CN113373144B - 用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途。具体地，本发明提供了包含miR‑181c和miR‑126联合表达microRNA的外泌体，能够显著增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。因此包含miR‑181c和miR‑126联合表达microRNA的外泌体能够用于预防或治疗皮肤损伤。

Description

用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本发明涉及用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
皮肤是人体最大的一个器官，主要功能是保护机体免受外界病原体的入侵，还具有排汗、感觉等功能。而皮肤组织经常发生急性或者慢性损伤，例如烧烫伤、糖尿病性足部溃疡等，这些创伤不但会影响病人的生理功能心理健康，也带来了巨大的社会经济负担。越来越多的研究致力于如何加速皮肤创面的愈合，促进皮肤组织的修复与再生，目前临床仍缺乏十分有效的治疗方法。
在皮肤修复与再生领域，以干细胞为中心的相关疗法取得了多种令人惊喜的治疗效果。研究证明干细胞在创伤修复中主要依靠旁分泌的方式来促进皮肤创伤的修复。但干细胞自身向受伤部位的移植、分化率很低，而且生存期短暂，此外干细胞在使用过程还存在着保存困难、伦理、突变致瘤、免疫排斥等限制。
外泌体作为一种细胞分泌的亚细胞成分，是直径在30-150nm的膜性囊泡，广泛参与细胞之间的交流，可以作为干细胞的旁分泌因子来发挥生物学效应，为进一步实现无细胞治疗(cell free therapy)提供了新的实现途径。外泌体具有多种干细胞不可比拟的优点：1)安全性好：利用外泌体来进行组织修复，可以避免产生免疫排斥反应、血管阻塞、突变成瘤的风险，将安全性大大提高。2)易保存运输：分离得到的外泌体可以在-80℃长期保存，外泌体的外膜可以保护其内容物。尤其对于RNA分子而言，避免了外部RNA酶对其的降解作用。3)作用快效率高：外泌体可以直接被细胞摄人，影响靶细胞的功能，提高了作用效率。4)无伦理限制：外泌体作为细胞分泌的一种亚细胞结构，其在应用时没有相关的伦理限制。5)来源广泛：外泌体可以从多种细胞的培养上清、多种体液、血液中提取，来源广泛，便于利用。
外泌体中含有多种物质，且其内容物可随分泌细胞种类的不同而改变。其主要的成分有蛋白质、miRNA、mRNA、DNA以及脂质，此外还有其他种类的RNA分子，例如piRNA，snRNA等。据统计，外泌体中已有27642中mRNA和4934种miRNA被发现并报道。受体细胞可以通过膜融合、胞吞作用或者细胞特异性的吞噬作用摄入外泌体。外泌体可以将其所携带的内容物等传递给受体细胞，影响细胞的微环境并调节相关蛋白的表达。
因此，本领域技术人员致力于开发以外泌体为载体的皮肤修护药物，以满足临床需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途。
本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物，所述核酸构建物的结构如式I所示，
X-L-Y， 式I
式I中，X为miR-126、其前体、或其编码基因序列；L为连接序列；Y为miR-181c其前体、或其编码基因序列。
在另一优选例中，所述核酸构建物为多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸。
在另一优选例中，所述L长度为5-10bp；优选为6bp。
在另一优选例中，所述L为TAGGAT。
在另一优选例中，所述miR-126的序列选自下组：
(A)如SEQ ID NO.:1所示的序列；
(B)将SEQ ID NO.:1所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的序列；
(C)序列与SEQ ID NO.:1所示的序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的序列；
(D)与(A)-(C)任一所述的序列互补的序列。
在另一优选例中，所述所述miR-181c的序列选自下组：
(A)如SEQ ID NO.:2所示的序列；
(B)将SEQ ID NO.:2所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的序列；
(C)序列与SEQ ID NO.:2所示的序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的序列；
(D)与(A)-(C)任一所述的序列互补的序列。
在另一优选例中，所述miR-126的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述miR-181c的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:3所示。
本发明的第二方面，提供了一种表达盒，所述表达盒具有本发明第一方面所述的核酸构建物，或者所述表达盒稳定表达本发明第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件：启动子、如式I所示的核酸构建物、和终止密码子。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第二方面中所述的表达盒。
在另一优选例中，所述的表达载体为质粒、或病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体为慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、或腺相关病毒载体。
本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组整合有一个或多个本发明第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选为HEK293细胞。
本发明第五方面提供了一种外泌体颗粒，所述外泌体颗粒包含本发明第一方面所述的核酸构建物。
本发明第六方面提供了本发明第五方面所述的外泌体颗粒在制备用于皮肤再生和修复的组合物中的应用。
在另一优选例中，所述组合物为药物、保健品或化妆品。
本发明第七方面提供了一种组合物，所述的组合物包括：
(i)药学上可接受的载体，以及
(ii)有效量的本发明第五方面所述的外泌体颗粒。
本发明第八方面提供了一种制备本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的外泌体颗粒的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的基因工程细胞，从而表达本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的外泌体颗粒；和/或分离本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的外泌体颗粒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了FUGW图谱。
图2显示了酶切鉴定图谱。
图3显示了PCR鉴定结果。
图4显示了miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体滴度鉴定结果。
图5A显示了电镜检测结果，图5B显示了NTA检测结果，图5C显示了Western blot标志物检测。
图6显示了细胞增殖检测结果。
图7显示了细胞周期检测结果。
图8显示了外泌体miRNA对TGFb 3UTR Luciferase活性实验。
图9显示了qPCR实验结果。
图10显示了不同外泌体处理的细胞增殖检测结果。
图11显示了不同外泌体处理的细胞周期检测。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现包含miR-181c和miR-126联合表达microRNA的外泌体，能够显著增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。因此包含miR-181c和miR-126联合表达microRNA的外泌体能够用于预防或治疗皮肤损伤。在此基础上完成了本发明。
miRNA及其前体
微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一种内源性的长度较短的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。
miRNA可从其前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
核酸构建物
本发明提供了一种分离的核酸构建物，所述核酸构建物的结构如式I所示，
X-L-Y， 式I
式I中，X为miR-126或其编码基因序列；L为连接序列；Y为miR-181c或其编码基因序列。
本发明提供的所述核酸构建物为多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸。即，本发明提供的核酸构建物可以为miRNA形式的核酸构建物(包括成熟miRNA或前体miRNA)或能够编码该miRNA的DNA形式核酸构建物。
当本发明的所述核酸构建物为多聚脱氧核糖核酸时，所述的核酸构建物可被哺乳细胞转录并表达成目的miRNA。
通常，所述的核酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
外泌体
外泌体(exosome)是细胞分泌的一种小膜泡(30-150nm)，其包含了复杂RNA和蛋白质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
几乎所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
外泌体的提取方式是本领域熟知的，比如可以采用超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、PS(磷脂酰丝氨酸)亲和法(该方法将PS与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS)、色谱法等。
本发明提供了包含本发明所述的miRNA形式的核酸构建物的外泌体颗粒，其包含miR-181c和miR-126联合表达microRNA，能够显著增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。因此包含miR-181c和miR-126联合表达microRNA的外泌体能够用于预防或治疗皮肤损伤。
组合物及施用方法
本发明提供的外泌体颗粒，能够作为“活性成分”用于制备组合物，这些组合物可以为药物、保健品、或化妆品。通常，该组合物中包含“有效量”或“有效剂量”的所述外泌体颗粒，及药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供的包含miR-181c和miR-126的核酸构建物，具有极高的目的miRNA表达丰度。
(2)首次制备出了包含miR-181c和miR-126联合表达microRNA的外泌体。
(3)本发明的包含miR-181c和miR-126的外泌体，能够显著增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。
实施例1miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体的构建和包装；
基因信息：
>hsa-mir-126MI0000471
CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA(SEQ ID NO.:1)
>hsa-mir-181c MI0000271
CGGAAAAUUUGCCAAGGGUUUGGGGGAACAUUCAACCUGUCGGUGAGUUUGGGCAGCUCAGGCAAACCAUCGACCGUUGAGUGGACCCUGAGGCCUGGAAUUGCCAUCCU(SEQ ID NO.:2)
基因合成:209bp
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCATAGGATCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ ID NO.:3)
载体名称：FUGW(来自Addgene，货号14883)
元件顺序：Ubiquitin promoter-mir-126-linker-mir-181c-Poly(A)
克隆位点：BamHI/AgeI
载体图谱如图1所示。
图1显示了FUGW图谱。
扩增引物：
F：AGGTCGACTCTAGAGGCGCTGGCGACGGGACATTATTACTTT(SEQ ID NO.:4)
R：AGTCCATGGTGGCGATTTTTTTTAGGATGGCAATTCCT(SEQ ID NO.:5)
