CN109735546B - 抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA及在制备抗血管纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA及在制备抗血管纤维化药物中的应用，抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA，由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列由SEQ ID No.1所示的，所述反义链的核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的。本发明的抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA能明显特异性抑制血管平滑肌细胞内BNIP3L的表达，转染siRNA腺病毒后，明显抑制血管平滑肌细胞的细胞周期进程，显著抑制血管平滑肌细胞的增殖，同时明显抑制细胞外基质蛋白的表达，从而起到抗病理性血管纤维化的作用。

Description

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA及在制备抗血管纤维化药物中 的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA及在制备抗血管纤维化药物中的应用。

背景技术

血管重塑是引起高血压、动脉粥样硬化等血管疾病和循环功能紊乱的病理基础。血管重塑是一个非常复杂的过程,它涉及多个细胞过程的变化,如内皮损伤、血管平滑肌细胞增殖、细胞外基质蛋白的沉积等，进而所引起的血管壁增厚、管腔狭窄、血管纤维化。其中心环节是血管平滑肌细胞的增殖和细胞外基质蛋白的沉积即血管纤维化的发生。近年来，对血管纤维化的研究越来越受到人们的关注。抑制血管纤维化可以有效地控制心脑血管疾病的发病风险。

1998年发现的BNIP3L蛋白在压力超负荷导致的心脏肥厚中转录显著上调，在高血压致心脏肥大的研究中，靶向心肌细胞转基因过表达和基因敲除BNIP3L实验表明BNIP3L在高血压导致的心功能下降及心衰的进程中具有重要的调控作用。而在对其机制的进一步探讨中，发现它主要通过两条通路调控心肌细胞的死亡，从而参与了高血压致心功能下降的发生发展，随后研究发现BNIP3L可以促进心脏成纤维细胞增殖，但BNIP3L与血管平滑肌细胞的关系及其在血管平滑肌细胞中的生物学作用还未见报道。此外，目前也并没有发现针对BNIP3L对抗血管重塑的相关技术。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点。以腺病毒为载体的药物大部分应用于治疗恶性肿瘤，也将可能应用于各种疾病的治疗。

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA缩写为：BNIP3L-siRNA。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA。

本发明的第二个目的在于提供一种抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA在制备抗血管纤维化药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种腺病毒表达载体。

本发明的第四个目的是提供腺病毒表达载体在制备抗血管纤维化药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA，由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列由SEQ ID No.1所示的，所述反义链的核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的。

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA在制备抗血管纤维化药物中的应用。

一种腺病毒表达载体，包含抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA。

腺病毒表达载体在制备抗血管纤维化药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明的抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA能明显特异性抑制血管平滑肌细胞内BNIP3L的表达，转染siRNA腺病毒后，明显抑制血管平滑肌细胞的细胞周期进程，显著抑制血管平滑肌细胞的增殖，同时明显抑制细胞外基质蛋白的表达，从而起到抗病理性血管纤维化的作用。

附图说明

图1为抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA抑制BNIP3L的表达的效果分析；其中各标号代表：1：对照组；2：阴性对照的siRNA；3:268位点的siRNA；4：721位点的siRNA；5：1427位点的siRNA。

图2为1427位点的siRNA腺病毒转染对BNIP3L表达的影响。

图3为血管纤维化进程中BNIP3L在血管中的表达水平。

图4为免疫组化示血管纤维化进程中BNIP3L与血管平滑肌细胞层的共定位。

图5为高血压状态下去甲肾上腺素的水平(*p<0.05与对照组相比较)。

图6为BNIP3L-siRNA腺病毒对BNIP3L表达的影响。(其中NE为Norepinephrine的缩写即去甲肾上腺素；NC为Negative Control的缩写，即阴性对照)

图7为BNIP3L-siRNA腺病毒对血管平滑肌细胞细胞增殖的影响(*p<0.05与对照组相比较，^#p<0.05，与NE组相比较)。

图8为BNIP3L-siRNA腺病毒对血管平滑肌细胞细胞周期的影响(*p<0.05与对照组相比较，^#p<0.05，与NE组相比较)。

图9为BNIP3L-siRNA腺病毒对血管平滑肌细胞纤维连接蛋白和胶原蛋白表达的影响。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进一步说明。

以下实施例中的方法中如无特别说明，所有的方法均为常规方法，所用的生化试剂均为市售试剂。

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA通过人工合成的方法制备。

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA简称BNIP3L-siRNA。

实施例1

抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA的来源

(1)BNIP3L-siRNA设计

从BNIP3L蛋白的转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有义链1位为C或G 19位为U或A,有义链15～19至少有3个U或A,或13～19至少有5个U或A。

