CN110075122B - 一种肝癌治疗性外泌体药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝癌治疗性外泌体药物，其为VPS35基因表达下调的肝癌细胞分泌的外泌体，并且导入了用于治疗肝癌的微小RNA分子。本发明的肝癌治疗性外泌体药物能够用于肝癌临床治疗，降低高危患者术后复发率，抑制肝癌进展，从而改善肝癌切除或肝移植的预后。

Description

一种肝癌治疗性外泌体药物
技术领域
本发明属于生物医药和基因工程领域，具体地说，涉及一种肝癌治疗性外泌体药物、其制备方法及其应用。
背景技术
肝细胞肝癌(以下简称“肝癌”)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一。我国是肝癌高发国，全球约50％的肝癌新发及死亡病例均发生在中国。手术切除、肝移植和射频消融仅适用于部分早期及中期肝癌病人，术后转移复发阻碍了其疗效的进一步提高；介入栓塞、靶向治疗、放疗等对大部分中晚期肝癌病人疗效有限。因此，寻找新的肝癌治疗靶点及治疗方法以提高疗效成为目前肝癌研究领域的热点及难点。
近几年，RNA干扰(RNA interfering，RNAi)作为一个新的基因治疗技术，其在抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等医药领域应用前景广阔，得到了迅速发展，部分RNA药物已进入临床试验阶段，为疑难杂症尤其是多因素的疾病如癌症、病毒感染开辟了全新的治疗途径。2016年12月23日，美国食品和药物管理局FDA批准了首个用于治疗脊髓性肌萎缩的RNA药物Spinraza(Nusinersen)的上市申请，标志着RNA药物正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。RNAi药物现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。
大量研究表明，作为一种潜在的小核酸RNA分子药物，miR-26a通过多种机制抑制肿瘤发生、发展，尤其是肝癌。前期复旦大学肝癌研究所通过大样本量(934例样本)的筛查和验证，在血浆中发现了包括miR-26a在内的7个与肝癌特异相关的microRNA(miR-26a、miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-27a、miR-801)，并以此为基础建立了肝癌的血浆microRNA诊断模型(Zhou,J.et al.(2011)Journal of clinical oncology 29,4781-4788)。我们的临床研究发现肝癌组织中miR-26a表达与肝癌的预后呈负相关，且miR-26a低表达的患者对干扰素治疗反应良好。同时，肝癌裸鼠动物模型实验证实，通过腺相关病毒-8(AAV-8)携载含有miR-26a的质粒可显著抑制肝癌进展。上述研究成果表明miR-26a不仅可作为肝癌预后的生物学标记物，也可作为肝癌个体化治疗的生物学标记物。
由于miRNA不能直接注射入肝脏组织或者直接通过静脉注射方式给药，否则会被直接降解掉而失去治疗作用，所以miRNA必须通过具有保护作用的运输载体给药于肝脏肿瘤组织。人们尝试了通过腺相关病毒8(AAV-8)传送miRNA到体内，可显著抑制动物模型的肝癌进展。但腺相关病毒或慢病毒作为小分子物质运输载体在用于治疗探索中出现诸多问题：首先，虽然腺相关病毒或者慢病毒进入体内后，通过与目的细胞整合，可以持续发挥作用，但是难以避免引起非治疗效应以外的基因整合，从而改变目的细胞的基因稳定性；其次，病毒可被宿主体内免疫系统识别，引起一系列炎性介质反应，导致体内免疫失衡和机体微环境紊乱等相关副作用。
