CN111909897B

CN111909897B - Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用

Info

Publication number: CN111909897B
Application number: CN202010817080.5A
Authority: CN
Inventors: 孙瑶湘; 赵珊; 杨婷婷; 乔国洪; 毛旭华; 汤俊明
Original assignee: Yixing Peoples Hospital
Current assignee: Yixing Peoples Hospital
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111909897A

Abstract

本发明提供了Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用，属于基因调控技术领域，Ruvbl2的表达或抑制对人脐带间质干细胞增殖和分化能力的具有调控作用。

Description

Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用

技术领域

本发明属于基因调控技术领域，尤其涉及Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用。

背景技术

间质干细胞(Mesenchymal stem cell；MSC)可被定义为一种具有内在潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等不同类型的细胞(Lindolfo etal.2009)。根据来源不同，可分为脐血间质干细胞、骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、脂肪间质干细胞等。MSC是再生医学领域应用最广泛的干细胞。间质干细胞在肿瘤发生和组织损伤修复中起着重要的作用。MSC在组织修复中的潜能与其分化与再生能力密切相关，了解MSC的增殖和分化作用有利于更好的利用MSC。

Ruvbl2是近年来受到关注的腺苷三磷酸酶家族的成员(Jha et al.2009)。Ruvbl2广泛参与细胞过程，包括转录、基因修复、细胞转化、细胞生长、细胞迁移和侵袭(Mao etal.2017)。已有少数研究报道Ruvbl2与其他转录因子协同促进肿瘤进程。Ruvbl2在肝细胞癌中表达上调。Ruvbl2通过热休克蛋白90介导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和丝裂原活化蛋白激酶的通路，从而促进肿瘤的发生(Yan et al.2019)。Armenteros-Monterroso et al.发现，Ruvbl2通过调控对髓细胞分化的抑制，对急性髓细胞白血病中原癌基因cMYC的致癌功能至关重要(Armenteros-Monterroso et al.2019)。在结肠癌中，人端粒酶逆转录酶可受Ruvbl2和晚期结病的调控而影响临床结果(Flavin et al.2011)。急性肾功能衰竭通常被认为是p53之后的第二大失活抑癌基因，研究提示Ruvbl2可能是急性肾功能衰竭的一种新的转录抑制基因。Ruvbl2的异位表达以急性肾功能衰竭依赖的方式降低急性肾功能衰竭的水平和下调了p53的水平(Xie et al.2012)。此外，Ruvbl2还可以通过免疫调节来影响疾病的进展，Ruvbl2是T细胞发育和抗体反应所必需的(Arnold et al.2012)。在体内，敲减Ruvbl2的Th2细胞抗原诱导性扩增减少，气道炎症反应减少(Hosokawa et al.2013)。Soomin等发现过表达Ruvbl2的胚胎干细胞分化成神经内胚层的能力增强，但Ruvbl2对于间充质干细胞增殖分化能力的调控作用尚无具体研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用，Ruvbl2的表达或抑制对人脐带间质干细胞增殖和分化能力的具有调控作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用。

优选的，敲除编码Ruvbl2的基因，抑制人脐带间质干细胞的分化。

优选的，过表达编码Ruvbl2的基因，促进人脐带间质干细胞的分化。

优选的，敲除编码Ruvbl2的基因，抑制人脐带间质干细胞的增殖。

优选的，过表达编码Ruvbl2的基因，促进人脐带间质干细胞的增殖。

本发明提供了Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用，Ruvbl2的表达或抑制对人脐带间质干细胞增殖和分化能力的具有调控作用。

附图说明

图1为hucMSC及其外泌体中Ruvbl2的表达情况，其中(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hucMSC及其对照HFL来源外泌体内生物标记物及Ruvbl-2的表达量，(B)琼脂糖凝胶电泳证明hucMSC及HFL中Ruvbl2的表达，(C)实时荧光定量PCR检测hucMSC及HFL中Ruvbl2的表达量，(D)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hucMSCyuHFL中Ruvbl-2的表达量；

图2为Ruvbl2敲减的hucMSC细胞株构建及鉴定，其中(A)构建Ruvbl-2敲减及空白对照(Plk-on/Plk-on BLANK/BLANK)质粒并进行酶切，琼脂糖凝胶电泳证明实验组内Ruvbl-2的成功插入，(B)荧光定量PCR验证敲减Ruvbl-2的慢病毒成功转染hucMSC细胞后，实验组和对照组细胞内Ruvbl-2的基因表达量(***P<0.001)；

图3为Ruvbl-2敲减削弱了hucMSC的干性基因表达，其中(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hucMSC及Ruvbl-2敲减后hucMSC内干性基因的蛋白表达量，(B)统计软件对A中条带表达量进行灰度扫描并分析(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05)；

