CN116144679A - 编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒 - Google Patents

编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种编码SARS‑CoV‑2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒及其制备方法、重组菌株、ORF7a膜外区重组蛋白质及其应用。所述编码SARS‑CoV‑2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。本发明可以低成本、高效率地制备的ORF7a膜外区重组蛋白质，制备的重组蛋白质能够很好地被ORF7a抗体所识别，具备作为抗原用于检测SARS‑CoV‑2感染者血清中抗体的功能；同时，ORF7a重组蛋白质也可以作为一种SARS‑CoV‑2的抗原用于SARS‑CoV‑2免疫接种。

Description

编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒及其制备方法、重组菌株、ORF7a膜外区重组蛋白质及其应用。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus，CoV)是一种包膜的单链RNA病毒，在人类、及其它哺乳动物和鸟类中广泛传播，能引起呼吸系统、肠、肝及神经系统疾病。已知有7种冠状病毒使人类致病，其中4种如Cov-229E，Cov-OC43，Cov-NL63和Cov-HKU1在人群中流行，常引起普通感冒症状。另外3种冠状病毒SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2具有高度的危险性，会导致严重的肺炎甚至死亡。
有必要对SARS-CoV-2病毒进行研究，SARS-CoV-2病毒基因组编码数个与其他已知病毒和非病毒蛋白质没有显著相似性的病毒特征性蛋白。这些蛋白并不是病毒复制所必须的，但可能参与病毒与宿主细胞的相互作用，被称为病毒辅助蛋白。研究发现辅助蛋白质ORF7a是SARS-CoV-2病毒粒子表面的蛋白质之一。SARS-CoV-2感染者血清中产生高滴度的ORF7a抗体。最新研究发现SARS-CoV-2病毒能够利用ORF7a吸附某些细胞表面分子，介导了病毒对某些种类人类细胞的感染，但是目前现有技术没有报道或记载过关于利用辅助蛋白质ORF7a来制备疫苗。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种SSARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因、重组质粒及其制备方法、重组菌株、ORF7a膜外区重组蛋白质及其应用，旨在能够低成本、高效率地制备的ORF7a膜外区重组蛋白质，制备的重组蛋白质能够很好地被ORF7a抗体所识别。
为实现上述目的，本发明提出一种SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，所述SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种重组质粒，所述重组质粒包含如上所述的编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，所述重组质粒的表达载体是pPICZα。
本发明还提出一种重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
从基因库中找到编码ORF7a膜外区的核苷酸序列，并进行密码子优化设计，得到ORF7a膜外区基因；
用限制性内切酶Xho 1和Not 1将带有Kex2位点的ORF7a膜外区基因从pU57载体上切下来，割胶回收切下的DNA片段；
将所述DNA片段通过T4 DNA连接酶与经过同样酶切的pPICZα载体相连接，得到连接产物；
将所述连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到阳性转化子菌落；
将所述阳性转化子菌落接种至含有博来霉素的LLB培养基培养后，提取质粒，得重组质粒。
本发明还提出一种重组菌株，所述重组菌株包括如上所述的重组质粒。
可选地，所述重组菌株的宿主细胞包括毕赤酵母。
本发明还提出一种ORF7a膜外区重组蛋白质，所述ORF7a膜外区重组蛋白质由如上所述的重组质粒编码所得，所述ORF7a膜外区重组蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提出一种免疫学检测方法，包括以下步骤：
采用如上所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为抗原，用来检测SARS-CoV-2病毒感染者血清中的ORF7a抗体。
本发明还提出一种如上所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为潜在的SARS-CoV-2病毒疫苗的应用。
