CN108060134B - 稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定超表达miR‑497的HPMC细胞株及其应用。稳定超表达miR‑497的HPMC细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定过表达miR‑497，保藏编号为：CCTCC NO：C201776，其基因组中含miRNA‑497minic质粒。用嘌呤霉素筛选HPMC稳转细胞株的筛选浓度为1.5～2.5μg/ml。HPMC稳转株中miR‑497的表达与VEGF呈负相关。本发明制备出的稳定miR‑497表达上调的HMPC细胞株可用于进一步的动物实验甚至临床试验，可用于探索PF的发生机制，寻找PF新的缓解措施，为患者继续维持PD开辟新道路。

Description

稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用。
背景技术
终末期肾脏病（End stage renal disease，ESRD）是21世纪全人类面临的主要健康问题之一，ESRD患者数以每年约10%的速度增长。近年来，随着高血压、肥胖、Ⅱ型糖尿病发病率的逐年升高及人口老龄化的加剧，慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease，CKD）导致的 ESRD 患者人数急剧增多。
ESRD患者必须依赖肾脏代替治疗（Renal replacement therapy，RRT）。目前已经有肾移植、血液透析（Hemodialysis，HD）和腹膜透析（Peritoneal dialysis， PD）三大替代治疗方式。但是，RRT和HD费用昂贵，而PD具有保护残余肾功能、交叉感染少、居家透析、活动相对自由、花费相对较低等优势，已成为肾脏一体化疗法中的重要组成部分。
然而，临床研究发现，随着患者PD时间延长，高浓度葡萄糖及其在高温消毒时产生的降解产物、酸性透析液的低pH值、乳酸盐缓冲液的使用、透析液的高渗透压等生物不相容性因素和反复发作的腹膜炎，会引起腹膜形态和功能的改变，最终使腹膜纤维化（Peritoneal fibrosis，PF），导致超滤衰竭（Ultrafiltration Failure，UFF），而其具体详细的发病机制尚未明了。
目前，已有研究表明，腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤是PF的重要机制。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤中发挥重要作用。miR-497高表达可抑制肿瘤组织血管新生及细胞外基质积聚。发明人前期实验已证明高糖可诱导损伤的腹膜间皮细胞miR-497表达减少，VEGF表达增多。
为了深入探索PF的发生机制，寻找PF新的缓解措施，为患者继续维持PD奠定坚实的基础，对腹膜间皮细胞进行基因改造是十分必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
构建一种稳定超表达miR-497的HPMC细胞株，所述细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定过表达miR-497，其保藏编号为：CCTCC NO：C201776。
优选的，其基因组中含miRNA-497minic质粒。
设计一种用嘌呤霉素筛选所述稳定超表达miR-497的HPMC细胞株的方法，所述嘌呤霉素的浓度为1.5～2.5μg/ ml。
优选的，所述嘌呤霉素的浓度为1.8～2.2μg/ ml。
优选的，所述嘌呤霉素的浓度为2μg/ ml。
所述稳定超表达miR-497的HPMC细胞株在调控HPMC细胞VEGF表达中的应用。
本发明所述的稳定超表达miR-497的HPMC细胞株，已于2017年10月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山（八一路299号）武汉大学中国典型培养物保藏中心，该稳定超表达miR-497的HPMC细胞株在保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：C201776。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明首次制备出在HMPC细胞中稳定miR-497表达上调细胞株。
2. 本发明论证用嘌呤霉素筛选稳定超表达miR-497的HPMC细胞株的最佳筛选浓度为2μg/ ml。
3. 本发明论证HPMC细胞中miR-497的表达与 VEGF 呈负相关。
