CN104846001B - 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外源蛋白原核分泌表达系统，由工程菌和载体两部分组成。首先以能高效胞外分泌SMP蛋白的D2野生株为出发菌，定点敲除了SMP蛋白编码基因，获得的突变株为工程菌，保藏号为CGMCC No.10365；同时以同源重组质粒pEX18Tc为基础构建了含有同源臂、SMP信号肽、多克隆位点的新质粒pEX18S，作为表达系统的载体；将外源基因插入到新质粒中即可将其整合到D2突变株基因组中的原smp基因所在位置，并进行高效胞外分泌表达。本发明的优点是：能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。

Description

一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种以嗜麦芽寡养单胞菌D2突变株为工程菌、以同源重组质粒pEX18S为载体的外源蛋白原核分泌表达系统及其应用。

背景技术

蛋白/基因表达是指结构基因在生物体(宿主)中的转录、翻译以及加工过程；基因工程技术中所谓的外源蛋白表达则是指将获得的外源基因片段通过载体重组到一个基因表达宿主中，使其能产生具有生物活性大量蛋白表达产物，是当今分子生物学领域应用最广泛的技术手段之一。随着生物工业生产工艺的发展，利用该技术已经成功生产出多种疫苗、生化药物、工业酶等具有重要功能或用途的蛋白、多肽类生物产品。生命科学的各个领域对高纯度、高产量和高稳定性的重组功能蛋白的需求日益增长，这使得外源蛋白表达技术成为基因工程、生物制药研究和应用的重要内容，也是生命科学研究领域的热点之一。

含有目的基因的宿主能否高效表达外源蛋白取决于多种因素，主要包括基因的结构特征、表达系统(宿主菌、载体)和细胞培养等多个方面，其中，外源基因的表达系统是影响蛋白表达的关键因素之一。一个理想的表达体系应具备目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高，而且表达产物容易分离纯化等特点。然而，高产量、高纯度的蛋白表达、生产仍然是目前的瓶颈技术，其主要原因是缺乏可用于生产外源蛋白的分泌表达系统。

蛋白表达系统的宿主可以为原核细胞(细菌)或真核细胞(酵母、植物细胞、动物细胞等)。酵母作为表达工具表达产量通常较低，表达质粒易于丢失，外源整合基因不稳定，较难用于外源蛋白的产业化；而哺乳类细胞、昆虫细胞等表达系统，虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂、表达水平低，产业化生产造价昂贵，不易普遍推广使用。

原核蛋白表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是由于目前以大肠杆菌为代表的多数原核细胞在大量生产时，其表达的外源目的蛋白常以包涵体形式表达，为胞内不溶性表达，活性产物分离纯化困难，需要通过复性等复杂的步骤才能部分恢复活性，从而限制了其应用。相比之下，如果外源蛋白能以“胞外分泌”的形式表达，产物分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白一般可溶，在分泌的过程中能获得有生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，不仅利于表达蛋白的纯化，还大大减小了毒性蛋白对细胞的毒害作用。因此，外源蛋白的胞外分泌表达被认为是利用基因工程技术生产外源蛋白质的最佳方式。枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌等工程菌有更加完整的分泌体系，蛋白在胞内表达后能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，即“分泌表达”，形成包涵体少，目的蛋白的回收相对简单，但其在表达外源蛋白的同时，往往自身也会向胞外分泌大量的蛋白酶，使外源蛋白无法稳定存在。

由上可见，寻找一种既能高效外来基因，又可增加蛋白质溶解性，而且目的产物易于纯化的方法或系统，仍然是目前备受关注的研究热点和重要任务。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，通过所含工程菌和同源重组载体，实现外源蛋白的分泌表达的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，包含工程菌和同源重组载体，其中该工程菌为嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其smp基因被定点敲除，该同源重组载体命名为pEX18S，其序列如SEQ ID：1所示。

所述嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其菌种分类名称为：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)D2smpmutant，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年01月19日，保藏编号：CGMCC NO：10365。

所述pEX18S以同源重组质粒pEX18Tc为骨架，按5'→3'将pEX18Tc的原多克隆位点的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ间的序列替换为嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因的上游同源臂序列、新的多克隆位点、嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因下游同源臂序列，其中上游同源臂序列内含有嗜麦芽寡养单胞菌D2株的信号肽序列。

所述同源重组载体pEX18S的制备方法包括如下步骤：

步骤1.基因组DNA的提取

将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株接种于LB液体培养基中过夜培养，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