图4为Ruvbl-2敲减后hucMSC的形态发生变化，其中(A)高倍镜下观察RuvbL-2敲减组细胞的形态，(B)克隆形成实验检测Ruvbl-2敲减后hucMSC细胞的增殖能力，(C)生长曲线检测Ruvbl-2敲减后hucMSC细胞的增殖能力，(***P<0.001)。

具体实施方式

本发明提供了Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用。在本发明中，所述Ruvbl2为Ruvb-like蛋白2。本发明对所述人脐带间质干细胞的来源没有特殊限定，采用常规市售或者采用常规方法获取即可。

本发明优选通过敲除编码Ruvbl2的基因，抑制人脐带间质干细胞的分化。本发明对敲除编码Ruvbl2的基因的敲除方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规敲除基因的方法敲除即可。

本发明优选通过过表达编码Ruvbl2的基因，促进人脐带间质干细胞的分化。本发明对过表达编码Ruvbl2的基因的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法即可。

本发明优选通过敲除编码Ruvbl2的基因，抑制人脐带间质干细胞的增殖。本发明对敲除编码Ruvbl2的基因的敲除方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规敲除基因的方法敲除即可。

本发明优选通过过表达编码Ruvbl2的基因，促进人脐带间质干细胞的增殖。本发明对过表达编码Ruvbl2的基因的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质谱法获取hucMSC与HFL外泌体中差异表达的蛋白Ruvbl2并进行基因及蛋白水平的表达验证。

1.1.1.实施例1所使用的主要材料和来源分别如下：

1.1.1.1.HucMSC与HFL培养主要试剂与仪器：

HFL(中国科学院细胞库)、α-MEM(美国Invitrogen公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)、二氧化碳培养箱(美国Forma公司)、无血清培养基(中国上海依科赛公司)、超净工作台(中国苏州净化厂)、超低温冰箱(中国澳柯玛公司)、水平离心机(德国Eppendorf公司)。

1.1.1.2.外泌体提取主要试剂与仪器：

重水(D2O，中国上海创赛公司)、分析纯蔗糖(中国广州化学试剂厂)、磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司)、BCA蛋白定量试剂盒(中国北京康为世纪公司)、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)、超低温冰箱(中国澳柯玛公司)、超速离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.1.1.3.细胞蛋白提取主要试剂与仪器：

磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司)、RIPA裂解液+蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合(美国Pierce公司)、BCA蛋白定量试剂盒(中国北京康为世纪公司)、超低温冰箱(中国澳柯玛公司)。

1.1.1.4.免疫印迹分析主要试剂与仪器：

CD44(美国Bioworld公司)、OCT4(美国Santa cruz公司)、SALL4(美国Santa cruz公司)、Nanog(美国SAB公司)、SOX2(美国Milipore公司)、β-actin(美国CST公司)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和鼠IgG二抗(中国北京康为世纪公司)、12％SDS-PAGE电泳胶、聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司)、化学发光凝胶成像系统(英国AmershamPharmaciaBiotech公司)。

1.1.1.5.细胞核糖核酸提取、浓度测定及逆转录主要试剂与仪器：

磷酸盐缓冲液(实验室配制)、外泌体(实验室提取)、Trizol(美国Gibco公司)、逆转录试剂盒Vazyme(中国南京诺唯赞生物科技公司)、六孔板(美国Cellster公司)板、超低温冰箱(中国澳柯玛公司)、超净工作台(中国苏州净化厂)、超速冷冻离心机(美国BeckmanCoulter公司)。

1.1.1.6.荧光定量PCR主要试剂与仪器：

荧光定量PCR Mixture(中国南京诺唯赞生物科技公司)、β-actin(美国CST公司)、OCT4(美国Santa cruz公司)、SALL4(美国Santa cruz公司)、Nanog(美国SAB公司)、SOX2(美国Milipore公司)、荧光定量PCR仪(中国北京康为世纪公司)、定量八联管及盖子(美国Bio-Rad公司)。

1.1.2.对本发明实施例1具体实施步骤描述如下:

1.1.2.1.HucMSC的分离培养：按照文献中公开的的人HucMSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增MSC(Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cells isolated fromthe umbilical cord.Cell Biol Int.2008Jan；32(1):8-15)，选择增殖能力强，状态好的健康人MSC，生长面积覆盖80％后用无血清培养基培养48h收集培养上清液，2000g/10min离心除去细胞碎片后即为MSC上清(MSC-CM)，﹣70℃冷藏备用。

