260

tggtaataca gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga 4320

cattacgaat gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc 4380

agaagaagta acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg 4440

ctccctatct actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga 4500

ttttgttatc ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttacgattg 4560

gttgattatg acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta 4620

tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact 4680

atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga 4740

agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg 4800

tatactaaac tcacaaatta gagcttcaat ttaattatat cagttattac ccgggaatct 4860

cggtcgtaat gatttttata atgacgaaaa aaaaaaattg ggaagaaaga gctc 4914

<210> 5

<211> 1794

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgacatga gattcccttc catctttacc gccgtgctgt tcgcagcctc ttccgccctg 60

gccgctccag ttaataccac gacagaggac gagaccgctc agatccccgc tgaggccgtc 120

atcggttact ctgaccttga gggagacttc gacgtggctg ttttgccatt ttccaactcg 180

actaataatg gacttctgtt catcaacacc actattgcct cgattgccgc gaaagaagag 240

ggcgtcagcc tcgagaaaag agaggccgag gccatcaaga acgtcattct gatgattgga 300

gacggcatgg ggccccagca agttggcatg ctggagacat acgccaaccg tgcgccagat 360

tcgatctatc aaggaagatc gacggcactc taccagctgg ctaaggaagg cgtggtgggc 420

gcttcgttga ctcaccctga agacgccgtg gttgtggatt cggcctgctc cgcgactcag 480

ctctcgacgg gtatcttcac cggcggagag gtgatcggca tcgattccga gggtaaccgg 540

gtggaaaccg tccttgagct tgccaaacga gtcggcaagg ccaccggatt ggtgtccgat 600

acgcgcctga cccacgcgac tccggcggcc ttcgccgctc accagccgca tagatctctg 660

gagaatgcca ttgccgaaga catgctcatg actggaccgg acgtcatgct gtcgggcgga 720

ttgagacact tcgtgccata ctccgtctct gagcctggag aaagcgcggg ctcggtcgag 780

acgctgatgc aaggtgcctg gtcgccaacc tccaagagga aggatgaacg aaacctgctc 840

caggaagctg cagaccaagg ctatggactc gcctttacga gagatcagat ggccgcactc 900

aacggcacca aggtacttgg actcttcgcc aactcgggta tggcggatgg tatcagcttt 960

agagatagcc atgacgaccc acagagacag cagcctaccc ttcatgagat gacccaaaaa 1020

gcactgtcca tgcttgaaca ggatgacgat ggtttctttc ttatggtcga gggtggccag 1080

atcgactggg ccgctcattc caacgatgct ggcaccatgc tcaatgaact gatcaagttc 1140

gatgaggccg tgcaaggtgt ctttgactgg gcccgagacc gagacgatac aattatcctg 1200

gttacggccg accatgagac gggagcattc ggcttctctt attccagcgc caatctccct 1260

gcagcgcaga agaaatccgg ccctgccttc gcagaccagg actacgctcc caatttcaac 1320

tttggtgact tctcgattct tgactctctc tatgagcaga agcagaccta ctacgagctg 1380

ctctctgact ttgaggctct tccacaaggt gagagaacac ctgctcgctt gatggcggct 1440

gtcaacggca actctgattt ccagattacc gaagcccagg cagctgaagt actcgccaac 1500

aagcccaacc cctaccacgt ggacggacat tcttacctcg gggtcagcga ggttcctgca 1560

gttcacgact ttgacgcatt cttcccctac aacgatagag gcaacctgct tgcgcgggca 1620

ttggctacac agcaaaatac cgtctggggg actggtacgc acacccacac gccagttaac 1680

gtctttgcat gggggccagc caacgacatc ttgccagtct cttccatcct gcaccactcc 1740

gagatcggac aataccttaa gacagttgta gcgaagtaat gaagatctgg atcc 1794

<210> 6

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcatccctg ctgaggaaga gaaccccgcc ttctggaacc gccaggcagc ccaggccctt 60