步骤2.smp基因缺失片段的制备

1)引物设计

根据嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株smp基因开放读码框架两侧的序列分别设计上、下游同源臂的扩增引物，以扩增获得不含smp基因序列的片段，

上游同源臂扩增引物：

正向引物UP-F：核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

反向引物UP-R：核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

下游同源臂扩增引物：

正向引物DOWN-F：核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；

反向引物DOWN-R：核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；

2)PCR分别扩增上、下游同源臂：

其中，模板为步骤1提取的基因组DNA，引物为上、下游同源臂扩增引物UP-F、UP-R和DOWN-F和DOWN-R；

反应体系50μL，其组成：

模板2.0μL，

HS DNA Polymerase 0.5μL，浓度为5U/μl，

2×GC Buffer 25μL，

dNTP 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/L，

dd H₂O 15.5μL，

引物各1.5μL，引物浓度为10μmol/L；

PCR扩增参数：

94℃预变性5min；

98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 40s，30个循环；

72℃延伸10min；

3)上、下游同源臂扩增产物的纯化

使用PCR产物纯化试剂盒对上、下游同源臂扩增产物进行纯化；

4)SOE PCR连接

PCR引物为上游同源臂的正向引物UP-F和下游同源臂的反向引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；

扩增体系：

模板各1μL；

浓度为5U/μL的HS DNA polymerase 0.5μL，

2×GC Buffer 25μL，

dNTPs 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/L

dd H₂O 15.5μL，

引物各1.5μL，引物浓度10μmol/L；

PCR扩增参数：

94℃预变性5min；

98℃10s，60℃5s，72℃1min10s，30个循环

72℃延伸10min，

获得smp基因缺失片段并纯化，纯化方法与纯化上、下游同源臂扩增产物相同；

步骤3.同源重组载体pEX18S的构建

1)双酶切

将步骤2获得的smp基因缺失片段和pEX18Tc质粒分别进行Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，酶切体系20μL体系：

10×buffer 2.0μL，

smp基因缺失片段或pEX18Tc质粒5.0μL，

Hind Ⅲ 1.0μL，

EcoR Ⅰ 1.0μL，

dd H₂O 11μL；

反应条件：37℃水浴30min，获得酶切产物，所述酶切产物为线性pEX18Tc质粒或双酶切后的smp基因缺失片段；

2)酶切产物的纯化：

使用凝胶回收试剂盒分别纯化回收上述酶切产物：

3)连接获得同源重组载体pEX18S

反应体系：

10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，

T4 DNA Ligase 1μL，

线性pEX18Tc质粒1μL，

双酶切后的smp基因缺失片段4μL，

dd H₂O 3μL，

合计：10μL，

反应条件：16℃过夜，获得同源重组载体pEX18S。

本发明还提供一种外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。

本发明还提供所述的外源蛋白原核分泌表达系统表达外源蛋白的方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增目的外源蛋白的基因片段，并且在其两端加入酶切位点；

2)将目的蛋白的基因片段和权利要求1所述同源重组载体pEX18S分别进行双酶切、连接，构建含有外源蛋白基因片段的重组质粒；

3)将含有外源蛋白基因的重组质粒转化到宿主细胞中，扩增培养；

4)将宿主细胞和所述的嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株进行同源重组，获得含有外源蛋白基因的嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株；

5)培养含有外源蛋白基因的嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株，分离上清液，纯化获得外源蛋白。

优选地，步骤3)所述宿主细胞为大肠杆菌SM10λpir。

本发明的特点在于：

1.表达系统中所采用的工程菌是以嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株经过基因工程改造后获得的突变株。具体说是以嗜麦芽寡养单胞菌D2株为出发菌，将该菌染色体上的D2蛋白酶基因(以下以smp表示)定点敲除，获得嗜麦芽寡养单胞菌smp基因缺失突变株，作为本发明表达系统的外源蛋白分泌表达工程菌。

嗜麦芽寡养单胞菌D2株是从双齿围沙蚕消化道中分离出的一株革兰阴性菌菌株，能够胞外大量分泌某种蛋白酶(SMP)，其特点为：(1)蛋白分泌到胞外，即培养基上清液中，易于分离纯化，(2)蛋白产量大，(3)纯度高；因此，非常适合作为外源蛋白的分泌表达的工程菌株。在本发明的表达系统中，通过同源重组技术，将嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组中SMP的编码基因敲除，从而获得嗜麦芽寡养单胞菌D2的突变株(smp基因缺失株)。当需表达其他外源蛋白时，只需将外源蛋白的编码基因重组到本发明构建的同源重组质粒pEX18S中，然后同源重组到原smp基因所在位置，即可进行分泌表达。