外泌体(exosome)作为直径最小的细胞外囊泡(extracellular vesicles)，由活性细胞分泌，颗粒直径大小约为40-120nm，具有脂质双层膜结构，其内容物包括各种活性质如miRNA、mRNA、DNA和蛋白质等。因其脂质双层膜包裹，一方面可以保护内在活性物质免于降解，另一方面通过膜表面相应配体或配体样跨膜蛋白与特定靶细胞表面受体结合、直接融合或被受体细胞吞噬，释放内容物从而完成细胞之间信息交换。与人工载体比较，外泌体在体内具有低免疫原性、低毒性、无诱导突变等特性，可作为miRNA体内靶向运送的天然载体。研究发现不同来源外泌体携载外源性活性物质(如小分子物质siRNA、miRNA等)可用于体内肿瘤治疗研究，这些研究选取的外泌体来源包括红细胞，间充质干细胞和未成熟DC细胞等，但它们存在诸如缺少靶向识别性、潜在免疫排斥性、易被体内吞噬细胞破坏等缺陷。临床研究表明，肿瘤来源外泌体与肿瘤自身具有更好的组织亲和性，以及免于体内免疫排斥和抗吞噬细胞破坏等特性，已被广泛用于肿瘤治疗药物载体研究。但有报道发现肿瘤来源外泌体可通过内含的多种活性物质如miRNA、蛋白成分等活性物质促进肿瘤进展。因此，肿瘤细胞来源外泌体在被开发用于肿瘤治疗药物载体的同时，应充分考虑到其可能存在促肿瘤进展成分。
因此，选取能够排除促肿瘤进展风险的携载miRNA分子比如miR-26a的运输载体成为干预肝癌进展能否成功实施的焦点问题。
发明内容
为了探索通过miRNA基因疗法来治疗肝癌的安全给药途径，发明人基于VPS35基因在细胞分泌活性Wnt成分到外泌体中扮演关键角色的既往研究发现(Belenkaya,T.Y.etal.(2008)Developmental cell 14,120-131；Gross,J.C.et al.(2012)Nature cellbiology 14,1036-1045；Port,F.et al.(2008)Nature cell biology 10,178-185.)，开发出一种新的miRNA分子给药方法，通过预先敲低VPS35，使得肝癌细胞分泌的外泌体中不含有或者含有较少促进肝癌进展的活性Wnt成分(LRP6)，同时保留与肝癌细胞的组织亲和性，继而携载miRNA分子比如miR-26a抑制肝癌进展，成为一种新型肝癌治疗思路，应用于开发和探索临床治疗肝癌新策略。具体而言，本发明包括以下技术方案。
一种肝癌治疗性外泌体药物，其为VPS35基因表达下调的肝癌细胞分泌的外泌体，并且导入了用于治疗肝癌的微小RNA(或称microRNA、miRNA)分子。
该肝癌治疗性外泌体药物中，外泌体实质上成为了携载药物比如微小RNA(或称microRNA、miRNA)分子的运输载体。
上述肝癌细胞来源于肝癌手术切除或者肝移植术后肿瘤组织。
优选地，上述肝癌细胞来源于待治疗肝癌患者自身。
上述微小RNA分子可以选自miR-26a、miR-122、miR-223、miR-27a、miR-801。由于miR-26a在肝癌患者血清外泌体中的表达水平与肝癌患者预后呈负相关，并是其独立预后影响因子，优选微小RNA分子是microRNA-26a(或称miR-26a)，其序列为SEQ ID NO:1：
5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’(SEQ ID NO:1)。
本发明的第二个方面提供了一种制备上述肝癌治疗性外泌体药物的方法，其包括如下步骤：
1)通过RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术或者基因编辑技术下调或敲除肝癌细胞的VPS35基因，得到VPS35基因表达下调的肝癌细胞；
2)培养步骤1)中得到的VPS35基因表达下调的肝癌细胞，收集其分泌的外泌体；
3)通过电转导或者化学转导法将所述微小RNA分子导入到步骤2)中得到的外泌体中，组装得到外泌体药物。
在另一种实施方式中，上述基因编辑技术是CRISPR/Cas系统、优选CRISPR/Cas9系统，用于敲除VPS35基因。
优选地，上述RNA干扰技术包括如下操作步骤：
a)针对VPS35基因，设计靶向该基因的siRNA；
b)设计用于表达siRNA的shRNA(短发夹RNA)；
c)将shRNA编码序列克隆入质粒，构建表达shRNA的慢病毒；
d)用步骤c)构建的慢病毒转化肝癌细胞。
在一种实施方式中，上述siRNA为SEQ ID NO:2：
5’-GUUGUUAUGUGCUUAGUAA-3’(SEQ ID NO:2)。
优选地，上述shRNA的正义链为SEQ ID NO:3，反义链为SEQ ID NO:4：
正义链：
5’-CCGGGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAACTTTTT-3’(SEQ IDNO:3)；
反义链：
