CN107384934A - 重组人干扰素α2b的制备方法 - Google Patents

重组人干扰素α2b的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干扰素技术领域，具体涉及一种重组人干扰素α2b的制备方法；包括如下步骤：(1)构建重组人干扰素α2b基因的表达载体，转化入感受态细胞；(2)构建大肠杆菌二硫键异构酶C基因的重组质粒；(3)将重组质粒转化入感受态细胞，获得双质粒重组表达菌株；(4)对双质粒重组表达菌株进行诱导表达、复性和纯化，获得重组人干扰素α2b；本发明提供的重组人干扰素α2b的制备方法，能促进二硫键cys1‑cys98正确配对，从而减少重组人干扰素α2b的慢带组分，进而提高人干扰素α2b的稳定性和抗病毒活性。

Description

重组人干扰素α2b的制备方法
技术领域
本发明涉及干扰素技术领域，具体涉及一种重组人干扰素α2b的制备方法。
背景技术
重组人干扰素α2b是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，临床上主要用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病，也用作一些肿瘤化疗药物的联合用药。重组人干扰素α2b生产过程中，需经过表达、分离、变性、复性才能得到有活性的蛋白质，而在复性过程中，重组人干扰素α2b中的部分二硫键cys1-cys98受空间位阻影响不能氧化配对，从而形成松散的构象，在氧化型SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图上，泳动较慢，表观分子量较cys1-cys98配对的重组人干扰素α2b大，称为慢带组分。慢带组分经复性后有时能达到总蛋白的50％，是影响重组人干扰素α2b品质的最关键组分，其影响着蛋白质的功能和稳定性，cys1-cys98不能氧化配对，会形成松散的构象，造成临床上许多不良反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人干扰素α2b的制备方法，其能促进二硫键cys1-cys98正确配对，从而减少重组人干扰素α2b的慢带组分，进而提高人干扰素α2b的稳定性和抗病毒活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种重组人干扰素α2b的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建重组人干扰素α2b基因的表达载体，转化入感受态细胞；
(2)构建大肠杆菌二硫键异构酶C基因的重组质粒；
(3)将重组质粒转化入感受态细胞，获得双质粒重组表达菌株；
(4)对双质粒重组表达菌株进行诱导表达、复性和纯化，获得重组人干扰素α2b。
大肠杆菌二硫键异构酶C(DsbC)的主要功能是使重组人干扰素α2b的cys1-cys98成功配对，对蛋白翻译后修饰、蛋白成熟以及在细胞中的准确定位、功能发挥和最终降解起着关键作用。Dsb家族主要由DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE、DsbG组成，其中DsbC和DsbG具有二硫键异构酶活性。DsbC是由两个23.3kDa的亚基构成，每个亚基都还有一个Cys98-XX-Cys101片段，形成一个不稳定和高反应活性的二硫键。Cys98能亲和攻击目标蛋白错配的二硫键，在DsbC与目标蛋白之间形成一个不稳定的混合二硫键，该二硫键又会被目标蛋白质中的另一个巯基亲核攻击，进而使目标蛋白的二硫键异构化成为正确配对的二硫键。
上述技术方案产生的有益效果在于：通过构建双质粒重组表达菌株，能够显著地促进重组人干扰素α2b变性后二硫键的正确配对，并能够降低重组人干扰素α2b蛋白质中的慢带组分，提高rhIFNα2b的稳定性和抗病毒活性，降低其免疫原性，减少患者使用干扰素时的不良反应发生率。
附图说明
图1为原核表达的DsbC蛋白质电泳图；
附图标注：M：蛋白质Marker、1：IPTG诱导前、2：IPTG诱导后(还原型上样缓冲液处理样品)；
图2为原核表达的重组人干扰素α2b蛋白质电泳图；
附图标注：M：蛋白质Marker、1：IPTG、42℃诱导前、2：IPTG、42℃诱导后(还原型上样缓冲液处理样品)；
图3为氧化型和还原型上样缓冲液处理的重组人干扰素0α2b及其与DsbC共表达的蛋白质电泳图；
附图标注：M：蛋白质Marker、1：与DsbC共表达的重组人干扰素α2b的蛋白质电泳(还原型上样缓冲液处理样品)、2：重组人干扰素α2b的蛋白质电泳(氧化型上样缓冲液处理样品)、3：与DsbC共表达的重组人干扰素α2b的蛋白质电泳(氧化型上样缓冲液处理样品)、4：重组人干扰素α2b的蛋白质电泳(还原型上样缓冲液处理样品)。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