由于该工程菌中已经敲除了原野生菌株的smp基因，所以，若外源基因与突变株基因组重组成功，则细菌培养液中的蛋白主要为所需表达的外源目的蛋白；而若重组不成功，则培养液中不会出现SMP蛋白条带，从而避免了结果的误判。另外，由于SMP蛋白具有蛋白酶活性，故当工程菌表达外源蛋白时，菌株自身的蛋白酶表达大大降低，从而避免了其对表达产物的破坏，使外源蛋白能稳定存在。

2.同源重组载体pEX18Tc是一种自杀质粒，其宿主范围广，可通过接合转移基因，不能在宿主菌细胞里进行独立复制，只有被整合入染色体上后和染色体一起复制，因此可利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失/置换菌株。pEX18Tc携带有SacB基因、tet基因等筛选标记及多克隆位点(MCS)。本发明以pEX18Tc为基础，通过SOE PCR的方法连接合成一个用于插入质粒pEX18Tc的长度为1135bp的片段，该片段由上游同源臂-多克隆位点-下游同源臂组成，具体排列顺序为：5’-Hind Ⅲ酶切位点-上游同源臂(末端为信号肽序列)-多克隆位点-下游同源臂-EcoR Ⅰ酶切位点-3’，将该片段及质粒pEX18Tc分别进行Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，然后将两片段用连接酶连接，从而获得可简便地将外源蛋白的基因序列插入到嗜麦芽寡养单胞菌D2突变株中进行高效分泌表达的新型同源重组载体pEX18S。

3.同源臂的作用是定位自杀质粒的整合位点，以利用同源重组技术精确地将外源基因插入到指定位置。本发明构建的pEX18S中的上、下游同源臂的序列是根据嗜麦芽寡养单胞菌D2株SMP开放读码框架两侧的序列设计的，可以使外源基因序列插入到本发明的工程菌基因组中原smp基因所在的位置，替代SMP蛋白进行高效胞外分泌表达。

4.本发明构建的pEX18S序列中，多克隆位点3’端上游81bp为信号肽的基因序列，为嗜麦芽寡养单胞菌smp基因所特有，属于sec信号肽，经过SignalP等软件分析推断，具有较高的引导蛋白分泌的效率，本发明将其命名为S_SMP，可高效地引导其下游多克隆位点中插入的外源蛋白基因的胞外分泌表达。

5.本发明构建的pEX18S序列中的多克隆位点含有Sal Ⅰ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ、Sac Ⅰ、EcoICR I和Not Ⅰ等酶切位点，其中Not I为低频的限制内切酶，在基因组中出现频率较低，从而减少了外源插入片段序列中含有相同酶切位点的几率，扩大了本系统的适用序列范围。

6.使用本发明的外源蛋白原核分泌表达系统表达的外源蛋白时，只要将编码蛋白的目的基因片段酶切后，连接插入到pEX18S的多克隆位点中，然后通过结合的方法转入到嗜麦芽寡养单胞菌smp基因缺失株中，目的基因即可通过同源重组定点插入到该菌株的基因组中，从而以胞外分泌的方式获得目的蛋白。

本发明的有益效果为：

1.构建的工程菌能以胞外分泌的方式高效表达外源蛋白，后续的分离纯化简便，蛋白的生物学活性不易损失。

2.本发明构建了同源重组载体pEX18S已含有上下游同源臂、多克隆位点以及高引导效率的信号肽序列，使用者只需将要表达的外源蛋白的基因序列插入到多克隆位点中，即可直接通过同源重组技术将其重组到工程菌的基因组DNA中进行下一步的分泌表达，大大省略了操作步骤，使用非常方便。

附图说明

图1为pEX18Tc插入片段结构示意图。

图2为PCR产物及质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果照片，其中泳道1为DNAmarker，2为上游同源臂PCR产物，3为下游同源臂PCR产物，4为SOE PCR链接产物，5为pEX18Tc质粒双酶切产物，6为未酶切的质粒pEX18S，7为质粒pEX18S双酶切产物。