4. 本发明制备出的稳定miR-497表达上调的HMPC细胞株，可作为基础的试验材料和模型细胞株，可用于进一步的动物实验乃至临床试验，可用于探索PF的发生机制，寻找PF新的缓解措施，为患者继续维持PD开辟新道路，意义重大。
附图说明
图1为miRNA-497minic的质粒图谱图；
图2为miRNA-497inhibit的质粒图谱图；
图3为miRNA-497minic转染293T细胞的荧光显微镜检测图；
图4为miRNA-497inhibit质粒转染293T细胞的荧光显微镜检测图；
图5为PCR检测miRNA ORF的溶解曲线图；
图6为PCR检测miRNA shRNA的溶解曲线图；
图7为RT-PCR检测HPMC细胞稳转株中ORF/shRNA的表达柱状图；
图8为HPMC细胞中miR-497表达上调和下调对VEGF mRNA表达的影响图；
图9为HPMC细胞中miR-497表达上调和下调对VEGF蛋白质表达的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：实验材料
1. 所用主要仪器及耗材如表1所示：
表1 仪器及耗材
Figure 251614DEST_PATH_IMAGE001
。
2. 所用主要试剂如表2所示：
表2 试剂
Figure 699913DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例二：重组质粒转染293T细胞
1. 细胞培养
（1）293T细胞由郑州大学第一附属医院肾脏病基础研究室原代培养。
（2）细胞常规培养：
293T细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基培养，置于37℃，5% CO2 培养箱中培养，根据培养基颜色及细胞生长情况更换新鲜培养基。
2. 质粒转染
（1）miRNA-497minic和miRNA-497inhibit质粒由GeneCopoeia构建，质粒图谱如图1和图2所示；
（2）选取生长状态良好的处于对数生长期的293T细胞1×105，接种于6cm细胞培养皿中，培养过夜；
（3）更换1% FBS培养基同步化处理细胞12h，依次接种于新的6cm培养皿中；
（4）10% FBS，DMEM，37℃，5% CO2培养，待细胞均匀地完全地贴壁于生长后且细胞密度大于80%用于质粒转染；
（5）往无菌EP管加入质粒 7.5μg，以 Opti-MEMI稀释至200μl；在另一无菌EP管内，以Opti-MEMI稀释15μl EndoFectin转染试剂；边轻柔进行涡旋，边往质粒中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂，不可颠倒添加顺序，室温培养该溶液10～25min，使质粒-EndoFectin混合物产生；
（6）将质粒-EndoFectin复合物接加入细胞板，轻柔涡旋平板使复合物分散，细胞在CO2条件下，37℃过夜培养8～14h，以加入2～5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜DMEM培养基更换旧培养基并继续在 CO2条件下， 37℃继续培养；
（7）转染48h后荧光显微镜检测荧光，判断转染效率；
（8）收集细胞提取RNA及蛋白用于下游检测。
结果如有绿色荧光的图3和有红色荧光的图4所示所示，miRNA-497minic和miRNA-497inhibit质粒分别转染到了293T细胞中。
实施例三：筛选重组细胞株
（1）抗生素母液的配制：
取抗生素固体粉末溶于无菌的ddH2O中，4℃保存；
母液的配制浓度为：嘌呤霉素10mg/ml，用细胞培养基稀释1000倍，稀释成终浓度为10µg/ml，本发明的最少致死浓度为2µg/ml；
（2）药筛：
细胞胰酶消化计数后，按每孔500 µl筛选培养基、1～5×104个细胞接种24孔板中的12个孔，其中每个梯度2个复孔；另外2孔作为不加药对照，在37℃、5% CO2条件下培养；
根据细胞大小和生长快慢调节细胞接种量，保证开始药筛时细胞密度为20～35%，因细胞处于生长状态时，抗生素产生作用效果，细胞生长代谢旺盛，抗生素效果显著；
（3）换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每2～3天更换一次筛选培养基。保持抗生素筛选浓度不变。
实施例四：慢病毒包装及纯化
1. DNA 溶液的制备
使用Magen无内毒素质粒抽提试剂盒，提取慢病毒包装系统中所需的minic克隆和inhibit克隆，使用紫外分光光度计测定提取物的浓度和纯度，所提质粒DNA的A260/A280值在1.8～2.0之间，进行后续实验。
2. 病毒包装
（1）培养包装细胞：
将1.3×106～1.5×106的 293T细胞接种入10cm的细胞培养皿中在37℃、5% CO2条件下进行培养两天，培养皿中加入含10%热灭活胎牛血清DMEM培养基10ml，当细胞的融合率达到70～80%时，进行质粒的转染；
