CN104877967A - 一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用。PCR扩增人源Nrf2基因ORF；纯化双酶切与骨架质粒pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接Nrf2慢病毒重组载体，转化后挑选克隆并确定阳性克隆；测序确定无突变后大量扩增；将重组载体及辅助质粒导入293FT细胞获得病毒；感染第3～5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2的细胞株MSCs。本发明通过在MSCs中稳定过表达Nrf2增加其细胞活力，兼具在缺氧及氧化应激条件下具有更强的抗凋亡特性；在体外获得治疗水平数量的Nrf2-MSCs，可作为临床前研究MSCs的良好工具细胞及制备增进临床前实验MSCs移植的药物。

Description

一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用

技术领域：

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用。

背景技术：

转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是一种作用于二相代谢酶基因上游的抗氧化反应元件(ARE)上的转录因子，是多种细胞保护基因表达的主要调节者。二相代谢酶或称二相抗氧化酶，主要有血红素加氧酶(HO-1，即热休克蛋白32)、醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽转移酶(GST)等，二相代谢酶的表达主要通过Keap1-Nrf2-ARE通路调控。ARE位于几乎所有二相酶基因的5`启动区，多种不同类别的物质能通过ARE来诱导二相酶基因的转录。正常状态下Nrf2与其分子伴侣Keap1结合于胞浆中，处于功能抑制状态，并由Keap1将其带入泛素化途径进行降解，因此在细胞中的半衰期很短。在细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2从Keap1中解离以稳定状态进入细胞核内并与ARE结合，最终导致其下游的二相代谢酶的转录。Nrf2作为细胞防御系统中最重要的保护性转录因子，在氧化应激状态时Nrf2的活化和核转位通过多种途径发挥抗氧化应激、抗凋亡和抗炎症作用。近年来研究发现，Nrf2具有广泛的细胞保护作用，对减轻多种组织损伤发挥重要作用。另外，Nrf2是Fas诱导凋亡的抑制物，过表达Nrf2可以保护细胞免于Fas诱导的凋亡，Nrf2还可以通过增加细胞内GSH水平来调节对死亡信号的敏感性，减轻组织的缺血再灌注损伤。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)存在于多种组织之中，例如可在骨髓、脂肪、肌肉、羊水、角膜基质和脐带组织、胎盘提取不同来源的间充质干细胞。骨髓来源的间充质干细胞最先被发现，目前国外临床试验多用第三方捐赠的骨髓来源，主要缺点是不易获取，且获取的过程对健康捐赠者有侵入性操作。脐带来源的间充质干细胞活性好，生长繁殖能力强，而且来源丰富，脐带分娩后一般予以丢弃，可变废为宝，并且利用脐带来源的间充质干细胞无伦理问题，对捐赠者无害。目前全球范围内登记的间充质干细胞移植治疗的临床试验超过200多项。一些临床试验初步结果显示MSCs对多种疾病如心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症acute respiratory distress syndrome(ARDS)、骨髓移植后发生的移植物抗宿主病graft-versus-host disease(GVHD)等都有一定的治疗效果，但其疗效受MSCs在体内存活时间的限制。

MSCs是良好的载体，经过基因修饰的间充质干细胞可能具有较好的应用前景。经过基因修饰后，MSCs的免疫调节和抗炎作用可得到增强，细胞活力和在体内的生存时间也得到增强。大多数临床前、临床研究所用的基因修饰的MSCs均由病毒载体对MSCs进行修饰。病毒载体因其转染效率而被广泛运用，常见的类型有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。腺病毒是瞬时转染，治疗剂量的腺病毒载体修饰的MSCs需要大量的腺病毒，其经济效益比难以达到满意。逆转录病毒和慢病毒载体修饰可将感兴趣的基因插入MSCs基因组中，稳定表达并可以随着细胞分裂传给子代，具有大量扩增的潜力。

发明内容：

本发明的目的是提供一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、PCR技术扩增人源Nrf2基因开放阅读框(open reading frame，ORF)；

(2)、将步骤(1)获得的PCR产物进行纯化，双酶切后与骨架质粒pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接，构建了Nrf2慢病毒重组载体；转化后挑选单克隆，摇菌，取菌液行PCR扩增确定阳性克隆；