图3为嗜麦芽寡养单胞菌D2株SMP氨基酸序列的Sec信号肽分析结果。

图4为嗜麦芽寡养单胞菌SMP信号肽的序列及特征。

图5为pEX18S质粒构建策略示意图。

图6为嗜麦芽寡养单胞菌D2 △smp缺失株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果照片，其中泳道M为DNA Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株，2为△smp缺失株。

图7为嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株与△smp缺失株培养液上清中的分泌蛋白SDS-PAGE电泳照片，其中泳道M为蛋白Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株；2为野生株。

图8为已插入M-IL-2编码基因的△smp:M-IL2突变株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果照片，其中泳道M为DNA Marker，1为△smp:M-IL2突变株，2为△smp缺失株。

图9为嗜麦芽寡养单胞菌△smp:M-IL2突变株培养液上清中的分泌的外源蛋白SDS-PAGE电泳照片，其中泳道M为蛋白Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失D2株；2为△smp:M-IL2突变株，3为D2野生株。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。

本发明所涉及材料来源如下：

1.菌株：

嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株为本室分离，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：1868，其为四环素和氯霉素敏感型(tet^S，cat^S)，本发明用其四环素敏感型特性。

大肠杆菌SM10λpir为链霉素敏感型(Sm^S)，购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

2.质粒：

pEX18Tc质粒(pEX18Tc Suicide plasmind)由西北大学段康民教授惠赠。

pET/M-IL2质粒为本室构建。

3.试剂和试剂盒：

胰蛋白胨和酵母提取物购自英国OXOID公司。

牛肉膏和蛋白胨购自英国OXOID公司。

氯化钠购自天津瑞金特化学品有限公司。

基因组DNA提取试剂盒购自美国Promega公司，货号#A1120。

PCR产物纯化试剂盒(Wizard PCR preps DNA purificaton system)购自美国Promega公司，货号#A7280。

限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ、Sal Ⅰ、Sac Ⅰ及其buffer购自大连宝生物工程有限公司。

凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)购自美国Omega公司。

T4 DNA Ligase及其buffer购自大连宝生物工程有限公司。

HS DNA Polymerase with GC Buffer购自大连宝生物工程有限公司。

质粒提取试剂盒购自美国Omega公司。

所用试剂盒均按照试剂盒所附带说明书中提供的操作步骤进行操作。

4.材料：

0.45μm微孔滤膜购自上海医药工业研究院。

其余实验仪器设备均为分子生物学实验室常规仪器设备。

5.培养基

LB液体培养基配方为：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH7.5。

LB固体培养基配方为：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂糖1.5％，pH7.5。

含10％蔗糖的LB固体培养基配方为：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，蔗糖10％，琼脂糖1.5％，pH7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基配方为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，pH 7.5。

实施例1：基因组DNA的提取

将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株接种于LB液体培养基中25℃，150rpm摇床过夜培养至对数生长期，用基因组DNA提取试剂盒提取嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株的基因组DNA。

实施例2：smp基因缺失片段的制备

1)引物设计：

根据嗜麦芽寡养单胞菌D2株SMP开放读码框架两侧的序列分别设计上、下游同源臂的扩增引物， 以扩增获得不含smp基因序列的片段。

上游同源臂扩增引物

正向引物UP-F(SEQ ID No：2)：

5’- AAGCTTAGGTGCAGAAGGTGTATC-3’，

反向引物UP-R(SEQ ID No：3)：

5’-GCGAGCTCGGATCCTCTAGAGTCGACAGTCTGCGCCGAAGC-3’；

下游同源臂扩增引物：

正向引物DOWN-F(SEQ ID No：4)：

5’-TAGAGGATCCGAGCTCGCGGCCGCTACAAGGCCACCGCGGTTG-3’，

反向引物DOWN-R(SEQ ID No：5)：

5’- GAATTCGCCCAACGCCACCGCAATG-3’。

加粗字体代表保护碱基，下划线字体代表限制性内切酶酶切位点；其中，AAGCTT为Hind Ⅲ位点，GAATTC为EcoR Ⅰ位点，GCGAGCTCGGATCCTCTAGAGTC和TAGAGGATCCGAGCTCGCGGCCGC含有为进行SOE引入的互补序列。

