CN114099537B - 敲低vamp5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用，属于生物化学及分子生物学技术领域。VAMP5基因能够作为治疗脑胶质瘤的靶点，敲低VAMP5基因表达能够治疗脑胶质瘤。经过实验证明，敲低人脑胶质瘤中的VAMP5基因后抑制了胶质瘤细胞贴壁形态的形成、细胞的增殖和迁移能力，慢病毒VAMP5敲低组相对于对照组能够使较低等级和部分高等级的脑胶质瘤细胞逐渐死亡。

Description

敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物化学及分子生物学技术领域，具体涉及敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
背景技术
脑胶质瘤是由于大脑或脊髓胶质细胞癌变所产生，是临床上最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，占原发性脑肿瘤的33％～45％，恶性脑肿瘤的约80％，超过95％的病人的存活期无法超过5年，具有发病率高、复发率高、易转移、死亡率高以及治愈率低的特点。脑胶质瘤按照WHO分类，按照肿瘤恶性程度递增分为I-IV型，其中WHO IV型恶性程度最高，又称为胶质母细胞瘤 (glioblastoma multiform，GBM)。近些年来虽然在脑胶质瘤的治疗，如外科手术切除、放疗和化疗方面取得了一些进展，但整体上仍然缺乏足够的治疗手段。手术切除仍然是脑胶质瘤最有效的治疗方法，但是受制于脑胶质瘤易扩散、肿瘤与正常组织间边界不清晰的特征，手术难以切除干净因此导致了复发率高。虽然目前已有大量的脑胶质瘤基因组测序结果，但是脑胶质瘤的致病机理仍然未研究清楚，缺少用于脑胶质瘤治疗的基因靶点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用，VAMP5基因能够作为治疗脑胶质瘤的靶点，敲低VAMP5基因表达能够治疗脑胶质瘤。
本发明提供了敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
优选的，所述敲低VAMP5基因表达的制剂包括shRNA，shRNA敲低的VAMP5基因的mRNA靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种敲低VAMP5基因表达的shRNA，包含碱基互补配对的正义链和反义链；
所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
本发明还提供了一种敲低VAMP5基因表达的重组慢病毒载体，以pHBLV-U6-MCS-ZsGreen-PGK-PURO或pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO为骨架，插入有上述方案所述的shRNA。
优选的，所述shRNA通过U6启动子表达。
本发明还提供了一种重组慢病毒，经上述方案所述重组慢病毒载体转染细胞系，包装获得。
本发明还提供了上述方案所述的shRNA或者所述的重组慢病毒载体或所述的重组慢病毒在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
优选的，所述脑胶质瘤包括LNZ308和/或A172。
本发明还提供了一种治疗脑胶质瘤的药物，所述药物中包含上述方案所述重组慢病毒和药学上可接受的辅料。
本发明提供了敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。本发明人研究发现VAMP5基因能够作为治疗脑胶质瘤的靶点，敲低VAMP5基因表达能够治疗脑胶质瘤。本发明经过试验证明，敲低人脑胶质瘤中的VAMP5基因后抑制了胶质瘤细胞贴壁形态的形成、细胞的增殖和迁移能力，慢病毒VAMP5敲低组相对于对照组(空载体病毒)能够使脑胶质瘤细胞逐渐死亡。
附图说明
图1为LNZ308细胞中慢病毒感染敲低VAMP5的结果；其中A为 LNZ308细胞系感染VAMP5 shRNA慢病毒和对照慢病毒的照片；B为 LNZ308细胞系敲低VAMP5的Western blot验证结果；C为LNZ308细胞系敲低VAMP5的划痕恢复实验结果；
图2为慢病毒感染LNZ308细胞敲低VAMP5的结果；其中A为慢病毒感染LNZ308细胞后不同时间点的细胞状态；B为LNZ308细胞感染慢病毒后进行细胞活力检测的结果；
图3为慢病毒介导敲低VAMP5对GBM类型的细胞影响；其中A为A172 细胞在病毒感染后特定时间点的照片，图B为U87mg细胞在病毒感染后特定时间点的照片；
图4为不同MOI的慢病毒感染GBM细胞系A172的结果；其中A为感染慢病毒后的细胞状态照片；B为细胞活力检测的结果；C为Western blot 验证A172中的VAMP5敲低效果的结果；
图5为不同的VAMP5敲低shRNA序列荧光慢病毒对LNZ308细胞的杀伤效果对比；其中，A为对照组空载体病毒，B为本发明所用shRNA序列的慢病毒，C为慢病毒shRNA序列1的LNZ308细胞感染结果，D为慢病毒shRNA序列2的LNZ308细胞感染结果。
具体实施方式
本发明提供了敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。在本发明中，所述VAMP5基因为治疗脑胶质瘤的新靶点。敲低脑胶质瘤中的VAMP5基因后能够抑制胶质瘤细胞贴壁形态的形成、降低细胞的增殖和迁移能力，使细胞变圆、漂浮并死亡。在本发明中，所述VAMP5 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，具体为：
1 actgcggccg ctccgcaggc agagaagccg ggagcgggcg aggcggcggc ggcagcagcg
61 atggcaggaa tagagttgga gcggtgccag cagcaggcga acgaggtgac ggaaattatg
121 cgtaacaacttcggcaaggt cctggagcgt ggtgtgaagc tggccgaact gcagcagcgt
181 tcagaccaac tcctggatat gagctcaacc ttcaacaaga ctacacagaa cctggcccag
241 aagaagtgct gggagaacat ccgttaccgg atctgcgtgg ggctggtggt ggttggtgtc
301 ctgctcatca tcctgattgt gctgctggtc gtctttctcc ctcagagcag tgacagcagt
361 agtgccccac ggacccagga tgcaggcatt gcctcagggc ctgggaactg acccagctgg
421 tcctgaagga gaagccaaat ggctgcactg gccgattctg gtctccagag gaccttggtg
481 tttgctctcc cttgacccac cccagtgagt gccaaagggc agccccaaca tgtgcacccc
541 tgcatttcct gtcatgccac agactggccc ttgagggcag cctgctgtac tggccatgct
601 gggccagccc cacctggagc tcagtaaaaa ctgctgtttg attaaaagctggtatctgtg。
在本发明中，所述shRNA敲低的VAMP5基因的mRNA靶序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，具体为：5’-gatatgagctcaaccttcaacaaga-3’。
本发明还提供了一种敲低VAMP5基因表达的shRNA，包含正义链和反义链；所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为： 5’-gatccgatatgagctcaaccttcaacaagat tcaagagatcttgttgaaggttgagctcatatctt-3’；所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体为： 5’-aattcaaaaaagatatgagctcaaccttcaacaagatctcttgaatcttgttgaaggttgagctcatatcg-3’。
在本发明中，所述正义链序列能够与VAMP5的mRNA靶序列特异性结合，降解VAMP5的mRNA表达量。在本发明中，所述正义链和反义链上的下划线区域为stem loop区域。
本发明还提供了一种敲低VAMP5基因表达的重组慢病毒载体，以 pHBLV-U6-MCS-ZsGreen-PGK-PURO或pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO为骨架，插入有上述方案所述的shRNA。在本发明中，所述shRNA优选的通过 U6启动子表达。在本发明中，所述pHBLV-U6-MCS-ZsGreen-PGK-PURO或 pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO来源于常规市售。在本发明中，所述shRNA的插入位点优选为BamHI和EcoRI。本发明对所述重组慢病毒载体的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规重组慢病毒载体构建方法即可。
本发明还提供了一种重组慢病毒，经上述方案所述重组慢病毒载体转染细胞系，包装获得。
在本发明中，所述重组慢病毒的构建方法优选的包括以下步骤：将重组慢病毒载体、慢病毒包膜载体和慢病毒包装载体共转染细胞系，收集细胞上清。在本发明中，所述慢病毒包膜载体优选为pMD2.G；所述慢病毒包装载体优选为psPAX2；所述细胞系优选为293T细胞。本发明对转染方法没有特殊限定，为本领域的常规技术。
本发明的重组慢病毒能够抑制脑胶质瘤(gliomas)细胞增殖和转移，抑制贴附形态的形成，最终使细胞死亡。本发明的重组慢病毒能够杀死脑胶质瘤细胞。
本发明还提供了上述方案所述的shRNA或者所述的重组慢病毒载体或所述的重组慢病毒在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗脑胶质瘤的药物，所述药物中包含上述方案所述的重组慢病毒和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药物的有效剂量以重组慢病毒的滴度计优选为MOI≥10，更优选为MOI>25。本发明对所述药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。
在本发明中，所述脑胶质瘤优选为LNZ308和/或A172。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1敲低VAMP5的shRNA慢病毒的构建
1、慢病毒载体质粒的构建。shRNA包含正义链和反义链；所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。将载体质粒pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGREEN-PGK-PURO或 pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO用New England Biolabs公司的BamHI和EcoRI 双酶切，所需试剂如表1所示，至于37℃水浴中反应3h后向每个离心管中加入10μL 6×Loading Buffer终止酶切。利用QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit纯化载体DNA。
表1酶切反应体系
试剂 体积(μL)
慢病毒载体DNA(1μg/μL) 1
10×CutSmart Buffer 5
H<sub>2</sub>O 42
EcoRI酶 1
BamHI酶 1
Total 50
转录shRNA粘性末端的双链DNA片段的获得。shRNA模板和引物均由生物公司合成，PAGE纯化而得的oligo序列，引物的浓度为100μM。反应体系如表2(20μL)：
表2：
Figure BDA0003381543600000051
Figure BDA0003381543600000061
退火参数设置如表3：
表3：
Figure BDA0003381543600000062
干扰片段与载体的酶连体系如表4，在16℃连接过夜：
表4：
Figure BDA0003381543600000063
Figure BDA0003381543600000071
连接好的质粒转化进大肠杆菌DH5α中，步骤如下：
1)DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，要立刻放到冰上融化；
2)待感受态细胞融化后，加入5μL连接产物到50μL的感受态细胞中，于冰上放置30min；
3)42℃热激90s，热激完之后立刻插入冰上冰育2-3min；
4)在超净台中，加入500μL SOC培养基，轻柔的上下颠倒3-5次；
5)37℃、230rpm震荡培养45-60min；
6)将菌液涂到氨苄抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将平板倒置于 37℃恒温箱培养16h，待长出单菌落后接种到5ml含有氨苄的LB培养基， 37℃，220rpm摇床培养18h，少量细菌与甘油混合-80℃保存备用。取3ml 菌液抽提质粒，DNA测序证实插入序列正确后，甘油菌种接种到10mL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm摇床培养18h。取3mL的过夜细菌加至200mL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm摇床培养16h。收获菌液后使用QIAGENQIAfilter大提质粒试剂盒提取质粒，最终收获的质粒浓度不低于1μg/μl。
2、慢病毒的包装。
1)细胞预培养。提前传代293T细胞至150mm培养皿中，置于37℃， 5％CO2的培养箱中过夜；第二天观察细胞密度，达到70％～80％的汇合率即可进行转染；开始转染之前，使用预热的DMEM清洗293T细胞2次，洗涤结束后加入17mL含氯喹的DMEM，置于37℃培养箱中备用。
2)转染。准备两个50mL离心管，分别标记为试管1和试管2，向试管1中按顺序加如表5所示试剂，轻轻转动混匀。
表5：
Figure BDA0003381543600000072
Figure BDA0003381543600000081
向试管2中加入2592μL的2X HBS。将试管1中的溶液缓慢滴入试管2，室温静置15min。将混合液滴入步骤(1)含293T细胞的平板中，确保混合均匀，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育5h，5h后更换为含2％FBS培养基， 24h更换新鲜的含2％FBS培养基。
3)收毒。转染后48h收集病毒上清。在48h收毒后补入含2％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养，待转染72h后再次收毒
4)超速离心。将步骤(3)中收集的病毒上清置于50mL离心管，4℃， 2000×g，离心10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，82700×g，离心120min，去掉上清，将慢病毒超速离心后的沉淀重悬于PBS，分装到灭菌处理的病毒管中得病毒原液，-80℃冰箱保存。
5)滴度检测。慢病毒滴度检测采用稀释计数测定法。滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。“TU”为“transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 IU/mL，指每毫升中含有的整合活性的病毒颗粒数。“IU”为integration units 的缩写，中文为整合单位。荧光慢病毒的滴度检测步骤如下：
I.细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x105/mL，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
II.加病毒
第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释于含10％FBS完全培养基中，共6个稀释度。将100μL 含有不同稀释度的培养基加入到293T细胞。
III.追加培养液
第三天，先吸去100μL含病毒培养基，加入100μL新鲜10％FBS完全培养基。
IV.观察结果并计算滴度
第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜 10％FBS完全培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10％FBS 完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～50％的孔计算病毒滴度。
滴度(TU/mL)＝细胞数×阳性克隆百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103 TU/mL
无荧光的慢病毒的滴度检测步骤：
I.细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x105/mL，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备12个孔，其中6个为嘌呤霉素筛选孔，6个为对照孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
II.加病毒
第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释于含10％FBS完全培养基中，共6个稀释度。将100μL 含有不同稀释度的培养基加入到全部的293T细胞孔中。
III.追加培养液
第三天，先吸去100μL含病毒培养基，在6个嘌呤筛选孔中加入100μL 含有1.5μg/ml的嘌呤霉素的10％FBS完全培养基，6个对照组中加入100μL 正常的10％FBS完全培养基。
IV.观察结果并计算滴度
第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜 10％FBS完全培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10％FBS 完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。6h荧光显微镜下观察结果，细胞计数计算嘌呤筛选组中的活细胞相对于对照组的活细胞的比例。滴度计算如下：
滴度(TU/mL)＝细胞数×阳性克隆百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103 TU/mL
实施例2使用构建好的VAMP5敲低慢病毒感染LNZ308细胞，观察效果。
LNZ308为LGG中的astrocytoma类型。
一、形态学观察
1、LNZ308细胞接种于24孔板，控制初始接种细胞数目相同为5×104细胞每孔。
2、培养24h后分别加入表达ZsGreen绿色荧光的对照病毒(不表达 shRNA)或VAMP5敲低病毒，控制病毒添加量使MOI＝10。
3、培养2d后移除培养基，随后加入2μg/ml的puro培养基，筛选24h 后，胰酶消化转接24孔板，控制孔与孔之间接种数目完全相同。
4、从细胞转接后开始计时，每天用荧光显微镜拍摄记录细胞状态，结果如图1中的A。VAMP5 shRNA病毒处理后的细胞数量明显比对照病毒处理后的细胞数量少。
5、转接后第二天收集蛋白样本，进行Westernblot实验，验证VAMP5 的敲除效果。结果如图1中的B显示，表达VAMP5 shRNA的病毒显著降低了VAMP5的蛋白表达。
二、划痕恢复实验
1、LNZ308细胞接种于24孔板，控制初始接种细胞数目相同为5×104细胞每孔。
2、培养24h后分别加入表达ZsGreen绿色荧光的对照病毒(不表达 shRNA)或VAMP5敲低病毒，控制病毒添加量使MOI＝10。
3、培养2天后移除培养基，随后加入2μg/ml的puro培养基，筛选24h。
4、移除带puro的培养基，加入正常培养基培养1天使细胞恢复状态。
5、施加细胞划痕，然后从此时开始计时，每天用显微镜绿色荧光视场拍摄细胞状态。结果如图1中的C。可以看出来，对照病毒感染的细胞两天后划痕基本上复原了，而VAMP5敲低组的细胞两天后划痕不仅未复原，划痕边界的细胞也逐渐死亡飘落了。由此可见在LNZ308细胞中敲低VAMP5 能够抑制细胞的复制、转移和贴壁能力。
实施例3敲低VAMP5对LNZ308细胞的杀伤效果。
1、接种LNZ308细胞于24孔板，初始接种量为5×104个细胞每孔。培养24h后添加不表达荧光的对照病毒和VAMP5敲低慢病毒，使MOI＝10。并从此时开始计时。
2、从添加病毒第5天，7天和10天拍照，记录细胞的状态，结果如图 2中的A。
3、拍照后，更换新的培养基1ml，同时在没有细胞生长的空白孔板中添加1ml培养基作为空白对照。
4、向每孔中添加CCK8试剂，随后置于37℃培养箱中，反应1.5h。
5、反应结束后将带有CCK8试剂的培养基吸取200μL，转移至96孔板。置于酶标仪中测量OD450。
6、按照细胞活力(％)＝(OD450敲低-OD450空白)/(OD450对照-OD450空白)×100％计算细胞活力，对比对照病毒感染组和VAMP5敲低病毒感染细胞的细胞活力差异。可以看出来敲低VAMP5表达，在第7天和第10天明显降低了细胞数量(图2中的B)。与细胞拍照结果相一致(图2中的A)。
本实施例的结果证明了敲低VAMP5的慢病毒对astrocytoma类型癌细胞 LN308具有较好的杀伤力，具备作为抗癌药物的潜力。
实施例3使用VAMP5敲低慢病毒感染GBM细胞系A172和U87mg验证细胞杀伤效果。
1、接种相同数目的A172和U87mg细胞系于24孔板中，每个孔5×104个细胞，培养1天。
2、分别加入适量的对照病毒和VAMP5敲低慢病毒(均表达ZsGreen 绿色荧光蛋白)使MOI＝50。
3、培养2天后，加入带puromycin的培养基(2μg/ml)筛选24h后胰酶消化、转接到新的孔板，保证每个孔的细胞接种数量相同，并从此开始计时。每天拍照记录细胞状态。结果显示VAMP5敲低慢病毒只影响了A172细胞 (图3中的A)，而不影响U87mg细胞的生长和分裂(图3中的B)。
本实施例的结果可以看出，敲低VAMP5对GBM类型的一部分细胞如 A172有杀伤作用。
实施例4使用不同MOI的慢病毒感染GBM细胞A172，验证敲低 VAMP5的细胞杀伤效果。
1、接种A172细胞系于12孔板，控制初始细胞数目相同，为5×104个细胞每孔，培养1天。
2、分别添加对照病毒和VAMP5敲低病毒，控制病毒剂量使MOI分别为5和25，培养2天。
3、移除慢病毒，胰酶消化，转接到新的12孔板并保证每个孔中的接种细胞相同。并从此开始计时，每天拍照记录细胞状态，图4中的A为转接后第4天的细胞状态。与对照病毒处理的细胞相比，较高剂量的VAMP5敲低慢病毒(MOI＝25)明显降低了细胞的密度(图4中的A)。
4、转接后第1天进行蛋白取样，Western blot验证的结果如图4中的B，可以看出来MOI＝5和MOI＝25均显著地敲低了VAMP5的表达量。
5、转接后第4天，用CCK8试剂进行细胞活力检测，测量方法同实施例3所述。结果显示高剂量的VAMP5 KD病毒(MOI＝25)明显降低了细胞的数量(图4中的C)。
从本实施例的结果可以看出，慢病毒VAMP5敲低组相对于对照组能够使较低等级(如LNZ308细胞)和A172高等级的脑胶质瘤细胞逐渐死亡。本发明不仅发现了治疗脑胶质瘤的新靶点VAMP5，并且制备的干扰VAMP5 表达的慢病毒具备治疗脑胶质瘤的应用。
实施例5其他shRNA序列对LNZ308细胞的杀伤效果对比
为了证明本发明所用shRNA序列的有效性，现选用其他的shRNA序列 (慢病毒shRNA序列1和慢病毒shRNA序列2)的慢病毒进行LNZ308细胞感染实验。
在本发明中，所述慢病毒shRNA序列1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：5- GATCCGGCGAACGAGGTGACGGAAATTATGTTCAAGAGACATAATTTCCGTCACCTCGTTCGCCTTTTTTG-3；所述慢病毒shRNA序列1的反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示，具体为：AATTCAAAAAAGGCGAACGAGGTGACGGAAATTATGTCTCTTGAACAT AATTTCCGTCACCTCGTTCGCCG。
在本发明中，所述慢病毒shRNA序列2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，具体为：5- GATCCGTCATCCTGATTGTGCTGCTGGTCGTTTCAAGAGAACGACCAGCAGCACAATCAGGATGATTTTTTG-3；所述慢病毒shRNA序列2的反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示，具体为： AATTCAAAAAATCATCCTGATTGTGCTGCTGGTCGTTCTCTTGAAACGACCAGCAGCACAATCAGGATGACG。
细胞培养条件如实施例3所述，培养基中添加了2μg/ml的嘌呤霉素以筛选细胞保证慢病毒充分感染；慢病毒采用带荧光的慢病毒，通过显微镜拍照记录细胞状态，LNZ308感染慢病毒6d时的实验结果(10×4放大倍数) 如图5所示，A为对照组空载体病毒，B为本发明所用shRNA序列的慢病毒，C为慢病毒shRNA序列1的LNZ308细胞感染结果，D为慢病毒shRNA序列2的LNZ308细胞感染结果。从图5可以对比看出本发明所用的shRNA 序列对LNZ308细胞具有最佳的杀伤效果，而相对的另外两种序列对LNZ308 杀伤效果较弱。结合前面的实施例中的westernblot结果可以确定shRNA确实敲低了VAMP5抑制了VAMP5蛋白表达。故可以验证本发明的shRNA序列的有效性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 河南大学
<120> 敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gatatgagct caaccttcaa caaga 25
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gatccgatat gagctcaacc ttcaacaaga ttcaagagat cttgttgaag gttgagctca 60
tatctt 66
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
aattcaaaaa agatatgagc tcaaccttca acaagatctc ttgaatcttg ttgaaggttg 60
agctcatatc g 71
<210> 4
<211> 660
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
actgcggccg ctccgcaggc agagaagccg ggagcgggcg aggcggcggc ggcagcagcg 60
atggcaggaa tagagttgga gcggtgccag cagcaggcga acgaggtgac ggaaattatg 120
cgtaacaact tcggcaaggt cctggagcgt ggtgtgaagc tggccgaact gcagcagcgt 180
tcagaccaac tcctggatat gagctcaacc ttcaacaaga ctacacagaa cctggcccag 240
aagaagtgct gggagaacat ccgttaccgg atctgcgtgg ggctggtggt ggttggtgtc 300
ctgctcatca tcctgattgt gctgctggtc gtctttctcc ctcagagcag tgacagcagt 360
agtgccccac ggacccagga tgcaggcatt gcctcagggc ctgggaactg acccagctgg 420
tcctgaagga gaagccaaat ggctgcactg gccgattctg gtctccagag gaccttggtg 480
tttgctctcc cttgacccac cccagtgagt gccaaagggc agccccaaca tgtgcacccc 540
tgcatttcct gtcatgccac agactggccc ttgagggcag cctgctgtac tggccatgct 600
gggccagccc cacctggagc tcagtaaaaa ctgctgtttg attaaaagct ggtatctgtg 660
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
gatccggcga acgaggtgac ggaaattatg ttcaagagac ataatttccg tcacctcgtt 60
cgcctttttt g 71
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
aattcaaaaa aggcgaacga ggtgacggaa attatgtctc ttgaacataa tttccgtcac 60
ctcgttcgcc g 71
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gatccgtcat cctgattgtg ctgctggtcg tttcaagaga acgaccagca gcacaatcag 60
gatgattttt tg 72
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
aattcaaaaa atcatcctga ttgtgctgct ggtcgttctc ttgaaacgac cagcagcaca 60
atcaggatga cg 72

Claims (8)

1.敲低VAMP5基因表达的制剂在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用；
所述敲低VAMP5基因表达的制剂包括shRNA，shRNA敲低的VAMP5基因的mRNA靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种敲低VAMP5基因表达的shRNA，包含碱基互补配对的正义链和反义链；
所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种敲低VAMP5基因表达的重组慢病毒载体，以pHBLV-U6-MCS-ZsGreen-PGK-PURO或pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO为骨架，插入有权利要求2所述的shRNA。
4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述shRNA通过U6启动子表达。
5.一种重组慢病毒，经权利要求3或4所述重组慢病毒载体转染细胞系，包装获得。
6.权利要求2所述的shRNA或者权利要求3或4所述的重组慢病毒载体或权利要求5所述的重组慢病毒在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脑胶质瘤的细胞包括LNZ308和/或A172。
8.一种治疗脑胶质瘤的药物，所述药物中包含权利要求5所述重组慢病毒和药学上可接受的辅料。
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