(1)构建重组人干扰素α2b基因的表达载体，转化入感受态细胞：
(1.1)PCR引物的设计：
设计人干扰素α2b基因的上下游引物P1和P2：
P1：GGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCAC(下划线为NdeⅠ酶切位点)
P2：GGGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTC(下划线为BamHⅠ酶切位点)
PCR扩增人干扰素α2b基因，其扩增体系，具体如下：
PCR反应程序包括：
1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收PCR产物人干扰素α2b基因片段。
(1.2)用相同的限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ切PCR回收产物和pJW2，(pJW2为原核表达载体，含有PRPL串联启动子)；回收人干扰素α2b基因片段和pJW2载体片段，用T4连接酶将两者连接，连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂LB(Amp+)板，筛选阳性菌落，抽提质粒，进行测序鉴定，将正确的克隆命名为pJW2-rhIFNα2b。
(1.3)挑取测序验证正确的克隆菌株于250mL LB(Amp+)液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.5，CaCL2法将重组表达载体pJW2-rhIFNα2b再次转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，负80度留存备用。
(2)构建大肠杆菌二硫键异构酶C基因的重组质粒：
(2.1)PCR引物的设计：
设计大肠杆菌二硫键异构酶C基因的上下游引物P3和P4：
P3：GCCATATGAAGAAAGGTTTTATGTTGTT(下划线为NdeⅠ酶切位点)
P4：TGGGATCCTTATTTACCGCTGGTCAT(下划线为BamHⅠ酶切位点)
以大肠杆菌二硫键异构酶C基因蛋白质编码区为模板，进行PCR扩增。
扩增体系，具体如下：
PCR反应程序为：
1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收PCR产物DsbC。
(2.2)用相同的限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ切PCR回收产物和pACYCDuet-1载体；回收大肠杆菌二硫键异构酶C基因片段和pACYCDuet-1载体片段，用T4连接酶将两者连接，获得重组质粒，命名为pACYCDuet-1-DsbC。
(3)获得双质粒重组表达菌体：
(3.1)将步骤(2.2)获得的重组质粒pACYCDuet-1-DsbC转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂LB(Cm+)板，筛选阳性菌落，抽提质粒，进行测序鉴定。
(3.2)将步骤(2.2)获得的重组质粒pACYCDuet-1-DsbC转化入步骤(1.3)获得的含有重组表达载体pJW2-rhIFNα2b的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂LB(Amp+)板，筛选阳性菌落，抽提质粒，进行测序鉴定。
(3.3)将测序正确的双质粒重组表达菌株再次转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂LB(Cm+)板，挑取单克隆于含5ml LB(Amp+，Cm+)液体培养基的试管中，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，42℃剧烈摇晃培养3小时；收集各试管的菌体做SDS-PAGE电泳，选取重组人干扰素α2b和DsbC共表达的阳性克隆菌株。
(4)重组表达菌体的诱导表达、复性和纯化：
(4.1)重组质粒pACYCDuet-1-DsbC表达菌体的诱导表达：挑取步骤(3.1)中获得的阳性克隆菌株接种于LB(Cm+)液体培养基中过夜培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0；取1ml阳性克隆菌液接种于2000ml的LB(Cm+)液体培养基扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，37℃剧烈摇晃培养3小时，于4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体。
