CN102286530A - 一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用。利用质粒HSP702-GFP和THX-HGFP，通过PCR和酶切连接等方法构建中间载体TH-HGFP；利用质粒TH-HGFP、PET23a-GST和pCDNA3.1-FLAG，通过PCR和酶切连接等方法分别构建中间载体TH-HIS-HGFP、TH-GST-HGFP和TH-FLAG-HGFP；利用上述中间载体分别与质粒pD5H8，通过PCR和酶切连接等方法构建四膜虫表达载体：pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP。该系列载体均含有绿色荧光筛选标记HGFP，可用于重组子的高通量筛选；该系列载体可替代盒式结构HGFP两侧均含反向的I-SceI稀有酶切位点，引入外源基因时，将带I-SceI接头的外源基因片段与用I-SceI处理后的该系列载体一步连接，即可得到含外源基因的四膜虫表达载体。本发明操作方便快捷，引入外源基因的四膜虫表达载体转染四膜虫后可实现外源基因的高效表达。

Description

一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体，同时还涉及一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体的构建方法，还涉及一种外源基因的四膜虫转基因表达载体的用途。特别适用于构建真核蛋白质的四膜虫rDNA表达载体，并于四膜虫中高效表达。还涉及到其在蛋白质相互作用研究上的应用。

背景技术

无论是作为食品、食品添加剂、工业原料、药品还是其他，蛋白质都跟我们的日常生活息息相关，其应用是十分广泛的。如具有广泛用途的淀粉酶，存在于人体内起着各种生理功能的含量很少以至微量的肽、蛋白质、糖肽，作为抗生素的抗菌肽等，然而由于天然存在的某些蛋白质产量、纯度低或是活性不高，难以满足需求；此外为了更深入地了解一些新发现的蛋白质分子的一级和二级结构及其生物学功能的研究，也需要得到大量蛋白产品才能得以实现。目前生产蛋白质的技术主要有：从动物和植物中提取；化学合成；用蛋白质重组技术表达，并用发酵技术生产。从动物和植物中提取的优点是蛋白质的活性高、稳定，专一性强，技术难度相对较小，但动植物组织中抗菌肽含量有限，而且提取方法繁琐却产量和回收率都很低，并且成本昂贵。化学合成蛋白质成本太高，对环境的污染很大，而且产业化困难。因此由于成本的原因，用提取和化学合成技术生产蛋白质往往很难在实际生产上应用。蛋白质重组技术和发酵工程技术的发展，使得科学家能够利用这些技术提高蛋白质的产量，克服提取和化学合成技术上遇到的难题。因此蛋白质重组技术和发酵工程技术是蛋白生产技术的发展趋势。

由于动物细胞表达系统成本高，不适用大规模生产蛋白质，到目前为此，用于表达外源蛋白的表达系统主要有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。而大肠杆菌表达系统虽然具有外源基因表达产物的水平高等优点，但是因其缺乏真核转录后加工及翻译后加工等功能，其表达的产物往往活性不高或是无活性等(特别是用其表达真核蛋白时)，使其应用受到限制(孙柏欣，刘长远，陈彦，赵华，赵彤华，李柏宏.基因表达系统研究进展.2008年第2期，205-209；谢磊，孙建波，张世清等.大肠杆菌表达系统及其研究进展[J].华南热带农业大学学报，2004，10(2)：16-20)；酵母表达系统因为酵母菌是真核生物，与动物细胞一样具有转录、翻译后的多种加工过程，能够表达出多种具有活性的外源蛋白而备受关注。但也存在着明显的局限，如以酿酒酵母为主体的表达系统中缺乏强有力的启动子、分泌效率差、质粒不稳定、难以达到很高发酵密度、只能分泌少量蛋白、其翻译后加工与高等真核生物有所不同等(郑光宇.真核生物表达系统研究进展[J].喀什师范学院学报，2004，25(6)：33-36；李艳，王正祥.酵母作为外源基因表达系统的研究进展[J].生物工程进展，2001，21(2)：10-14.)。总之，各种表达系统各有优缺点。随着基因重组技术的发展，选择表达系统对于目的产物制备是相当重要的，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。研发新型外源蛋白的高效表达系统一直是相关领域的研究热点。

四膜虫(Tetrahymena)隶属于原生动物亚门、纤毛亚门、寡膜纲、膜口目、四膜科属，是单细胞真核生物；过去50年中，以四膜虫为实验对象取得的一系列突破性的成果包括：核酶的发现(获1989年诺贝尔化学奖)、端粒与端粒酶的发现(获2009年诺贝尔生理与医学奖)、组蛋白和微管蛋白翻译后修饰功能、发育中大核DNA重整中的RNAi模型等等，说明四膜虫虽然是单细胞生物，但其具备真核生物基本生命特征。四膜虫蛋白表达系统中二硫键的正确配对和蛋白修饰作用克服了大肠杆菌表达的蛋白一般不会形成正确的二硫键和缺少翻译后的修饰的缺点，同时四膜虫中表达蛋白只有简单的N-糖基化，不存在如酵母中丰富的甘露糖残基修饰，植物中丰富的木糖残基修饰等非哺乳动物中的修饰类型，这些生物学特性使其能够作为理想的真核表达系统(潘惟钧，樊启昶.四膜虫——分子生物学研究的理想材料.生物学通报，1990年第2期：13-16.)。

自然界中，四膜虫主要以水中的细菌和其它有机质为食，目前还没有发现它能引起人体疾病或危害人类健康，以四膜虫为表达系统安全可靠。

实验室中，四膜虫营养生长快速(2-3小时一代)，且作为第一种进行无菌纯培养并且实现细胞同步化的真核细胞，相比其它模式生物或细胞系(如秀丽线虫、鱼类和哺乳动物体细胞)，其培养简单、经济，操作精确度高和可控性强，而且可以实现工业化大规模培养，细胞密度最高可到10⁷个/毫升。利用四膜虫发酵技术生产重组蛋白国外已有报道，在四膜虫中可表达疫苗，单克隆抗体等蛋白。如Guberman等人进行了在四膜虫中大规模生产磷脂酶A1的研究(A.Guberman，M.Hartmann，A.Tiedtke，J.Florin-Christensen，M.Florin-Christensen.Amethod for the preparation of Tetrahymena thermophila phospholipase A1 suitable for large-scaleproduction.Journal of Applied Microbiology 1999，86，226-230)。

2005年底嗜热四膜虫大核基因组测序计划(Tetrahymena thermophila MacronuclearGenome Sequencing Project)已经完成、相应的预测基因数据库(Tetrahymena Genome Database，TGD)也已公布、另有近5万条基因表达序列标签(expressed sequence tag，EST)的数据支持。比较基因组学的研究表明，拥有24000多个大核基因的嗜热四膜虫较酵母与人类具有更高程度的功能保守性，是开展真核生物基因功能研究的良好材料，即有利于表达包括水产动物抗菌肽基因在内的真核生物蛋白。2007-2008年，对嗜热四膜虫构建了世界上第一个纤毛虫全基因组基因表达芯片分析平台，完成了嗜热四膜虫在3种典型生理或发育状态下共20个时期的全基因组表达数据的采集和分析，以此为基础建立的四膜虫基因表达数据库(TetrahymenaGene Expression Database)和网站(http://tged.ihb.ac.cn/)已成为四膜虫基因组学研究的重要资源。四膜虫全基因组基因表达数据分析也为我们找到安全、可控的高效四膜虫启动子提供了基础。

在四膜虫中已经建立起一系列成熟的基因重组和细胞转染的分子遗传学操作方法和技术，使得在嗜热四膜虫中进行基因敲除/插入、基因表达抑制和基因过表达等十分方便快捷。其中通过真核生物最高效启动子(四膜虫金属硫蛋白基因MTT1的启动子：大于300倍的诱导表达)和四膜虫特有的高拷贝载体(四膜虫rDNA载体：9,000-10,000个/细胞)可实现异源基因的过表达和可控诱导表达。国外已报道有多种外源基因在嗜热四膜虫体内成功表达，其中包括多子小瓜虫的I-抗原基因、恶性疟原虫的子环孢子蛋白基因，人的DNase I等(WeideT，Bockau U，Rave A，Herrmann L，Hartmann MW.A recombinase system facilitates cloning ofexpression cassettes in the ciliate Tetrahymena thermophila.BMC Microbiol.2007Mar 1；7：12)。

热激蛋白(Heat Stress Proteins，HSPs)，又称热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)或应激蛋白(Stress Proteins，SP)，是动物机体细胞在一些应激原，如环境高温、缺氧、重金属中毒、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢毒物等条件诱导下，激活HSP基因，高效表达的一组进化上高度保守的蛋白质。根据其相对分子质量，可将HSP分成6个家族，其中热休克蛋白70(Hsp70)是在大多数生物中含量最多，细胞应激后生成最显著，具有高度的保守性，因此在HSP中最受关注、研究最为深入。从功能上看，HSP70家族可分为组成型和热诱导型2种，它们主要参与新生肽的成熟与分拣(maturing and sorting)以及分泌蛋白向细胞器或胞外的转运等细胞活动，在胁迫条件下HSP70能防止蛋白降解，有利于变性蛋白的复性。高温是诱导HSP70表达的主要因素。热诱导HSP70的表达是通过热激转录因子(heat shock factors，HSFs)和某些相应的热激元件(heat shock elements，HSEs)起作用的(张侠，尹海波，熊冬金，张慧，赵彦修.植物热激蛋白70，植物生理学通讯，2004，40(4)，500-504)。在正常细胞中不表达或表达量很少，应激条件下表达迅速增高。正常情况下HSP70mRNA很不稳定，半衰期只有15～30min，而热应激下可长达4h(Thomas J，Mcgarry，et al.The preferential transaction of drosophila HSP70mRNA repuires sepuences in the untranslated leader[J].Cell，1985，42：311.)。热应激条件下细胞内其它mRNA虽不被降解，但翻译停止。HSP70mRNA则大量翻译，其5非翻译区有两个保守序列，热应激条件下可能与某些因子结合而促进其与核糖体结合，从而使HSP70mRNA优先翻译，若将这一区域连在其它基因上在热休克条件下该基因也能获得高表达。可见热应激下HSP70mRNA是通过增强稳定性和优先翻译来保证机体需要。因此，用HSP70启动子作为调控外源基因表达的启动子，既有利于启动外源基因的表达，也易于通过应激对外源基因的转录进行调控(程继忠，皇甫永穆，冯作化，等.人结核杆菌热休克蛋白70启动子对外源基因在分枝杆菌中表达的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(6)：410-415；Bukau B，Horwich AL.The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.Cell.1998.92(3)：351-366；〕Sorensen J.G.，Kristensen T.N.and Loescheke V.The evolutionary and ecological role of heatshock proteins.Ecological Letters，2003，6：1025-1037；冯立芳，缪炜。不同纬度螅状独缩虫耐热能力及Hsp70mRNA表达水平的比较。动物学报。2008，54(3)：525-530)。在原核生物嗜热四膜虫中，在37℃、39℃、41℃热激条件下，hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5这5个基因的表达水平高于正常生长时期的30℃。除hsp70-4外，其余4个hsp70基因的表达水平并不随着温度的升高而增加，在41℃时它们的表达水平要低于39℃。在37℃、39℃、41℃这3个不同热激条件下，hsp70-2对热激响应最敏感，其表达水平在5个hsp70基因中是最高的。因此可选用嗜热四膜虫的hsp70-2启动子构建高效表达且易于通过热激对外源基因的转录进行调控的四膜虫表达载体(冯立芳，畅悦，袁冬霞，缪炜.动物学研究.2011，32(3)：1-10)。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是1962年下村修和约翰森从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中分离出来的，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP能发射绿色荧光。后来查尔菲向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，而钱永健解释了其机制并使科学家很容易地使用绿色荧光蛋白，他还将颜色标签扩展至除绿色之外的颜色，以便可以用各种颜色标识不同的蛋白和细胞，这使绿色荧光蛋白技术的应用更加简单(崔志芳，邹玉红，季爱云.绿色荧光蛋白研究的三个里程碑——2008年诺贝尔化学奖简介.自然杂志，2008，30(6)：324～328)。GFP所发射的绿色荧光性质稳定，无种属限制。其独特之处在于：它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的(Trejc K，Sixma TK，Kitts PA，et al.Structural basis for dualexcitation and phot0is0merizati0n of the Aequorea victoria green fluorescent protein[J].Proc.Nat 1.Acad.Sci.USA，1997，94：2306-2311)。绿色荧光蛋白对生物体无毒无害，分子量小，方便构建载体，同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测，所以，作为一种生物分子标记(如载体的筛选标记等)，具有广泛的应用前景。GFP作为良好的细胞、发育、分子生物学的活体标记，用于监测各种体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用GFP进行示踪的研究范围相当广泛.从细胞生物学的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学和囊泡跟踪，到一些热门的前沿和学科和技术领域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。

因此，构建能高效稳定表达、转染生物体的操作技术简单、成功率高的含HSP70启动子、并能方便外源基因插入和筛选的四膜虫转基因表达载体用于外源蛋白的表达，特别是针对具有生物活性的真核来源的蛋白质的表达具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种一步法引入外源基因的四膜虫表达载体，该载体具有大肠杆菌宿主正常复制所需的复制起始点及Amp抗性筛选标记；载体的可替代盒式结构HGFP中的含绿色荧光筛选标记筛选，可替代盒式结构HGFP两侧引入了两个反向的识别序列长达18bp的稀有内切酶——归位酶I-Sce I作为克隆位点，使得载体的应用几乎不受酶切位点的限制，且酶切后的载体不做去磷酸化处理，也可有效地防止载体自连，一步连接即可完成外源基因的四膜虫表达载体的构建，一个PCR反应即可确定外源基因的插入方向；这一系列载体的rDNA骨架及HSP70-2启动子能实现目标基因的遗传转化和高效表达。这一系列表达载体可在同一载体上完成基因克隆、测序和高效表达三种功能并能方便地筛选重组子，从而简化了分子生物学操作步骤，节约了时间，减轻工作量，且成功率，可靠性都比较高，使用广泛。

本发明的另一个目的在于提供了一种一步法引入外源基因的四膜虫表达载体的构建方法。这一系列载体的构建过程中均通过PCR及酶切连接的方法构建中间载体TH-HGFP或TH-HIS-HGFP或TH-GST-HGFP或TH-FLAG-HGFP，这些载体含两端带有反向互补的I-Sce I酶切位点的绿色荧光筛选标记HGFP，然后将各中间载体的Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段或Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段或Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段或Not I-HSP70-25′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段通过Not I酶切位点引入到载体pD5H8，最后获得一系列一步法引入外源基因、绿色荧光蛋白筛选和高效表达外源基因的四膜虫转基因克隆表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP。从而简化了分子生物学操作步骤。

本发明的再一个目的在于提供了一种一系列一步法引入外源基因的四膜虫表达载体在表达外源蛋白GFP中的用途。外源基因gfp的四膜虫表达载体电转到四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，表达载体能替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，以实现目标基因的遗传转化，并在热激条件下，HSP70-2强启动子启动高效表达该基因的非融合蛋白或HIS融合蛋白或GST融合蛋白或FLAG融合蛋白。因此一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体可被用于克隆、高效表达外源基因，特别是表达真核蛋白，如抗体，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等药物等，这些蛋白质在治疗药物开发；诊断；人类和动物疫苗的开发；药物设计，工业酶生产等方面具有广泛的应用；还可根据需要任意选择不带标签、带GST标签、带HIS标签或带FLAG标签的表达载体，可应用于蛋白质的表达纯化及研究蛋白质相互作用等方面。

本发明是这样实现的：

本发明所述的一系列四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP均是一种HSP70-2基因启动子驱动外源基因的四膜虫转基因表达载体。四膜虫的HSP70-2基因启动子是一个强启动子，能高效启动下游基因的表达。以39℃热激处理条件下的四膜虫cDNA为模板，采用实时定量PCR方法比较嗜热四膜虫HSP70-2基因与目前已报道嗜热四膜虫HSP70-1基因(Barchetta S，La Terza A，Ballarini P，Pucciarelli S，Miceli C.Combination of two regulatory elements in the Tetrahymena thermophilaHSP70-1 gene controls heat shock activation.Eukaryot Cell.2008，7(2)：379-386.)，发现HSP70-2基因的相对表达量更高，相应的HSP70-2基因的启动子效率也更高〔冯立芳，畅悦，袁冬霞，缪炜.动物学研究.2011(已接收)〕。基于此，本发明所述的一系列四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有的四膜虫HSP70-2基因启动子是一个强启动子，能够实现外源基因的高效表达。

本发明所述的一系列四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有的盒式结构HGFP是个可替换的盒式结构。该盒式结构HGFP两侧各含有一个稀有I-Sce I酶切位点，并且该两个I-Sce I酶切位点的序列是反向的。首先将拟研究对象外源基因Y(可在四膜虫体内表达的任何无毒外源基因)经PCR扩增，在其起始密码子ATG前加上I-Sce I酶切位点，在其终止密码子TGA前(不保留终止密码子TGA)加上反向的I-Sce I酶切位点。接着经I-Sce I酶切将质粒pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP或pD5H8-FLAG-HGFP上的盒式结构HGFP替换为拟研究对象——外源基因Y，得到所需的质粒pD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST-Y或pD5H8-FLAG-Y(具体操作过程可参考本发明中所述表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的构建方法)。并且盒式结构HGFP中含有绿色荧光筛选标记，因而可以通过该筛选标记来筛选重组子。最后用电穿孔法转染所构质粒pD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST-Y或pD5H8-FLAG-Y到四膜虫体内，便使四膜虫成为一个表达外源基因Y的表达系统。

以gfp为例，将载体pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)通过电穿孔法转染到四膜虫体内后，在巴龙霉素药物筛选作用下，使得外源基因gfp在四膜虫体内拷贝数大量倍增。以Y-th-gfp-63F(10uM)，Y-th-gfp-64R为引物，分别对pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜虫表达株做Whole Cell PCR验证：a.收集150-200ul细胞与1.5ml的离心管中，以最大的转速离心6-10分钟或更长，倒掉上清。b.加80-100ul 1×Buffer K(2mM Mg²⁺)到细胞中，用吸管吹散将其悬浮起来，并转移到0.5ml的离心管中，使用PCR仪在55℃孵育1小时，99℃变性20分钟。c.将上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的体系中：20ul上述裂解物，0.5ul 10×PCRBuffer，1.4ul  MgCl₂(25mM)(Final 3mM)，0.5ul dNTP(10uM)，1ul Y-th-gfp-63F(10uM)，1ulY-th-gfp-64R(10uM)，0.2ul Taq，0.4ul H₂O。PCR条件：94℃2min，94℃，30sec，50℃1min，68℃1min，25-35 cycles，68℃10min。均能扩增得到约750bp的gfpPCR产物则说明相应的四膜虫转染成功，四膜虫含有质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP(详情见附图说明28)。实现了目标基因的遗传转化。

构建含HSP702启动子和HGFP的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP或pD5H8-FLAG-HGFP，及含HSP702启动子的四膜虫GFP表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的具体实验技术参考J.萨姆布鲁克与D.W.拉塞尔著的《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，2002年8月第三版，北京：科学出版社)。本发明中所用限制性内切酶购买自TOYOBO公司及大连宝生物工程有限公司、胶回收试剂盒购买自Axygen公司、质粒DNA小量提取试剂盒购买自BioFlux公司、pGEM-T载体购买自Promega公司、DNA聚合酶购买自大连宝生物工程有限公司、T4连接酶购买自New England Biolabs公司、热敏磷酸酶购买自New England Biolabs公司、转化用大肠杆菌E.coli DH5α购买自天根生化公司、DNA分子量标记Marker均购买自天根生化公司及大连宝生物工程有限公司、琼脂糖购买自Biowest公司、TBT购买自AcrosOrganic公司、所有离心管、吸头均购买自Axygen公司、所用引物均由上海英骏生物技术有限公司完成，所有测序均由上海英骏生物技术有限公司及北京华大基因研究中心完成。本发明所用嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)株系信息参考Eisen等(Eisen JA，Coyne RS，WuM，Wu D，Thiagarajan M，Wortman JR，Badger JH，Ren Q，Amedeo P，Jones KM，Tallon LJ，Delcher AL，Salzberg SL，Silva JC，Haas BJ，Majoros WH，Farzad M，Carlton JM，Smith RK Jr，Garg J，Pearlman RE，Karrer KM，Sun L，Manning G，Elde NC，Turkewitz AP，Asai DJ，Wilkes DE，Wang Y，Cai H，Collins K，Stewart BA，Lee SR，Wilamowska K，Weinberg Z，Ruzzo WL，Wloga D，Gaertig J，Frankel J，Tsao CC，Gorovsky MA，Keeling PJ，Waller RF，Patron NJ，Cherry JM，StoverNA，Krieger CJ，del Toro C，Ryder HF，Williamson SC，Barbeau RA，Hamilton EP，Orias E.Macronuclear genome sequence of the ciliate Tetrahymena thermophila，a model eukaryote.PlosBiol.2006，4(9)：e286.)，质粒pD5H8信息参考Gaertig等(Gaertig J，Gorovsky MA.Efficient masstransformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants.Proc Natl Acad SciUSA.1992，89(19)：9196-9200.)。