5’-AATTAAAAAGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAA C-3’(SEQ IDNO:4)。
本发明的第三个方面提供了上述肝癌治疗性外泌体药物在制备抗肝癌药物中的应用。
优选地，通过将所述抗肝癌药物与体外Organoid模型共培养、并且/或者通过尾静脉注射进入肝癌PDX动物模型体内予以验证肝癌抑制效果后，再施用于作为肝癌细胞来源的患者比如肝癌细胞来源的肝癌手术切除患者或者接受肝移植术的肝癌患者。
本发明的肝癌治疗性外泌体药物可以将人工合成的外源性抑癌活性miRNA分子运输到肝癌细胞中，发挥抑癌作用。由于外泌体中促进肝癌进展的活性成分比如VPS35基因导致的Wnt活性成分(如LRP6)被有效地降低或消除，从而不具有促进肝癌进展功能，因此本发明在临床治疗肝癌方面具有较大的应用前景。本发明的外泌体药物通过对肝癌体外Organoid模型、肝癌体内PDX动物模型进行疗效验证，得到了预期治疗结果，表明可以用于肝癌临床治疗，对于改善患者预后、降低患者副作用具有重要的临床意义。
附图说明
图1显示了表达shRNA的慢病毒感染肝癌细胞前后肝癌细胞的VPS35蛋白水平Western-blot验证对比结果。其中，HCC0137NC是未使用慢病毒感染的肝癌细胞阴性对照，HCC0137V35是使用了慢病毒感染的肝癌细胞，Beta-actin是内参。
图2显示了外泌体药物与体外Organoid模型共培养的细胞活力测试统计曲线。其中治疗组使用了外泌体药物，对照组使用携载miRNA无义模拟物(miRNA mimic negativecontrol)的外泌体。
图3显示了外泌体药物与肝癌体外Organoid模型共培养后的肝癌Organoid模型生长状态。其中治疗组使用了外泌体药物，对照组未使用外泌体药物。
图4显示了外泌体药物对于肝癌体内PDX动物模型的肝癌抑制效果的肝癌组织体积柱形图。其中，治疗组使用了外泌体药物，对照组使用携载miRNA无义模拟物(miRNAmimic negative control)的外泌体。
图5显示了外泌体药物对于肝癌PDX动物模型的肝癌抑制效果的肝癌组织对比照片。其中，治疗组使用了外泌体药物，对照组使用携载miRNA无义模拟物(miRNA mimicnegative control)的外泌体。
具体实施方式
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
本文的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。
在本发明中，术语“微小RNA”、“microRNA”和“miRNA”表示相同的意义，可以互换使用，尤其是指作为被外泌体携载运输对象的药物分子。
为了与用于靶向VPS35基因的小RNA分子区别开来，本文中将用作对肿瘤细胞进行VPS35基因干预下调的小RNA分子称作“siRNA”即小干扰RNA(small interfering RNA)。
为了在病毒中表达靶向VPS35基因的siRNA比如SEQ ID NO:2，在设计shRNA(短发夹RNA)时，例如参考文献(Gross,J.C.et al.(2012)Nature cell biology 14,1036-1045)设计VPS35shRNA oligos，编码该shRNA的基因序列结构为：
AgeI酶切位点的粘性末端—19bp正义序列(Sense)—Loop—19bp反义序列(Antisense)—EcoRI酶切位点的粘性末端，具体为：
正义链(Top)：
5’-CCGGGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAACTTTTT-3’(SEQ IDNO:3)
其中，CCGG是AgeI酶切位点的粘性末端，TTTTT是EcoRI酶切位点的粘性末端，这两个序列都是与pLKO载体连接的部分；CTCGAG是最终形成茎环Loop的部分。
相对应地，设计结构为AATTCAAAAA—19bp正义序列—CTCGAG—19bp反义序列-3的(Bottom)反义链：
5’-AATTAAAAAGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAAC-3’(SEQ IDNO:4)。
另外，利用基因编辑技术比如CRISPR/Cas9系统来剪切肝癌细胞中的VPS35基因也是一种下调VPS35基因表达的有效手段。