实验步骤：
以通过全基因合成DNA为模板，通过扩增引物进行PCR反应，扩增获得大小209bp左右的PCR产物，再对PCR产物和病毒载体进行BamHI和AgeI的双酶切，通过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接后进行转化反应，通过对转化子的鉴定，挑选阳性克隆送测，以测序序列和预期序列一致的作为正确克隆，命名为FUGW-mir-126-mir-181c-慢病毒载体。
mir-126-mir-181c-慢病毒载体的包装：
细胞准备：
细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为1.2×107细胞/20ml(0.6×109/L)时，重新接种于15cm的细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养，细胞密度达70％～80％时转染。转染24h前将细胞培养基更换为无血清培养基。
病毒包装：
制备慢病毒包装系统中3种质粒的DNA溶液(FUGW-mir-126-mir-181c-慢病毒载体20μg，pCMV-dR8.2 dvpr载体(购自addgene)15μg，pCMV-VSV-G载体(购自addgene)10μg，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。取100μlLipofectamine2000(购自invitrogen)试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM(购自invitrogen)混合，在室温下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，5分钟内轻轻地颠倒混匀。室温下温育20min。将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。培养8h后弃去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后弃去。每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。
收集转染48小时后的293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中并盖上盖子，将过滤杯插到滤过液收集管中。组合好后，做好平衡，放在转头上。在4000g离心约10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。所获得的病毒命名为mir-126-mir-181c慢病毒载体慢病毒颗粒。
miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体的构建鉴定结果如下：
图2显示了酶切鉴定图谱，其中泳道1:pGC-FU Vector；泳道2:pGC-FU-miRNA重组质粒BamHI/AgeI酶切产物；泳道3:1kb Marker(Marker条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)。
图3显示了PCR鉴定结果(PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱)，其中，泳道1:PCR鉴定跑胶图；泳道2:marker(Marker条带从上到下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp)。
测序结果表明，目标序列与预期序列一致。
miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体构建后，通过酶切鉴定、PCR扩增鉴定、测序鉴定，多种鉴定结果都与预期一致，说明miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体构建成功。
图4显示了miR-126-Linker-MiR-181c慢病毒载体滴度鉴定结果(qPCR检测病毒滴度检测结果)。
在本次滴度检测中，1.00E-05ul组样品和对照(control)组样品的Ct值存在6个左右差异，认为在1.00E-05ul组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：2.00E+9TU/ml，说明构建的慢病毒成功。
实施例2 mir-126-mir-181c稳定细胞株制备
细胞培养：
HEK293来自美国ATCC。用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，细胞密度为1.2×107细胞/20ml(0.6×109/L)时，重新接种于24孔的细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养；
病毒感染：
当细胞密度达50％～60％时进行病毒感染，感染前将细胞培养基更换为无血清培养基。根据HEK293细胞的MOI值(MOI＝5)，加入适宜量的mir-126-mir-181c慢病毒(加入病毒数＝细胞数x MOI值)。12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。
培养基更换：
当HEK293细胞被mir-126-mir-181c慢病毒感染后三天时，使用无血清的外泌体专用培养基(SBI)进行半剂量替换。替换方法，每次保留1/2的原有培养基，加入1/2的新鲜的外泌体专用无血清培养基，每三天更换一次培养基，确保细胞生长状态良好。
稳定株细胞筛选：
病毒感染后的HEK293细胞，先进行单克隆筛选，筛选后的细胞株持续培养20天以上，在此期间需要对细胞进行定期换液。
mir-126和mir-181c稳定细胞株基因表达筛选
将持续培养20天以上的感染后HEK293细胞进行qPCR检测实验，
收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5ml eppendorf管中；2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min；4℃，12000rpm，离心15min；吸取上清移至新的1.5mleppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10min；4℃，12000rpm离心10min后，去上清；加入至少1ml 75％乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀。4℃，10000rpm离心5min，弃去大部分上清；4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清；室温干燥；待RNA基本透明时，加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