2)PCR分别扩增上、下游同源臂：

取实施例1提取的基因组DNA为模板，上下游同源臂扩增引物UP-F、UP-R、DOWN-F和DOWN-R为引物；

反应体系(50μL)：模板2.0μL，HS DNA Polymerase (浓度5U/μl)0.5μL，2×GC Buffer 25μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4.0μL，dd H₂O 15.5μL，引物(浓度10μmol/L)各1.5μL。扩增条件为94℃预变性5min后，98℃ 10s，60℃ 5s，72℃40s，30个循环后72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳鉴定上、下游同源臂PCR产物，如图2所示，泳道1为DNA marker，2为上游同源臂PCR产物，3为下游同源臂PCR产物。

3)上、下游同源臂扩增产物的纯化：

用PCR产物纯化试剂盒对上、下游同源臂扩增产物进行纯化。

4)SOE PCR连接

PCR引物为上游同源臂的正向引物UP-F和下游同源臂的反向引物DOWN-R；模板为前一步的上、下游同源臂的纯化产物。

扩增体系：模板(上、下游同源臂纯化产物)各1μL，HS DNAPolymerase(浓度5U/μL)0.5μL，2×GC Buffer 25μL，dNTPs(2.5mmol/Leach)4.0μL，dd H₂O 15.5μL，引物(10μmol/L)各1.5μL；循环参数为：94℃预变性5min；98℃10s，60℃5s，72℃1min10s，30个循环后72℃延伸10min，获得用于插入质粒pEX18Tc的smp基因缺失片段，扩增产物长度为1135bp，产物两端为酶切位点Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ连接上游同源臂序列，并且上游同源臂序列中保留了嗜麦芽寡养单胞菌smp基因所特有的信号肽S_SMP，信号肽S_SMP下游连接多克隆位点MCS2，可用于插入外源蛋白基因，MCS2下游连接下游同源臂序列，下游同源臂序列下游连接EcoR Ⅰ，构建策略见图1。图2中第4泳道为扩增产物电泳图，可以看出与通过与DNA marker(第1泳道)比对，扩增产物大小与预测一致。

上游同源臂序列中保留的信号肽S_SMP，可具有较高地蛋白分泌的效率，高效地引导下游多克隆位点中插入的外源蛋白基因的胞外分泌表达。

图3为使用SignalP软件预测信号肽位置，从图3中可以看出采用神经网络法(NN)预测信号肽切割位点在24与25个氨基酸之间。图4为SMP信号肽的序列及特征，可以看出SMP信号肽的N端为带有正电荷氨基酸，中间为疏水氨基酸区域，C端带有极性氨基酸，为蛋白酶的切割位点。

实施例3：自杀质粒pEX18S的组装构建

1)双酶切

将实施例2获得的插入片段和pEX18Tc质粒的Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切：酶切体系20μL体系10×buffer 2.0μL，DNA 5.0μL，Hind Ⅲ 1.0μL，EcoR Ⅰ 1.0μL，dd H₂O 11μL；反应条件：37℃水浴30min，获得酶切产物，分别为酶切后的smp基因缺失片段和线性pEX18Tc质粒。其中pEX18Tc质粒双酶切产物见图2第5泳道所示。

2)酶切产物的纯化：使用凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)分别纯化回收以上酶切产物。

3)连接反应：体系(10μL)10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1μL，质粒1μL，插入片段4μL，dd H₂O 3μL。反应条件：16℃过夜，连接产物即为pEX18S质粒。pEX18S质粒的构建策略参见图5。

4)pEX18S质粒的扩增和提取：

a.将连接产物通过1×TSS法转化宿主菌大肠杆菌SM10λpir，

具体步骤为：将SM10λpir单个菌落接种至5ml LB液体培养基中，37℃培养过夜后取1ml培养物转至1.5ml EP管中，5000×g离心3min，弃上清；加入100μl 1×TSS溶液重悬细菌，加入连接产物混匀后冰浴40min，42℃热休克90sec，冰浴30s，向管中加入100μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min，然后涂在含有四环素(20μg/ml)的LB固体培养基上，37℃过夜培养后从挑取单克隆菌落，接种于LB液体培养基37℃过夜培养。

b.质粒提取

质粒提取使用美国Omega公司生产的质粒提取试剂盒，根据其说明书进行提取。

构建的自杀质粒pEX18S长度为7421bp，经测序验证，序列如SEQ ID No：1所示：其中第3555-3560位(AAGCTT)为HindⅢ酶切位点，第4057-4134位(ATGAACAAGTACAAGACCCTGGCCGCGCTGGTTGCCACCGCGCTGCTGGCCACTGCCGGTGCCGCTTCGGCGCAGACT)为信号肽编码序列，第4135-4166位(GTCGACTCTAGAGGATCCGAGCTCGCGGCCGC)为多克隆位点(MCS2)，第4678-4683位(GAATTC)为EcoR Ⅰ酶切位点。

