CN109897811A - 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 - Google Patents
一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109897811A CN109897811A CN201910135472.0A CN201910135472A CN109897811A CN 109897811 A CN109897811 A CN 109897811A CN 201910135472 A CN201910135472 A CN 201910135472A CN 109897811 A CN109897811 A CN 109897811A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- expression
- primer
- carrier
- foreign protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 26
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- -1 0.5 2.0 μ L Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用。
背景技术
蛋白/基因表达是指结构基因在生物体(宿主)中的转录、翻译以及加工过程；基因工程技术中所谓的外源蛋白表达则是指将获得的外源基因片段通过载体重组到一个基因表达宿主中，使其能产生具有生物活性大量蛋白表达产物，是当今分子生物学领域应用最广泛的技术手段之一。随着生物工业生产工艺的发展，利用该技术已经成功生产出多种疫苗、生化药物、工业酶等具有重要功能或用途的蛋白、多肽类生物产品。生命科学的各个领域对高纯度、高产量和高稳定性的重组功能蛋白的需求日益增长，这使得外源蛋白表达技术成为基因工程、生物制药研究和应用的重要内容，也是生命科学研究领域的热点之一。
含有目的基因的宿主能否高效表达外源蛋白取决于多种因素，主要包括基因的结构特征、表达系统(宿主菌、载体)和细胞培养等多个方面，其中，外源基因的表达系统是影响蛋白表达的关键因素之一。一个理想的表达体系应具备目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高，而且表达产物容易分离纯化等特点。然而，高产量、高纯度的蛋白表达、生产仍然是目前的瓶颈技术，其主要原因是缺乏可用于生产外源蛋白的分泌表达系统。
蛋白表达系统的宿主可以为原核细胞(细菌)或真核细胞(酵母、植物细胞、动物细胞等)。酵母作为表达工具表达产量通常较低，表达质粒易于丢失，外源整合基因不稳定，较难用于外源蛋白的产业化；而哺乳类细胞、昆虫细胞等表达系统，虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂、表达水平低，产业化生产造价昂贵，不易普遍推广使用。
原核蛋白表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是由于目前以大肠杆菌为代表的多数原核细胞在大量生产时，其表达的外源目的蛋白常以包涵体形式表达，为胞内不溶性表达，活性产物分离纯化困难，需要通过复性等复杂的步骤才能部分恢复活性，从而限制了其应用。相比之下，如果外源蛋白能以“胞外分泌”的形式表达，产物分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白一般可溶，在分泌的过程中能获得有生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，不仅利于表达蛋白的纯化，还大大减小了毒性蛋白对细胞的毒害作用。因此，外源蛋白的胞外分泌表达被认为是利用基因工程技术生产外源蛋白质的最佳方式。枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌等工程菌有更加完整的分泌体系，蛋白在胞内表达后能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，即“分泌表达”，形成包涵体少，目的蛋白的回收相对简单，但其在表达外源蛋白的同时，往往自身也会向胞外分泌大量的蛋白酶，使外源蛋白无法稳定存在。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；
根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；
以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；
反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×Es Taq Master mix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL；
重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；
将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。
根据本发明实施例的第二个方面，提供如本发明实施例的第一个方面所述的外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。
本发明提出一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一种外源蛋白原核分泌表达系统，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；
根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；
以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；
反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×Es Taq Master mix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL；
重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；
将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。
根据本发明实施例还提供如本发明上述各实施例所述的外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。
综上所述，本发明提出一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；
根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；
以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；
反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×Es Taq Master mix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL；
重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；
将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。
2.如权利要求1所述的外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910135472.0A CN109897811A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910135472.0A CN109897811A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109897811A true CN109897811A (zh) | 2019-06-18 |
Family
ID=66945305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910135472.0A Pending CN109897811A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109897811A (zh) |
-
2019
- 2019-02-22 CN CN201910135472.0A patent/CN109897811A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 钱立生等: "《生物工程综合实验实训教程》", 31 January 2018, 安徽科学技术出版社 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110128521B (zh) | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 | |
| CN105061589B (zh) | 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法 | |
| CN107245494A (zh) | Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法 | |
| CN106676086B (zh) | 一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因 | |
| CN102839165A (zh) | 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法 | |
| CN102757974B (zh) | 一种重组人表皮生长因子的新型制备方法 | |
| CN104450746A (zh) | 一种向蛋白质定点引入非天然氨基酸的方法 | |
| CN104402975B (zh) | 抗衰老短肽及其制备方法 | |
| CN112980865A (zh) | 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法 | |
| CN104195157A (zh) | 生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法 | |
| CN101429519A (zh) | 重组人胰岛素样生长因子-1(igf-1)融合蛋白的制备方法 | |
| CN102020712B (zh) | 一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法 | |
| EP3000823B1 (en) | Strong secretory signal peptide enhancing small peptide motif and use thereof | |
| CN104131021A (zh) | 抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法 | |
| CN102628058B (zh) | 制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液 | |
| CN111363028B (zh) | 重组人源ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 | |
| CN102559730B (zh) | 一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN109897811A (zh) | 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 | |
| CN104846001B (zh) | 一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用 | |
| CN109266676A (zh) | 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法 | |
| CN104163865A (zh) | 优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的dna序列及其编码蛋白质 | |
| CN101948837A (zh) | 在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法 | |
| CN101182475A (zh) | 高效表达弹性蛋白酶的毕赤酵母及其构建方法和应用 | |
| CN102286530A (zh) | 一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用 | |
| CN103589769A (zh) | 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190618 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |