CN115160414A

CN115160414A - SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN115160414A
Application number: CN202110371805.7A
Authority: CN
Inventors: 刘波; 吴军; 王甜甜; 孙鹏; 巩新; 侯旭宸; 张斌; 徐惠芳; 武建鑫
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其构建的生产菌可以实现冠状病毒SARS‑CoV‑2南非V2型突变株S蛋白受体结合区在毕赤酵母细胞的高效表达，且具有生长快、易于大规模生产、安全性高等特点。重组表达所得的冠状病毒SARS‑CoV‑2南非V2型突变株S蛋白受体结合区不存在过度糖基化的问题，以其免疫小鼠后能够产生高滴度的抗SARS‑CoV‑2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的抗体，且能够中和SARS‑CoV‑2突变株病毒。因此在新型突变株冠状病毒传染等应急条件下，有利于新型突变后冠状病毒疫苗高效研发和大规模生产。

Description

SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法及其应用。

背景技术

2002-2003年爆发的SARS-CoV和2012年爆发的MERS-CoV分别导致了10％和35％的病死率。多种冠状病毒突破种属界限传播给人类，导致约30％的呼吸道感染，并造成巨大损失。2019年12月爆发的新型冠状病毒SARS-CoV-2已在全球上百个国家和地区传播，截止到2021年3月16日，已有超过1.2亿人感染，其中260多万人死亡，2020年3月11日，WHO宣布新冠疫情全球大流行。这提示我们，冠状病毒越来越威胁人类健康，相关疫苗和药物的研究是迫切的任务。

S蛋白是冠状病毒表面唯一的蛋白，属于Ⅰ型膜蛋白，并且被N-糖基化修饰，其单体由约1300个氨基酸构成，单体折叠后聚合形成同源三聚体。S蛋白单体由N末端的S1亚基和C末端的S2亚基构成，其中S1亚基负责与宿主细胞受体结合，病毒被宿主细胞摄取后，S2亚基靠近融合肽的S2位点被宿主蛋白酶切割，触发S蛋白构象改变，进而S2亚基介导膜融合(参考文献：Glycan shield and epitope masking of a coronavirus spike proteinobserved by cryo-electron microscopy)。

新型冠状病毒SARS-CoV-2S蛋白与SARS-CoV S蛋白的同源性较高，二者的高级结构也有一定的相似度，并且SARS-CoV-2同样通过受体ACE2侵入人体细胞(cryo-EMstructure of the 2019-nCoV spike in the precusion conformation)，这提示我们，SARS-CoV疫苗的研发经验可以为SARS-CoV-2疫苗的研制提供线索。

新冠病毒属于RNA病毒冠状病毒属，RNA病毒具有遗传变异率较高的特点。新冠病毒在复制过程中会随机发生突变。新冠病毒属于RNA病毒，基因组复制依赖于RNA聚合酶。而RNA聚合酶缺乏校对功能，不能对错配碱基进行修正，因此，RNA病毒在复制过程中的易发生错误导致突变。其次，新冠病毒为单链RNA病毒，与双链DNA或双链RNA病毒不同，不能通过互补链进行校正，因此易发生突变。再次，病毒RNA和RNA之间会发生重组，导致病毒基因组发生突变。

自2019年12月发生新冠肺炎疫情以来，全球各地出现了多种新冠病毒变异株，部分变异株展现出了传播力增强的特性，目前，全球主要流行的病毒变异株包括D614G、L452R、Cluster 5、B.1.1.7、B.1.351和P.1等。其中南非突变株B.1.35120C/501Y.V2在2020年12月下旬在南非发现，现已经在非洲、欧洲、亚洲和澳大利亚发现。SARS-CoV-2 S蛋白受体结合区(receptor-binding domain，RBD)，即RBD区作为独立的结构域，可形成正确构象，并包含多个空间结构依赖的抗原表位，是几种亚单位疫苗的主要考察的抗原之一，即RBD是除了Spike蛋白S1区、S2区、全长S区、核蛋白几种抗原外的考察抗原之一。但SARS-CoV-2S蛋白RBD有两个潜在的N-糖基化位点，正确的糖型结构对维持RBD天然构象及免疫原性具有重要作用。SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白的RBD区(以下称为RBDV2)存在3个主要突变：N501Y、E484K和K417N。这些位点的改变造成传染性增加，体外研究表明有自然感染后免疫逃逸的可能性，并且影响了疫苗的效应。