(3)、将阳性克隆进行测序，确定无突变后大量扩增；

(4)、将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体与辅助质粒按质量比10：5：5：5的比例共转染至293FT细胞，转染后分两次收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，过滤上清，即获得病毒；所述的辅助质粒分别为pCMSCV、PMDG和PMO Ⅱ，它们与骨架质粒构成四质粒慢病毒包装系统。

(5)、将步骤(4)获得的病毒感染第3～5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。

优选，步骤(1)的PCR反应体系为：50uL反应体系包含25uL 2×Taq plus PCR Master Mix，正向和反向引物各1uL，cDNA模板1uL，无酶水22uL；PCR反应条件为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃2.5min，从变性自延伸结束一共35个循环，72摄氏度5min。

优选，步骤(4)中所述的共转染293FT细胞，具体共转染步骤为：在培养皿内接种合适密度的293FT细胞，要求转染前达到80％以上，将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体、pCMSCV、PMDG、PMO Ⅱ按质量比10：5：5：5的比例稀释于Opti-MEM中，另外吸取Lipo2000进行稀释，室温静置后将两者混合，轻轻混匀，静置；分别加入培养皿中，轻轻混匀；转染6h后更换成含有10％胎牛血清DMEM培养基，分别在24h及48h后收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，0.45uM PVDF膜过滤器过滤上清，获得导入重组质粒包装成Nrf2重组慢病毒，分装冻存于-80℃冰箱或直接用于感染细胞。

优选，步骤(5)中所述的感染第3～5代hUC-MSCs细胞，具体感染步骤为：感染前一天接种细胞于培养瓶中，至第二天感染时密度约为30％，感染前半小时，加入感染增敏剂，感染时将病毒液和培养基1：1稀释，过滤后以此病毒液将培养瓶中的培养液置换出来，6小时换一次病毒液，共感染3次。

临床上间充质干细胞的临床试验一般取10代以内，本发明选取第3～5代的hUC-MSCs作为感染慢病毒对象，以期获得较为初代的细胞达到治疗目的。

本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。

本发明的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs增加了细胞活力，且在缺氧及氧化应激条件下具有更强的抗凋亡特性，因此，本发明的第三个目的是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在作为临床前研究MSCs的良好工具细胞中的应用。

本发明的第四个目的是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在制备增进临床前实验MSCs移植的药物中的应用。

本发明的293FT细胞为人胚肾细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

本发明的hUC-MSCs细胞购自中山大学附属第三医院生物治疗中心。

本发明的辅助质粒pCMSCV、PMDG和PMO Ⅱ及四质粒慢病毒包装系统购自广州永诺生物科技公司。

本发明通过在人间充质干细胞中稳定过表达Nrf2基因，增加其细胞活力，兼具在缺氧的条件下具有更强的抗凋亡特性；在体外获得治疗水平数量的Nrf2-MSCs，可作为临床前研究MSCs的良好工具细胞。

附图说明：

图1是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs(B)和对照组(A)经过15h缺氧后细胞活力情况；

图2是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其对照组经过15h缺氧后用western-blot检测凋亡标志物caspase3变化情况；

图3是NCBI-Blast比对功能预测PCR产物；

图4是PCR反应结果及重组质粒建立，其中，A是PCR获得的人源Nrf2ORF，B是重组载体阳性克隆菌液PCR产物；

图5是重组载体阳性克隆测序结果；

图6是稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs(B)及其不含插入基因的空载对照组(A)，因其骨架质粒均带有GFP，故我们可以从图中可见慢病毒感染效率可。

图7是过表达结果验证，采用western-blot的方法检测到在MSCs中成功过表达Nrf-2。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、PCR技术扩增人源Nrf2(来源于人胚肾细胞)开放阅读框(open reading frame，ORF)

1.1引物设计

在NCBI上找到Nrf2的Gene ID：4780，在其ORF起始密码子(atg)前方寻找正向引物，反向引物在终止密码子(tag)后寻找，然后将其反向互补得到反向引物。分别在正向引物和反向引物前面加上XbaI和BamHI酶切位点及保护碱基，引物序列如下：

正向引物Fw：CGATTCTAGATTCCTGCTTTATAGCGTGCAAA

反向引物Rv：ATATGGATCCTCACATCACAGTAGGAGCTT

经过NCBI-Blast比对功能预测所设计的引物PCR产物特异性较好，只有一种产物即Nrf2ORF片段，如图3所示。

1.2PCR扩增

模板：以293FT为模板，TRIZOL法(试剂采用life technologies TRIZOL regent，货号：15596-018)提取RNA，利用Roche公司的反转录试剂盒(货号：4379012001)反转录为cDNA再以此为模板按以上条件和步骤做PCR。