（2）准备 DNA-EndoFectin 慢病毒混合物：
使用HiPure Plasmid EF Mini Kit试剂盒，往无菌EP管加入ORF/shRNA 表达质粒2.5μg、LentiPac HIV混合试剂 5.0μl，以 Opti-MEMI稀释至 200 μl。在另一个无菌EP管内，以Opti-MEMI 稀释 15μl EndoFectin转染试剂。同时，将上述稀释的EndoFectin转染用试剂滴加到DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中，按照添加顺序进行添加，将该溶液，置于室温下孵育10～25min，产生DNA-EndoFectin复合物；
（3）转染包装细胞：
将 DNA-EndoFectin复合物加入细胞板中，将细胞板进行轻柔的涡旋，以利于复合物的分散。细胞在CO2条件下，37℃过夜培养，用新鲜的含2～5%热灭活的胎牛血清、青霉素以及链霉素的DMEM培养基更换旧的培养基，培养基中加入1/500体积的TiterBoost试剂，置于37℃、5% CO2条件下培养；
（4）经过48h的转染后收获慢病毒，将收集到培养基离心10min，转速500×g，用0.45μm 的低蛋白结合PES过滤膜过滤上清液，弃去沉淀，即得到含慢病毒的培养基。
3. 慢病毒滴度检测
使用Lenti-PacTM HIV和FIV qRT-PCR Titration Kits进行快速、简单的慢病毒滴度检测。使用的试剂盒包括RNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂盒以及对照用的标准品。采用SYBR® Green检测方法的qRT-PCR 技术定量慢病毒RNA基因组，结果如图5和图6所示。
反应条件说明：95℃ 10min一个循环，（95℃15s，60℃30s，PCR仪采集荧光信号）40个循环。
引物信息如表3所示：
表3 引物信息
Figure 10808DEST_PATH_IMAGE003
。
实施例五：慢病毒感染人腹膜间皮细胞（HPMC）
1. 慢病毒感染MOI值预实验
（1）设置MOI梯度：按照不加病毒0、10、20、30、50、80和100来设置MOI梯度，不加病毒组用来判定细胞状态；
（2）将要感染慢病毒的细胞按每孔接种2×104个细胞的量接种于24孔板中，以第二天的融合度达到30%～40%为宜。置37℃培养箱培养24h；
（3）按照设置好的MOI值算好每孔需要加的病毒量；
每孔加病毒量按以下公式：
加病毒量（μl）= MOI×细胞数/滴度（TU/ml）×1000
（4）按照算好的病毒量吸取病毒原液加入培养基中，摇动24孔板混匀，加完病毒的孔中再加入Polybrene，终浓度5μg/ml，摇动孔板混匀置37℃培养箱继续培养24h；
（5）提前将培养基置于37℃预热，弃去含病毒的旧培养基，重新吸取预热好的新鲜完全培养基，加入24孔板中，置于37℃培养箱继续培养；
（6）第五天时观察细胞感染效率，确定合适的MOI值。
MOI值=病毒数/细胞数。
2. 慢病毒感染HPMC细胞
HPMC细由郑州大学第一附属医院肾脏病基础研究室原代培养。
（1）将状态良好的HPMC细胞接种到24孔板中，计数后，进行铺板，每孔加入500μl的培养基，保证第二天感染病毒时融合率达到30～40%，以7×104 cells/孔的密度接种于新的24孔板；
（2）24h后，选择的合适MOI值为20，进行病毒的感染。将病毒加完的孔中再加入Polybrene，至终浓度为5μg/ml，摇动24孔板便于混匀，置37℃培养箱继续培养24h；
（3）病毒感染8～12h后，观察细胞状态：如细胞状态差，尽快更换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24h内换液，但不宜超过24h，更换新鲜培养基后再将24孔板置于5% CO2培养箱培养；
（4）病毒感染72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估算慢病毒感染目的细胞的效率，若荧光弱，可到96h后观察，如果96h仍无荧光，即感染实验失败。
实施例六：HPMC细胞稳转株的筛选
1. 稳转株筛选
（1）嘌呤霉素最优浓度筛选
以7×104 cells/孔的密度将HPMC细胞在24孔板内铺板，置于5% CO2培养箱孵育过夜。
准备筛选培养基：用完全培养基将配好的嘌呤霉素（1mg/mL）进行梯度稀释，最终配成的培养基含嘌呤霉素浓度为：0.5μg/ ml、1μg/ ml、1.5μg/ ml、2μg/ ml、4μg/ ml、6μg/ml。
细胞孵育过夜，先加入一定量的筛选培养基，然后再次进行孵育细胞。48h后更换新的筛选培养基。每日对孵育的细胞进行监测、观察其存活细胞的比例。
持续筛选孵育的细胞4天后，最佳的嘌呤霉素筛选浓度就是能使孔中所有HPMC细胞死亡的最低浓度。
试验结果显示：确定HPMC细胞的最佳筛选浓度为2μg/ ml。
（2）慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选
以5～8×104 cells/孔的细胞密度在24孔板内铺板，将24孔板置于5% CO2培养箱孵育过夜。加入病毒颗粒，加polybrene至5 μg/ml；
病毒感染细胞8～12h，弃去培养基，每孔加入500μl新鲜的完全培养基，置5% CO2、37℃培养箱培养；
病毒感染细胞72h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基，继续培养、传代扩增；
制备筛选培养基：先确定杀灭曲线，再配制含有2μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基；
按2～3天的周期更换新鲜的筛选培养基；
每天荧光显微镜下观察细胞，记录活细胞生长比例和荧光蛋白的表达水平和比例。
结果显示：嘌呤霉素最佳筛选的时间在3～10天之间，得到HPMC细胞稳转株。
实施例七：实时荧光定量PCR鉴定HPMC细胞稳转株
6孔板中，分别接种HPMC细胞、HPMC细胞HIF-2α ORF/shRNA稳转株，用Trizol法提取细胞的总RNA，反转录得到cDNA。
以人β-actin基因作为内参，HIF-2α和β-actin cDNA引物序列均由GeneCopoeia合成。
20μl反应体系，反应条件为：95℃ 5min，进入45次循环（95℃ 45s，60℃ 1min采集荧光），最后55℃ 5min，实验重复进行3次。
RT-PCR结果如图7所示，表达效率分析结果如表4所示：
表4 表达效率分析
Figure 406018DEST_PATH_IMAGE004
。
结果显示荧光定量PCR检测结果显示过表达细胞株中miR497表达水平显著高于对照细胞株及正常细胞株，miR-497可以在HPMC细胞系中有效的上调miR-497表达；构建的miR-497下调细胞株中，miR-497 inhibit可以在HPMC细胞系中有效的抑制miR-497表达。
稳定miR-497表达上调和稳定miR-497表达下调的HPMC细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定超表达miR-497，细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C201776；稳定低表达miR-497的HPMC细胞株，细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定低表达miR-497，细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C2017235。
实施例八：miR-497表达上调和下调对HPMC细胞中VEGF表达的影响
1. 对VEGF的mRNA表达的影响
RT-PCR检测稳定miR-497表达上调和稳定miR-497表达下调及对照组HPMC细胞中VEGF的mRNA表达，克隆VEGF的引物序列为：
VEGF-F：GTGACCACATTCACT GTG AGC CT
VEGF-R：GGC TCA CCG CCT TGG CTT GT。
结果如图8所示：
可见稳定miR-497表达上调的HPMC细胞系中，VEGF的mRNA表达明显少于稳定miR-497表达下调的HPMC细胞株、对照组及正常组细胞株；稳定miR-497表达下调的HPMC细胞系中，VEGF的mRNA表达明显多于稳定miR-497表达上调的HPMC细胞株、对照组及正常组细胞株。
说明随着HPMC细胞中miR-497表达增多，VEGF的mRNA表达减少。
2. 对VEGF的蛋白质表达的影响
Western blot检测稳定miR-497表达上调和稳定miR-497表达下调及对照组HPMC细胞中VEGF的蛋白质表达：
分别培养HPMC细胞正常组，稳定表达miR-497上调和稳定表达miR-497下调及其对照组的细胞株，提取总蛋白，把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔，选择选择恒压80V电泳，目的蛋白被分离后停止电泳。然后利用PVDF膜在恒流250mA，冰浴，转膜70min，牛奶封闭2h，一抗封闭过夜。用1×TBST洗3遍，每次10min。二抗孵育2小时，1×TBST洗3遍，每次10min，曝光。
结果如图9所示：