本发明通过基因工程对肝癌患者来源的肿瘤细胞进行VPS35基因干预下调，使其分泌的外泌体中不再含有、或者极少含有促进肝癌进展的活性成分比如Wnt，因此该外泌体不再具有促进肝癌进展功能。当该外泌体作为药物载体施加于患者时，在保留有效传递信息载体特征的同时，减少或消除促进肿瘤进展的不利影响因素，大大减少了患者术后复发率，从而改善肝癌切除或肝移植的预后。
该外泌体尤其适用于携载那些在发挥治疗作用之前容易被人体组织或细胞代谢降解掉的药物，包括但不限于用于基因疗法药物分子比如miRNA例如miR-26a、miR-122、miR-223、miR-27a、miR-801等。
本领域技术人员应当理解，在外泌体药物分别通过与体外Organoid模型共培养、尾静脉注射进入肝癌PDX动物模型体内予以验证肝癌抑制效果后，同时对外泌体药物的生物安全性以及潜在危害性方面进行体内外实验充分验证后，再进一步应用于病人。所有操作实施前，与患者充分沟通，在患者了解相关风险和潜在获益前提下，并签署知情同意书后方可实施。在外泌体载药系统施用于患者之前，应在充分质检合格、体内外实验验证共同有效前提下，方可实施。
本发明肝癌治疗性外泌体药物为临床治疗肝癌提供了一种新思路，可应用于临床肝癌切除或肝移植患者术后辅助治疗，指导肝癌切除或肝移植术后化疗敏感药物筛选，降低高危患者术后复发率，从而改善肝癌切除或肝移植的预后。该治疗方法对于改善患者预后、降低患者副作用具有重要的临床意义。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例
实施例中所用的miRNA分子由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，PCR所用基因序列和引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供。按试剂盒说明书操作。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
消化液：胰酶(0.25％)(Gibco公司)。
平衡盐溶液：PBS平衡盐溶液(Gibco公司)。
完全培养基：DMEM基础培养基(Gibco公司)+10％胎牛血清(Gibco公司)+1％青霉素和链霉素(Gibco公司)。
无外泌体血清培养基：DMEM基础培养基。
解剖培养液：250ml HBSS(Hanks’平衡盐溶液)溶液中加入2.5ml Ab/Am(1％)。
原代培养液：500ml RPMI 1640中加入12.5ml FBS(2.5％)和5ml Ab/Am(1％)。
实施例1肝癌细胞培养和模型构建
收集肝癌手术切除或肝移植术后肿瘤组织标本，利用体外原代细胞培养方法，获得稳定传代的肝癌细胞；同时构建体外Organoid模型和PDX动物体内模型，为后续治疗验证提供必备条件。
1.1原代细胞培养
将肝癌组织转移到培养皿中，先用平衡盐溶液洗掉组织中的血液。尽量剪碎，加消化液。用封口膜封好，37℃摇床孵育30min，筛网过滤，用平衡盐溶液清洗3次。4℃，380g，8min离心后用平衡盐溶液洗一次，收集下面的细胞，加入完全培养基，置37℃、5％CO2培养箱孵育。培养至80-90％融合度后传代，不断筛选优化，最终获得一种稳定传代的肝癌细胞，命名为HCC0137。
1.2构建体外Organoid模型
将肝癌组织转移到培养皿中，先用平衡盐溶液洗掉组织中的血液。剪成约1mm*5-10mm大小，体积约4–8mm3组织块，将组织块移到预先准备好的完全培养基中，置37℃、5％CO2培养箱进行培养，大约1周后，显微镜镜检出组织块周围生长出新细胞，得到肝癌体外Organoid类器官模型。
1.3构建PDX动物体内模型
将肝癌组织转移到培养皿中，先用平衡盐溶液洗掉组织中的血液。剪成约5mm*10mm大小组织块，与20％混匀后皮下接种至裸鼠动物模型(南京大学模式动物研究所提供，BALB/c裸鼠)体内。初步构建肝癌皮下抑制瘤，再通过原位移植技术，构建肝脏原位移植瘤。
实施例2肝癌细胞VPS35基因下调
通过质粒合成和慢病毒构建等分子生物学技术对实施例1中获得的稳定传代的肝癌细胞HCC0137进行VPS35基因敲低。
2.1质粒构建：