RNA的逆转录反应：M-MLV逆转录酶和dNTPs购自Promega公司，RTprimer由上海生工合成，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下参考说明书；
相关引物信息如下：
RT primerl：
CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO.:6)
miR-181cqPCR primer:
R:CAGTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.:7)F:AACAAGAACATTCAACCTGTCGGTG(SEQ IDNO.:8)
miR-126 qPCR primer:
R:CAGTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.:16)F:AGCCAGCGCATTATTACTTTTGGTA(SEQ IDNO.:17)
通过qPCR筛选miR-181c和miR-126同时表达的细胞株，筛选到的阳性细胞株(A9clone细胞株)扩增、建库、冻存。miRNA126和miR-181c高产稳定细胞株构建成功。
实施例3制备外泌体
筛选获得高表达miR-181c和miR-126细胞株进行扩增培养，为了获得高纯度的外泌体，培养过程中使用无血清外泌体专用培养基(Umibio)，在细胞生长良好的情况下，收集细胞上清液，暂存在4℃中；待细胞培养收集到足量的上清液时，首先通过1000g离心10分钟，去除细胞颗粒；再通过10000g离心10分钟，去除细胞碎片；接着通过100000g离心2小时，沉淀外泌体颗粒，起名为miR-181c&miR-126外泌体。
外泌体的鉴定：
(1)透射电镜检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：
固定：2.5％戊二醛固定，2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗，三次；
1％锇酸固定液固定，2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗，三次；
脱水：50％乙醇，20分钟；70％乙醇，20分钟；90％乙醇，20分钟；90％乙醇：90％丙酮(1：1)，20分钟；90％丙酮，20分钟；以上在4度冰箱内进行，100％丙酮室温，20分钟；
包埋：纯丙酮+包埋液(2：1)，室温3小时；纯丙酮+包埋液(1：2)，室温过夜；纯包埋液，37℃2小时；
固化：37度烘箱内，过夜；45度烘箱内，12小时；60度烘箱内，24小时；
切片(超薄切片机切片50-60nm)：装上样品，选择刀口，使刀口与样品要平行；检查各夹具锁紧装置，打开锁定开关，通过粗细微调的调节，用手动使样品与刀面接触；加蒸馏水通过水的折光，掌握水面与刀面要平行；转换自动切片操作，拨拢水面上的切片，用氯仿熏；然后用铜网捞起切片；
染色：3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色。
检测：透射电镜观察照相，拍片。
(2)纳米激光粒度仪检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：(以美国Zetaview粒径仪为例)
打开计算机和仪器电源，预热仪器10分钟，然后启动操作软件，设定粒径模式和参数，将筛选过的外泌体样品放入样品池，放置于仪器的嵌入式样品检测装置，合上滑盖，设置检测时间与次数，然后开始检测样品，观察面板前数值，数值在300HZ左右为佳；过低或过高需停止检测，对样品进行适当稀释后，再进行测定。检测完毕后，保存资料。
(3)Western Blot检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：
抽提蛋白：向筛选过的外泌体中加入裂解液，4℃裂解15分钟，然后4℃/12000g离心5分钟，放入100℃水浴20分钟，然后继续4℃下12000g离心2分钟，-20℃保存备用。
配置SDS-PAGE：把玻璃板冲洗干净，晾干。把晾干后的玻璃板按要求放入制具，根据蛋白的大小配制SDS-PAGE胶，先配分离胶，玻璃板中加入7ml分离胶，再加2ml无水乙醇，30min后等分离胶充分凝固后再配浓缩胶，弃去玻璃板中的无水乙醇，用滤纸把残留的无水乙醇吸干，加入2ml浓缩胶，然后插入梳齿。
上样电泳：等胶凝固后，将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。用双手抓住梳子的两端轻轻用力向上拔去梳子，用1ml的移液器吸入电泳缓冲液轻轻吹洗上样孔，将准备好的样品上样，每个样品取相同总蛋白量，用20ul的移液器垂直于上样孔把样品缓慢加入上样孔内。在电泳槽下部加入适量的电泳液
电泳：恒流30mA 2小时
免疫印迹：电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转120分钟，将蛋白转移到PVDF膜上：在医用托盘中倒入500-800ml的电转移缓冲液，把玻璃板从电泳装置中取出来，用胶铲在玻璃板的上端轻轻地把两块玻璃板撬开，把胶的最底端用胶铲轻轻切除，然后用胶铲把胶轻轻托起来放在滤纸上，放置顺序从负极到正极依次放置：滤纸—胶—PVDF膜—滤纸，把治具放入转移电泳装置中，加入1L的电转移缓冲液进行转膜。
免疫显色：
封闭：在培养皿中倒入40-50ml的封闭液把已经转好的PVDF膜正面向上放入培养皿中，以防止蛋白脱落，PVDF膜要完全浸没在封闭液中，室温封闭1小时。
一抗孵育：用PE手套把已封闭好的PVDF膜包起来，加入封闭液稀释的抗体，放在混合器上4度孵育12h。
洗膜：把PVDF膜从PE手套中取出来，放入培养皿中，加入40-50mlTBST溶液，放在脱色摇床上轻摇，洗膜3次，每次10分钟。
二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2小时。
显色：采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片。