ORF的全长扩增利用德国DBI公司的2×Taq plus PCR Master Mix为基础反应体系(DBI,公司，货号：DB-2032)，50uL反应体系包含25uL 2×Taq plus PCR Master Mix，正向和反向引物各1uL，cDNA模板1uL，无酶水22uL。

PCR反应程序为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃2.5min，从变性自延伸结束一共35个循环，72摄氏度5min。

PCR产物进行琼脂糖/溴化乙锭电泳，在2000kb附近(具体为2023bp大小的DNA片段)获得单一亮白条带，PCR电泳结果如图4A所示，在紫外灯光下将挑选片段3即A中第三列切下，采用美国Omega Bio-Tek公司试剂盒对脚回收产物进行回收，进一步采用OmegaBio-Tek公司的cycle pure试剂盒进行纯化，回收和纯化步骤按试剂盒说明书进行。然后将纯化后的DNA片段进行双酶切(双酶切体系：对于Nrf-2PCR产物：Xba Ⅰ2uL，BamH Ⅰ1uL，buffer 5uL，PCR产物10uL，无酶水补足50uL；反应条件为37℃1h，65℃20min灭活酶；2)用于重组Nrf2PCR产物的骨架载体(pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP)购自广州永诺公司(编号为LV003)：Xba Ⅰ2uL，BamH Ⅰ1uL，buffer 5uL，骨架载体3.6uL，无酶水补足50uL；37℃1h，65℃20min灭活酶。)后与慢病毒载体pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接(连接体系：连接酶选用NEB公司的T4连接酶(货号：M0202S)，连接体系：已双酶切后的骨架载体1uL，buffer 2uL，T4ligase，Nrf2PCR products1uL补足至20uL；室温下反应2h，65℃10min灭活酶。至此，完成了Nrf2PCR产物片段与骨架载体pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接，构建了Nrf2慢病毒重组载体)，转化后挑选克隆，摇菌扩增做菌液PCR确定阳性克隆(具体为：转化条件：1)选用TAKARA公司的E.coli DH5α(货号：e133886)；2)将DH5α从-80冰箱取出，置于冰上融化15分钟，分装每管为50uL吸取少量Nrf2重组质粒加入其中1管DH5α，吸取少许非重组的骨架质粒加入1管DH5α，另外取1管不加质粒作为对照，冰浴30min，于42℃加热器中热激90sec，迅速置冰上静置2min，细菌培养基LB稀释10倍后直接取200uL用于涂琼脂糖板，板子为氨苄抗性。涂板后待菌液风干，盖上培养皿盖子倒置培养皿，置37摄氏度细菌培养箱培养12～16小时形成境界分明的单个细菌集落后后挑选单克隆，摇菌，取菌液行PCR扩增确定阳性克隆。)阳性克隆菌液PCR电泳如图4B所示，挑选这2个阳性克隆送测序，测序结果显示无突变，如图5所示。

将获得的Nrf2慢病毒重组载体或非重组的骨架质粒与辅助质粒(pCMSCV、PMDG和PMO Ⅱ)按10：5：5：5的比例共转染至293FT细胞，转染后分两次收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，过滤上清，即获得病毒；所述的辅助质粒分别为pCMSCV、PMDG和PMO Ⅱ，它们与骨架质粒构成四质粒慢病毒包装系统，具体共转染步骤为：在10cm培养皿内接种合适密度的293FT细胞(要求转染前达到80％以上)，将重组后的Nrf2骨架质粒或非重组的骨架质粒与其他3个质粒按10：5：5：5的比例(即pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP或Nrf2-pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP：pCMSCV：PMDG：PMO Ⅱ＝10ug：5ug：5ug：5ug)稀释于1mL Opti-MEM中，另外吸取25uL Lipo 2000于1mL中稀释，室温静置5min后将两者混合，轻轻混匀，静置15min。分别加入10cm培养皿中，轻轻混匀。转染6h后更换成含有10％胎牛血清DMEM培养基(血清和DMEM均购自Gibco公司)，分别在24h及48h后收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，0.45uM PVDF膜过滤器(购自minipore公司)过滤上清，此为导入重组质粒包装成Nrf2重组慢病毒及其空载对照，分装冻存于-80℃冰箱或直接用于感染细胞。再将病毒感染第3～5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs，具体感染步骤为：感染前一天接种细胞于25cm²培养瓶中，至第二天感染时密度约为30％，感染前半小时，加入含有感染增敏剂(Polybrene，购自Sigma公司，工作浓度为6ug/mL)，感染时将病毒液和培养基1：1稀释，0.45uM过滤后以此病毒液将培养平中的培养液置换出来，6小时换一次病毒液，共感染3次。