(4.2)双质粒重组表达菌体的诱导表达：挑取步骤(3.3)中获得的阳性克隆菌株接种于LB(Amp+，Cm+)液体培养基中过夜培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0；取1ml阳性克隆菌液接种于2000ml的LB(Amp+，Cm+)液体培养基扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，42℃剧烈摇晃培养3小时，于4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体。
(4.3)双质粒重组表达菌体的复性和纯化：
取1g菌体，加入50mL变性液，室温搅拌3h，12000rpm-15000rpm，20min，离心取上清；在1mL上清液中加入复性液250mL，4℃搅拌24h，用3L透析液透析3次，12000rpm-15000rpm，20min，离心取上清，0.8μ滤膜过滤；将上清液通过4C1-Sepharoseα-干扰素单抗亲和层析胶，100mL平衡液平衡，1％醋酸洗脱，回收重组人干扰素α2b。
其中，变性液组成如下：
Tris-Hcl 20mM
盐酸胍6M
EDTA5mM
β-巯基乙醇100mM，PH 8.5；
复性液组成如下：
Tris 20mM
Gly 50mM
NaCl 25mM
EDTA 5mM
β-巯基乙醇1mM，PH 8.5；
透析液组成如下：
Tris 20mM
乳化剂tween 200.2％
EDTA 2mM
β-巯基乙醇 1mM，PH 8.0；
平衡液组成如下：
NaCl 1M
PB 25mM
乳化剂tween 200.5％，PH7.4；
所述α-干扰素单抗亲和层析胶为安徽安科生物工程股份有限公司自主研发产品，商品名称为4C1-Sepharoseα-干扰素单抗亲和层析胶。
(5)氧化型SDS-PAGE检测慢带组分减少
取步骤(4.1)中IPTG诱导表达前菌体和IPTG诱导表达后菌液各100μl进行SDS-PAGE蛋白质电泳，每100μl菌液12000rpm离心1min，弃上清；加入适量PBS重悬菌体和5μl还原型4×Loading Buffer(含10％巯基乙醇)，混匀；95℃水浴5min，12000rpm离心10min，取20μl上清液进行SDS-PAGE蛋白质电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度10％，结果见图1。泳道1为IPTG诱导表达前菌体蛋白质电泳图；泳道2为IPTG诱导表达后菌体蛋白质电泳图，在30KD处可见明显条带，为DsbC。
取步骤(4.2)中IPTG、42℃诱导表达前菌体和IPTG、42℃诱导表达后菌液各100μl进行SDS-PAGE蛋白质电泳，每100μl菌液12000rpm离心1min，弃上清；加入适量PBS重悬菌体和5μl还原型4×Loading Buffer(含10％巯基乙醇)，混匀；95℃水浴5min，12000rpm离心10min，取20μl上清液进行SDS-PAGE蛋白质电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度10％，结果见图2。泳道1为IPTG、42℃诱导表达前菌体蛋白质电泳图；泳道2为IPTG、42℃诱导表达后菌体蛋白质电泳图，在16KD和30KD处可见明显条带，分别为重组人干扰素α2b和DsbC；泳道3为重组人干扰素α2b标准品阳性对照。
取步骤(4.3)中复性纯化后的重组人干扰素α2b及重组人干扰素α2b标准品各20μl进行SDS-PAGE蛋白质电泳，结果见图3。泳道1为10μl纯化产物混合2.5μl还原型4×LoadingBuffer(含10％巯基乙醇)；泳道2为10μl纯化产物混合2.5μl氧化型4×Loading Buffer(不含巯基乙醇)；泳道3为10μl重组人干扰素α2b标准品混合2.5μl氧化型4×Loading Buffer(不含巯基乙醇)；泳道4为10μl重组人干扰素α2b标准品混合2.5μl还原型4×LoadingBuffer(含10％巯基乙醇)。结果显示经过氧化型SDS-PAGE检测泳道3中出现的慢带组分在泳道2中明显减少。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>安徽安科生物工程(集团)股份有限公司
<120>重组人干扰素α2b的制备方法
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
GGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCAC 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
GGGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTC 32
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