本发明提供的技术方案中，所述SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将该基因片段构建至表达载体，可以异源表达ORF7a膜外区蛋白质，从而实现低成本、高效率地制备的ORF7a膜外区重组蛋白质，制备的重组蛋白质能够很好地被ORF7a抗体所识别，具备作为抗原用于检测SARS-CoV-2感染者血清中抗体的功能；同时，ORF7a重组蛋白质也可以作为一种SARS-CoV-2的抗原用于SARS-CoV-2免疫接种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中ORF7a膜外区重组表达的重组质粒构建图；
图2为本发明实施例3中制备的ORF7a膜外区重组蛋白质的蛋白质的凝胶电泳图；
图3为本发明实施例4中ORF7a抗体检测制备的ORF7a膜外区的重组蛋白质的免疫印迹图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
有必要对SARS-CoV-2病毒进行研究，SARS-CoV-2病毒基因组编码数个与其他已知病毒和非病毒蛋白质没有显著相似性的病毒特征性蛋白。这些蛋白并不是病毒复制所必须的，但可能参与病毒与宿主细胞的相互作用，被称为病毒辅助蛋白。研究发现辅助蛋白质ORF7是SARS-CoV-2病毒粒子表面的蛋白质之一。SARS-CoV-2感染者血清中产生高滴度的ORF7a抗体。最新研究发现SARS-CoV-2病毒能够利用ORF7a吸附某些细胞表面分子，介导了病毒对某些种类人类细胞的感染，因此如何大规模的制备出被ORF7a抗体所识别的蛋白质具有重要研究意义。
鉴于此，本发明提出一种编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，旨在能够低成本、高效率地制备的ORF7a膜外区重组蛋白质，制备的重组蛋白质能够很好地被ORF7a抗体所识别。本发明附图中，图1为本发明实施例1中ORF7a膜外区重组表达的重组质粒构建图；图2为本发明实施例3中制备的ORF7a膜外区重组蛋白质的蛋白质的凝胶电泳图；图3为本发明实施例3中ORF7a抗体检测制备的ORF7a膜外区的重组蛋白质的免疫印迹图。
本发明提出一种编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，所述编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，具体如下所示：
GAACTATATCACTACCAGGAGTGCGTGCGTGGTACGACAGTTCTCTTGAAAGAGCCATGTAGCTCAGGAACTTATGAAGGGAATTCCCCATTTCACCCTCTTGCCGATAACAAGTTCGCGCTGACCTGCTTCAGTACACAATTTGCTTTCGCGTGTCCCGACGGCGTAAAACATGTCTACCAATTACGAGCAAGATCGGTATCTCCGAAGCTGTTTATTAGGCAGGAGGAAGTCCAA。
本发明提供的技术方案中，所述SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区基因连接至表达载体，可以异源表达ORF7a膜外区蛋白质，从而实现低成本、高效率地制备的ORF7a膜外区重组蛋白质，制备的重组蛋白质能够很好地被ORF7a抗体所识别，具备作为抗原用于检测SARS-CoV-2感染者血清中抗体的功能；同时，ORF7a重组蛋白质也可以作为一种SARS-CoV-2的抗原用于SARS-CoV-2免疫接种。
进一步地，本发明提出一种重组质粒，所述重组质粒包含如上所述的编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，所述重组质粒的表达载体是pPICZα。pPICZα是购自Invitrogen公司的一种商业化载体。载体pPICZα指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常见的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。
进一步地，本发明提出一种如上所述的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、从基因库中找到编码ORF7a膜外区的核苷酸序列，并进行密码子优化设计，得到ORF7a膜外区基因；
可以理解的是，全长的SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a含有一部分信号肽区域和一段跨细胞膜区域。这两个区域是ORF7a功能所不需要的，而且会增加重组蛋白质表达的难度，因此我们选择只表达ORF7a的膜外区。ORF7a的膜外区可以通过蛋白质序列分析确定具体的位置，即氨基酸残基16-96。
本步骤中，从GenBank基因数据库查找编码为:NC_045512.2的SARS-CoV-2基因组序列，从中找到编码ORF7a膜外区的核苷酸序列。根据毕赤酵母密码子的偏爱性，对甘露糖酶基因密码子进行优化设计，密码子优化可能对ORF7a膜外区的表达量具有促进作用。优化后的ORF7a膜外区基因通过基因合成得到ORF7a膜外区基因。在基因的5’端加上编码Kex2酶切位点的核苷酸序列“aaaaga”。通过基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得上述基因。合成的基因位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点Xho 1和Not1。
S2、用限制性内切酶Xho 1和Not 1将带有Kex2位点的ORF7a膜外区基因从pU57载体上切下来，割胶回收切下的DNA片段；
通过限制性核酸内切酶Xho1和Not1将合成的基因插入到表达载体pPICZα的多克隆位点。需要特别说明的是我们的构建策略有一处独特的设计。本发明选用Xho1内切酶酶切位点连接基因的5’端。使用该内切酶会删除载体上用于切割α信号肽的Kex2酶切位点，因此在ORF7a膜外区基因起始加上了编码Kex2切割位点的核苷酸序列(aaaaga)，这样做的目的是可以去除最终产生的重组ORF7a膜外区蛋白质上来自表达载体自身的氨基酸残基。这种独特的设计能够产生仅含有ORF7a原始氨基酸残基的重组蛋白质，维持了ORF7a原有的抗原性。
S3、将所述DNA片段通过T4 DNA连接酶与经过同样酶切的pPICZα载体相连接，得到连接产物；
本步骤中，需要说明的是T4 DNA连接酶购自Takara公司，经过同样酶切的pPICZα载体为一种用于在毕赤酵母中重组表达外源基因的商业化载体，购自Invitrogen公司，该载体上带有博来霉素抗性基因。
S4、将所述连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到阳性转化子菌落；
本步骤中的大肠杆菌DH5α感受态细胞是一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自Invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室。将转化的细胞涂布在含有25μg/mL博来霉素(购自Sigma公司)的LLB琼脂平板上进行阳性转化子筛选；其中涉及到的大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及CaCl2转化方法是生物学实验室的常规操作，具体方法可参考CurrentProtocols in Molecular Biology一书中关于DNA转化的章节(doi.org/10.1002/0471142727.mb0108s37)；其中用到的LLB琼脂平板是通过在LLB培养基(每升中含有5gNaCl、5g酵母提取液和10g蛋白胨)加入2.5％的琼脂制备而成。
S5、将所述阳性转化子菌落接种至含有博来霉素的LLB培养基中培养后，提取质粒，得重组质粒。
本步骤中，所述提取质粒采用试剂盒进行提取，此为常规操作。
本发明还提出一种重组菌株，所述重组菌株包括如上所述的重组质粒。
所述重组菌株包括如上所述的含有表达ORF7a膜外区的重组质粒载体(pPICZα-ORF7a)。
进一步地，所述重组菌株的宿主细胞包括毕赤酵母。该重组菌株可以由包含上述的重组质粒pPICZα-ORF7a电转化毕赤酵母细胞获得。在重组菌株中ORF7a膜外区基因整合在酵母细胞的基因组上，可随着宿主细胞的繁殖而复制。
通过基因工程异源表达是获取ORF7a蛋白质的几乎唯一可行途径。在当前已发表的研究论文中，制备重组ORF7a蛋白质的方法有两条途径。一是在哺乳动物细胞中瞬时表达产生ORF7a蛋白质；二是在大肠杆菌中表达ORF7a蛋白质的膜外区。即使是膜外区，ORF7a在大肠杆菌中都是不可溶性的包涵体形式，需要蛋白质变性和复性处理后获得可用的可溶形式。哺乳动物细胞瞬时表达还是大肠杆菌包涵体复性的方法都不是大规模制备重组蛋白质的理想形式。哺乳动物细胞表达产量低、成本高；就ORF7a来说大肠杆菌无法分泌表达、无法直接可溶性表达。酵母细胞具有基因表达调控和蛋白修饰功能，本身就避免了原核表达系统中产物活性低以及包涵体的变性、复性等的问题，同时酵母可以通过高密度发酵，且分泌产物与天然蛋白相似，临床应用较安全。
本发明还提出一种ORF7a膜外区重组蛋白质，所述ORF7a膜外区重组蛋白质由如上所述的重组质粒编码所得，所述ORF7a膜外区重组蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体如下所示：
ELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQ。
SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a是一个含有121个氨基酸的I型跨膜蛋白质。氨基酸序列分析显示ORF7a由四部分组成：依次为N端15个残基的信号肽(1-15aa)，膜外区(16-96aa)，跨膜区(97-117aa)和一个5个残基的内质网滞留信号基序(117-121aa)。结构分析显示SARS-CoV ORF7a膜外区为一个7股β折叠片组成三明治结构，属于免疫球蛋白超家族，是ORF7a与其他分子相互作用的区域，也是ORF7a刺激免疫系统应答的区域。该重组蛋白质含有79个氨基酸残基，理论分子量为8986.20道尔顿，等电点为7.21。
本发明还提出一种免疫学检测方法，包括以下步骤：
采用如上所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为抗原，用来检测SARS-CoV-2病毒感染者血清中的ORF7a抗体。
作为SARS-CoV-2编码的病毒蛋白质，本发明中毕赤酵母工程菌所生产的重组ORF7a膜外区蛋白质可用于识别/检测ORF7a抗体。本发明使用Western blotting方法验证重组ORF7a膜外区蛋白质与ORF7a抗体的反应性。实验中所用的ORF7a抗体来自经哺乳动物细胞瞬时表达的ORF7a免疫兔子所产生的多克隆抗体。Western blotting又称为免疫印迹。除了免疫印迹法，基于相同的原理也可以采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)在多孔板中检测重组ORF7a膜外区蛋白质与ORF7a抗体的反应性。相比免疫印迹，ELISA法操作简便、通量高，非常适合检测血清中的ORF7a抗体。
进一步地，本发明还提出一种如上所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为潜在的SARS-CoV-2病毒疫苗的应用。将本发明提供的重组ORF7a膜外区蛋白质用作SARS-CoV-2的抗原，ORF7a膜外区重组蛋白质作为基因工程亚单位疫苗的成分，通过免疫接种预防SARS-CoV-2的感染。常见的SARS-CoV-2的疫苗为灭活疫苗。国内少部分人群使用了以重组SARS-CoV-2刺突蛋白为抗原的亚单位疫苗。基于ORF7a蛋白具有类似刺突蛋白的功能，可以作为媒介感染部分人类细胞，因此重组ORF7a具有作为疫苗预防感染的潜在功能。
需要说明的是，上述涉及到基因合成、重组质粒及重组菌株制备、以及重组菌株发酵培养获得重组蛋白等的实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1毕赤酵母SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a重组质粒的制备
图1为本发明实施例1中ORF7a膜外区重组表达的重组质粒构建图；请参阅图1，构建过程如下：
(1)从GenBank基因数据库查找编码为:NC_045512.2的SARS-CoV-2基因组序列，从中找到编码ORF7a膜外区的核苷酸序列。根据毕赤酵母密码子的偏爱性，对甘露糖酶基因密码子进行优化设计，得到ORF7a膜外区基因。在基因的5’端加上编码Kex2酶切位点的核苷酸序列“aaaaga”。通过基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得上述基因。合成的基因位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点Xho 1和Not 1。
(2)用限制性内切酶Xho 1和Not 1(均购自Takara公司)将带有Kex2位点的ORF7a膜外区基因从pU57载体上切下来，割胶回收切下的DNA片段。
(3)将胶回收片段通过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)与经过同样酶切的pPICZα载体(一种用于在毕赤酵母中重组表达外源基因的商业化载体，购自Invitrogen公司，该载体上带有博来霉素抗性基因)相连接。
(4)将连接产物通过CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α(一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自Invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞中。将转化的细胞涂布在含有25μg/mL博来霉素(购自Sigma公司)的LLB琼脂平板上进行阳性转化子筛选。
(5)挑取单菌落接种至含有25μg/mL博来霉素的LLB培养基中，过夜培养，然后用试剂盒提取质粒，通过Xho 1和Not 1双酶切进行鉴定，酶切结果正确的即为SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a重组质粒，pPICZα-ORF7a。
实施例2重组菌株的制备
(1)将实施例1获得的重组质粒pPICZα-ORF7a通过BglII限制性核酸内切酶线性化后，采用电转化法转化到毕赤酵母X-33(购自Invitrogen公司，为实验室常见的基因工程表达菌，该菌株自带有博来霉素抗性，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞。
(2)将转化后的毕赤酵母涂布在含有博来霉素(50μg/mL)(购自Sigma公司)的YPD琼脂平板上，在此抗性平板上生长的菌落为重组毕赤酵母菌株。
YPD培养基配方：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，若制固体培养基，加入2％琼脂粉。
实施例3重组ORF7a膜外区蛋白质的制备
(1)将实施例2制备的重组菌株在液体YPD培养基中(培养基中加入50μg/mL博来霉素)过夜培养。将毕赤酵母基因工程菌按1:90-110的比例(优选为1:100)接种至BMGY培养基中。在28℃，150-220rpm(优选为200rpm)摇瓶培养培养20-26h(优选为24h)摇瓶后，加入1％终浓度的甲醇，此后每隔24h加入一次，共三次。最后一次加入甲醇24h后终止摇瓶培养。
BMGY培养基的具体配方如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液，1％甘油。
摇瓶培养结束后，5000rpm离心收集发酵液上清。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析ORF7a膜外区蛋白质的生产情况。
实施例4重组ORF7a膜外区蛋白质与ORF7a抗体反应测试
作为SARS-CoV-2编码的病毒蛋白质，本发明中毕赤酵母工程菌所生产的重组ORF7a膜外区蛋白质可用于识别/检测ORF7a抗体。本实施例使用Western blotting方法验证重组ORF7a膜外区蛋白质与ORF7a抗体的反应性。实验中所用的ORF7a抗体来自经哺乳动物细胞瞬时表达的ORF7a免疫兔子所产生的多克隆抗体。
Western blotting又称为免疫印迹。具体过程如下。通过SDS-PAGE分析重组ORF7a膜外区蛋白质(即毕赤酵母工程菌发酵液)；通过电转移将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上；用封闭缓冲液(10mM Tris–HCl、150mM NaCl、0.05％Tween-20和5％脱脂奶粉)在4℃条件下封闭过夜。封闭后的PVDF膜与1：1000稀释的ORF7a多克隆抗体(Cell SignalingTechnology公司，商品目录号：#67750)室温条件下孵育2h。然后用的羊抗兔二抗(购自上海生工，商品目录号为D110011，过氧化物酶标记，1：10000稀释)在室温下孵育1h。使用增强型化学发光试剂(购自上海生工，商品目录号为C500044)显示免疫印迹条带。
图1为本发明实施例1中ORF7a膜外区重组表达的重组质粒构建图；
图2为本发明实施例3中制备的ORF7a膜外区重组蛋白质的蛋白质凝胶电泳图；
图3为本发明实施例4中ORF7a抗体检测制备的ORF7a膜外区的重组蛋白质免疫印迹图。
由图2可以看出，经三次甲醇诱导之后，在工程菌发酵液上清中产生目标蛋白质的条带。使用Bradford法(一种常见的蛋白质定量方法，可以购买到现成的实验试剂盒)蛋白质定量分析得出发酵液中目标蛋白质的含量约为0.8mg/ml。由图3可知，在PVDF膜上可以检测到重组ORF7a膜外区蛋白质对应的特异性条带。由此可知，本发明所制备的ORF7a膜外区重组蛋白质作为抗原，可以识别ORF7a抗体，从而用来检测SARS-CoV-2感染的血清，进一步地，可以用来制作疫苗用来免疫预防SARS-CoV-2的感染。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，其特征在于，所述编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含如权利要求1所述的编码SARS-CoV-2辅助蛋白质ORF7a膜外区的基因，所述重组质粒的表达载体是pPICZα。
3.一种如权利要求2所述重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
从基因库中找到编码ORF7a膜外区的核苷酸序列，并进行密码子优化设计，得到ORF7a膜外区基因；
用限制性内切酶Xho 1和Not 1将带有Kex2位点的ORF7a膜外区基因从pU57载体上切下来，割胶回收切下的DNA片段；
将所述DNA片段通过T4 DNA连接酶与经过同样酶切的pPICZα载体相连接，得到连接产物；
将所述连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到阳性转化子菌落；
将所述阳性转化子菌落接种至含有博来霉素的LLB培养基中培养后，提取质粒，得重组质粒。
4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包括如权利要求2所述的重组质粒。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主细胞包括毕赤酵母。
6.一种ORF7a膜外区重组蛋白质，其特征在于，所述ORF7a膜外区重组蛋白质由如权利要求2所述的重组质粒编码所得，所述ORF7a膜外区重组蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
7.一种免疫学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求6所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为抗原，用来检测SARS-CoV-2病毒感染者血清中的ORF7a抗体。
8.一种如权利要求6所述的ORF7a膜外区重组蛋白质作为潜在的SARS-CoV-2病毒疫苗的应用。
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