基于RNAi技术，为了实现肝癌细胞VPS35基因的下调，本实验使用可靶向该基因位点的19nt的siRNA，其序列为：5’-GUUGUUAUGUGCUUAGUAA-3’(SEQ ID NO:2)。
为了在病毒中表达该siRNA，本实验设计了shRNA(短发夹RNA)，编码该shRNA的基因序列为：
正义链：
5’-CCGGGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAACTTTTT-3’(SEQ IDNO:3)；
反义链：
5’-AATTAAAAAGTTGTTATGTGCTTAGTAACTCGAGTTACTAAGCACATAACAAC-3’(SEQ IDNO:4)。
使用PCR扩增试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B639289)对编码shRNA的上述正义链、反义链DNA序列进行扩增。
将上述shRNA正义、反义链退火形成双链shRNA序列，使用SuperSilencingTMshRNA质粒表达载体(上海吉玛制药技术有限公司，货号C01001)，连接至pLKO.1-TRC(质粒pLKO.1–TRC克隆载体由David Root馈赠，编号Addgene plasmid#10878)。
退火反应体系(7μl)：
10X PCR buffer 5μl；
shRNA-VPS35-F(10μM) 1μl；
shRNA-VPS35-R(10μM) 1μl。
退火反应程序：
95℃ 4min，
72℃ 10min，
迅速置于由两个泡沫架组成的封闭空间，缓慢冷却至室温。
2.2酶切、连接、鉴定阳性克隆
双酶切质粒pLKO.1-TRC，酶切后的质粒经胶回收纯化后与上述经退火的双链shRNA序列进行连接；将连接后的质粒转化感受态细胞XL2-Blue大肠杆菌克隆菌，涂LA平板，12-16h后挑单克隆，测序验证插入序列的正确，构建得到pLKO.1-shRNA-VPS35质粒，用于下一步的病毒包装。
Figure BDA0002054038120000091
37℃反应1h。
连接体系(10μl)：
凝胶纯化消化的pLKO.1-TRC 0.5μl；
退火后shRNA双链序列 4.5μl；
溶液I 5μl。
16℃反应1h。
2.3病毒包装
A.种板：将293T细胞接种至10cm培养皿(不含抗生素)，第二天转染时融合度达90％-95％。
B.质粒转染：DNA(μg):lipo 2000(μl)＝1:2.5。具体步骤包括：
1)将培养基换成10ml无血清培养基。
2)将10μg pLKO.1-shRNA-VPS35(或对照质粒pLKO.1-shRNA-luciferase)、7.5μgpsAPX2和2.5μg pMDG2溶于opti-MEM(Invitrogen)中，总体积为1.5ml，轻柔混匀后室温放置5min；
3)将60μl lipo2000(Invitrogen)溶于无血清培养基中，总体积为1.5ml，轻柔混匀，室温放置5min；
4)将A、B两管混合，总量3ml，轻柔混匀后室温放置20min；
5)将3ml的C液加入培养皿中，轻轻混匀。于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
6)4-6小时后换为15ml完全培养基；
7)继续培养48h。
C.收集第一批病毒：收集培养液，置于50ml离心管，4℃放置；加入10ml完全培养基。
D.病毒收获及浓缩：
1)收集培养液，置于前一天收集的离心管中；
2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
3)以0.45μm滤器过滤上清液于50ml超速离心管中；
4)把病毒粗提液样品加入到Amicon Ultra-15超滤离心管中(截留分子量100KD，Millipore)，在4℃、2000g离心30min。
5)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存，得到用于表达shRNA的慢病毒。
2.4构建VPS35下调表达的肝癌细胞
1)将实施例1中得到的肝癌细胞HCC0137接种于6孔板中，待细胞贴壁后用上述慢病毒进行感染，感染48小时后换用含有2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养4-6天。
2)加消化液消化细胞并接种于96孔板中，调整接种的细胞密度为1-5个/孔；
3)继续培养两周左右，中间隔天换液(用含有1μg/ml嘌呤霉素的完全培养基半量维持)，待孔板中细胞长至细胞克隆时，挑取3-5个克隆至孔板中扩大培养，直至获得需要的细胞量；
4)利用Western-blot方法对肝癌细胞的VPS35基因下调情况在蛋白水平进行验证。
Western-blot中使用的VPS35抗体为ab10099，Abcam公司；1:2000稀释。结果见图1。由图1可见，慢病毒感染肝癌细胞HCC0137后，肝癌细胞的VPS35蛋白水平显著降低，表明VPS35基因明显下调。
实施例3收集外泌体
将实施例2构建的VPS35基因下调的肝癌细胞用不含外泌体的培养基孵育培养，培养条件同步骤1.1。细胞培养至50-60％融合度时，用PBS洗3次，加入不含外泌体的培养基，于37℃、5％CO2培养箱内培养48小时后收集细胞培养上清，用超速离心法、或者使用商品化试剂盒(比如System Biosciences(SBI)公司的ExoQuick-TC EV Isolation Kit试剂盒)提取外泌体。
实施例4外源性miR-26a导入外泌体
实施例中所用的外源性小核酸miR-26a(或称microRNA-26a、miR-26a模拟物)和miRNA无义模拟物(miRNA mimic negative control)皆由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供，相关信息如下：
miR-26a模拟物：hsa-miR-26a-5p mimic，5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’(SEQID NO:1)，货号：MC10249；
miRNA无义模拟物：mirVanaTMmiRNA Mimic,Negative Control，货号：4464058；
该miR-26a基因检测探针：Assay ID：000405，Catalog number：4427975。
利用电转导方法将miR-26a模拟物导入实施例3获得的外泌体中，得到外泌体药物，具体操作步骤为：取10μg外泌体加入200μl电转缓冲液(Bio-rad)中，装于1.5ml的EP管，标记A管；将hsa-miR-26a-5p mimic(10nmol)加入200μl电转缓冲液(Bio-rad)，装于1.5ml的EP管，标记B管。随后，混合A、B管中的液体，转移至预冷的电击杯中(4mm，Bio-rad)，置于冰上。设置好GenePulserXcellTM电转仪参数，把电击杯安装好后进行电转。电转结束后立即转移电转杯于冰上。使用超速离心法重新提取外泌体，BCA Protein Assay Kit蛋白浓度定量，得到肝癌治疗性外泌体药物。
作为对照物，参照上述步骤，利用电转导方法miRNA无义模拟物导入实施例3获得的外泌体中，得到携载miRNA无义模拟物的外泌体，用于对比试验。
实施例5外泌体药物治疗肝癌
5.1肝癌治疗性外泌体药物与步骤1.2中构建的体外Organoid模型共培养：
上述实施例4中收集制备的外泌体药物通过BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)对外泌体进行浓度而定，按起始10U对应10μg/200μl的外泌体药物浓度与体外Organoid模型共培养，依次递减为2U，0.4U，0.08U，0.016U，0.0032U，0.00064U。分别观察外泌体药物治疗组与对照组共培养72小时后的细胞活力情况，结果见图2和图3。
图2显示了外泌体药物与体外Organoid模型共培养的细胞活力测试统计曲线；图3显示了外泌体药物与体外Organoid模型共培养的组织切片。其中治疗组使用了外泌体药物，对照组未使用外泌体药物。统计分析提示外泌体药物治疗组对肝癌体外Organoid模型抑制效果显著高于对照组：治疗组(IC50：0.407U)；对照组(IC50：3.462U)。
5.2肝癌治疗性外泌体药物给药于步骤1.3中构建的PDX动物模型：
上述实施例4中收集制备的外泌体药物同样通过BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)对外泌体进行浓度而定，每只PDX裸鼠模型每次尾静脉注射1μg外泌体药物(溶解在100μl PBS溶液中)，每隔3天注射一次。观察4周后肝癌原位动物模型的肿瘤生长情况，结果见图4和图5。
图4和图5显示了外泌体药物对于肝癌PDX动物模型的肝癌抑制效果。其中图4为肝癌组织体积柱形图，图5为PDX动物模型的肝癌组织照片，其中治疗组使用了外泌体药物，对照组使用携载miRNA无义模拟物的外泌体。统计分析提示外泌体药物治疗组对肝癌PDX模型抑制效果显著高于对照组(P<0.01)。
上述实验结果表明，本发明的肝癌治疗性外泌体药物能够有效抑制肝癌细胞的体内外进展，验证了其肝癌抑制效果，显示了其通过基因疗法用于治疗肝癌的可能性。
虽然以上实验仅以miR-26a为例，对于VPS35基因下调的肿瘤细胞分泌的外泌体的保护和运输作用及生物安全性进行了验证，但是本领域的技术人员显而易见可以理解该外泌体显然也适用于其他miRNA药物分子，从而制备出抗肝癌药物。在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。
序列表
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种肝癌治疗性外泌体药物
<130> SHPI1910155
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 1
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 2
guuguuaugu gcuuaguaa 19
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccgggttgtt atgtgcttag taactcgagt tactaagcac ataacaactt ttt 53
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aattaaaaag ttgttatgtg cttagtaact cgagttacta agcacataac aac 53

Claims (10)

1.一种肝癌治疗性外泌体药物，其为VPS35基因表达下调的肝癌细胞分泌的外泌体，并且通过电转导或者化学转导法导入了用于治疗肝癌的微小RNA分子，所述微小RNA分子是miR-26a，所述外泌体不含有LRP6。
2.如权利要求1所述的肝癌治疗性外泌体药物，其特征在于，所述肝癌细胞来源于肝癌手术切除或者肝移植术后肿瘤组织。
3.如权利要求1所述的肝癌治疗性外泌体药物，其特征在于，所述肝癌细胞来源于待治疗肝癌患者自身。
4.一种制备如权利要求1所述肝癌治疗性外泌体药物的方法，其包括如下步骤：
1)通过RNA干扰技术或者基因编辑技术下调或敲除肝癌细胞的VPS35基因，得到VPS35基因表达下调的肝癌细胞；
2)培养步骤1)中得到的VPS35基因表达下调的肝癌细胞，收集其分泌的外泌体；
3)通过电转导或者化学转导法将微小RNA分子导入到步骤2)中得到的外泌体中，组装得到外泌体药物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术包括如下操作步骤：
a)针对VPS35基因，设计靶向该基因的siRNA；
b)设计用于表达siRNA的shRNA；
c)将shRNA编码序列克隆入质粒，构建表达shRNA的慢病毒；
d)用步骤c)构建的慢病毒转化肝癌细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述siRNA的序列 为SEQ ID NO:2。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述shRNA的正义链为SEQ ID NO:3，反义链为SEQ ID NO:4。
9.如权利要求1至3中任一项所述的肝癌治疗性外泌体药物在制备抗肝癌药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过将所述抗肝癌药物与体外Organoid模型共培养、并且/或者通过尾静脉注射进入肝癌PDX动物模型体内予以验证肝癌抑制效果后，再施用于肝癌细胞来源的肝癌手术切除患者或者接受肝移植术的肝癌患者。
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