实施例4：嗜麦芽寡养单胞菌smp基因缺失突变株的构建及鉴定

1)用于同源重组的自杀质粒的构建：首先用SOE PCR方法合成一段只有上、下游同源臂序列的片段，其中

上游同源臂扩增引物

正向引物UP-F(SEQ ID No:2)：

5’- AAGCTTAGGTGCAGAAGGTGTATC-3’，

反向引物UP-R’(SEQ ID No：6)：

5’-CAACCGCGGTGGCCTTGTAGACAGTCTGCGCCGAAGC-3’

下游同源臂扩增引物：

正向引物DOWN-F’(SEQ ID No：7)

5’-GCTTCGGCGCAGACTGTCTACAAGGCCACCGCGGTTG-3’

反向引物DOWN-R(SEQ ID No：5)：

5’- GAATTCGCCCAACGCCACCGCAATG-3’。

加粗字体代表保护碱基，下划线字体代表限制性内切酶酶切位点；其中，AAGCTT为Hind Ⅲ位点，GAATTC为EcoR Ⅰ位点

其余步骤方法参照实施例2，反应引物由UP-R和DOWN-F相应替换为UP-R’和DOWN-F’，然后连接到自杀质粒pEX18Tc中，获得同源重组质粒pEX18Tc’，并转化到宿主细胞大肠杆菌SM10λpir进行扩增(步骤方法参照实施例3)。其中pEX18Tc’比pEX18S缺少多克隆位点(MCS2)序列。

2)利用同源重组技术定点敲除嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组中的smp基因：

将含有同源重组载体pEX18Tc’的大肠杆菌SM10λpir(Sm^S，链霉素敏感)和嗜麦芽寡养单胞菌D2(tet^S，四环素敏感)菌株分别接种于LB液体培养基，180r/min培养至OD600约为0.6，之后4℃，5000r/min离心5min，收集菌体，再用100μl LB液体培养基重悬两菌。将菌液混合点样于1cm²大小的0.45μm微孔滤膜，然后将滤膜贴于LB固体培养基，30℃过夜接合。次日用1ml LB液体培养基洗涤滤膜，吸取适量洗下的菌液涂布在含有双抗(Sm和Tet)的LB平板上，30℃培养至长出单个菌落。挑取双抗平板上的单克隆菌落，分别接种到含10％蔗糖的LB平板上，23℃培养48h长出单克隆菌落，即为嗜麦芽寡养单胞菌D2 △smp缺失株。

2)突变株的鉴定：挑取2)中单克隆菌落提取基因组DNA(方法同实施例1)，根据敲除序列的内部基因设计鉴定引物进行PCR鉴定，以野生株D2为对照。其中，上游引物序列(SEQ ID No：8)为5’-TACAAGGGCAAGCCGGACAG-3’；下游引物序列(SEQ ID No：9)为5’-ACCTTGGTCGCATCGCTCAG-3’，产物为725bp。图6为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中泳道M为DNA Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株，2为△smp缺失株，可见1中在750bp附近看到清晰条带，说明含有smp部分基因序列，2中在该位置没有条带，说明不含有smp基因序列，证明敲除成功，成功获得△smp缺失株。

3)嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株SMP表达情况的观察

配制牛肉膏蛋白胨培养基；将野生株和△smp缺失株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，30℃，180r/min振荡培养48h。然后取适量上清进行SDS-PAGE电泳，如图7所示，其中泳道M为蛋白Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株；2为野生株，可见2(野生株)的培养液上清中有42KD的SMP蛋白条带，而1(缺失株)则没有该蛋白条带，进一步证明△smp缺失株构建成功。