gatgttgcca aaaagttgca gccgatccag actgctgcca agaatgtcat cctcttcttg 120

ggagatggaa tgggtgtgcc aacggtcaca gccactcgaa tcttgaaggg acagatgaac 180

ggcaaactgg gacctgaaac accactggct atggaccaat tcccatacgt cgctctctcc 240

aagacgtaca acgtggacag acaggtgcca gacagcgcag gcactgccac tgcctacctg 300

tgtggagtca aaggaaacta cagaaccatc ggtgtctcgg ctgccgcccg ctacaaccag 360

tgcaacacga cacgaggtaa tgaggtcacg tctgtgatta accgggccaa gaaagcaggt 420

aaggccgtcg gagttgtgac caccaccagg gttcagcatg cctctccagc cggagcctac 480

gcgcacacgg tgaaccgaaa ctggtactct gatgccgacc tgcctgctga tgcacagaag 540

aacggctgcc aggacatcgc cgcacaactg gtctacaaca tggatattga tgtcatcctg 600

ggtggcggac gaatgtatat gtttcctgag ggcacgccag accctgaata cccagatgat 660

gcctcggtga acggagtcag aaaggacaag cagaacctgg ttcaggaatg gcaggccaag 720

caccagggag cccagtatgt gtggaataga actgcgctcc ttcaggctgc cgacgactcc 780

tcggttacgc acctcatggg cctctttgag ccagcagaca tgaagtacaa cgtgcagcaa 840

gaccacacca aggacccgac cctcgcggag atgaccgaag ctgccctgca agttctgagc 900

aggaacccca gaggcttcta cctcttcgtc gagggtggaa gaattgacca cggtcaccac 960

gatggcaagg cttacatggc actgactgag gctatcatgt ttgacaatgc tatcgccaag 1020

gctaacgagc ttacttcgga actggacacg ctgatccttg tcactgctga ccactcccat 1080

gtcttctctt ttggtggcta cacactgcgt ggaacctcca ttttcggtct ggcccccggc 1140

aaggcattgg actctaagtc ctacacctcc atcctctatg gcaacggccc aggctatgcg 1200

cttggcggtg gatcgagacc cgatgtgaac ggctccactt ctgaggaacc ttcttacaga 1260

caacaggcgg ctgtgccact ggcttccgag acccacggtg gcgaagacgt ggcggtgttc 1320

gctcggggac cacaggcgca cctcgtgcat ggcgtgcaag aggagacctt cgtcgcgcac 1380

atcatggcct ttgctggctg cgttgagcca tacaccgact gcaacctgcc agcccccgcc 1440

actgccacct ctatccccga ctaa 1464

Claims

1.一种重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因在构建重组碱性磷酸酶多形汉逊酵母工程菌株中的应用。

3.一种表达载体pUC57-OGAPO1，其特征在于，包括酵母表达大片段与pUC57质粒中限制性酶切位点Sac I和EcoR I顺时针方向之间的片段；所述酵母表达大片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.权利要求3所述的表达载体pUC57-OGAPO1在构建重组碱性磷酸酶多形汉逊酵母工程菌株中的应用。

5.一种生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）克隆一种为在酵母中表达而进行了密码子优化的重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因进入不同的表达载体，其中，所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

（2）转化酵母细胞，涂板，得到全部转化子；

（3）转化子筛选，获得酵母重组CmAP工程菌株；

（4）表达目的蛋白：取一定量的步骤（3）获得的酵母重组CmAP工程菌株的菌液进行发酵，发酵液离心，取上清，微滤上清液，超滤处理，获得浓缩液；

（5）采用两步法对步骤（4）获得的浓缩液进行纯化，其特征在于，包括阴离子交换层析和分子筛层析；

所述的酵母细胞来源于多形汉逊酵母。

6.权利要求5所述的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，其特征在于，所述的表达载体来源于多形汉逊酵母的表达载体。

7.权利要求5所述的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，其特征在于，所述的转化子筛选包括以下步骤：（1）随机挑选出300株单克隆转化子，以300株单克隆转化子和含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的表达载体为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物进行凝胶电泳，紫外成像，拍照，再用软件计算图片中所有条带的平均光密度值，然后将300株单克隆转化子对应条带的平均光密度值除以含有所述重组碱性磷酸酶CmAP的编码基因的表达载体对应条带的平均光密度值以得到300个目的基因相对拷贝数，根据目的基因相对拷贝数从大到小对300个菌株进行排序，选取前30个菌株，进入第二轮筛选；（2）通过摇瓶发酵检测第一轮筛选得到的30个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对30个菌株进行排序，选取前3个菌株进入第三轮筛选；（3）通过30升发酵罐发酵检测第二轮筛选得到的3个菌株的发酵液的碱性磷酸酶活性，重复检测三次，取平均值作为酶活检测值，根据酶活检测值从大到小对3个菌株进行排序，选取第一个菌株作为酵母重组CmAP工程菌株用于日后生产重组碱性磷酸酶CmAP，剩余的两个作为备选菌株，3个菌株用液氮或-80冰箱保存。

8.权利要求5所述的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，其特征在于，所述的超滤处理使用30-50 kDa的膜包进行截留。

9.权利要求5所述的生产重组碱性磷酸酶CmAP的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析包括以下步骤：先用填料装柱，然后用缓冲液平衡层析柱，上样，再用缓冲液加浓度为0.05-0.5M的NaCl溶液进行线性洗脱，最后收集全部洗脱峰对应的洗脱液，分别检测各洗脱峰对应的洗脱液的碱性磷酸酶活性，选取酶活最大的洗脱液进入第二步纯化。