本发明中含HSP70-2启动子及绿色荧光筛选标记HGFP的一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP或pD5H8-FLAG-HGFP的构建方法及四膜虫的GFP表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的构建过程，一步法引入外源基因的四膜虫表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A.利用引物：

Y-TGFP-I-SceI-41F：

5′GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC 3′

Y-TGFP-I-SceI-42R：

5′GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT 3′

以质粒THX-HGFP为模板扩增获得两端带I-Sce I识别序列接头的HGFP片段，并用I-SceI处理，获得带I-Sce I粘性末端的片段I-Sce I-HGFP-I-Sce I。

B.利用引物：

Y-th-gfp-61F：

5′CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT 3′

Y-th-gfp-62R：

5′GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′

以质粒HSP702-GFP(本实验室构建，申请号/专利号：200910062093，发明名称：含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用，申请时间：2009年5月15日)为模板反扩载体，并用I-Sce I处理，获得带I-Sce I粘性末端的载体片段I-Sce I-HSP70-25′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-I-Sce I。

C.连接A步骤I-Sce I处理的I-Sce I-HGFP-I-Sce I片段与B步骤I-Sce I处理的载体片段I-SceI-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-I-Sce I得到重组质粒TH-HGFP。

D.利用M13正反向引物，以TH-HGFP为模板，PCR扩增获得含Not I-HSP70-25′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I序列的PCR片段，然后Not I处理得到带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段。

E.将质粒pD5H8(罗彻斯特大学的Martin A.Gorovsky教授赠送，质粒pD5H8信息同前参考文献：Gaertig J，Gorovsky MA.Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophilaby electroporation of conjugants.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(19)：9196-9200)经Not I单酶切后，回收单酶切片段，并用热敏磷酸酶进行去磷酸化处理，得到去磷酸化的pD5H8载体。

F.将步骤D中带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤E中去磷酸化的pD5H8载体连接，得到所述表达载体pD5H8-HGFP。

G.利用引物：

Y-th-2gfp(his)-69F：

5′CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG 3′

Y-th-2gfp(his)-70R：

5′CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′以质粒TH-HGFP为模板反扩载体，并用HindIII处理，得到带HIndIII接头的HindIII-HIS-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-HindIII片段。

H.将步骤G中带HindIII接头的HindIII-HIS-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-13′UTR-HGFP-HindIII片段用连接酶处理，使其自连得到重组质粒TH-HIS-HGFP。

I.利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP为模板，PCR扩增获得含Not I-HSP70-25′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I序列的PCR片段，然后Not I处理得到带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段。

J.将步骤I中带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤E中去磷酸化的pD5H8载体连接，得到所述表达载体pD5H8-HIS-HGFP。

K.利用引物：

Y-th-2gfp-(GST)71F：

5′CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC 3′

Y-th-2gfp-(GST)72R：

5′GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′

以质粒TH-HGFP为模板反扩载体，并用HindIII和Bgl II双酶切处理，得到带用Hind III和Bgl II接头的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II。

L.利用引物：

Y-GST-73F：5′GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA 3′

Y-GST-74R：5′CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT 3′

以质粒pET23a-GST(湖北大学马立新教授赠送)为模板扩增获得GST片段，并用HindIII和Bgl II双酶切处理，得到带HindIII和Bgl II接头的GST片段。

M.连接步骤L中带HindIII和Bgl II接头的GST片段与步骤K中带用HindIII和Bgl II接头的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II片段得到重组质粒TH-GST-HGFP。

N.利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP为模板，PCR扩增获得含Not I-HSP70-25′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I序列的片段，然后Not I处理该PCR片度得到带NotI接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段。

O.将步骤M中带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤E中去磷酸化的pD5H8载体连接，得到所述表达载体pD5H8-GST-HGFP。

P.利用引物：

Y-FLAG-87F：5′GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA 3′

Y-FLAG-88R：5′CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA 3′

以质粒pCDNA3.1-FLAG(湖北大学马立新教授赠送)为模板扩增获得FLAG片段，并用HindIII和Bgl II双酶切处理。

Q.连接步骤P中带HindIII和Bgl II接头的FLAG片段与步骤K中带用HindIII和Bgl II接头的Hind III-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II片段得到重组质粒TH-FLAG-HGFP。

R.利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP为模板，PCR扩增获得含Not I-HSP70-25′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I序列的片段，然后Not I处理该PCR片段得到带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段。

S.将步骤R中带Not I接头的Not I-HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤E中去磷酸化的pD5H8载体连接，得到所述表达载体pD5H8-FLAG-HGFP。

T.利用引物：

Y-th-gfp-63F：

5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′

Y-th-gfp-64R：

5′CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT 3′

以质粒HSP702-GFP(同前)为模板，扩增获得两端带I-Sce I识别序列接头的GFP片段，并用I-Sce I处理，获得带I-Sce I粘性末端的片段I-Sce I-GFP-I-Sce I。

U.将载体pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP或pD5H8-FLAG-HGFP经I-Sce I双酶切后，回收长度分别约为15200bp，15200bp，15700bp，15200bp的大片段。

V.将步骤P中带I-Sce I接头的I-Sce I-GFP-I-Sce I片段与步骤Q中用I-Sce I处理后的pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP载体连接得到GFP的四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP。

本发明提供了一系列含HSP70-2启动子和HGFP的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP，这些载体将四膜虫热休克蛋白70启动子、含绿色荧光筛选标记的盒式结构HGFP、四膜虫热休克蛋白70终止子连接进嗜热四膜虫的rDNA载体pD5H8中，连入的三部分序列分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。用gfp替换掉原有表达载体pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP载体中盒式结构HGFP获得gfp的四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP，这些表达载体将四膜虫热休克蛋白70启动子、编码绿色荧光蛋白ORF序列、四膜虫热休克蛋白70终止子连接进嗜热四膜虫的rDNA载体pD5H8中，连入的三部分序列分别为SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。这一系列gfp的四膜虫表达载体转染四膜虫后，经热激诱导各能表达得到一种分离的蛋白质，其蛋白质的核苷酸序列分别为SEQID NO.5中1127-1858核苷酸序列，SEQ ID NO.6中1109-1882核苷酸序列，SEQ ID NO.7中1115-2538核苷酸序列，SEQ ID NO.8中1115-1939核苷酸序列(四膜虫中密码子TAA，TAG非终止子，均编码氨基酸：谷氨酰胺)，所有序列由上海英骏生物技术有限公司测序确认，具体位置信息描述如下：

A.一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP中HSP70-2启动子+盒式结构HGFP+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR全长3129bp，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和3122-3129；

I-Sce I酶切位点为：1109-1126和2617-2634；

HSP70-2基因启动子(HSP70-25′UTR)：9-1105；

盒式结构HGFP中gfp基因起始密码子(ATG)：1637-1639；终止密码子(TGA)：2351-2353；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：2644-3121。

B.一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HIS-HGFP中HSP70-2启动子+盒式结构HGFP+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR全长3153bp，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和3146-3153；

I-Sce I酶切位点为：1133-1150和2640-2659；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

His标签：1109-1126；

Hind III酶切位点：1127-1132；

盒式结构HGFP中gfp基因起始密码子(ATG)：1661-1663；终止密码子(TGA)：2375-2377；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：2668-3145。

C.一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-GST-HGFP中HSP70-2启动子+盒式结构HGFP+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR全长3709bp，其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和3699-3709；

I-Sce I酶切位点为：1789-1807和3197-3214；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

Bgl II酶切位点：1109-1114；

Gst标签：1115-1783；

Hind III酶切位点：1784-1789；

盒式结构HGFP中gfp基因起始密码子(ATG)：2217-2219；终止密码子(TGA)：2930-2933；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：3224-3701。

D.一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-FLAG-HGFP中HSP70-2启动子+盒式结构HGFP+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR全长3109bp，其序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和31020-3109；

I-Sce I酶切位点为：1190-1207和2597-2614；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

Bgl II酶切位点：1109-1114；

FLAG标签：1115-1183；

Hind III酶切位点：1184-1189；

盒式结构HGFP中gfp基因起始密码子(ATG)：1617-1619；终止密码子(TGA)：2331-2333；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：2624-3101。

E.一种分离的蛋白质GFP的四膜虫表达载体pD5H8-GFP中HSP70-2启动子+GFP的ORRF+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-GFP-HSP70-1 3′UTR全长2353bp，其序列为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和2346-2353；

I-Sce I酶切位点为：1109-1126和1841-1858；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

gfp基因起始密码子(ATG)：1127-1129；终止密码子(TGA)：1859-1861；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：1868-2345。

F.一种分离的蛋白质GFP的四膜虫表达载体pD5H8-HIS-GFP中HSP70-2启动子+GFP的ORRF+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-HIS-GFP-HSP70-1 3′UTR全长2377bp，其序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和2370-2377；

I-Sce I酶切位点为：1133-1150和1865-1882；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

His标签：1109-1126；

Hind III酶切位点：1127-1132；

gfp基因起始密码子(ATG)：1151-1153；终止密码子(TGA)：1883-1885；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：1892-2377。