GCCATATGAAGAAAGGTTTTATGTTGTT 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
TGGGATCCTTATTTACCGCTGGTCAT 26

Claims (7)

1.一种重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建重组人干扰素α2b基因的表达载体，转化入感受态细胞；
(2)构建大肠杆菌二硫键异构酶C基因的重组质粒；
(3)将重组质粒转化入感受态细胞，获得双质粒重组表达菌株；
(4)对双质粒重组表达菌株进行诱导表达、复性和纯化，获得重组人干扰素α2b。
2.根据权利要求1所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤如下：
(1.1)以人干扰素α2b基因为模板，在序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的上、下游引物P1和P2的作用下，经PCR扩增获得人干扰素α2b基因片段；
(1.2)将上述获得的人干扰素α2b基因片段用限制性内切酶双酶切，插入到原核表达载体相应的酶切位点，所述限制性内切酶为Nde Ⅰ和BamH Ⅰ，原核表达载体为pJW-2，其上含有PRPL串联启动子；
(1.3)用CaCL2法将含有重组人干扰素α2b基因的表达载体转化入感受态细胞，所述感受态细胞为E.coli BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的重组质粒采用如下方法进行构建：
(2.1)以大肠杆菌二硫键异构酶C基因为模板，在序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的上、下游引物P3和P4的作用下，经PCR扩增获得大肠杆菌二硫键异构酶C基因片段；
(2.2)将上述获得的大肠杆菌二硫键异构酶C基因片段用限制性内切酶双酶切，插入到原核表达载体相应的酶切位点，所述限制性内切酶为Nde Ⅰ和BamH Ⅰ，原核表达载体为pACYCDuet-1。
4.根据权利要求1所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作步骤如下：
(3.1)将重组质粒转化入感受态细胞，涂LB板，筛选阳性菌落，抽提质粒，进行测序鉴定；
(3.2)将测序正确的双质粒重组表达菌株再次转化入感受态细胞，涂LB板，挑取单克隆于含LB液体培养基的试管中，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，42℃振摇培养3小时；收集菌体做SDS-PAGE电泳，选取重组人干扰素α2b和DsbC共表达的阳性克隆菌株，即得双质粒重组表达菌株。
5.根据权利要求1所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的诱导表达方法为：挑取步骤(3)中获得的阳性克隆菌株接种于LB液体培养基中过夜培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0；按1:2000的比例将过夜培养液转接至LB液体培养基中扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.4～1.0；加入0.05μM/LIPTG于培养液中，42℃振摇培养3小时，在4℃，6000rpm的条件下，离心10min，收集菌株。
6.根据权利要求1所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的复性和纯化方法为：向收集的菌体中加入变性液，室温搅拌3h，12000-15000rpm，20min，离心取上清液；在上清液中加入复性液，4℃搅拌24h，更换透析液2次，12000-15000rpm，20min，离心取上清液，过滤后通过4C1-Sepharoseα-干扰素单抗亲和层析胶，100mL平衡液平衡，1％醋酸洗脱，回收重组人干扰素α2b。
7.根据权利要求6所述的重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于，所述变性液组成如下：Tris-HCl 20mM、盐酸胍6M、EDTA 5mM、β-巯基乙醇100mM，PH 8.5；所述复性液组成如下：Tris 20mM、Gly 50mM、NaCl 25mM、EDTA 5mM、β-巯基乙醇1mM，PH 8.5；所述透析液组成如下：Tris 20mM、乳化剂tween 20 0.2％、EDTA 2mM、β-巯基乙醇1mM，PH 8.0；所述平衡液组成如下：NaCl1M、PB25mM、乳化剂tween 20 0.5％，PH7.4。
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