酵母作为一种已长期用于工业规模生产的微生物，已成功用于乙型肝炎(HBV)疫苗、乳头瘤病毒(HPV)疫苗等非糖蛋白亚单位疫苗的生产，它所具有的安全性高、工程株构建周期短、生长快、易于大规模生产等特点使其非常适合于在突发传染病和其它应急条件下作为高效、大规模的疫苗生产的表达系统。但是，酵母存在过度糖基化(过度甘露糖基化)的现象，过度糖基化对重要的抗原表位的遮蔽会降低疫苗的保护效果。酵母糖基化修饰系统的研究和改造，使其糖基化修饰接近、甚至更优于抗原的天然糖基结构，这有望使糖基化修饰途径遗传改造的酵母替代鸡胚、哺乳动物细胞用于基因工程亚单位疫苗的快速、高效生产。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何构建一种可以高效生产SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区抗原的工程酵母。

本发明首先提供一种SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区(RBDV2)生产菌的构建方法，包括如下步骤：在作为出发菌的α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株中导入编码SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的核酸分子；所述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有与SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的结合活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

上述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述构建方法中，所述α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株，具体可为现有技术中已有的α-1,6-甘露糖转移酶灭活的毕赤酵母菌株，优选毕赤酵母菌株GJK0601。

上述构建方法中，所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b1)编码链的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2的第32位-第679位的cDNA分子或基因组DNA；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的第32位-第679位的cDNA分子或基因组DNA。

上述构建方法中，所述在作为出发菌的α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株中导入编码SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的核酸分子具体为在GJK0601中导入序列表中的SEQ ID No.2的第32位-第679位的核酸分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供一种蛋白质，其为SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区，简称RBDV2，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的结合活性的蛋白质；

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码蛋白质SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b1)编码链的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2的第32位-第679位的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的第32位-第679位的cDNA分子或DNA分子。

其中，SEQ ID No.2的第32位-第679位由648个核苷酸组成，编码序列表中的SEQID No.1所示的蛋白质。

上述生物材料中，B4)所述重组微生物优选为以上述构建方法构建的SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌。

本发明还提供一种制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的方法，其包括发酵所述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌，得到SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区。

上述制备方法中，所述发酵，发酵过程中以甲醇诱导SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区表达。

上述制备方法中，还包括将所述发酵所得上清液依次进行阳离子交换层析、疏水层析、G25脱盐、阴离子交换层析，分离出所述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区。

本发明还提供如下应用：

Y1、上述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法在制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区中的应用；

Y2、上述蛋白质或上述生物材料在构建SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌中的应用；

Y3、上述蛋白质或上述生物材料在制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区中的应用。

本发明公开了一种SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其构建的生产菌可以实现冠状病毒SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区在毕赤酵母细胞的高效表达，且具有生长快、易于大规模生产、安全性高等特点。重组表达所得的冠状病毒SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区不存在过度糖基化的问题，以其免疫小鼠后能够产生高滴度的抗SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的抗体，且能够中和SARS-CoV-2突变株假病毒。因此在新发突变株冠状病毒传染等应急条件下，有利于突变株冠状病毒疫苗高效研发和大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中GJK0601/pPICZα-S-RBDV2阳性克隆筛选SDS-PAGE分析图，其中泳道1-4为其他公司优化后的RBD核苷酸序列表达后的蛋白，泳道5为SEQ ID No.2阳性表达克隆表达后的蛋白，泳道6为RBD标准蛋白。

图2为本发明实施例2中GJK0601/pPICZα-S-RBDV2不同诱导时间电泳检测图。

图3为本发明实施例2中GJK0601/pPICZα-S-RBDV2纯化样品SDS-PAGE图。

图4为本发明实施例3中二免14天后小鼠血清抗RBDV2抗体滴度。

图5为本发明实施例4中小鼠二免血清假病毒中和试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株GJK0601(文中记为“och1敲除菌”)是非专利文献“王越、巩新、唱韶红、刘波、宋淼、黄海华、吴军.α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF表达的研究.生物工程学报，25卷5期，2007年9月”，公众可以从申请人处获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，所述冠状病毒具体为SARS-CoV-2南非V2型突变株，记录于非专利文献“NCBI：South_Africa/KRISP-K004312/2020501Y.V2 variant of SARS-CoV-2”。公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，载体pPICZαA为Invitrogen公司产品。