根据以下原则：GC含量在30％—50％左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效；将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列及EST同源的序列。最后将靶点定位为268、721、1427三个位点进行化学合成siRNA。并合成阴性对照的siRNA。

阴性对照siRNA:正义链：5’to 3’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；(SEQ ID No.3)

反义链：5’to 3’ACGUGACACGUUCGGAGAATT；(SEQ ID No.4)

268位点的siRNA：正义链：5’to 3’GGCAGUUCUCACUGUGACATT；(SEQ ID No.5)

反义链：5’to 3’UGUCACAGUGAGAACUGCCTT；(SEQ ID No.6)

721位点的siRNA：正义链：5’to 3’GAAUUUGAGACCUAUUGUATT；(SEQ ID No7)

反义链：5’to 3’UACAAUAGGUCUCAAAUUCTT；(SEQ ID No.8)

1427位点的siRNA：正义链：5’to 3’GGCCUAGACAUACAUGAAATT；(SEQ ID No.1)

反义链：5’to 3’UUUCAUGUAUGUCUAGGCCTT。(SEQ ID No.2)

上述siRNA委托上海吉玛制药技术有限公司直接合成。

(2)BNIP3L-siRNA的筛选

将上述合成的各个siRNA用Lipofectamine 3000(invitrogen)转入A7r5细胞(ATCC BNCC339542)中,具体操作步骤详见Lipofectamine 3000(invitrogen)说明书。

将转染的细胞消化收集后提取细胞蛋白，进行Western blot检测BNIiP3L与GAPDH的表达。结果如图1所示，1427位点的siRNA可以明显抑制BNIP3L的表达。

实施例2将1427位点的siRNA进行腺病毒包装

一、BNIP3L-siRNA腺病毒载体的制备

首先采用化学合成法合成含BNIP3L-siRNA(1427位点)的单链DNAoligo。然后于90℃水浴15min退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点(AgeΙ与EcoRΙ)直接连入酶切后的RNAi腺病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证，测序结果经比对确认正确。阳性克隆即为构建成功的目的基因RNAi腺病毒载体。

具体操作如下：

1、采用化学合成法合成以下单链DNA oligo(上海吉凯基因有限公司合成)：

5’to 3’

ccggcaGGCCTAGACATACATGAAActcgagTTTCATGTATGTCTAGGCCTGtttttg(SEQ IDNo.9)

2、把上述合成的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温，产生双链。

3、连接

通过T4DNA连接酶将双酶切(Age I与EcoR I)线性化的RNAi腺病毒载体GV119(上海吉凯基因有限公司)和上述DNA片段进行连接反应，连接后的产物进行转化实验。连接反应体系如下，于16℃连接过夜，连接产物(连接液)进行转化实验。

4、转化

感受态细胞的制备：

配置下述溶液：

1)0.1M CaCl₂溶液，以0.45μm过滤除菌；

2)250mM KCl₂溶液；

3)2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

4)SOB:250mM KCl₂溶液1ml加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入2M MgCl₂溶液0.5ml。

用氯化钙制备新鲜的DH5α大肠杆菌感受态细胞

1)从37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300rpm)。

2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

3)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

9)将细胞分装成小份，放于-70℃。

转化过程：

配置下述溶液：

1)250mM KCl₂溶液；

2)2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

3)SOB培养基：1mL 250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液；

4)SOB琼脂培养基：0.49396g MgSO₄.7H₂O溶于100mlSOB培养基，加入1.5g琼脂粉，高压灭菌，冷至温度低于60℃，加入Amp至终浓度到100μg/ml，混匀铺板；

5)1M葡萄糖溶液，过滤除菌；

6)SOC培养基：2ml 1M葡萄糖溶液加入100ml SOB培养基；

转化步骤：

1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管，再快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。

3)每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

4)将平板置于室温直至液体被吸收，再倒置平皿，于37℃培养，16小时；

5)进行阳性克隆PCR。

5、阳性克隆的PCR鉴定

挑取转化子重悬于10μl LB溶液，混匀取1μl作为模板；使用GV119通用引物(上海吉凯基因有限公司)，进行菌落PCR鉴定实验。

PCR鉴定体系和PCR程序：

PCR程序：

阳性克隆测序:将PCR阳性克隆进行测序，序列如序列表中的SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，测序结果正确，与合成的序列一致。

阳性克隆即为构建成功的目的基因siRNA腺病毒载体,表明成功获得了siRNA腺病毒载体。

二、siRNA腺病毒的包装与滴度检测

1.腺病毒包装

1.1 HEK293(ATCC，cat#CRL-1573)细胞培养

1)活细胞计数

用无血清DMEM培养基把细胞悬液稀释到1000个/ml(一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml的细胞悬液中加入0.1ml的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，10分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

2)细胞株的冻存

取培养2天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×10⁶～2×10⁷/ml。在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml胎牛血清和0.1ml DMSO，混匀后密封。置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

3)细胞复苏

从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70％酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10％FBS的DMEM培养基，置温箱培养。次日更换一次细胞培养液后再继续培养。

4)细胞传代

弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。加入1ml 0.25％胰酶消化液，消化约1.5min，直到细胞完全消化下来。加入含10％FBS和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。混匀细胞后按照1：5传入新的培养瓶中，继续培养。3天左右、待细胞长满时，重新进行传代。

1.2 DNA溶液的制备

将腺病毒穿梭质粒(上述制备的siRNA腺病毒载体)和辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3Cre(Microbix.Canada))用大肠杆菌菌株DH5α进行扩增，方法如下：

1)用冷却的无菌吸头取200μlDH5α转移到无菌的微量离心管中，每管分别加入2μl腺病毒穿梭质粒、辅助包装质粒，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管，再快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。

3)每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

4)将平板置于室温直至液体被吸收，再倒置平皿，于37℃培养，16小时；

5)挑取单克隆加入Amp抗性(100ug/ml)的LB液体培养基上，于37℃摇床培养，16小时。

6)将步骤5中得到的菌液以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒(Cat.12145)提取质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。

1.3质粒转染过程

1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达40％，重新接种于T25瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到60％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清DMEM培养基。

3)向一灭菌离心管中加入所制备的DNA溶液(穿梭质粒(上述siRNA腺病毒载体)5μg和辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3Cre(Microbix.Canada))5μg)与DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取10μlLipofectamine 2000试剂在另一管中与50μl DMEM混合，在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。

6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养。

8)培养6h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入2ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养。

10)每天观察转染后细胞生长状况，若细胞培养基明显变黄，酌情补加适量的新鲜全培养液。

1.4重组腺病毒的收获

转染后大约15天左右，HEK 293细胞开始飘落，部分细胞出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃,7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

2.腺病毒的扩增

2.1第1轮扩增

将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞4倍稀释后传入另1个T25细胞培养瓶中，以含10％FBS的DMEM培养液在37℃,5％CO₂下培养(以下扩增中均使用此条件培养细胞)。待细胞达到60％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入复制缺陷型腺病毒重组成功后收获的粗提液2mL，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液3mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃,7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

2.2第2轮扩增将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞全部传入1个T75细胞培养瓶中，以完全培养基继续培养。待细胞达到90％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入第1轮扩增所得的病毒液2ml，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液10mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于10ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃，7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

3.腺病毒纯化

按Adeno-X^TMVirus Purification Kit(BD Biosciences,Clontech)的步骤纯化重组腺病毒，主要步骤如下:

1)取出BD Adeno-X纯化装置，将10ml的病毒粗制液用0.45μm孔径的滤膜过滤，滤液保存在收集瓶中；

2)往病毒滤液中加入4μl 25U/ul的Benzonase.混匀，37℃保温30min；

3)往收集瓶中加入10ml的l×dilution buffer，使之与病毒滤液混合均匀；

4)将20ml的注射器中吸入5ml灭菌PBS，把注射器插入滤器，推入PBS使之流经套管，将滤器和套管中的空气排尽；

5)将套管插入收集瓶中的病毒滤液中；

6)将病毒滤液吸入注射器中，以5ml/min的速度推出，使之流经滤器。注意避免空气进入系统中；

7)将套管的入口从收集瓶转移到1×Wash Buffer中；

8)通过套管将wash buffer吸入注射器中，将全部wash buffer以5ml/min的速度推入流经滤器；

9)取下滤器；

10)用5ml的BD Luer-Lok注射器洗脱腺病毒：在注射器中吸入3ml的1×EultionBuffer；连接注射器和滤器的凹口，推入l ml Elution Buffer流经滤器到5ml的灭菌离心管中；室温下孵育滤器5min，推入剩下的elution buffer流经滤器来收集剩下的腺病毒；

11)将纯化后的腺病毒分装，-70℃保存。

4.腺病毒滴度检测

4.1腺病毒滴度测定-终点稀释法

1)在实验前24小时，向96孔板的每一个孔加入100μl HEK293细胞悬液，约含1x103个细胞；

2)准备10个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990μl的完全培养液，其余的9个管子中各加入900μl的完全培养液。

3)待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990μl的Ep管中做1:100稀释(10^-2)；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900μl的Ep管中做1:10稀释(10^-3)，直至稀释到10^-13。

4)从细胞培养箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将10^-13至10^-6稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行的第1-10每孔加入90μl病毒稀释液，而每一行的第11-12每孔均加入90μl不含病毒的完全培养基作为对照。

5)将96孔板置于置37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养，

6)10d后观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，统计每一行的阳性率，计算病毒滴度(Spearman-Karber Method):

4.2病毒滴度计算方法

病毒滴度＝10^(x+0.8)(PFU/ml)，x＝10^-1到10^-13依次稀释度下CPE阳性率总和。

最后得到滴度1×10¹⁰PFU/ml。

*公式使用条件:

①阴性对照没有CPE和生长抑制现象；

②加入最小稀释浓度病毒液的孔均有CPE。

实施例3将所构建的BNIP3L-siRNA腺病毒转染血管平滑肌细胞。

1)120g左右的Wistar大鼠麻醉后，75％酒精中浸泡5min；将麻醉后的大鼠置于手术台上，取胸主动脉；用眼科剪剖开血管，用眼科弯镊取出血管内皮层后，PBS清洗；用眼科剪将组织裁成表面积为2mm²左右的组织块，贴在培养瓶中，组织间距在0.5cm左右，加入4ml左右的含20％胎牛血清DMEM培养基；培养瓶倒置于CO₂培养箱中2h，确保组织块与培养瓶充分粘合；轻轻将其翻转，使得组织块完全浸泡于培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养，传5代后经鉴定用于实验。

2)将腺病毒以100PFUs/cell的浓度加入细胞培养液中

3)48小时后收集细胞，检测其细胞内BNIP3L表达的变化。

用western blot检测其转染血管平滑肌细胞后对BNIP3L蛋白表达的影响，结果显示：与对照组相比，BNIP3L-siRNA腺病毒转染血管平滑细胞后可以明显抑制细胞内BNIP3L的表达，如图2所示。

实施例4BNIP3L-siRNA腺病毒对病理条件下的纤维化的调控作用

在应激或病理条件下如高血压，体内去甲肾上腺素分泌增加，去甲肾上腺素(NE)分泌增加会导致了血管纤维化的发生。

采用腹主动脉缩窄术建立压力超负荷致高血压的Wistar大鼠动物模型，手术八周后开胸取大鼠血管组织和血浆，血管组织进行病理切片Masson染色，并提取血管组织蛋白进行western blot检测，发现高血压组血管明显纤维化，BNIP3L表达明显增加(图3)，BNIP3L免疫组化结果显示BNIP3L在血管平滑肌细胞层表达明显增加(图4)。采用高压液相检测大鼠血浆中NE的水平，发现高血压组血浆中NE水平明显升高(图5)。而去甲肾上腺素(NE)分泌增加会导致了血管纤维化的发生。

为了进一步观察BNIP3L-siRNA腺病毒对病理条件下的纤维化的调控作用，我们转染BNIP3L-siRNA腺病毒的同时给予去甲肾上腺素(10^-5M NE)诱导，腺病毒转染48小时后，用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(博士德，AR1156)检测细胞的增殖；或者收集细胞，70％的乙醇固定细胞过夜后用PI染色液(leagene公司，DA0021)进行染色，流式细胞术检测细胞周期；或者提取细胞蛋白，采用western blot方法检测胶原蛋白和纤维连接蛋白的表达。结果显示：NE诱导可以促进BNIP3L的表达增加，促进血管平滑肌细胞的增殖和细胞外基质蛋白的表达(图6-9)，而BNIP3L-siRNA腺病毒可以明显抑制NE诱导的BNIP3L的表达(图6)，抑制NE诱导的细胞增殖(图7)、细胞周期的进程(图8)和细胞外基质蛋白的表达(图9)，从而起到抗病理性血管纤维化的作用。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA及在制备抗血管纤维化药物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccuagaca uacaugaaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uuucauguau gucuaggcct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcaguucuc acugugacat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugucacagug agaacugcct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaauuugaga ccuauuguat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uacaauaggu cucaaauuct t 21

<210> 9

<211> 58

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccggcaggcc tagacataca tgaaactcga gtttcatgta tgtctaggcc tgtttttg 58

Claims (2)

1.抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA在制备抗血管纤维化药物中的应用，所述siRNA由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列由SEQ ID No.1所示的，所述反义链的核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的。

2.一种腺病毒表达载体在制备抗血管纤维化药物中的应用，所述腺病毒表达载体是包含抑制BNIP3L蛋白表达的siRNA。

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