加ECL、曝光、显影、定影的具体步骤如下：
将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合A液和B液，配成总体积为1ml，将混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应5分钟。
将膜取出，沥掉多余的ECL底物反应液，不要让PVDF干掉，保持PVDF没有明显的反应液滴，就可以放入暗盒，铺上保鲜膜，关上暗盒，根据ECL的发光程度，选择曝光时间的长短在保鲜膜上做出相应的标记。取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中2分钟。
戴手套用镊子把X光片从定影液中取出放入65度烘箱烘干，分析。把晾干后的X光片，放入暗盒里，根据之前所做标记用记号笔把蛋白预染marker位置和样品名称标注在X光片上，然后对结果进行分析。
外泌体的鉴定结果如图5A至图5C所示，图5A显示了电镜检测结果，图5B显示了NTA检测结果，图5C显示了Western blot标志物检测。
通过电镜检测到了100nm左右的外泌体典型照片，通过NTA检测到了外泌体在100nm左右有个主峰，说明外泌体纯度很高，通过Western blot检测到外泌体中有CD63和Tsg101的表达。
实施例4外泌体-细胞共孵育实验
培养生长状态良好的细胞(Hacat人永生化角质形成细胞，购自中科院细胞库)，前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，共孵育当天按实验设计的组别加入外泌体颗粒进行目的细胞的共孵育实验。
(1)细胞增殖检测
通过Cellomics仪器可以读取细胞并拍照，然后通过软件分析处理计算出孔板中不同组别含有的细胞数目。连续检测3-5天后，绘制出细胞生长曲线图，从而呈现出细胞生长状况。
a)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；
b)用血球计数板对细胞计数；
c)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)。每组3-5复孔，每孔100μl，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；
d)铺好板后，置37℃5％CO2培养箱培养；
e)从铺板后第二天开始，每天CELLOMICS检测读板一次，连续检测读板3-5天；
f)通过调整cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；
g)对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
(2)细胞周期变化检测
a)待各实验组6cm dish细胞生长至覆盖率约为80％时(确保细胞未进入生长平台期)：吸弃细胞培养上清，D-Hanks洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞于5ml离心管中，每组设三个复孔。(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥1000000/处理)；
b)1200rmp离心5min，弃去上清；
c)4℃预冷的PBS(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀1次，1500rmp 5min离心，收集细胞；
d)4℃预冷的70％乙醇固定细胞至少1h；
e)1500rmp离心5min去固定液，PBS洗涤细胞沉淀一次，步骤同c)；
f)细胞染色液配制：40×PI母液(2mg/ml)：100×RNase母液(10mg/ml)：
1×PBS＝25：10：1000；
g)细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(1～1.5ml)重悬，使上机时细胞通过率为200～350Cell/s；
h)300目的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。
(3)细胞光老化实验
实验组外泌体与HaCaT共同培养48h后，移去Transwell，给予UVA30 mJ/cm2照射24小时，照射完成后继续培养24小时。对照组给予相同强度UVA照射，照射完成后继续培养24小时。按LDH、SOD、MDA测定试剂盒(碧云天)说明进行实验组与对照组细胞培养液中乳酸脱氢酶酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。
(4)外泌体miRNA对TGFb 3UTR Luciferase活性实验
携带有TGFb 3UTR的Luciferase标记HEK293细胞株购买自Invitrogen，通过共孵育miR-181c&miR-126外泌体和对照组外泌体，检测外泌体miRNA对Luciferase活性的影响。
图6显示了细胞增殖检测结果(CCK8检测细胞增殖)。
图7显示了细胞周期检测结果。
细胞光老化实验检测结果如表1所示：
表1
实验组、对照组SOD、LDH、MDA含量的测定(X±S,)
图8显示了外泌体miRNA对TGFb 3UTR Luciferase活性实验。
细胞增殖检测结果表明皮肤细胞HaCaT在加入miR-181c&miR-126外泌体后，可以显著的增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。
细胞周期检测结果表明，皮肤细胞HaCaT在加入miR-181c&miR-126外泌体后，可以看到S期显著的增加了，说明细胞的DNA合成代谢加快了，促进了细胞的增殖代谢。
细胞光老化实验结果表明，皮肤细胞HaCaT在进行光老化测试中，加入了miR-181c&miR-126外泌体的实验组中SOD、LDH活性明显高于对照组，MDA含量实验组低于对照组，说明miR-181c&miR-126外泌体对于皮肤抗老化有很高的保护作用。
外泌体miRNA对TGFb 3UTR Luciferase活性实验检测结果表明，携带有TGFb 3UTR的Luciferase标记HEK293细胞株中加入了miR-181c&miR-126外泌体后，TGFb 3UTR的Luciferase活性下降，说明外泌体中的miR-181c&miR-126的可以有效的抑制TGFb 3UTR的活性，进一步说明miR-181c&miR-126外泌体可以通过调控TGFb通路，TGFb通路是皮肤再生修复的重要通路机制。
应用价值：