实施例5：以本发明建立的原核分泌表达系统对外源蛋白(蜂毒肽和IL-2融合蛋白，以下简称M-IL2)的表达实例

1)M-IL2基因片段的PCR扩增：

引物设计：加粗字体代表保护碱基，下划线分别代表Sal Ⅰ、Sac Ⅰ酶切位点，扩增产物长度为420bp

正向引物M-IL2-F(SEQ ID No：10)：

5’- GTCGACGCACCTACTTCAAGTTCG-3’，

反向引物M-IL2-R(SEQ ID No：11)：

5’ GAGCTCTTAAGTTAGTGTTGAGATGATG-3’，

加粗字体代表保护碱基，下划线字体代表限制性内切酶酶切位点，其中GTCGAC为Sal Ⅰ位点，GAGCTC为Sac Ⅰ位点。

PCR扩增反应体系50μL：

模板(含有M-IL2融合蛋白ORF的质粒pET/M-IL2(本室构建))2.0μL，

Primer STAR polymerase(5U/μl)0.5μL，

2×GC Buffer 25μL，

dNTP(2.5mmol/L each)4.0μL，

dd H₂O 15.5μL，

正向引物M-IL2-F和反向引物M-IL2-R(10μmol/L)各1.5μL。

扩增条件为：94℃预变性5min；98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸10min，获得两端分别带有Sal Ⅰ、Sac Ⅰ的IL-2的基因插入片段，经测序序列长度420bp如SEQ ID NO：12所示，与预期一致。

2)同源重组质粒pEX18S和M-IL2插入片段的双酶切：

将实施例1-3构建成功的pEX18S质粒和前一步骤获得的M-IL2插入片段进行双酶切，酶切体系为50μL：10×buffer 5μL，DNA(pEX18S或M-IL-2插入片段)4μL，Sal Ⅰ 1μL，SacⅠ 1μL，dd H₂O 39μL；反应条件：37℃水浴30min，获得酶切后的线性同源重组质粒pEX18S和M-IL2插入片段。

3)同源重组质粒构建：将产物用凝胶回收试剂盒纯化回收以上酶切产物后，连接反应：体系(10μL)10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1μL，质粒1μL，插入片段4μL，dd H₂O 3μL。反应条件：16℃过夜。将连接产物通过1×TSS法转化宿主菌大肠杆菌SM10λpir，其方法参照实施例3中进行，质粒提取使用质粒提取试剂盒提取得到的重组质粒pEX18s/M-IL2，进行双酶切鉴定。

4)利用同源重组技术将M-IL2基因插入到工程菌的基因组中：

将含有重组质粒pEX18s/M-IL2的大肠杆菌SM10λpir和嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株分别接种于LB液体培养基，振荡培养后经离心，收集菌体。再用适量LB液体培养基重悬两菌，将菌液混合点样于1cm²大小的0.45μm微孔滤膜，然后将滤膜贴于LB固体培养基，30℃过夜接合。次日用1ml LB液体培养基洗涤滤膜，吸取适量洗下的菌液涂布在含有双抗(Sm和Tet)的LB平板上，30℃培养至长出单个菌落。挑取双抗平板上的单克隆菌落，分别接种到含10％蔗糖的LB平板上，23℃培养48h长出单克隆菌落，挑取单克隆菌落提取基因组DNA进行PCR鉴定，鉴定引物分别为M-IL2-F/M-IL2-R，以△smp缺失株为对照，如图8所示，其中泳道M为DNA Marker，1为△smp:M-IL2突变株，2为△smp缺失株，可以看到1中在不到500bp处有一清晰条带，为插入片段条带，2中则无该条带，证实M-IL2的基因已插入到嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株的基因组中，所得菌株命名为△smp:M-IL2突变株。

5)外源蛋白M-IL2的分泌表达及鉴定：

将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株、△smp缺失株和△smp:M-IL2突变株分别培养于牛肉膏蛋白胨培养基中，培养48h后分离得到上清。取适量上清进行SDS-PAGE电泳，如图9所示，其中泳道M为蛋白Marker，1为嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失D2株；2为△smp:M-IL2突变株，3为D2野生株，结果可见1中，没有明显蛋白条带，2中可见约为18kD大小的清晰的蛋白条带，3中可见42kD大小的蛋白条带(SMP蛋白)。说明构建的△smp:M-IL2突变株可表达外源M-IL2蛋白，并分泌到胞外。

需要说明的是，实施例5以M-IL2为例说明本发明的外源蛋白表达系统可以将外源蛋白表达并分泌到胞外，但并非仅限于M-IL2，而是只要是具有完整的ORF(开放阅读框)的蛋白都可以使用本发明的外源表达系统进行表达。

从上述实施例可以看出，本发明所构建的外源蛋白表达系统可将外源蛋白插入到同源重组载体中，通过同源重组将外源基因整合到嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp突变株中smp基因所在位置，借助其胞外分泌系统大量生产外源目的蛋白，且无蛋白酶干扰，所得蛋白无须复性，蛋白活性高，易于纯化，操作简便，具有很好的产业化前景。