可见稳定miR-497表达上调的HPMC细胞系中，VEGF的蛋白质表达明显少于稳定miR-497表达下调的HPMC细胞株、对照组及正常组细胞株；稳定miR-497表达下调的HPMC细胞系中，VEGF的蛋白质表达明显多于稳定miR-497表达上调的HPMC细胞株。
说明随着HPMC细胞中miR-497表达增多，VEGF的蛋白质表达减少。
3. 结论
稳定miR-497表达上调的HPMC细胞系中，VEGF的mRNA和蛋白质表达明显少于稳定miR-497表达下调的HPMC细胞株；稳定miR-497表达下调的HPMC细胞系中，VEGF的mRNA和蛋白质表达明显多于稳定miR-497表达上调的HPMC细胞株。
HPMC细胞中miR-497的表达与 VEGF 的表达呈负相关。
鉴于VEGF在腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤中发挥重要作用，与腹膜纤维化有关，在HPMC细胞中调控miR-497表达可探索PF的发生机制，寻找PF新的缓解措施，为患者继续维持PD奠定基础。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtgaccacat tcactgtgag cct 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggctcaccgc cttggcttgt 20

Claims (5)

1.一种稳定超表达miR-497的HPMC细胞株，其保藏编号为：CCTCC NO：C201776。
2.根据权利要求1所述的稳定超表达miR-497的HPMC细胞株，其特征在于，其基因组中含miRNA-497minic质粒。
3.一种用嘌呤霉素筛选权利要求1所述稳定超表达miR-497的HPMC细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为1.5～2.5μg/ ml。
4.一种用嘌呤霉素筛选权利要求3所述稳定超表达miR-497的HPMC细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为1.8～2.2μg/ ml。
5.根据权利要求4所述用嘌呤霉素筛选权利要求1所述稳定超表达miR-497的HPMC细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为2μg/ ml。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102031310A (zh) * 2010-11-30 2011-04-27 华东师范大学 miRNA-195/497化合物共同作为乳腺癌标志物的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031310A (zh) * 2010-11-30 2011-04-27 华东师范大学 miRNA-195/497化合物共同作为乳腺癌标志物的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A microrna screen to identify regulators of peritoneal fibrosis in a rat model of peritoneal dialysis;Fan Lin等;《BMC Nephrology》;20150409;第16卷;第1-9页 *
miRNA-497在肿瘤中的研究进展;马沙蕊等;《国外医学医学地理分册》;20150331;第36卷(第1期);第75-78页 *
Overexpression of miRNA-497 inhibits tumor angiogenesis by targeting VEGFR2;Yingfeng Tu等;《Sci Rep》;20150908;第5卷;第1-15页 *
Role of miR-497 in VEGF-A-mediated cancer cell growth and invasion in non-small cell lung cancer;Aiqin Gu等;《Int J Biochem Cell Biol》;20151017;第10卷;第118-125页 *
Roles of miR-497 and its potential signaling pathway in diseases and with vascular endothelial growth factor;Tian-Biao Zhou;《J Recept Signal Transduct Res》;20141104;第1-4页 *

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