外泌体对于需要皮肤组织修复与再生的提供了十分有前景的途径，通过外泌体在皮肤组织修复与再生方面的作用，来自某些干细胞、体细胞的外泌体可以加速皮肤的创伤愈合、促进皮肤组织再生，即使是对于慢性难愈性创面仍有较好的修复效果，因此，外泌体为皮肤组织的修复再生开辟了新的领域。
本发明通过基因工程的方式，在工程细胞株HEK293的基础上转入了促进细胞再生修复的重要microRNA分子：miR-181c和miR-126。研究表明，miR-181c和miR-126这两个分子可以促进皮肤再生修复，通过基因工程的方法获得了高产miR-181c和miR-126外泌体的细胞株。携带有miR-181c和miR-126的外泌体具有以下特点：安全性好、易保存运输、无伦理限制、作用快效率高。
miR-181c&miR-126外泌体在皮肤再生修复领域的应用：
1)外泌体能够迁移至受损区域，激活皮肤干细胞，促进皮肤细胞新生；
2)调节修复损伤的各层皮肤细胞，重新再生健康细胞修复受损的各层皮肤细胞，外泌体的复合因子可在皮肤组织中长期储存，通过人体自身皮肤微环境调节发挥功效，属于生理性修复，作用更为安全，有效。
3)外泌体可以激活体内的抗氧化系统，促进抗氧化维生素、抗氧化酶、抗氧化物质在细胞的增加，从而达到全面抗氧化，减少自由基，保护皮肤的作用。
4)可以抗炎，调节皮肤微环境干细胞分泌的复合因子，其活性蛋白成可以调节免疫、促细胞迁移类等，在皮肤组织可发挥改善细胞功能、抗炎、维护组织微环境稳态等作用。
筛选例1不同表达盒的构建和筛选
为了构建出具有高表达丰度的表达体系，发明人在研究过程中针对表达盒结构进行了大量的优化验证工作，例举部分如下。
本筛选例展示了通过构建不同长度linker的miRNA共表达载体，转染入细胞后，检测携带的miRNA的表达丰度。
基因信息：
4-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCAAGGACGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ ID NO.:9)
5-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCATAGGACGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ ID NO.:10)
6-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCATAGGATCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ ID NO.:3)
7-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCAGTAGGATCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ IDNO.:11)
8-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCAGTAGGATCCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ IDNO.:12)
9-Linker序列：
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCATGTAGGATCCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ IDNO.:13)
序列中下划线处为Linker序列。
实验步骤：
1.克隆构建：
以通过全基因合成以上DNA序列为模板，通过扩增引物进行PCR反应，扩增获得大小209bp左右的PCR产物，再对PCR产物和病毒载体进行BamHI和AgeI的双酶切，通过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接后进行转化反应，通过对转化子的鉴定，挑选阳性克隆送测，以测序序列和预期序列一致的作为正确克隆，命名为：
A)FUGW-mir-126-4-Linker-mir-181c-慢病毒载体
B)FUGW-mir-126-5-Linker-mir-181c-慢病毒载体
C)FUGW-mir-126-6-Linker-mir-181c-慢病毒载体
D)FUGW-mir-126-7-Linker-mir-181c-慢病毒载体
E)FUGW-mir-126-8-Linker-mir-181c-慢病毒载体
F)FUGW-mir-126-9-Linker-mir-181c-慢病毒载体
2.细胞转染：
分别提取以上7种重组DNA质粒，分别转染到HEK293细胞中，转染后48小时，收集细胞，并裂解至Trizol试剂中。
转染步骤参考Invitrogen Lipofectamine2000使用说明书。
3.RNA的提取和反转录：
RNA提取参考Invitrogen Trizol试剂使用说明书；
反转录方法参考Promega反转录试剂盒使用说明书；
4.qPCR检测miR-126和miR-181c
相关引物信息如下：
RTprimerl：
CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO.:6)
miR-181cqPCR primer:
R:CAGTGCAGGGTCCGAGGTF:AACAAGAACATTCAACCTGTCGGTG(SEQ ID NO.:7)
miR-126qPCR primer:
R:CAGTGCAGGGTCCGAGGTF:AGCCAGCGCATTATTACTTTTGGTA(SEQ ID NO.:8)
qPCR步骤参考TaKaRa一步法荧光定量PCR试剂盒说明书
qPCR实验结果如图9所示，通过构建不同长度linker载体的microRNA表达检测，发现6-linker载体中的两个microRNA的表达均较其他长度的linker都高，因此，后期实验中选择6-linker长度的载体进行研究。
对比例1不同microRNA外泌体对细胞功能的影响；
发明人在研发过程中，针对不同的microRNA进行了活性测试，结果发现不同的microRNA细胞活性差异较大。
本对比例展示了部分携带有不同的microRNA外泌体对于细胞功能的影响。
基因信息：
1)mir-126
CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCAAAAAAAAA(SEQ ID NO.:14)
2)mir-181c
CGGAAAAUUUGCCAAGGGUUUGGGGGAACAUUCAACCUGUCGGUGAGUUUGGGCAGCUCAGGCAAACCAUCGACCGUUGAGUGGACCCUGAGGCCUGGAAUUGCCAUCCUAAAAAAAA(SEQ ID NO.:15)
3)mir-126-Linker-mir-181c
CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCATAGGATCGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAACCTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCTAAAAAAAA(SEQ ID NO.:3)
实验步骤：
1.克隆构建：
以通过全基因合成以上DNA序列为模板，通过扩增引物进行PCR反应，扩增获得大小209bp左右的PCR产物，再对PCR产物和病毒载体进行BamHI和AgeI的双酶切，通过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接后进行转化反应，通过对转化子的鉴定，挑选阳性克隆送测，以测序序列和预期序列一致的作为正确克隆，命名为：
A)FUGW-mir-126-慢病毒载体
B)FUGW-mir-181c-慢病毒载体
C)FUGW-mir-126-7-Linker-mir-181c-慢病毒载体
2.病毒包装和稳定株制备
将以上三个慢病毒骨架质粒分别与辅助质粒在HEK293T细胞中进行共转染，之后收集病毒上清液，在进行分离纯化、滴度鉴定，分别获得以下三个重组慢病毒颗粒；
A)FUGW-mir-126-重组慢病毒
B)FUGW-mir-181c-重组慢病毒
C)FUGW-mir-126-7-Linker-mir-181c-重组慢病毒
以上病毒分别感染HEK293细胞后，先进行单克隆筛选，筛选后的细胞株持续培养20天以上，在此期间需要对细胞进行定期换液，最终获得稳定株；
3.细胞扩增和外泌体分离提取；
通过无血清外泌体专用培养基(Umibio)分别扩增稳定细胞株，收集上清液，再通过外泌体超速离心提取，最终分别获得以下外泌体：
A)miR-126外泌体
B)miR-181c外泌体
C)miR-181c&miR-126外泌体
4.外泌体-细胞共孵育实验；
培养生长状态良好的细胞--Hacat人永生化角质形成细胞，购自中科院细胞库，前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，共孵育当天按实验设计的组别加入外泌体颗粒进行目的细胞的共孵育实验，随后检测细胞增殖和细胞周期的变化。
图10显示了细胞增殖检测结果。结果显示，皮肤细胞HaCaT在分别加入miR-126外泌体，miR-181c外泌体，miR-181c&miR-126外泌体外泌体后，miR-181c&miR-126外泌体可以显著的增加细胞的生长速率，促进细胞的生长。
图11显示了细胞周期检测。结果显示，皮肤细胞HaCaT在加入分别加入miR-126外泌体，miR-181c外泌体，miR-181c&miR-126外泌体外泌体后，可以看到miR-181c&miR-126外泌体作用后S期显著的增加了，说明细胞的DNA合成代谢加快了，促进了细胞的增殖代谢。
5.细胞光老化实验
实验组外泌体与HaCaT共同培养48h后，移去Transwell，给予UVA30 mJ/cm2照射24小时，照射完成后继续培养24小时。对照组给予相同强度UVA照射，照射完成后继续培养24小时。按LDH、SOD、MDA测定试剂盒(碧云天)说明进行实验组与对照组细胞培养液中乳酸脱氢酶酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。
检测结果如表2所示。
表2
检测结果表明，皮肤细胞HaCaT在进行光老化测试中，分别加入miR-126外泌体，miR-181c外泌体，miR-126外泌体+miR-181c外泌体，miR-181c&miR-126外泌体后的实验组中SOD、LDH活性明显高于对照组，MDA含量实验组低于对照组，其中miR-181c&miR-126外泌体组的变化最为显著，说明对于皮肤抗老化有很高的保护作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 苏州华莱丽生物科技有限公司
<120> 用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途
<130> P210310
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 85
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
cgcuggcgac gggacauuau uacuuuuggu acgcgcugug acacuucaaa cucguaccgu 60
gaguaauaau gcgccgucca cggca 85
<210> 2
<211> 110
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cggaaaauuu gccaaggguu ugggggaaca uucaaccugu cggugaguuu gggcagcuca 60
ggcaaaccau cgaccguuga guggacccug aggccuggaa uugccauccu 110
<210> 3
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
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attcaacctg tcggtgagtt tgggcagctc aggcaaacca tcgaccgttg agtggaccct 180
gaggcctgga attgccatcc taaaaaaaa 209
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
agtccatggt ggcgattttt tttaggatgg caattcct 38
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> v 为 a, c, or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n 为 a, c, g, or t
<400> 6
cagtgcaggg tccgaggtca gagccacctg ggcaattttt ttttttvn 48
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
cagtgcaggg tccgaggt 18
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
aacaagaaca ttcaacctgt cggtg 25
<210> 9
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60
gagtaataat gcgccgtcca cggcaaggac ggaaaatttg ccaagggttt gggggaacat 120
tcaacctgtc ggtgagtttg ggcagctcag gcaaaccatc gaccgttgag tggaccctga 180
ggcctggaat tgccatccta aaaaaaa 207
<210> 10
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60
gagtaataat gcgccgtcca cggcatagga cggaaaattt gccaagggtt tgggggaaca 120
ttcaacctgt cggtgagttt gggcagctca ggcaaaccat cgaccgttga gtggaccctg 180
aggcctggaa ttgccatcct aaaaaaaa 208
<210> 11
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60
gagtaataat gcgccgtcca cggcagtagg atcggaaaat ttgccaaggg tttgggggaa 120
cattcaacct gtcggtgagt ttgggcagct caggcaaacc atcgaccgtt gagtggaccc 180
tgaggcctgg aattgccatc ctaaaaaaaa 210
<210> 12
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60
gagtaataat gcgccgtcca cggcagtagg atccggaaaa tttgccaagg gtttggggga 120
acattcaacc tgtcggtgag tttgggcagc tcaggcaaac catcgaccgt tgagtggacc 180
ctgaggcctg gaattgccat cctaaaaaaa a 211
<210> 13
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60
gagtaataat gcgccgtcca cggcatgtag gatccggaaa atttgccaag ggtttggggg 120
aacattcaac ctgtcggtga gtttgggcag ctcaggcaaa ccatcgaccg ttgagtggac 180
cctgaggcct ggaattgcca tcctaaaaaa aa 212
<210> 14
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
cgcuggcgac gggacauuau uacuuuuggu acgcgcugug acacuucaaa cucguaccgu 60
gaguaauaau gcgccgucca cggcaaaaaa aaa 93
<210> 15
<211> 118
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
cggaaaauuu gccaaggguu ugggggaaca uucaaccugu cggugaguuu gggcagcuca 60
ggcaaaccau cgaccguuga guggacccug aggccuggaa uugccauccu aaaaaaaa 118
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
cagtgcaggg tccgaggt 18
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
agccagcgca ttattacttt tggta 25

Claims (10)

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的结构如式I所示，
X-L-Y，　　式I
式I中，
X为序列如SEQ ID NO.1所示的miR-126；
L为连接序列，所述连接序列为TAGGAT或GTAGGAT；
Y为序列如SEQ ID NO.2所示的miR-181c。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述连接序列为TAGGAT。
3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒具有权利要求1所述的核酸构建物，或者所述表达盒稳定表达权利要求1所述的核酸构建物。
4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求3所述的表达盒。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为质粒或病毒载体。
6.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求4所述的表达载体，或其基因组整合有一个或多个权利要求1所述的核酸构建物。
7.一种外泌体颗粒，其特征在于，所述外泌体颗粒包含权利要求1所述的核酸构建物。
8.权利要求7所述的外泌体颗粒在制备用于皮肤再生和修复的组合物中的应用。
9.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括：
(i)药学上可接受的载体，以及
(ii) 有效量的权利要求7所述的外泌体颗粒。
10.一种制备权利要求1所述的核酸构建物或权利要求7所述的外泌体颗粒的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的基因工程细胞，从而表达权利要求1的核酸构建物或权利要求7所述的外泌体颗粒；和/或
分离权利要求1所述的核酸构建物或权利要求7所述的外泌体颗粒。
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