G.一种分离的蛋白质GFP的四膜虫表达载体pD5H8-GST-GFP中HSP70-2启动子+GFP的ORRF+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-GST-GFP-HSP70-1 3′UTR全长3034bp，其序列为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和3027-3034；

I-Sce I酶切位点为：1790-1807和2522-2539；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

Bgl II酶切位点：1109-1114；

Gst标签：1115-1783；

Hind III酶切位点：1784-1789；

gfp基因起始密码子(ATG)：1808-1810；终止密码子(TGA)：2540-2542；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：2549-3026。

H.一种分离的蛋白质GFP的四膜虫表达载体pD5H8-FLAG-GFP中HSP70-2启动子+GFP的ORRF+HSP70-1终止子的结构HSP70-2 5′UTR-FLAG-GFP-HSP70-1 3′UTR全长2434bp，其序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和2427-2434；

I-Sce I酶切位点为：1190-1207和1922-1939；

HSP70-2基因启动子(HSP70-2 5′UTR)：9-1105；

Bgl II酶切位点：1109-1114；

FLAG标签：1115-1183；

Hind III酶切位点：1184-1189；

gfp基因起始密码子(ATG)：1208-1210；终止密码子(TGA)：1940-1942；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-1 3′UTR)：1949-2426。

将本发明的表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP经电穿孔法转染到四膜虫体内，39℃热激诱导1小时后，可通过western blotting及荧光显微镜观察绿色荧光检测其表达情况。

本发明中所用不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086与CU428株系信息参考Jacek Gaertig，Hamilton，Orias与Cole ES等(Jacek Gaertig and MartinaA.Gorovaky.Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation ofconjugants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992October，Vol.89，9196-9200；(Hamilton EP，Orias E.Genetic crosses：setting up crosses，testing progeny，and isolating phenotypic assortants.MethodCell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：219-228；Cole ES et al.Amutational analysis of conjugation in Tetrahymena thermophila.2.Phenotypes affecting middle andlate development：third prezygotic nuclear division，pronuclear exchange，pronuclear fusion，andpostzygotic development.Dev Biol.1997 Sep 15；189(2)：233-45.)；SPP培养基配方参考Orias等(Orias E，Hamilton EP，Orias JD.Tetrahymena as a laboratory organism：useful strains，cellculture，and cell line maintenance.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000.vol 62：194.)；电穿孔技术方法参考Gaertig J等(Gaertig J，Gorovsky MA.Gene transfer byelectroporation in Tetrahymena.Methods Mol Biol.1995；47：331-48；J Gaertig，L Gu，B Hai，and MA Gorovsky.High frequency vector-mediated transformation and gene replacement in Tetrahymena.Nucleic Acids Res.1994December 11；22(24)：5391-5398.)；四膜虫细胞的固定、计数方法参考章宗涉、黄祥飞编著的《淡水浮游生物研究方法》(北京：科学出版社。1991：334-339。)。

利用一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST-HGFP或pD5H8-FLAG-HGFP构建的外源蛋白GFP表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP在四膜虫中表达外源蛋白GFP中的应用，其步骤是：

(1)外源蛋白GFP的表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP，经电穿孔法转染到四膜虫体内。

A.将不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086与CU428(两株四膜虫均由罗彻斯特大学的Martin A.Gorovsky教授赠送)株系分别接种至50mlSPP培养基于250ml的锥形瓶内，30℃适中振荡，细胞生长至密度为3-5×10⁵/ml。

B.800-1500g离心2min收集细胞，用50ml饥饿Buffer清洗、重离心，并重悬细胞于50ml饥饿Buffer，30℃孵育。

C.4～8小时后细胞计数，调整密度至3×10⁵/ml。

D.将各自50ml细胞置于同一个2L锥形瓶内，30℃以100-180rpm速度振荡(以避免细胞配对)。在电转前10h停止振荡，停止后1h细胞开始配对。

E.细胞配对开始4h后，检查配对效率。如果需要高效的转化率，则需要80％以上的配对率。

F.将转化用的DNA重悬于125ul的电转Buffer。若DNA保存在H₂O或TE里，则加入相应的电转Buffer至总体积为125ul。

G.在停止振荡(或者是混合细胞)10-10.5h后，于800g离心5min，去上清，将细胞重悬于100ml电转液，离心(同上)4min。

H.重悬细胞至1ml电转Buffer(约3×10⁷/ml)，立即使用细胞进行电转。CET效率在低温下会降低，因此细胞与转化用的DNA不应放在冰上。

I.将富集的125μl四膜虫与50μg相同体积的30℃温育的质粒(pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)分别混匀，并迅速转移到30℃温育的0.2cm电击杯(Bio-Rad公司产品)中，用Bio-Rad电穿孔仪进行电击，电击参数为：300V，25μF，50Ω，电击后的电击杯于室温(20-25℃，以下相同)静置1min。

(2)转染后四膜虫的培养及筛选

A.将电击后的四膜虫转移到96ml SPP培养基中，于30℃恒温箱静置1小时，然后均匀分装到96孔一次性培养皿。

B.电击12～16小时后向96孔培养皿内加巴龙霉素(Sigma公司产品)，使每孔内的巴龙霉素浓度达到100μg/ml。

C.电击后第3天，将长势良好的四膜虫转移至新的96孔一次性培养皿中，并将巴龙霉素浓度提高至200μg/ml。此后每两天增加的巴龙霉素浓度梯度为200μg/ml，直至1000μg/ml。

D.从1000μg/ml巴龙霉素浓度下长势良好的四膜虫培养液中挑取单个四膜虫细胞到96孔一次性培养皿中。

E.单细胞挑选3天后，从96孔一次性培养皿内选取长势良好的四膜虫转移到含有200μlSPP培养基的96孔一次性培养皿中30℃恒温培养，保持培养基内巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

(3)Whole Cell PCR鉴定转染四膜虫

A.24孔一次性培养皿培养用巴龙霉素筛选至1000μg/ml的转染四膜虫单克隆至对数期。

B.Whole Cell PCR验证、筛选阳性克隆：a.收集150-200ul转染四膜虫细胞与1.5ml的离心管中，以最大的转速离心6-10分钟或更长，倒掉上清。b.加80-100ul 1×Buffer K(2mMMg²⁺)到细胞中，用吸管吹散将其悬浮起来，并转移到0.5ml的离心管中，使用PCR仪在55℃孵育1小时，99℃变性20分钟。C.将上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的体系中：20ul上述裂解物，0.5ul 10×PCR Buffer，1.4ulMgCl₂(25mM)(Final 3mM)，0.5uldNTP(10uM)，1ul Y-th-gfp-63F(10uM)，1ul Y-th-gfp-64R(10uM)，0.2ul Taq，0.4ul H₂O。PCR条件：94℃2min，94℃30sec，50℃1min，68℃1min，25-35cycles，68℃10min。

C.以Y-th-gfp-63F，Y-th-gfp-64R为引物，能扩增得到约750bp的gfp PCR产物则说明相应的培养皿孔内筛选到的四膜虫转染成功，对应四膜虫含有质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP(鉴定结果如图28)。

(4)免疫印记检测转染的四膜虫中的GFP蛋白的表达

A.将转染成功的四膜虫转接至装有50ml SPP培养基的锥形瓶中于30℃培养，巴龙霉素浓度为1000μg/ml。待四膜虫密度长至3×10⁵个/ml，39℃热激，处理1小时。

B.4℃，1800rpm离心3min，收集细胞。

C.加入PBS，重悬细胞，1800rpm离心5min，弃上清。

D.加入PBS，稀释细胞至5×10⁷个/ml，转移至1.5ml离心管，超声破细胞。破细胞参数：Frequency：22％，Time：60S，Pause：1second，1second破至菌体悬液由浑浊变为澄清。

E.按比例加入5×蛋白电泳缓冲液，在沸水中煮3min，离心，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳。

F.蛋白质电泳完成，将分离胶从玻璃板上取下，于电转液中平衡半小时，与凝胶同样大小的NC膜和3mm滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵垫的结构装入转印夹。转印时凝胶接负极，NC膜接正极。电转移条件恒压90V，电转2h。

G.转印结束，将NC膜至于PBST中洗涤三次，每次5min。

H.将NC膜至于封闭液中封闭1-2h，然后用PBST中洗涤三次，每次5min。

I.将NC膜与适当稀释的第一抗体(GFP抗体)，在37℃反应1h，然后用PBST中洗涤三次，每次5min。

J.将NC膜与适当稀释的第二抗体，在37℃反应1h，然后用PBST中洗涤6次，每次5min。

K.将NC膜至于显色液中显色5min，用UVP冷光CCD爆光检测。免疫印记检测检测转染的四膜虫中的GFP蛋白的表达结果如图29所示。能检查到27KD的蛋白说明对应转染四膜虫中有GFP表达。

(5)荧光显微镜观察转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫中的GFP蛋白的表达

A.24孔一次性培养皿培养(30℃)Whole Cell PCR鉴定正确的转染四膜虫单克隆至对数后，一份39℃热激，处理1小时，另一份不做处理。

B.各取未热激处理和39℃热激处理后的1ml四膜虫富集至50μl，离心条件为：1500rpm、30℃、2min，然后用ZEISS显微镜在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光观察，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录，如图30所示。未热激处理的转染四膜虫无法观察到绿色荧光，热激处理后四膜虫能观察到绿色荧光，则说明对应的转染四膜虫中有GFP的表达。

综上所述，所述一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有四膜虫HSP70-2基因启动子序列、绿色荧光筛选标记HGFP、与四膜虫rDNA序列高度相似的pD5H8载体序列；所述一系列gfp表达载体pD5H8-GFP，pD5H8-HIS-GFP，pD5H8-GST-GFP，pD5H8-FLAG-GFP上含有四膜虫HSP70-2基因启动子序列、编码绿色荧光蛋白ORF序列、与四膜虫rDNA序列高度相似的pD5H8载体序列，他们分别具有如下特征：

(1)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有可替换的盒式结构HGFP，通过替换为不同的外源基因，以实现四膜虫作为一个外源基因表达系统；

(2)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替换的盒式结构HGFP，是通过稀有I-Sce I酶切位点来被替换的，外源基因的选择几乎不受限制性内切酶的限制，且一步即可替换完成。

(3)外源基因的插入到这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上方向均分别只需一个PCR反应即可验证。

(4)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替换的盒式结构HGFP两侧的I-Sce I酶切位点是反向的，替换不同的外源基因时，可有效地防止载体自连。

(5)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有可替换的盒式结构HGFP含有绿色荧光筛选标记，故可以通过绿色荧光筛选标记来筛选外源基因的重组子，重组子的鉴定方便。

(6)在巴龙霉素药物筛选作用下，这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP能使正确克隆至其中的外源基因于四膜虫中大量扩增，实现目标基因的遗传转化。如gfp的四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP转染四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，可替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增(见图28)。

(7)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP上含有高效表达启动子：四膜虫HSP70-2基因启动子，是一个强启动子，在四膜虫中，能高效启动正确克隆至下游的外源基因的表达。与现已报道的四膜虫HSP70-1基因相比，在热激条件下，效率高1.9倍，实现下游基因的大量表达。如gfp的四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP转染四膜虫后，通过免疫印记均检测到了gfp蛋白的表达。

(8)这一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP不仅能使正确克隆至其中的外源基因于四膜虫中大量表达，而且所表达的蛋白还具有生物活性。如gfp的四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP转染四膜虫后，荧光显微镜还能观察到39℃热激处理后四膜虫能发出绿色荧光，说明该gfp蛋白具有生物活性。

所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体，其特征在于：所述的表达载体含有可替代的绿色荧光筛选标记HGFP。

所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体，其特征在于：所述的表达载体的盒式结构HGFP两侧含有反向的I-Sce I稀有酶切位点，一步引入外源基因时用于克隆的外源片段的正反向引物接头中含有相应的反向互补I-Sce I酶切位点。

利用本发明所述的一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP构建的外源蛋白的四膜虫表达载体经电穿孔法转染到四膜虫体内后用于蛋白质表达具有以下优点：

(1)四膜虫广泛分布于全球各地的淡水环境中，以摄取水中的细菌与其他有机质维生，尚未发现对造成人体疾病或对人类健康造成危害。以四膜虫为表达系统，安全性可靠。

(2)嗜热四膜虫作为真核生物，较酵母等模式生物和人类具有更高程度的功能保守性，因此一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体可被用于克隆表达外源基因，特别是表达真核蛋白，如抗体，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等药物等，这些蛋白质在治疗药物开发；诊断；人类和动物疫苗的开发；药物设计，工业酶生产等方面具有广泛的应用。

(3)作为单细胞生物，四膜虫与其它细胞系(如哺乳动物体细胞)相比，四膜虫作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，培养更简单、快速和经济，操作精确度和可控制性强；同时四膜虫生活周期短且具备真核生物基本生命过程，并且不具有类似于酵母的复杂胞壁结构，却含有可观的细胞膜转运蛋白系统。四膜虫中表达蛋白只有简单的N-糖基化，不存在如酵母中丰富的甘露糖残基修饰，植物中丰富的木糖残基修饰等非哺乳动物中的修饰类型，其独特的生物学使其能够作为理想的表达系统。

(4)只需将外源蛋白的四膜虫表达载体经电穿孔法转染到四膜虫体内即可。

(5)可根据需要任意选择不带标签，带GST标签或带HIS标签的表达载体，可用于蛋白质的表达纯化，蛋白质的功能或相互作用的研究等。

(6)一系列表达载体pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP上含有高效表达启动子。加之巴龙霉素药物筛选作用下，表达载体可替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增(见图28)，因此外源基因能得到高效的表达。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

图1为一种THX-HGFP质粒图

图2为一种HSP702-GFP质粒图

图3为一种质粒TH-HGFP构建示意图

图4为一种质粒pD5H8-HGFP构建示意图

图5为一种质粒TH-HIS-HGFP构建示意图

图6为一种质粒pD5H8-HIS-HGFP构建示意图

图7为一种质粒TH-GST-HGFP构建示意图

图8为一种质粒pD5H8-GST-HGFP构建示意图

图9为一种质粒TH-FLAG-HGFP构建示意图

图10为一种质粒pD5H8-FLAG-HGFP构建示意图

图11为一种质粒pD5H8-GFP构建示意图

图12为一种质粒pD5H8-HIS-GFP构建示意图

图13为一种质粒pD5H8-GST-GFP构建示意图

图14为一种质粒pD5H8-FLAG-GFP构建示意图

图15为一种质粒pD5H8的Not I酶切结果示意图。

泳道1为pD5H8质粒对照；泳道2为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道3-5为pD5H8的Not I单酶切后的条带，大小约为13.8kb。

图16为一种质粒pD5H8-HGFP的电泳示意图。

泳道1-5为质粒pD5H8-HGFP，大小约为16.9kb；泳道6为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp。

图17为一种质粒pD5H8-HIS-HGFP电泳示意图。

泳道1-3为质粒pD5H8-HIS-HGFP，大小为16.9kb；泳道4为λ-Hind III digest DNA maker，其条带大小依次为23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp。

图18为一种质粒pD5H8-GST-HGFP电泳示意图。

泳道1-8为质粒pD5H8-GST-HGFP，大小约为17.5kb；泳道9为λ-EcoT14 I digest DNAmaker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp。

图19为一种质粒pD5H8-FLAG-HGFP电泳示意图。

泳道1-4为质粒pD5H8-FLAG-HGFP，大小为16.9kb；泳道5为λ-EcoT14 I digest DNAmaker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp。

图20为一种质粒pD5H8-HGFP的I-Sce I酶切结果示意图。

泳道1为对照：质粒pD5H8-HGFP；泳道2为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp；泳道3-6为质粒pD5H8-HGFP被I-Sce I双酶切后所得两个片段，大小分别约为15.2kb，1.5kb，其中小片段为HGFP片段。

图21为一种质粒pD5H8-HIS-HGFP的I-Sce I酶切结果示意图。

泳道1为对照：质粒pD5H8-HIS-HGFP；泳道2为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp；泳道3-6为质粒pD5H8-HIS-HGFP被I-Sce I双酶切后所得两个片段，大小分别约为15.2kb，1.5kb，其中小片段为HGFP片段。

图22为一种质粒pD5H8-GST-HGFP的I-Sce I酶切结果示意图。

泳道1为对照：质粒pD5H8-GST-HGFP；泳道2为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp；泳道3-6为质粒pD5H8-GST-HGFP被I-Sce I双酶切后所得两个片段，大小分别约为15.7kb，1.5kb，其中小片段为HGFP片段。

图23为一种质粒pD5H8-FLAG-HGFP的I-Sce I酶切结果示意图。

泳道1-2为质粒pD5H8-FLAG-HGFP被I-Sce I双酶切后所得两个片段，大小分别约为15.2kb，1.5kb，其中小片段为HGFP片段。泳道3为对照：质粒pD5H8-FLAG-HGFP；泳道4为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp。

图24为一种质粒pD5H8-GFP的PCR验证的结果示意图。

泳道1-6为以质粒pD5H8-GFP为模板，以Y-th-gfp-63F，TH-GFP-R为引物所扩得的约850bp的片段，表明对应质粒pD5H8-GFP为GFP正向插入的正确质粒；泳道7为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp。

图25为一种质粒pD5H8-HIS-GFP的PCR验证的结果示意图。

泳道1为λ-EcoT14 I digest DNA maker+λ-Hind III digest DNA maker，其条带大小依次为23130bp，19329bp，9416bp，7743bp，6557bp，6223bp，4361bp，4254bp，3472bp，2690bp，2322bp，2027bp，1882bp，1489bp，925bp，564bp，421bp；泳道2-5为以质粒pD5H8-HIS-GFP为模板，以Y-th-gfp-63F，TH-GFP-R为引物所扩得的约850bp的片段，表明对应质粒pD5H8-HIS-GFP为GFP正向插入的正确质粒。

图26为一种质粒pD5H8-GST-GFP的PCR验证的结果示意图。

泳道1为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，489bp，925bp，421bp；泳道2-5为以质粒pD5H8-GST-GFP为模板，以Y-th-gfp-63F，TH-GFP-R为引物所扩得的约850bp的片段，表明对应质粒pD5H8-GST-GFP为GFP正向插入的正确质粒。

图27为一种质粒pD5H8-FLAG-HGFP的PCR验证的结果示意图。

泳道1为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道2-6为以质粒pD5H8-FLAG-HGFP为模板，以Y-th-gfp-63F，TH-GFP-R为引物所扩得的约850bp的片段，表明对应质粒pD5H8-FLAG-HGFP为GFP正向插入的正确质粒。

图28为一种转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜虫Whole Cell PCR鉴定结果示意图。

泳道1-3转染质粒pD5H8-GFP的四膜虫的Whole Cell PCR鉴定结果；泳道4为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道5-7为转染质粒pD5H8-HIS-GFP的四膜虫的Whole Cell PCR鉴定结果；泳道5-7为转染质粒pD5H8-HIS-GFP的四膜虫的Whole Cell PCR鉴定结果；泳道8-10为转染质粒pD5H8-GST-GFP的四膜虫的Whole Cell PCR鉴定结果。泳道11为λ-EcoT14 I digest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道12-14为转染质粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫的Whole Cell PCR鉴定结果。结果表明以Y-th-gfp-63F，Y-th-gfp-64R为引物，分别对转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜虫做Whole Cell PCR鉴定，均能扩增得到约750bp的GFP片段，则说明相应的四膜虫转染成功，四膜虫对应含有质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP(详情见附图说明28)。实现了目标基因的遗传转化。

图29为一种免疫印记检测检测转染质粒pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜虫中GFP蛋白的表达结果示意图。

图中结果表明转染质粒pD5H8-GFP的四膜虫表达的GFP蛋白用一抗：GFP，能检测到明显的约27KD目的条带，而转染质粒pD5H8的四膜虫表达的蛋白用一抗：GFP，并不能检测到目的条带；转染质粒pD5H8-HIS-GFP的四膜虫表达的GFP蛋白用一抗：GFP或HIS，均能检测到明显的约27KD目的条带，而转染质粒pD5H8的四膜虫表达的蛋白用一抗：GFP或HIS，并不能检测到目的条带；转染质粒pD5H8-GST-GFP的四膜虫表达的GFP蛋白用一抗：GFP或GST，均能检测到明显的约52KD目的条带，而转染质粒pD5H8的四膜虫表达的蛋白用一抗：GFP或GST，并不能检测到目的条带；转染质粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫表达的GFP蛋白用一抗：GFP或FLAG，均能检测到明显的27KD目的条带，而转染质粒pD5H8的四膜虫表达的蛋白用一抗：GFP或FLAG，并不能检测到目的条带。说明本发明中的载体pD5H8-GFP，pD5H8-HIS-GFP，pD5H8-GST-GFP，pD5H8-FLAG-GFP均能在四膜虫体内顺利表达出绿色荧光蛋白。

图30为一种不同处理的转染质粒pD5H8(或pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。

其中A1为39℃处理转染质粒pD5H8-GFP的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；A2为未处理转染质粒pD5H8-GFP的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。B1为39℃处理转染质粒pD5H8-HIS-GFP的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；B2为未处理转染质粒pD5H8-HIS-GFP的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。C1为39℃处理转染质粒pD5H8-GST-GFP的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；C2为未处理转染质粒pD5H8-GST-GFP的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。D1为39℃处理转染质粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；D2为未处理转染质粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。E1为39℃处理转染质粒pD5H8的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；E2为为未处理转染质粒pD5H8的四膜虫，在荧光显微镜下观察到的示意图。可以看到，本发明中的载体pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP)能在四膜虫体内顺利表达出具有活性的绿色荧光蛋白，这就利用用四膜虫表达外源蛋白打下了基础。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。具体实施例用于说明目的面并非用于限定本发明的范围。

实施例1：

质粒TH-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-TGFP-I-SceI-41F：5′GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC 3′，Y-TGFP-I-SceI-42R：5′GAGCTCTAGGGATAACAGGGT AATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAA3′(其中TAGGGATAACAGGGTAAT 为I-Sce I位点)。(b)所用模板为实验室构建质粒THX-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约1500bp的目的DNA片段HGFP。(g)将回收的目的片段HGFP用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段HGFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-HGFP-I-Sce I。

(2)(a)所用引物为：Y-th-gfp-61F：5′CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT 3′，Y-th-gfp-62R：5′GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′(其中ATTACCCTGTTATCCCTA为I-SceI位点)。(b)所用模板为实验室构建质粒HSP702-GFP。(c)PCR反应体系组分：5μl10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约4700bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-I-Sce I。

(3)连接(1)步I-Sce I处理得到的的I-Sce I-HGFP-I-Sce I片段与(2)步I-Sce I处理得到的载体片段I-Sce I-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-I-Sce I，16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上培养16小时。

(5)从中挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒TH-HGFP。

(7)质粒TH-HGFP经I-Sce I双酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒TH-HGFP构建正确。

(8)将经酶切鉴定的TH-HGFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明HGFP序列通过I-Sce I位点插入至载体中。具体克隆过程见图3。

实施例2：

质粒pD5H8-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：M13正反向引物。(b)所用模板为构建质粒TH-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃3.5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约3400bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用Not I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl Not I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收Not I酶切后的约3100bp的片段Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I。

(2)将质粒pD5H8经Not I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8，5μl Not I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收13.8kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图15中的泳道“2”所示DNA条带位置。

(3)用热敏磷酸酶对步骤(2)中的13.8kb大片段回收产物进行去磷酸化处理，反应在含1×热敏磷酸酶缓冲液的50μl体系中进行，37℃作用30min，然后65℃5min热失活。

(4)将步骤(1)中回收的3.1kb小片段Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I与步骤(3)中经去磷酸化酶处理后的13.8kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(5)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(6)挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(7)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-HGFP。

(8)将上步所提取的质粒跑电泳看大小，若无其他污染，则大小为16.9kp的质粒所对应的发绿色荧光的菌落为阳性克隆。电泳图如图16中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-HGFP构建正确。挑取其中3个质粒大小正确的克隆测序结果均正确。具体克隆过程见图4。

实施例3：

质粒TH-HIS-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-th-2gfp(his)-69F：5′CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG 3′，Y-th-2gfp(his)-70R：5′CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′(其中AAGCTT为HindIII位点)。(b)所用模板为构建质粒TH-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM TaqDNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃6.5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约6200bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用HindIII在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl HindIII酶，补无菌水至50μl。

(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收HindIII酶切后的片段的HindIII-HIS-HSP70-25′UTR-AMP-HSP70-13′UTR-HGFP-HindIII。

(2)将步骤(1)中带HindIII接头的HindIII-HIS-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-HindIII片段2ul用加T4连接酶16℃过夜连接。

(3)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上培养16小时。

(4)从中挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(5)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒TH-HIS-HGFP。

(6)质粒TH-HIS-HGFP经HindIII酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒TH-HIS-HGFP构建正确。

(7)将经酶切鉴定的TH-HIS-HGFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明载体中含正向插入的HIS标签序列。具体克隆过程见图5。

实施例4：

质粒pD5H8-HIS-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：M13正反向引物。(b)所用模板为构建质粒TH-HIS-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNAPolymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃3.5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约3400bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用Not I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl Not I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收Not I酶切后的约3100bp的片段Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I。

(2)将质粒pD5H8经Not I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8，5μl Not I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收13.8kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图15中的泳道所示DNA条带位置。

(3)用热敏磷酸酶对步骤(2)中的13.8kb大片段回收产物进行去磷酸化处理，反应在含1×热敏磷酸酶缓冲液的50μl体系中进行，37℃作用30min，然后65℃5min热失活。

(4)将步骤(1)中回收的3.1kb小片段Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I与步骤(3)中经去磷酸化酶处理后的13.8kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(5)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(6)挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(7)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-HIS-HGFP。

(8)将上步所提取的质粒跑电泳看大小，若无其他污染，则大小为16.9kp的质粒所对应的发绿色荧光的菌落为阳性克隆。电泳图如图17中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-HIS-HGFP构建正确。挑取其中3个质粒大小正确的克隆测序结果均正确。具体克隆过程见图6。

实施例5：

质粒TH-GST-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-th-2gfp-(GST)71F：5′CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC 3′，Y-th-2gfp-(GST)72R：5′GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′(其中AAGCTT为HindIII位点，AGATCT为Bgl II位点)。

(b)所用模板为构建质粒TH-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃6.5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约6200bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用HindIII，Bgl II在37℃双酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl HindIII酶，2μl Bgl II酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收HindIII，Bgl II双酶切后的片段的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II。

(2)a)所用引物为：Y-GST-73F：5′GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3′，Y-GST-74R：5′CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT 3′(其中AAGCTT为HindIII位点，AGATCT为Bgl II位点)。(b)所用模板为质粒pET23a-GST(湖北大学马立新教授所赠)。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl2)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUMTM Taq DNAPolymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约680bp的目的DNA片段GST。(g)将回收的目的片段用HindIII，Bgl II在37℃双酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl HindIII酶，2μl Bgl II酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收HindIII，Bgl II双酶切后的片段的HindIII-GST-Bgl II。

(3)将步骤(1)中带HindIII及Bgl II接头的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II载体片段与步骤(2)中带HindIII及Bgl II接头的GST片段加T4连接酶16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上培养16小时。

(5)从中挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒TH-GST-HGFP。

(7)质粒TH-GST-HGFP经HindIII，Bgl II双酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒TH-GST-HGFP构建正确。

(8)将经酶切鉴定的TH-GST-HGFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，表明载体中含有正向插入的正确的GST标签序列。具体克隆过程见图7。

实施例6：

质粒pD5H8-GST-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：M13正反向引物。(b)所用模板为构建质粒TH-GST-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃4min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约4000bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用Not I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl Not I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收Not I酶切后的约3700bp的片段Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I。

(2)将质粒pD5H8经Not I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8，5μl Not I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收13.8kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图15中的泳道所示DNA条带位置。

(3)用热敏磷酸酶对步骤(2)中的13.8kb大片段回收产物进行去磷酸化处理，反应在含1×热敏磷酸酶缓冲液的50μl体系中进行，37℃作用30min，然后65℃5min热失活。

(4)将步骤(1)中回收的3.7kb小片段Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I与步骤(3)中经去磷酸化酶处理后的13.8kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(5)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(6)挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(7)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-GST-HGFP。

(8)将上步所提取的质粒跑电泳看大小，若无其他污染，则大小为17.5kp的质粒所对应的发绿色荧光的菌落为阳性克隆。电泳图如图18中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-GST-HGFP构建正确。挑取其中3个质粒大小正确的克隆测序结果均正确。具体克隆过程见图8。

实施例7：

质粒TH-FLAG-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：

Y-th-2gfp-(GST)71F：5′CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC 3′，Y-th-2gfp-(GST)72R：5′GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′(其中AAGCTT为HindIII位点，AGATCT为Bgl II位点)。(b)所用模板为构建质粒TH-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNAPolymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃6.5min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约6200bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用HindIII，Bgl II在37℃双酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl HindIII酶，2μl Bgl II酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收HindIII，Bgl II双酶切后的片段的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II。

(2)a)所用引物为：Y-FLAG-87F：5′GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3′，Y-FLAG-88R：5′CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3′(其中AAGCTT为HindIII位点，AGATCT为Bgl II位点)。(b)所用模板为pCDNA3.1-FLAG(湖北大学马立新教授所赠质粒)。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl2)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIU-MTM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约87bp的目的DNA片段FLAG。(g)将回收的目的片段用HindIII，Bgl II在37℃双酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl HindIII酶，2μl Bgl II酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收HindIII，Bgl II双酶切后的片段的HindIII-FLAG-Bgl II。

(3)将步骤(1)中带HindIII及Bgl II接头的HindIII-HSP70-2 5′UTR-AMP-HSP70-1 3′UTR-HGFP-Bgl II载体片段与步骤(2)中带HindIII及Bgl II接头的FLAG片段加T4连接酶16℃过夜连接。

(9)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上培养16小时。

(10)从中挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(11)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒TH-GST-HGFP。

(12)质粒TH-FLAG-HGFP经HindIII，Bgl II分别单酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒TH-FLAG-HGFP构建正确。

(13)将经酶切鉴定的TH-FLAG-HGFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明载体含有正向插入的FLAG标签序列。具体克隆过程见图9。

实施例8：

质粒pD5H8-FLAG-HGFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：M13正反向引物。(b)所用模板为构建质粒TH-FLAG-HGFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃4min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约3400bp的目的DNA片段。(g)将回收的目的片段用Not I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段，2μl Not I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收Not I酶切后的约3100bp的片段Not I-HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-NotI。

(2)将质粒pD5H8经Not I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8，5μl Not I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收13.8kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图15中的泳道所示DNA条带位置。

(3)用热敏磷酸酶对步骤(2)中的13.8kb大片段回收产物进行去磷酸化处理，反应在含1×热敏磷酸酶缓冲液的50μl体系中进行，37℃作用30min，然后65℃5min热失活。

(4)将步骤(1)中回收的3.7kb小片段Not I-HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I与步骤(3)中经去磷酸化酶处理后的13.8kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(5)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(6)挑取发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(7)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-FLAG-HGFP。

(8)将上步所提取的质粒跑电泳看大小，若无其他污染，则大小为17.5kp的质粒所对应的发绿色荧光的菌落为阳性克隆。电泳图如图19中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-FLAG-HGFP构建正确。挑取其中3个质粒大小正确的克隆测序结果均正确。具体克隆过程见图10。

实施例9

质粒pD5H8-GFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，Y-th-gfp-64R：5′CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT 3′(其中TAGGGATAACAGGGTAAT为I-Sce I位点)。(b)所用模板为实验室构建质粒HSP702-GFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUMTM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约750bp的目的DNA片段GFP。(g)将回收的目的片段GFP用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段GFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-GFP-I-Sce I。

(2)将质粒pD5H8-HGFP经I-Sce I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8-HGFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收约15.2kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图20中的泳道所示DNA条带位置。

(3)将步骤(1)中回收的750bp小片段I-Sce I-GFP-I-Sce I与步骤(3)中15.2kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(5)挑取不发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-GFP。

(7)质粒pD5H8-GFP用引物Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，TH-GFP-R：5′CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA 3′验证GFP片段及其插入方向。PCR产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，电泳鉴定得到图24中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-GFP构建正确。

(8)将经PCR鉴定的pD5H8-GFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明GFP基因正向正确插入到pD5H8-HGFP。具体克隆过程见图11。

实施例10：

质粒pD5H8-HIS-GFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，Y-th-gfp-64R：5′CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT 3′(其中TAGGGATAACAGGGTAAT为I-Sce I位点)。

(b)所用模板为实验室构建质粒HSP702-GFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUMTM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约750bp的目的DNA片段GFP。(g)将回收的目的片段GFP用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段GFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-GFP-I-Sce I。

(2)将质粒pD5H8-HIS-HGFP经I-Sce I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8-HIS-HGFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收约15.2kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图21中的泳道所示DNA条带位置。

(3)将步骤(1)中回收的750bp小片段I-Sce I-GFP-I-Sce I与步骤(3)中15.2kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(5)挑取不发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-HIS-GFP。

(7)质粒pD5H8-HIS-GFP用引物Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，TH-GFP-R：5′CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3′验证GFP片段及其插入方向。PCR产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，电泳鉴定得到图25中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-HIS-GFP构建正确。

(8)将经PCR鉴定的pD5H8-HIS-GFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明GFP基因正向正确插入到pD5H8-HIS-HGFP。具体克隆过程见图12。

实施例11：

质粒pD5H8-GST-GFP构建，其步骤是：

(1)(a)所用引物为：Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，Y-th-gfp-64R：5′CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT 3′(其中TAGGGATAACAGGGTAAT为I-Sce I位点)。

(b)所用模板为实验室构建质粒HSP702-GFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUMTM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约750bp的目的DNA片段GFP。(g)将回收的目的片段GFP用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段GFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-GFP-I-Sce I。

(2)将质粒pD5H8-GST-HGFP经I-Sce I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒pD5H8-GST-HGFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收约15.7kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图22中的泳道所示DNA条带位置。

(3)将步骤(1)中回收的750bp小片段I-Sce I-GFP-I-Sce I与步骤(3)中15.7kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(5)挑取不发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-GST-GFP。

(7)质粒pD5H8-GST-GFP用引物Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，TH-GFP-R：5′CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3′验证GFP片段及其插入方向。PCR产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，电泳鉴定得到图26中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-GST-GFP构建正确。

(8)将经PCR鉴定的pD5H8-GST-GFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明GFP基因正向正确插入到pD5H8-GST-HGFP。具体克隆过程见图13。

实施例12：

质粒pD5H8-FLAG-GFP构建，其步骤是：

(9)(a)所用引物为：Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，Y-th-gfp-64R：5′CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT 3′(其中TAGGGATAACAGGGTAAT为I-Sce I位点)。(b)所用模板为实验室构建质粒HSP702-GFP。(c)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl2)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUMTM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(d)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(e)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min循环35次；72℃延伸10min。(f)Axygen胶回收试剂盒回收纯化约750bp的目的DNA片段GFP。(g)将回收的目的片段GFP用I-Sce I在37℃酶切2小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30ul回收的目的片段GFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。(h)Axygen PCR清洁试剂盒回收I-Sce I酶切后的片段I-Sce I-GFP-I-Sce I。

(10)将质粒pD5H8-FLAG-HGFP经I-Sce I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl10×Buffer，10μg质粒pD5H8-FLAG-HGFP，2μl I-Sce I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收约15.2kb大片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)。见图23中的泳道所示DNA条带位置。

(11)将步骤(1)中回收的750bp小片段I-Sce I-GFP-I-Sce I与步骤(3)中15.2kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(12)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(13)挑取不发绿色荧光的单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(14)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒pD5H8-FLAG-GFP。

(15)质粒pD5H8-FLAG-GFP用引物Y-th-gfp-63F：5′CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC 3′，TH-GFP-R：5′CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3′验证GFP片段及其插入方向。PCR产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，电泳鉴定得到图27中的泳道所示DNA条带位置所示，表明质粒pD5H8-FLAG-GFP构建正确。

(16)将经PCR鉴定的pD5H8-FLAG-GFP质粒送往北京华大基因研究中心测序，测序结果表明GFP基因正向正确插入到pD5H8-FLAG-HGFP。具体克隆过程见图14。

实施例13：

利用一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体构建的gfp四膜虫表达载体pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP转染四膜虫的步骤是：

(1)将含有质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的菌液转接到含50ml LB(50μg/ml氨苄青霉素)液体培养基的250ml锥形瓶中，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(2)用E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid Mini Kit(Omega公司产品)去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP，最后用100μl 10mM pH7.5的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)洗脱回收柱上的质粒。并用Biophotometer分光光度计(Eppendorf公司产品)测定提取的质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的DNA浓度，确认提取的质粒DNA浓度大于或等于0.4μg/ml，若低于该浓度，则需用3M醋酸钠加无水乙醇进行共沉淀来富集DNA，提高质粒DNA浓度(具体操作过程参考：J.萨姆布鲁克与D.W.拉塞尔著的《分子克隆实验指南》，黄培堂等译。2002年8月第三版，北京：科学出版社：1688-1689。)。

(3)四膜虫的培养。将不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086与CU428株系分别转接到50ml SPP培养基于250ml的锥形瓶内。在转速为160rpm的摇床上，30℃培养，直至细胞密度长到3-5×10⁵个/ml。SPP培养基配方为：1％(质量比)Proteose peptore(Difco公司产品)，0.1％(质量比)yeast extract(Oxoid公司产品)，0.2％(质量比)glucose(分析纯，广州化学试剂厂产品)，0.003％Ferric citrate(Sigma公司产品)。Beckman库尔特细胞计数仪计算细胞密度。

(4)四膜虫的清洗。将50ml四膜虫转到50ml离心管内，用水平转子离心机(湘仪TDZ5-WS多管架自动平衡离心机，本发明中所有四膜虫细胞的离心均用此离心机)800-1500g在30℃离心2min，倒去上清。用50ml于30℃温育过的Tris缓冲液清洗四膜虫2次。

(5)四膜虫的饥饿处理。清洗后向离心管中加入少量10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液，轻缓振荡开沉淀四膜虫，然后将管内液体及四膜虫全部转移到无菌锥形瓶中，并于30℃恒温水浴静置2小时后计数，最后用10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液调整四膜虫密度至3×10⁵个/ml。

(6)不同交配型的四膜虫配对。将第(5)步中不同交配型的野生型嗜热四膜虫B2086与CU428按1∶1四膜虫细胞数目在2L容量的灭菌锥形瓶内混合，使瓶内液体在80～100ml之间。2L锥形瓶置于30℃水浴摇床160rpm振荡18小时后停止。停止振荡4小时后，取出0.5ml四膜虫，计算配对效率。若配对效率在80％以上，有利于提高后续的电穿孔实验效率。停止振荡10小时后，取25ml混合的配对四膜虫于50ml离心管中，800-1500g在30℃离心2min。小心倒去上清，然后加入10mM pH7.530℃温育的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)清洗四膜虫一次。再次于800-1500g在30℃离心2min，弃去上清液，富集四膜虫至125μl。

(7)质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP通过电穿孔法进入四膜虫。将富集的125μl四膜虫与50μg相同体积的30℃温育的质粒HSP702-GFP-pD5H8在灭菌离心管中混匀，并迅速转移到30℃温育的0.2cm电击杯(Bio-Rad公司产品)中，然后立即放入电穿孔仪(Bio-Rad公司产品)进行电击，电击参数为：300V， 25μF，50Ω，电击后的电击杯于室温静置1min。

实施例14：

转染后四膜虫的培养及筛选：

本发明中的转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫培养、筛选过程必须无菌操作，四膜虫的培养、筛选环境为30℃恒温箱内。具体步骤如下：

(1)将电击杯内的四膜虫用粗口吸管轻缓转移到30℃温育的装有24ml SPP培养基的锥形瓶中，接着在30℃恒温箱静置1小时，然后均匀分装到24孔一次性培养皿中。

(2)电击12～16小时后加巴龙霉素(Sigma公司产品)，使每孔内的巴龙霉素浓度达到100μg/ml。

(3)电击后第3天，观察培养皿内细胞生长情况，取20μl生长良好的四膜虫转移至新的96孔一次性培养皿中，加200μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到200μg/ml。