下述实施例中，Capto MMC层析介质、Phenyl HP、G25fine层析介质、SOURCE30Q层析介质等均为GE Healthcare公司产品。

下述实施例中，羊抗兔IgG二抗(SAB3700885)为Sigma公司产品；限制性内切酶BglII为NEB公司产品。

下列实施例中，含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基为具体配方如下：10g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，100μg/mL Zeocin。

下列实施例中，Zeocin为Invitrogen公司产品，货号ant-zn-1。

下述实施例中，若无特殊说明，全基因合成、核苷酸合成、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司、北京擎科生物科技有限公司进行。

下述实施例中，BALB/c小鼠(01011)为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

下述实施例中，如无特殊说明，各核苷酸序列的首位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1、SARS-CoV-2 S-RBDV2重组酵母菌株的构建

一、SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白的RBD区(RBDV2)基因的获取及酵母表达载体的构建

本实施例采用的毕赤酵母菌株为发明人前期构建的α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株GJK0601。

根据公布的SARS-CoV-2南非V2型突变株的序列(NCBI：South_Africa/KRISP-K004312/2020501Y.V2 variant ofSARS-CoV-2)，选取S蛋白的第319位至第534位氨基酸(R319-V534)，发明人根据研究酵母高表达蛋白多年的经验，人工设计了一条特有的RBDV2密码子DNA序列，其为序列如SEQ ID No.2的第32位-第679位所示的DNA片段。委托北京擎科生物科技有限公司合成了序列如SEQ ID No.2(包含XhoI酶切位点、RBDV2密码子DNA序列、NotI酶切位点)所示的DNA片段。将合成的片段插入到pPICZαA载体的XhoI和NotI酶切位点之间，获得重组表达载体pPICZα-S-RBDV2，即RBDV2216表达载体。

重组表达载体pPICZα-S-RBDV2的结构描述为：将pPICZαA载体的XhoI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2的第32位-第685位所示的DNA片段的重组质粒。SEQID No.2的第32位-第679位为根据SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白的第319位至第534位氨基酸(R319-V534)进行人工密码子优化后得到的编码基因序列，编码SEQ ID No.1所示的SARS-CoV-2 S-RBDV2蛋白(又名RBDV2 216)。

二、重组表达载体pPICZα-S-RBDV2转化毕赤酵母菌株GJK0601

将毕赤酵母菌株GJK0601划线于YPD平板上复苏，分离单克隆。挑取复苏的单克隆，接种到YPD液体培养基中，试管培养至其对数期后取1ml转接到100ml YPD摇瓶中25℃200rpm摇床培养至OD₆₀₀至1.3-1.5，1500g 4℃离心5min弃上清，用等体积的预冷的蒸馏水重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次；再用等体积的预冷的1M山梨醇重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。以上经3次蒸馏水和3次山梨醇洗涤的菌体沉淀，添加1ml 1M山梨醇悬起，100μl每支分装到无菌离心管中，-80℃保存，即得到毕赤酵母菌株GJK0601电击转化感受态细胞。

将构建好的表达质粒pPICZα-S-RBDV2约10μg用限制性内切酶BglII进行单点线性化，酶切体系(50μL)如下：表达质粒pPICZα-S-RBDV2 43μL、BglII 2μL、10×NEB3.1 buffer5μL，37℃酶切1h后取样，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，分析质粒是否线性化完全。分离结果显示线性化完全的酶切产物用离心柱型的DNA片段回收试剂盒进行片段回收，最后洗脱线性化的质粒时用30μL纯水洗脱。

取线性化的表达质粒pPICZα-S-RBDV2 15μl，加入到100μl毕赤酵母菌株GJK0601电击转化感受态细胞，轻轻混匀，转入预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min。按照酵母电转手册要求，2kV电压电击后迅速加入900μL预冷的1M山梨醇，转入一只洁净试管中，置25℃培养箱中静置2小时。之后再加入1ml无抗生素添加的YPD液体培养基，置25℃，200rpm摇床培养3-4小时。将以上摇床培养得到的菌液，取300μL涂布于筛选抗性为Zeocin的YPD平板，25℃温箱倒置培养60-72h。

三、重组表达菌株的筛选

待所涂平板长出单克隆后，挑取1个单克隆划线至新的含100μg/mL Zeocin的YPD平板上，25℃温箱倒置培养。待菌落长出后，接种至3ml的含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，25℃，200rpm摇床培养，待菌液长浓后，按照5％(体积百分含量)的接种量转接到3ml BMGY培养基，25℃ 200rpm摇床培养，48小时后每12小时补加0.5％(V/V)甲醇诱导。诱导48h后，12000rpm，3min收集培养上清。

以上经48小时甲醇诱导后所收集的培养上清，进行Western Blot(WB)筛选。Western Blot步骤如下：(1)12％的SDS-PAGE胶分离样品；(2)将SDS-PAGE胶上的样品转印到PVDF膜上；(3)5％的牛奶封闭液封闭转印有目的蛋白的PVDF膜，室温封闭1小时；(4)转到用5％的牛奶以1:1000的稀释度稀释一抗(Anti-CoV spike Antibody，义翘神州40150-T62)孵育2小时；(5)PBST洗涤5min，清洗5次；(6)转到用5％的牛奶以1:4000的稀释度稀释羊抗兔IgG二抗(Sigma SAB3700885)孵育1小时；(7)PBST洗涤5min，清洗5次；(8)用Pro-lightHRP Chemiluminescent显色液(天根生化，PA112-02)显色。

以其他公司优化后的RBD核苷酸序列，即SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6替换SEQ ID No.2的第32位-第679位，表达制备步骤一至步骤三其它方法不变，得到其他公司优化后的RBD阳性表达克隆表达的目的蛋白RBDV2，作为对照。

结果如图1所示，与其他克隆相比(SEQ ID No.3表达后的蛋白为泳道1、SEQ IDNo.4表达后的蛋白为泳道2、SEQ ID No.5表达后的蛋白为泳道3、SEQ ID No.6表达后的蛋白为泳道4)，SEQ ID No.2的第32位-第679位序列阳性表达克隆能高水平表达目的蛋白RBDV2，选取该克隆为下一步实验克隆菌株，并将其命名为GJK0601/pPICZα-S-RBDV2。

实施例2、重组SARS-CoV-2南非V2型突变株S-RBDV2糖蛋白的表达与纯化一、重组菌株GJK0601/pPICZα-S-RBDV2培养

挑取实施例1鉴定得到的阳性克隆(即重组菌株GJK0601/pPICZα-S-RBDV2)接种到YPD液体培养基(含100μg/mL Zeocin)中，25℃，200rpm培养至OD₆₀₀为15-20，以5％(V/V)的接种量转接到BMGY培养基，25℃，200rpm发酵24小时后加入体积百分比为0.5％的甲醇诱导S-RBDV2的表达，每12小时诱导一次，并取样检测表达情况，电泳检测图见图2。诱导48小时后离心收集培养上清。

二、SARS-CoV-2南非V2型突变株S-RBDV2的纯化

1、阳离子交换层析

将步骤一诱导表达48小时的培养上清用水稀释2倍，调pH至6.5，用Capto MMC层析介质纯化，流动相成分为：

A：20mM pH6.5 PB(磷酸盐缓冲液)；

B：100mM pH8.5 Tris-HCl+1M NaCl。

上样结束用A平衡，然后用B洗脱。

2、疏水层析

将用Capto MMC纯化样品用Phenyl HP纯化，先用40％(体积百分含量)D洗脱杂蛋白，再用20％(体积百分含量)D洗脱目的蛋白，流动相成分为：

C：20mM pH7.5Tris-HCl+1M硫酸铵；

D：20mM pH7.5 Tris-HCl

3、G25脱盐

将Phenyl HP纯化样品用G25fine层析介质脱盐，收集蛋白样品，流动相成分为：20mM pH8.5 Tris-HCl。

4、阴离子交换层析

将脱盐的样品用SOURCE30Q层析介质纯化，流动相成分为：

E：20mM pH8.5 Tris-HCl；

F：20mM pH8.5 Tris-HCl+1M NaCl。

上样结束用E平衡，然后用F洗脱。

通过SDS-PAGE电泳发现，通过Capto MMC可将SARS-CoV-2 S-RBDV2蛋白捕获；脱盐后样品用SOURCE30Q纯化。SDS-PAGE检测，结果如图3所示。

实施例3、小鼠免疫实验

免疫方法已经在多篇文献中公开，如《人类疾病动物模型的复制，李才主编，人民卫生出版社出版》。具体如下：取20只6～8周龄大的雌性BALB/c小鼠，随机分为以下2组：

免疫1组(双佐剂免疫组)：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗。所用疫苗为10μgRBDV2+100μg Al(OH)₃+250μg CpG2006，其中，RBDV2即为前文制备得到的GJK0601表达的SARS-CoV-2南非V2型突变株S-RBDV2糖蛋白，按100μl体积含有10μg RBDV2、100μg Al(OH)₃和250μg CpG2006用生理盐水配伍疫苗。

免疫2组(单佐剂免疫组)：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗。所用疫苗为10μgRBDV2+100μg Al(OH)₃，其中，RBDV2即为前文制备得到的GJK0601表达的SARS-CoV-2南非V2型突变株S-RBDV2糖蛋白，按100μl体积含有10μg RBDV2和100μg Al(OH)₃用生理盐水配伍疫苗。

佐剂对照组：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗。所用佐剂为100μg Al(OH)₃+250μg CpG2006。

生理盐水对照组：第0、14天分别肌肉注射100μl生理盐水。

各组均在第28天取血。

用ELISA法测各组小鼠血清中抗RBDV2的抗体滴度。操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M].科学出版社,2008.。

结果如图4所示：免疫组(单佐剂或者双佐剂)的抗体滴度远高于生理盐水对照组或佐剂对照组的抗体滴度。

实施例4、假病毒中和试验

按照常规方法进行假病毒中和试验，操作步骤参见“Establishment andvalidation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.EmergingMicrobes and Infections，2020，9”文献中所述的方法，假病毒购自北京天坛药物生物技术开发公司，产品号80044。中和抗体在体外与假病毒中和，使得假病毒丧失感染细胞的能力，进入细胞的假病毒会表达fluc蛋白，与发光底物反应后，通过机器检测其发光值，通过与假病毒对照组发光值比较，计算其抑制百分比，通过计算公式可以计算出当假病毒50％被抑制时抗体的稀释倍数，来计算其ED50，用ED50来表示抗体对假病毒中和活性大小。

1)样品准备：实施例3得到的4组小鼠免疫后血清56℃水浴灭活0.5-1小时；

2)将96孔板四周的36个孔中加入260ul高压灭菌水封边，减少因边缘孔培养基蒸发带来的误差；

3)第2列(细胞对照CC)加入DMEM完全培养基150μl/孔，第3列(病毒对照VC)列加入DMEM完全培养基100μl/孔，在B4-B11孔(即96孔板的第4-11列)中加入培养基142.5μl/孔，其余孔加入培养基100μl/孔，每列6孔；

4)B4-B11孔中加入待测小鼠免疫血清样品(第一孔按1:100加入，倍比稀释。)7.5μl

5)对B4-B11孔中液体轻柔的反复吹吸6-8次，然后转移50μl液体至对应的C4-C11孔(即96孔板的第C排4-11列)，之后所有孔都3倍倍比稀释

6)用DMEM完全培养基将SARS-CoV-2假病毒稀释至1.3×10⁴TCID₅₀/mL，于第3～11列每孔加50μl

7)将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育1小时

8)待孵育30min后，开始消化Huh7细胞，将细胞浓度稀释至2×10⁵cells/mL

9)孵育结束后，每孔加入100μl细胞，使每孔细胞为2×10⁴cells

10)放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24小时

11)培养完毕后，吸弃150μl上清，加入100μl Bright-Glo^TM荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min后，反复吹打，转移150μl液体至白板中

12)使用PerkinElmer EnSight多功能成像酶标仪读取发光值(RLU)

13)以公式(1)计算中和抑制率：

中和抗体滴度被表示为抑制率为50％时对应的血清稀释度的倒数或者抑制率为50％时对应的抗体浓度。

阳性判断值：中和实验过程中需要设置阴性对照，阳性对照，作为参照，来判断实验是否成立，阴性对照ED50小于30，阳性ED50大于30作为判断值。

如图5所示，单佐剂免疫组(10μg RBDV2+100μgAl(OH)₃组)的中和抗体滴度＞1：100，明显高于阴性对照组(佐剂对照组和生理盐水对照组)；双佐剂免疫组的中和抗体滴度＞1：1000，明显高于佐剂对照组、生理盐水对照组和单佐剂免疫组。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法及其应用

<130> GNCSY210842

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

210 215

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaagaagaa ggggtatctc tcgagaaaag aagagtacaa ccaactgaat ccattgttag 60

atttcctaat atcactaacc tgtgcccatt tggtgaagtt tttaacgcta ctagatttgc 120

ttctgtttac gcctggaaca gaaagagaat ttctaactgt gttgctgatt actctgttct 180

ttacaactct gcctcttttt ctacttttaa gtgttatggt gtctctccaa ccaagttgaa 240

cgatttgtgt tttaccaacg tttacgctga ttcttttgtt attagaggtg atgaggttag 300

acaaattgct cctggtcaaa ctggtaacat tgctgattat aactacaagt tgcctgatga 360

ttttactggt tgcgtcattg cttggaactc taataatttg gattctaagg ttggtggaaa 420

ttacaactac ttgtacagat tgtttagaaa gagtaacttg aagccatttg aaagagatat 480

ttctactgaa atctaccaag ctggatctac tccttgtaac ggtgtcaagg gttttaactg 540

ctactttcct ttgcagtctt acggttttca acccacttac ggtgttggtt accagcccta 600

cagagttgtt gttttgtctt ttgagttgct tcatgctcca gctactgttt gtggtcctaa 660

gaagtctact aacttggttt aataggcggc cgccagcttt ctagaacaaa a 711

<210> 3

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagttcaac caacagaaag tattgttaga tttccaaata ttactaactt gtgtccattc 60

ggtgaagttt ttaatgcaac aagatttgca agtgtttacg catggaatag aaaaagaatt 120

agtaactgtg ttgctgatta ctctgttttg tataactctg cttctttttc tacattcaag 180

tgttatggtg tttctccaac aaaattaaac gatttgtgtt tcaccaacgt ttatgctgat 240

tcttttgtta ttagaggtga tgaagttaga caaattgctc ctggtcaaac aggtaatatt 300

gctgattata attacaagtt gccagatgat ttcactggtt gtgttattgc ttggaattct 360

aataatttgg attccaaggt tggtggtaat tataattatt tgtacagatt gttcagaaag 420

tccaatttga aaccatttga aagagatatt tctaccgaaa tttaccaagc aggttctact 480

ccttgtaatg gtgttaaggg ttttaattgt tacttccctt tgcaatctta cggttttcaa 540

ccaacttacg gtgttggtta tcaaccttat agagttgttg ttttatcctt tgaattgttg 600

catgctccag ctactgtttg tggtcctaaa aagtctacta atttggtt 648

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagttcaac caacagaaag tattgttaga tttccaaata ttactaactt gtgtccattc 60

ggtgaagttt ttaatgcaac aagatttgca agtgtttacg catggaatag aaaaagaatt 120

agtaactgtg ttgctgatta ctctgttttg tataactctg cttctttttc tacattcaag 180

tgttatggtg tttctccaac aaaattaaac gatttgtgtt tcaccaacgt ttatgctgat 240

tcttttgtta ttagaggtga tgaagttaga caaattgctc ctggtcaaac aggtaatatt 300

gctgattata attacaagtt gccagatgat ttcactggtt gtgttattgc ttggaattct 360

aataatttgg attccaaggt tggtggtaat tataattatt tgtacagatt gttcagaaag 420

tccaatttga aaccatttga aagagatatt tctaccgaaa tttaccaagc aggttctact 480

ccttgtaatg gtgttaaggg ttttaattgt tacttccctt tgcaatctta cggttttcaa 540

ccaacttacg gtgttggtta tcaaccttat agagttgttg ttttatcctt tgaattgttg 600

catgctccag ctactgtttg tggtcctaaa aagtctacta atttggtt 648

<210> 5

<211> 648

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

agagtgcagc caacagagag catcgtgagg ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60

ggcgaggtgt tcaacgcaac aaggttcgcc agcgtgtacg cctggaacag aaaaaggatc 120

agcaactgcg tggcagacta cagtgtgctg tacaactccg cctccttctc caccttcaaa 180

tgctatggcg tgtcccccac caagctgaac gatctgtgtt ttaccaacgt gtacgccgac 240

tccttcgtga ttaggggcga cgaggtgcgc cagatcgctc ctggacagac aggaaacatc 300

gccgactata actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgattgc ttggaactcc 360

aacaacctgg acagtaaagt gggcggcaac tacaattacc tgtacagact gttcaggaag 420

agcaacctga aacccttcga aagagacatc tccacagaga tctaccaggc cggcagcacc 480

ccatgtaacg gagtgaaggg atttaactgc tacttccccc tgcagtccta cggcttccag 540

ccaacatacg gcgtgggcta ccagccttac agggtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg 600

cacgcccccg ctacagtgtg tggacctaag aagtccacca acctggtg 648

<210> 6

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtgttcagc ctaccgaatc tattgttcgt tttcctaata ttaccaacct gtgtcctttt 60

ggtgaagtct ttaatgctac ccgttttgct tcagtttatg catggaatcg taaacgtatt 120

agtaactgtg ttgcagatta tagcgttctg tataacagcg ccagctttag tacctttaaa 180

tgttatggtg tgagtccgac taaactgaat gatctgtgtt ttaccaatgt ttatgcagat 240

agctttgtta ttcgtggtga tgaagttcgc cagattgcac cgggtcagac cggtaatatt 300

gccgattata attataaact gccggatgat tttaccggtt gtgtgattgc ctggaattca 360

aataatctgg atagcaaagt gggtggtaat tataattatc tgtatcgtct gtttcgcaaa 420

agcaatctga aaccgtttga acgtgatatt tctaccgaaa tttatcaggc gggcagcaca 480

ccgtgtaatg gtgttaaagg ttttaactgt tattttcctc tgcagtctta tggttttcag 540

ccgacctatg gtgttggtta tcagccgtat cgcgttgtgg ttctgagttt tgaactgctg 600

catgccccgg caacggtttg tggtcctaaa aagtcaacca atctggtt 648

Claims

1.一种SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其特征在于：在作为出发菌的α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株中导入编码SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的核酸分子；所述SARS-CoV-2S蛋白受体结合区是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有冠状病毒SARS-CoV-2S蛋白受体结合活性的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其特征在于：所述α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株为毕赤酵母菌株GJK0601，所述GJK0601在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.1853。

3.根据权利要求1-2任一项所述的SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的第32位-第679位的cDNA分子或基因组DNA；

4.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法，其特征在于：所述在作为出发菌的α-1,6-甘露糖转移酶灭活的菌株中导入编码SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的核酸分子具体为在GJK0601中导入SEQ ID No.2的第32位-第679位所示的核酸分子。

5.权利要求1中所述的蛋白质。

6.与权利要求5所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求5所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

8.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B4)所述重组微生物为以权利要求1-4任一项所述的SARS-CoV-2S蛋白受体结合区生产菌的构建方法所构建的SARS-CoV-2S蛋白受体结合区生产菌。

9.一种制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区的方法，其特征在于：包括发酵所述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌，得到SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区；所述发酵，为好氧发酵，发酵过程中以甲醇诱导SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区表达。

10.应用，所述应用为Y1-Y3中的任一项：

Y1、权利要求1-4任一项所述SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌的构建方法在制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区中的应用；

Y2、权利要求5所述蛋白质或权利要求6-8任一项所述生物材料在构建SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区生产菌中的应用；

Y3、权利要求5所述蛋白质或权利要求6-8任一项所述生物材料在制备SARS-CoV-2南非V2型突变株S蛋白受体结合区中的应用。