经过Nrf2过表达的细胞株MSCs在缺氧环境(1％O₂)下具有增加细胞活性和抗凋亡作用，过表达Nrf2基因的细胞株MSCs和其不表达插入基因的对照组经过15h缺氧后细胞活力情况分别如图1B和图1A所示,图1A为不表达插入基因的对照组，经过15h缺氧处理，细胞膜模糊，细胞活力明显下降。而过表达Nrf2的MSCs同样条件缺氧处理，细胞活力佳，显示了Nrf2的抗缺氧能力。

过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其对照组经过15h缺氧后用western-blot检测凋亡标志物caspase3变化情况，结果如图2所示经过缺氧处理不表达插入基因的对照组凋亡标记marker剪切型的caspase3明显增加，而过表达Nrf2的MSCs剪切型的caspase3表达与未缺氧对照组无差异，显示了过表达Nrf2在缺氧条件下对抗凋亡的能力，图中为4次实验的代表图。

因重组和非重组的骨架质粒均带有GFP，故可以从图6中可见慢病毒感染效率，其中，图6B为稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs，图6A为不含插入基因的空载对照组。

过表达结果验证，采用western-blot的方法检测到在MSCs中成功过表达Nrf-2，如图7所示。

Claims (7)

1.一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、PCR技术扩增人源Nrf2基因开放阅读框；

(2)、将步骤(1)获得的PCR产物进行纯化，双酶切后与骨架质粒pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接，构建了Nrf2慢病毒重组载体；转化后挑选单克隆，摇菌，取菌液行PCR扩增确定阳性克隆；

(3)、将阳性克隆进行测序，确定无突变后大量扩增；

(4)、将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体与辅助质粒按质量比10：5：5：5的比例共转染至293FT细胞，转染后分两次收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，过滤上清，即获得病毒；所述的辅助质粒分别为pCMSCV、PMDG和PMOⅡ，它们与骨架质粒构成四质粒慢病毒包装系统；

(5)、将步骤(4)获得的高滴度病毒感染第3～5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。

2.根据权利要求1所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，步骤(1)的PCR反应体系为：50uL反应体系包含25uL 2×Taq plus PCR Master Mix，正向和反向引物各1uL，cDNA模板1uL，无酶水22uL；PCR反应程序为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃2.5min，从变性自延伸结束一共35个循环，72摄氏度5min。

3.根据权利要求1所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的共转染293FT细胞，具体共转染步骤为：在培养皿内接种合适密度的293FT细胞，要求转染前达到80％以上，将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体、pCMSCV、PMDG、PMO Ⅱ按质量比10：5：5：5的比例稀释于Opti-MEM中，另外吸取Lipo 2000进行稀释，室温静置后将两者混合，轻轻混匀，静置；分别加入培养皿中，轻轻混匀；转染6h后更换成含有10％胎牛血清DMEM培养基，分别在24h及48h后收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，0.45uM PVDF膜过滤器过滤上清，获得导入重组质粒包装成Nrf2重组慢病毒，分装冻存于-80℃冰箱或直接用于感染细胞。

4.根据权利要求1所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的感染第3～5代hUC-MSCs细胞，具体感染步骤为：感染前一天接种细胞于培养瓶中，至第二天感染时密度约为30％，感染前半小时，加入感染增敏剂，感染时将病毒液和培养基1：1稀释，过滤后以此病毒液将培养瓶中的培养液置换出来，6小时换一次病毒液，共感染3次。

5.一种按照权利要求1所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法制备得到的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。

6.权利要求5所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在作为临床前研究MSCs的良好工具细胞中的应用。

7.权利要求5所述的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在制备增进临床前实验MSCs移植的药物中的应用。