(4)电击后第4天，取20μl含巴龙霉素浓度为200μg/ml的四膜虫至新的96孔一次性培养皿，加200μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到400μg/ml。

(5)电击后第5天，取20μl含巴龙霉素浓度为400μg/ml的四膜虫至新的96孔一次性培养皿，加200μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到600μg/ml。

(6)电击后第6天，取20μl含巴龙霉素浓度为600μg/ml的四膜虫至新的96孔一次性培养皿，加200μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到800μg/ml。

(7)电击后第7天，取20μl含巴龙霉素浓度为800μg/ml的四膜虫至新的96孔一次性培养皿，加200μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到1000μg/ml。

(8)电击后第8天，在解剖镜(Zeiss)下，从含巴龙霉素浓度为1000μg/ml的四膜虫培养液中，用微毛细吸管(Sigma-Aldrich公司产品)挑取单个四膜虫到96孔一次性培养皿(CellStar公司产品)中，每孔内含一个四膜虫细胞和1000μg/ml巴龙霉素的200μlSPP培养基。

(9)单细胞挑选3天后，从96孔一次性培养皿内选取长势良好的四膜虫转移到含有200μlSPP培养基的96孔一次性培养皿中30℃恒温培养，保持培养基内巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

实施例15：

Whole Cell PCR鉴定转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP的四膜虫。

(1)24孔一次性培养皿培养用巴龙霉素筛选至1000μg/ml的转染四膜虫单克隆至对数期。

(2)Whole Cell PCR验证、筛选阳性克隆：a.收集150-200ul转染四膜虫细胞与1.5ml的离心管中，以最大的转速离心6-10分钟或更长，倒掉上清。b.加80-100ul 1×Buffer K(2mMMg²⁺)到细胞中，用吸管吹散将其悬浮起来，并转移到0.5ml的离心管中，使用PCR仪在55℃孵育1小时，99℃变性20分钟。c.将上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的体系中：20ul上述裂解物，0.5ul 10×PCR Buffer，1.4ulMgCl2(25mM)(Final 3mM)，0.5uldNTP(10uM)，1ulY-th-gfp-63F(10uM)，1ul Y-th-gfp-64R(10uM)，0.2ul Taq，0.4ul H₂O。PCR条件：condition：94℃2min，94℃30sec，50℃1min，68℃1min，25-35cycles，68℃10min。

(3)以Y-th-gfp-63F，Y-th-gfp-64R为引物，能扩增得到约750bp的gfp PCR产物则说明相应的培养皿孔内筛选到的四膜虫转染成功，对应四膜虫含有质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP(鉴定结果如图28)。

实施例16：

Western blotting检测转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫中的GFP蛋白质的表达。

(1)将转染成功的四膜虫转接至装有50ml SPP培养基的锥形瓶中于30℃培养，巴龙霉素浓度为1000μg/ml。待四膜虫密度长至3×10⁵个/ml，39℃热激，处理1小时。

(2)4℃，1800rpm离心3min，收集细胞。

(3)加入PBS，重悬细胞，1800rpm离心5min，弃上清。

(4)加入PBS，稀释细胞至5×10⁷个/ml，转移至1.5ml离心管，超声破细胞。破细胞参数：Frequency：22％，Time：60S，Pause：1second，1second破至菌体悬液由浑浊变为澄清。

(5)按比例加入5×蛋白电泳缓冲液，在沸水中煮3min，离心，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳。

(6)蛋白质电泳完成，将分离胶从玻璃板上取下，于电转液中平衡半小时，与凝胶同样大小的NC膜和3mm滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵垫的结构装入转印夹。转印时凝胶接负极，NC膜接正极。电转移条件恒压90V，电转2h。

(7)转印结束，将NC膜至于PBST中洗涤三次，每次5min。

(8)将NC膜至于封闭液中封闭1-2h，然后用PBST中洗涤三次，每次5min。

(9)将NC膜与适当稀释的对应第一抗体(GFP抗体、HIS抗体、GST抗体或FLAG抗体)，在37℃反应1h，然后用PBST中洗涤三次，每次5min。

(10)将NC膜与适当稀释的第二抗体，在37℃反应1h，然后用PBST中洗涤6次，每次5min。

(11)将NC膜至于显色液中显色5min，用UVP冷光CCD爆光检测。免疫印记检测检测转染的四膜虫中的GFP蛋白的表达结果如图29所示。转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫的western blotting中用相应的抗体均分别能检测到约27KD，27KD，52KD，27KD的条带(见表1)，则说明对应四膜虫中均有GFP蛋白表达。

表1：Western blotting检测结果

实施例17：

荧光显微镜观察转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫中的GFP蛋白的表达。

(1)24孔一次性培养皿培养(30℃)Whole Cell PCR鉴定正确的转染四膜虫单克隆至对数后，一份39℃热激，处理1小时，另一份不做处理。

(2)各取未热激处理和39℃热激处理后的1ml四膜虫富集至50μl，离心条件为：1500rpm、30℃、2min，然后用ZEISS显微镜在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光观察，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录，如图30所示。以转染质粒pD5H8的四膜虫为对照，其无论热激与否均是看不到绿色荧光，而转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫则未热激时无法看到绿色荧光，热激后均能看到绿色荧光(见表2)，说明转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫中有GFP均有表达，且均具有生物活性。

表2：荧光显微镜观察转染质粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜虫中的GFP蛋白的表达情况

Claims (8)

1.一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HGFP，其序列为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

2.一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-HIS-HGFP，其序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-GST-HGFP，其序列为SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

4.一种一步法引入外源基因的四膜虫转基因表达载体pD5H8-FLAG-HGFP，其序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

5.权利要求1至4项所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体，其特征在于：所述的表达载体含有可替代的绿色荧光筛选标记HGFP。

6.权利要求1至4项所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体，其特征在于：所述的表达载体的盒式结构HGFP两侧含有反向的I-Sce I稀有酶切位点，一步引入外源基因时用于克隆的外源片段的正反向引物接头中含有相应的反向互补I-Sce I酶切位点。

7.权利要求1至4任一项所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体的构建方法，其步骤是：

(1)利用引物：

Y-TGFP-I-SceI-41F；

5′GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC 3′

Y-TGFP-I-SceI-42R；

5′GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT 3′；

以质粒THX-HGFP为模板扩增获得两端带I-Sce I识别序列接头的HGFP片段，并用I-Sce I处理；

(2)利用引物：

Y-th-gfp-61F：

5′CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3′；

Y-th-gfp-62R：

5′GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3′；

以质粒HSP702-GFP为模板反扩载体，并用I-Sce I处理；

(3)连接步骤(1)I-Sce I处理的HGFP片段与步骤(2)I-Sce I处理的载体片段得到重组质粒TH-HGFP；

(4)利用M13正反向引物，以TH-HGFP为模板，PCR扩增获得Not I-HSP70-25′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段，然后Not I处理该PCR片度；

(5)将质粒pD5H8经Not I单酶切后，回收单切片段，并用热敏磷酸酶对该回收片段进行去磷酸化处理；

(6)将步骤(4)中Not I处理后的Not I-HSP70-2 5′UTR-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤(5)中经去磷酸化酶处理后得到载体连接，得到所述表达载体pD5H8-HGFP。

(7)利用引物：

Y-th-2gfp(his)-69F：

5′CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG 3′

Y-th-2gfp(his)-7OR：

5′CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′

以质粒TH-HGFP为模板反扩载体，并用HindIII处理；

(8)将步骤(7)HindIII处理过的的载体片段用连接酶处理，使其自连得到重组质粒TH-HIS-HGFP；

(9)利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP为模板，PCR扩增获得Not I-HSP70-25′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段，然后Not I处理该PCR片度；

(10)将步骤(10)中Not I处理后的Not I-HSP70-2 5′UTR-HIS-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段与步骤(5)中经去磷酸化酶处理后得到载体连接，得到所述表达载体pD5H8-HIS-HGFP；

(11)利用引物：

Y-th-2gfp-(GST)71F：

5′CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC 3′

Y-th-2gfp-(GST)72R：

5′GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT 3′

以质粒TH-HGFP为模板反扩载体，并用HindIII和Bgl II双酶切处理；

(12)利用引物：

Y-GST-73F：5′GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3′

Y-GST-74R：5′CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT 3′

以质粒pET23a-GST为模板扩增获得GST片段，并用HindIII和Bgl II双酶切处理；

(13)连接步骤(12)HindIII和Bgl II双酶切处理后的GST片段与步骤(11)HindIII和Bgl II双酶切处理后的载体片段得到重组质粒TH-GST-HGFP；

(14)利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP为模板，PCR扩增获得Not I-HSP70-25′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段，然后Not I处理该PCR片度；

(15)将步骤(14)中Not I处理后的Not I-HSP70-2 5′UTR-GST-HGFP-HSP70-1 3′UTR-NotI片段与步骤(5)中经去磷酸化酶处理后得到载体连接，得到所述表达载体pD5H8-GST-HGFP；

(16)利用引物：

Y-FLAG-87F：5′GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA 3′

Y-FLAG-88R：5′CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA 3′

以质粒pCDNA3.1-FLAG为模板扩增获得FLAG片段，并用HindIII和Bgl II双酶切处理；

(17)连接步骤(16)HindIII和Bgl II双酶切处理后的FLAG片段与步骤(11)HindIII和Bgl II双酶切处理后的载体片段得到重组质粒TH-FLAG-HGFP；

(18)利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP为模板，PCR扩增获得Not I-HSP70-25′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-Not I片段，然后Not I处理该PCR片度；

(19)将步骤(14)中Not I处理后的Not I-HSP70-2 5′UTR-FLAG-HGFP-HSP70-1 3′UTR-NotI片段与步骤(5)中经去磷酸化酶处理后得到载体连接，得到所述表达载体pD5H8-FLAG-HGFP。

8.权利要求1至4任一项所述的一步法引入外源基因的四膜虫表达载体在表达外源蛋白GFP中的应用。

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