Claims (4)

1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包含工程菌和同源重组载体，其中该工程菌为嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其smp基因被定点敲除，该同源重组载体命名为pEX18S，其序列如SEQ ID No:1所示，所述pEX18S以同源重组质粒pEX18Tc为骨架，按5'→3'将pEX18Tc的原多克隆位点的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ间的序列替换为嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因的上游同源臂序列、新的多克隆位点、嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因下游同源臂序列，其中上游同源臂序列内含有嗜麦芽寡养单胞菌D2株的信号肽序列；

其中，所述嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其菌种分类名称为：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)D2smpmutant，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年01月19日，保藏编号：CGMCC NO:10365；

其中，所述同源重组载体pEX18S的制备方法包括如下步骤：

步骤1.基因组DNA的提取

将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株接种于LB液体培养基中过夜培养，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

步骤2.smp基因缺失片段的制备

1)引物设计

根据嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株smp基因开放读码框架两侧的序列分别设计上、下游同源臂的扩增引物，以扩增获得不含smp基因序列的片段，

上游同源臂扩增引物：

正向引物UP-F：核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

反向引物UP-R：核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

下游同源臂扩增引物：

正向引物DOWN-F：核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；

反向引物DOWN-R：核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；

2)PCR分别扩增上、下游同源臂：

其中，模板为步骤1提取的基因组DNA，引物为上、下游同源臂扩增引物UP-F和UP-R、DOWN-F和DOWN-R；

反应体系50μL，其组成：

模板2.0μL，

HS DNA Polymerase 0.5μL，浓度为5U/μl，

2×PrimerGC Buffer 25μL，

dNTP 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/L，

dd H₂O 15.5μL，

引物各1.5μL，引物浓度为10μmol/L；

PCR扩增参数：

94℃预变性5min；

98℃10s，60℃5s，72℃40s，30个循环；

72℃延伸10min；

3)上、下游同源臂扩增产物的纯化

使用PCR产物纯化试剂盒对上、下游同源臂扩增产物进行纯化；

4)SOE PCR连接

PCR引物为上游同源臂的正向引物UP-F和下游同源臂的反向引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；

扩增体系：

模板各1μL；

浓度为5U/μL的PrimerHS DNA polymerase 0.5μL，

2×PrimerGC Buffer 25μL，

dNTPs 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/L

dd H₂O 15.5μL，

引物各1.5μL，引物浓度10μmol/L；

PCR扩增参数：

94℃预变性5min；

98℃10s，60℃5s，72℃1min10s，30个循环；

72℃延伸10min；

获得smp基因缺失片段并纯化，纯化方法与纯化上、下游同源臂扩增产物相同；

步骤3.同源重组载体pEX18S的构建

1)双酶切

将步骤2获得的smp基因缺失片段和pEX18Tc质粒分别进行Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，酶切体系20μL体系：

10×buffer 2.0μL，

smp基因缺失片段或pEX18Tc质粒5.0μL，

HindⅢ1.0μL，

EcoRⅠ1.0μL，

dd H₂O 11μL；

反应条件：37℃水浴30min，获得酶切产物，所述酶切产物为线性pEX18Tc质粒或双酶切后的smp基因缺失片段；

2)酶切产物的纯化：

使用凝胶回收试剂盒分别纯化回收上述酶切产物：

3)连接获得同源重组载体pEX18S

反应体系：

10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，

T4DNA Ligase 1μL，

线性pEX18Tc质粒1μL，

双酶切后的smp基因缺失片段4μL，

dd H₂O 3μL，

合计：10μL，

反应条件：16℃过夜，获得同源重组载体pEX18S。

2.如权利要求1所述的外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。

3.如权利要求1所述的外源蛋白原核分泌表达系统表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)PCR扩增目的外源蛋白的基因片段，并且在其两端加入酶切位点；

2)将目的蛋白的基因片段和权利要求1所述同源重组载体pEX18S分别进行双酶切、连接，构建含有外源蛋白基因片段的重组质粒；

3)将含有外源蛋白基因的重组质粒转化到宿主细胞中，扩增培养；

4)将宿主细胞和如权利要求2所述的嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株进行同源重组，获得含有外源蛋白基因的嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株；

5)培养含有外源蛋白基因的嗜麦芽寡养单胞菌△smp缺失株，分离上清液，纯化获得外源蛋白。

4.如权利要求3所述的外源蛋白原核分泌表达系统表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌SM10λpir。