CN106267208A - Rps15a基因的用途及其相关药物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及RPS15A基因的用途及其相关药物，具体涉及针对RPS15A基因的医药用途及其小干扰RNA(siRNA)分子。本发明构建了RPS15A基因小分子干扰RNA、RPS15A基因干扰核酸构建体、RPS15A基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。本发明还涉及RPS15A基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制RPS15A基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中RPS15A基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及RPS15A基因的用途及其相关药物，具体涉及针对RPS15A基因的医药用途及其小干扰RNA(siRNA)分子。
背景技术
核糖体蛋白S15A(Ribosomal Protein S15a,RPS15A)位于细胞质中，是40S亚基的一个组成部分。该蛋白属于S8P家族核糖体蛋白，是一种高度保守的蛋白，其在早期的翻译能够促进mRNA/核糖体的相互作用。
目前临床上肿瘤治疗常由于病人产生耐药性导致预后不良的情况发生，因此迫切需要了解抗药性的分子机制和开发新的治疗策略。有研究表明，核糖体的结构成分RPS15A可能与耐药性的产生有关(Sertel S,Eichhorn T,Sieber S,et al Factors determining sensitivity or resistance of tumor celllines towards artesunate.Chemico-Biological Interactions.2010；185(1):42-52.)Hershey J.W.B.Regulation of protein synthesis and the role ofeIF3 in cancer.Braz.J.Med.Biol.Res.2010；43(10):920-930.)。
核仁，合成核糖体的重要细胞器，很早就被认为与癌症的发生发展有关。一些核糖体蛋白(RPS)突变可能会增加癌症发生发展的风险。P53是重要的抑癌基因，在细胞周期阻滞、DNA损伤修复及细胞凋亡等生物过程中发挥重要作用，并已成为潜在的肿瘤治疗靶点。MDM2(Mdm2 p53 bindingprotein homolog)及MDMX(Mdm4 p53 binding protein homolog)是p53的主要抑制因子，两者相互协同并通过不同的信号途径抑制p53的活性。MDM2是p53的E3连接酶，介导p53的泛素化从而降低p53的稳定性。MDMX则主要通过与p53的转录活性区结合，抑制p53对其下游基因的转录活性。MDM2与MDMX通过不同机制协同对p53产生抑制作用(V,A,Garcia-Echeverria C,etal.Comparative study of thep53-mdm2and p53-MDMX interfaces.Oncogene 1999Jan；18(1):189-99.)。研究表明，RPS15在Mdm2-p53-MdmX途径中具有相当重要的作用。在Mdm2-p53-MdmX途径中，一些核糖体蛋白已经被证明与MDM2相连接，抑制MDM2 E3连接酶的活性，导致p53稳定化和细胞周期停滞，因此，RP-Mdm2的p53的信号通路用于核糖体合成监控，因而是至关重要的。研究发现，RPL37，RPS15和RPS20为RP，并且也可以连接Mdm2并激活p53。每一个上述的RP异位表达时，在p53零表达的细胞和含有内源性p53基因的细胞系中，分别可发现共表达Flag标记的Mdm2、HA标记的p53基因以及内源性p53。对于每个RP，Mdm2的机制和p53稳定化似乎是通过抑制Mdm2的E3泛素连接酶的活性而实现的。有趣的是，尽管它们各自能够诱导细胞死亡和细胞周期停滞，这些核糖体蛋白的不同之处在于由它们各自引入到细胞中调控p53的靶基因不同。此外，每个核糖体蛋白可以以不同的方式下调MDMX的水平。因此，RPS15A参与调节Mdm2-p53基因MDMX网络的机制对于肿瘤的治疗可能具有非常重大的意义(Daftuar L,Zhu Y,Jacq X,Prives C.Ribosomal proteins RPL37,RPS15and RPS20regulate the Mdm2-p53-MdmX network.PLoS One 2013；8(7):e68667.)。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默的技术。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特定基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性地引起RNAi(Tuschl T,Zamore PD,Sharp PA,BartelDP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage ofmRNA at 21to 23nucleotide intervals.Cell 2000；101:25-33.)。
在目前的肿瘤治疗中，肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达，从而抑制肿瘤进程(Uprichard,Susan L.The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005；579:5996-6007.)。
因此本领域仍需要进一步明确RPS15A蛋白与疾病的关系，并在此基础上寻找能够影响RPS15A蛋白表达的药物，从而达到治疗疾病的目的。
发明内容
本发明的发明人通过大量实验和反复研究，发现下调RPS15A基因表达可以抑制肿瘤细胞增殖，从而达到治疗肿瘤的目的；并在此基础上进一步发现了可以高效抑制RPS15A基因表达的靶序列、核酸分子等相关药物，由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子在制备预防和/或治疗肿瘤、抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
在本发明的一个实施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
在本发明的一个具体实施方案中，其中所述siRNA包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
在本发明的一个具体实施方案中，其中所述shRNA包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤选自肝癌、食管癌。
本发明第二方面涉及分离的抑制RPS15A基因表达的siRNA的靶序列，其包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
本发明第三方面涉及抑制RPS15A基因表达的siRNA分子，其包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
本发明第四方面涉及抑制RPS15A基因表达的shRNA分子，其包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
在本发明的一个实施方案中，所述shRNA分子包含SEQ ID NO：9所示的序列。
本发明还涉及核酸构建体，其包含本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子。
在本发明的一个实施方案中，所述核酸构建体为慢病毒载体。
在本发明中，所述慢病毒载体的种类为本领域所公知，例如选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
本发明还涉及细胞，其含有本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子或本发明任一项的核酸构建体。
本发明还涉及慢病毒，其包含本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子，或者其由含有上述核酸分子的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明还涉及药物组合物，其含有本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞或本发明任一项的慢病毒，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及本发明第二方面任一项的靶序列用于筛选针对RPS15A基因、影响RPS15A基因转录、表达或活性的药物或试剂中的用途。
本发明还涉及本发明第二方面任一项的靶序列在筛选用于预防和/或治疗与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，其中所述与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
本发明还涉及本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物在制备预防和/或治疗与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途。
本发明还涉及预防和/或治疗与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，其中所述与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
本发明还涉及分离的RPS15A基因或该基因的一部分在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，其中所述该基因的一部分含有本发明第二方面任一项的靶序列。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的肿瘤选自肝癌、食管癌。
本发明还涉及预防和/或治疗肿瘤、抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，所述方法包括给予有需要的受试者或肿瘤细胞有效量的特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
在本发明的一个实施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤选自肝癌、食管癌。
本发明还涉及用于降低肿瘤细胞中的RPS15A基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤选自肝癌、食管癌。
以下对本发明做进一步描述。
本发明首先提供了特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子在制备预防和/或治疗肿瘤、抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的药物中的用途。
本发明还涉及预防和/或治疗肿瘤、抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，所述方法包括给予有需要的受试者或肿瘤细胞有效量的特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤选自其生长与RPS15A蛋白的表达或活性相关的肿瘤，例如选自肝癌、食管癌。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低RPS15A基因的转录或翻译，或者足够降低RPS15A蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述RPS15A基因的表达至少被降低90％以上。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
在本发明的一个实施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述反义寡核苷酸、双链RNA、siRNA或者shRNA含有RPS15A基因的启动子序列或RPS15A基因的信息序列。
优选地，所述小干扰RNA(siRNA)包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
优选地，所述短发夹RNA(shRNA)包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
本发明第二方面涉及分离的抑制RPS15A基因表达的siRNA的靶序列，其包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
在本发明中，所述RPS15A基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默RPS15A基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的RPS15A基因中的片段。
优选地，所述靶序列为RPS15A基因的mRNA片段中15-27个连续的核苷酸序列，例如为19-23个连续的核苷酸序列，例如为19、20或21个连续的核苷酸序列。
优选地，所述RPS15A基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1所示的序列。
进一步地，所述RPS15A基因来源于人。
本发明第三方面涉及针对上述靶序列设计的抑制RPS15A基因表达的siRNA分子。
所述siRNA分子包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与RPS15A基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述siRNA分子第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；优选地，长度均为19-23个核苷酸；更优选地，长度均为19、20或者21个核苷酸。
在本发明的具体实施方案中，所述siRNA分子第一链的序列如SEQ IDNO：14所示，具体为5’-GUGCAACUCAAAGACCUGGAA-3’。
在本发明的具体实施方案中，以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计针对人RPS15A基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源RPS15A基因表达的作用。
本发明第四方面涉及抑制RPS15A基因表达的shRNA分子，其包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与RPS15A基因中15-27个连续的核苷酸序列相同，或者能够与该序列在高等严紧条件下杂交。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默细胞中内源RPS15A基因表达的作用。
优选地，所述正义链片段与RPS15A基因中19-23个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与RPS15A基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列相同；或者与上述序列在高等严紧条件下杂交。
进一步地，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一种序列：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。
在本发明的具体实施方案中，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:9所示，具体为：5’-GTGCAACTCAAAGACCTGGAATTCAAGAGATTCCAGGTCTTTGAGTTGCAC-3’。
shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人RPS15A基因表达的作用。
编码本发明所述shRNA片段的核酸构建体(例如慢病毒载体)含有SEQID NO:9所示的序列及其互补序列。
本发明还涉及核酸构建体，其包含本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子。
在本发明的一个实施方案中，所述核酸构建体为慢病毒载体。
在本发明的一个实施方案中，其含有本发明任一项所述的shRNA的片段，能表达所述shRNA。
所述核酸构建体可以通过将编码前述shRNA的片段克隆入已知载体获得。进一步地，所述核酸构建体为慢病毒载体。所述慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默RPS15A基因的表达。
进一步地，所述慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；所述可被检测的标记物例如为绿色荧光蛋白(GFP)。
在本发明中，所述慢病毒载体的种类为本领域所公知，例如选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
在本发明的具体实施方案中，具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人RPS15A基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。
本发明的RPS15A基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。所述的慢病毒载体则可用于制备所述RPS15A基因的siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及细胞，其含有本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子或本发明任一项的核酸构建体。优选地，所述细胞为真核细胞，例如为哺乳动物细胞。
本发明还涉及慢病毒，其包含本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子，或者其由含有上述核酸分子的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对RPS15A基因的小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。该慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明还涉及药物组合物，其含有本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞或本发明任一项的慢病毒，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
在制备这些药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤选自肝癌、食管癌。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
本发明从众多的RPS15A基因片段上筛选到了能够通过基因沉默来降低RPS15A基因表达或RPS15A蛋白活性的靶序列，可以利用该靶序列为靶标筛选影响该基因表达和该蛋白活性的分子，进而用于预防或治疗与该基因相关的疾病例如肿瘤。
因此本发明还涉及本发明第二方面任一项的靶序列用于筛选针对RPS15A基因、影响RPS15A基因转录、表达或活性的药物或试剂中的用途，以及在筛选用于预防和/或治疗与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，其中所述与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
本发明还涉及本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物在制备预防和/或治疗与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途。
本发明还涉及预防和/或治疗与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，其中所述与RPS15A基因的表达、RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
本发明还涉及分离的RPS15A基因或该基因的一部分在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，其中所述该基因的一部分含有本发明第二方面任一项的靶序列。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的肿瘤选自其生长与RPS15A蛋白的表达或活性相关的肿瘤，例如肝癌、食管癌。
所述将分离的RPS15A基因或该基因的一部分用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将RPS15A基因或该基因的一部分作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将RPS15A基因或该基因的一部分作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
所述将RPS15A基因或该基因的一部分作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将RPS15A基因或该基因的一部分作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内RPS15A基因的表达水平。
所述将RPS15A基因或该基因的一部分作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将RPS15A基因或该基因的一部分作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人RPS15A基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的RPS15A基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人RPS15A基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将RPS15A基因及其蛋白作为作用对象。
所述将RPS15A基因或该基因的一部分用于制备肿瘤诊断药物，是指将RPS15A基因或该基因的一部分的表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中RPS15A基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过分离的RPS15A基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人RPS15A基因的转录或翻译，或者足够降低人RPS15A蛋白的表达或活性的剂量。以使人RPS15A基因的表达至少被降低90％以上。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人RPS15A基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人RPS15A基因表达水平的物质给药于患者。
本发明还涉及用于降低肿瘤细胞中的RPS15A基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的本发明第二、三、四方面任一项的核酸分子、本发明任一项的核酸构建体、本发明任一项的细胞、本发明任一项的慢病毒或本发明任一项的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤选自肝癌、食管癌。
在本发明的具体实施方案中，设计了针对人RPS15A基因的RNAi靶点序列，构建相应的RPS15A RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：1的RNAi载体pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA能够显著下调RPS15A基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA能够靶向地将针对RPS15A基因的RNAi序列高效导入人食管癌细胞，降低RPS15A基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的RPS15A基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人RPS15A基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中RPS15A基因的表达，促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
在本发明中，所述RPS15A基因是指核糖体蛋白S15A(RibosomalProtein S15a,RPS15A)基因，其序列例如可参考NM_001019。
在本发明中，所述靶序列中可以指RPS15A基因的基因组序列，也可以指其cDNA序列。优选地，所述靶序列为与SEQ ID NO：1所示的序列中至少连续10个(优选至少连续15个，更优选至少连续18个)序列相同的序列。
在本发明中，所述siRNA，即小干扰RNA(small interfering RNA)是一种双链小RNA分子，其由完全互补的第一链和第二链组成，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与RPS15A基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；优选地，长度均为19-23个核苷酸；更优选地，长度均为19、20或者21个核苷酸。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
在本发明中，所述shRNA，即小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNAor short hairpin RNA,shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，其包含正义链片段、反义链片段以及连接正义链片段和反义链片段的茎环结构，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。其中正义链和反义链的序列互补，并且所述正义链片段的序列与RPS15A基因中15-27个连续的核苷酸序列相同，优选地，所述正义链片段与RPS15A基因中19-23个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与RPS15A基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列相同，或者为与上述各序列在高等严紧条件下杂交的序列。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。
本发明的小分子干扰核糖核酸(siRNA)可用化学合成方法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。
本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子等。
本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列可以是RPS15A基因的基因组序列，或RPS15A基因的cDNA序列。具体地，本发明所述的小干扰RNA可以由序列表中的至少一个序列组成。
本发明的siRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。
本发明的siRNA中的第一链和shRNA中的正义链的序列与靶序列相同，其与siRNA靶序列相比具有至少连续10个(优选至少连续15个，更优选至少连续18个)相同的核苷酸序列，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。
在本发明中，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm－5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5－10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10－20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20－25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook,J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。
在本发明中，所述核酸构建体是指包括复制系统以及能够在给定的靶细胞内转录和翻译多肽编码序列的序列。
在本发明中，siRNA和shRNA的序列可以用核糖核酸(RNA)表示，也可以用脱氧核糖核酸(cDNA)表示，其具有相同的含义。本领域的技术人员能够理解，在体内或细胞内时，siRNA和shRNA均以RNA的形式发挥作用，但在体外或细胞外，为了方便合成和载体构建，可以以DNA序列的形式合成。
附图说明
图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱
图2：人食管癌细胞ECA109与EC9706细胞、TE-1细胞中RPS15A基因相对表达丰度
图3：RPS15A-RNAi慢病毒侵染人食管癌细胞ECA1095天后，RPS15A mRNA的表达水平显著降低
图4：RPS15A-RNAi慢病毒侵染人食管癌细胞ECA1095天后，引起细胞增殖抑制
具体实施方式
本发明涉及一组针对人RPS15A基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人RPS15A mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源RPS15A基因的表达。
发明人发现，采用RNAi方法下调人RPS15A基因的表达后可有效抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，可以有效地控制肿瘤的生长进程。发明人进一步合成针对RPS15A基因的siRNA，筛选出了可有效抑制RPS15A的表达进而抑制食管癌ECA109细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了干扰人RPS15A基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默RPS15A基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人RPS15A基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，能够稳定并特异地下调RPS15A基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明RPS15A基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默RPS15A基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
本发明的设计思路为：
本发明通过如下方法来筛选获得一种人RPS15A基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人RPS15A基因序列；预测siRNA位点；合成针对RPS15A基因的有效的siRNA序列、两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达RPS15A基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix，Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默RPS15A基因的慢病毒。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低RPS15A基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，RPS15A基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，RPS15A基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的RPS15A基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。如按照[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译，分子克隆试验指南，第三版，北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 针对人RPS15A基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人RPS15A基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取RPS15A(NM_001019)基因信息；设计针对RPS15A基因的有效的siRNA靶点。表1列出了针对RPS15A基因的有效siRNA靶点序列。
表1 靶向于人RPS15A基因的siRNA靶点序列
| SEQ ID NO | 靶序列 | 起始位点 |
| 1 | GTGCAACTCAAAGACCTGGAA | 339 |
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo序列(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，如图1所示，该载体是从pSicoR(Plasmid#11579)(http://www.addgene.org/11579/)改造而来，在pSicoR基础上将mU6启动子替换为人的U6启动子(hU6)，进而得到pGCSIL-GFP)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。其中颈-环-颈的序列为：gtgcaactcaaagacctggaa ttcaagaga ttccaggtctttgagttgcac(SEQ ID NO：9)
表2 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆的表面蘸一下，溶于10μlLB培养基，混匀取1μl作为模板；根据慢病毒载体pGCSIL-GFP中RNAi序列的上下游序列，设计通用PCR引物，上游引物序列：5’-ccatgattccttcatatttgc-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物序列：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’(SEQ ID NO：3)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：1的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-ttctccgaacgtgtcacgt-3’(SEQ ID NO：4)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。
表3 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
表4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) | 2.0 |
| 10×buffer | 5.0 |
| 100×BSA | 0.5 |
| Age I(10U/μl) | 1.0 |
| EcoR I(10U/μl) | 1.0 |
| dd H2O | 40.5 |
| Total | 50.0 |
表5 载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
表6-1 PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×buffer | 2.0 |
| dNTPs(2.5mM) | 0.8 |
| 上游引物 | 0.4 |
| 下游引物 | 0.4 |
| Taq聚合酶 | 0.2 |
| 模板 | 1.0 |
| ddH2O | 15.2 |
| Total | 20.0 |
表6-2 PCR反应体系程序设定
3.包装RPS15A-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105个细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的shRNA的第一链的序列如SEQ IDNO:9所示。对照慢病毒的包装过程同RPS15A-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA载体。
实施例2 实时荧光定量RT-PCR法检测RPS15A在食管癌细胞中的表达水平
处于对数生长期的人食管癌ECA109，EC9709，TE-1细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约80％。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP900型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。RPS15A基因的引物如下：上游引物5’-ctccaaagtcatcgtccggtt-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-tgagttgcacgtcaaatctgg’(SEQ ID NO：6)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(SEQ ID NO：7)和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(SEQ ID NO：8)。按表8中的比例配置反应体系。
表7 逆转录反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 5×RT buffer | 4.0 |
| 10mM dNTPs | 2.0 |
| RNasin | 0.5 |
| M-MLV-RTase | 1.0 |
| DEPC H2O | 3.5 |
| Total | 11.0 |
表8 Real-time PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| SYBR premix ex taq: | 10.0 |
| 上游引物(2.5μM)： | 0.5 |
| 下游引物(2.5μM)： | 0.5 |
| cDNA | 1.0 |
| ddH2O | 8.0 |
| Total | 20.0 |
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算RPS15A mRNA在各个食管癌细胞的表达丰度。实验结果(图2)表明，人食管癌ECA109细胞表达RPS15A。
实施例3 实时荧光定量RT-PCR法检测RPS15A基因的沉默效率
处于对数生长期的人食管癌ECA109细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，ECA109:10)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP900型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。RPS15A基因的引物如下：上游引物5’-ctccaaagtcatcgtccggtt-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-tgagttgcacgtcaaatctgg’(SEQ ID NO：6)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(SEQ ID NO：7)和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(SEQ ID NO：8)。按表8中的比例配置反应体系。
表7 逆转录反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 5×RT buffer | 4.0 |
| 10mM dNTPs | 2.0 |
| RNasin | 0.5 |
| M-MLV-RTase | 1.0 |
| DEPC H2O | 3.5 |
| Total | 11.0 |
表8 Real-time PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| SYBR premix ex taq: | 10.0 |
| 上游引物(2.5μM)： | 0.5 |
| 下游引物(2.5μM)： | 0.5 |
| cDNA | 1.0 |
| ddH2O | 8.0 |
| Total | 20.0 |
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了RPS15A mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图3)表明，人食管癌ECA109细胞中RPS15A mRNA的表达水平下调了90.0％以上。
实施例4 检测侵染了RPS15A-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人ECA109细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，ECA109:10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图4所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了80％以上，表明RPS15A基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (16)
1.特异性抑制RPS15A基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RPS15A蛋白的表达或活性的分子在制备预防和/或治疗肿瘤、或抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述的分子选自核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒；优选地，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
3.权利要求2的用途，其中所述siRNA包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
4.权利要求2的用途，其中所述shRNA包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
5.分离的抑制RPS15A基因表达的siRNA的靶序列，其包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
6.抑制RPS15A基因表达的siRNA分子，其包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列。
7.抑制RPS15A基因表达的shRNA分子，其包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含选自如下(1)-(3)所示的序列中的一种：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列；
(2)与SEQ ID NO：1所示的序列在高等严紧条件下杂交的序列；
(3)与(1)或(2)所述序列互补的序列；
优选地，所述shRNA分子包含SEQ ID NO：9所示的序列。
8.核酸构建体，其包含权利要求5-7任一项的核酸分子。
9.权利要求8的核酸构建体，其为慢病毒载体，优选地，所述慢病毒载体选自pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
10.细胞，其含有权利要求5-7任一项的核酸分子或权利要求8或9的核酸构建体。
11.慢病毒，其包含权利要求5-7任一项的核酸分子，或者其由权利要求8或9所述的核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
12.药物组合物，其含有权利要求5-7任一项的核酸分子、权利要求8或9的核酸构建体、权利要求10的细胞或权利要求11的慢病毒，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
13.权利要求1的靶序列用于筛选针对RPS15A基因、影响RPS15A基因转录、表达或活性的药物或试剂中的用途；或者所述靶序列在筛选用于预防和/或治疗与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途，优选地，其中所述与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
14.权利要求5-7任一项的核酸分子、权利要求8或9的核酸构建体、权利要求10的细胞、权利要求11的慢病毒或权利要求12的药物组合物在制备预防和/或治疗与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病的药物中的用途，优选地，其中所述与RPS15A基因的表达或RPS15A蛋白活性相关的疾病为肿瘤，例如为肝癌、食管癌。
15.分离的RPS15A基因或该基因的一部分在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途；优选地，所述该基因的一部 分含有权利要求5的靶序列；进一步优选地，其中所述的肿瘤选自肝癌、食管癌。
16.用于降低肿瘤细胞中的RPS15A基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的权利要求5-7任一项的核酸分子、权利要求8或9的核酸构建体、权利要求10的细胞、权利要求11的慢病毒或权利要求12的药物组合物。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAIYU XU.ET.AL: "Down-regulation of ribosomal protein S15A mRNA with a short hairpinRNA inhibits human hepatic cancer cell growth in vitro", 《GENE》 * |
| ZHAO X.ET AL.: "Decreased expression of RPS15A suppresses proliferation of lung cancer cells", 《TUMOUR BIOL》 * |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN107349217A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-11-17 | 深圳大学 | 一种基于mettl3的小干扰rna及其药物和应用 |
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