HFL的分离培养:购于中国科学院细胞库，保存于RPMI-1640中，添加10％胎牛血清(美国Gibco公司)于37℃的5％的二氧化碳中。

1.1.2.2.HucMSC和HFL分泌的上清中外泌体的分离纯化：将收集的MSC-CM/HFL-CM经差速离心弃去细胞碎片及细胞器后移至15ml规格的100KDa MWCO超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至5ml浓度为30％的蔗糖/D2O密度垫上，4℃条件下，100000g离心120min，收集底部5ml的缓冲垫(含exosome)用磷酸盐缓冲液稀释洗涤后，置入100000Da MWCO超滤离心管中洗涤，最后将收集的外泌体浓缩液定量，0.22μm滤膜过滤除菌，BCA法测定蛋白浓度，分装，于﹣70℃冷藏备用。

1.1.2.3.细胞蛋白提取：弃去细胞培养板孔中培养基，加入无菌磷酸盐缓冲液清洗3遍，将孔内残留培养液请洗干净。然后每孔中加入99μl RIPA裂解液及1μl蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合，细胞推铲快速刮取细胞置于1.5ml EP管内冰置。将EP管于涡旋振荡仪上振荡1min后冰置l0min，如此循环3次之后，离心速度为4℃12000g离心l0min。最后用移液器将EP管内上清移至新的EP管中，注意不要吸取EP管底部细胞沉淀。BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白加样缓冲液，100℃热水中煮l0min，使蛋白变性，-80℃保存备用。

1.1.2.4.免疫印迹测定蛋白浓度：配制12％SDS-PAGE电泳胶，将上述提取的exosome充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至聚偏二氟乙烯膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与CD44抗体(1:500)、OCT4(1:500)、SALL4(1:500)、Nanog(1:500)、SOX2(1:500)、β-actin(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween20洗膜3次后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和鼠IgG二抗(1:2000)37℃温育1h，TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测。结果如图1，图1中的A：聚丙烯酰胺凝胶电泳分析hucMSC与HFL细胞来源外泌体内分析标志物及Ruvbl-2的表达量，Ruvbl-2在hucMSC外泌体中高表达，符合质谱检测结果；图1中的D：聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Ruvbl-2在hucMSC及对照细胞HFL中的表达量，hucMSC中Ruvbl-2高表达。

1.1.2.5.细胞核糖核酸提取、浓度测定及逆转录:

1.1.2.5.1.细胞核糖核酸提取:1×10⁵个细胞种于六孔板，细胞贴壁过夜，加入外泌体处理48h，用于核糖核酸收取。首先在超净工作台中弃去孔中培养液，加入无菌磷酸盐缓冲液清洗3遍，将孔内残留培养液清除干净。接着每孔中加1ml Trizol，转移到EP管内，室温静置5min，使其充分裂解。然后EP管中加入200μl氯仿，上下剧烈振荡30s，使其充分混匀,静置15min。再上离心机，离心速度为4℃12000g离心15min，移液器吸取EP管内上层水相至新的EP管中，注意不要吸取中间界面。向转移出来的水相中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，静置5～l0min，之后上离心机,离心速度为4℃12000g离心l0min，弃去上清，底部沉淀物即为核糖核酸。加入1ml现配制的75％乙醇，用手指轻轻弹起沉淀，使其漂浮起来。上离心机，离心速度为4℃7400g离心5min，弃尽上清，用移液器小枪头将多余的乙醇全部吸去。最后将EP管开盖，置于超净工作台中将沉淀风干至半透明状，加入20μl～30μl的DEPC水溶解核糖核酸，4℃过夜。

1.1.2.5.2.核糖核酸浓度测定：

使用Nanodrop仪器，选择ND-1000软件，点击Nucleic Acids，选择RNA40。仪器开盖，加入1.5μl双蒸水清洗进行仪器初始化，用卷纸将加样孔擦拭干净，然后加入1.5μl双蒸水，点击“blank”调零，再擦掉多余的双蒸水，加入1.5μl核糖核酸样品，点击“measure”进行浓度测定。测定结束后，加入1.5μl双蒸水清洗，关掉软件，关闭仪器。

1.1.2.5.3.核糖核酸逆转录：

使用Vazyme逆转录试剂盒，根据说明书配制反应体系共20μl，其中10μl 2×RTMix，2μl Enzyme Mix，lμl Randomhexamers,1μl Oligo(dT)ls，lμg RNA模板，不含RNase水补足至20μl。反应体系混匀后分装至PCR管中，瞬离后再上PCR仪进行参数设定，设置反应条件为25℃l0min,50℃45min，85℃5min。反应完毕后，产物置于一20℃冰箱中备用。

1.1.2.6.荧光定量PCR：依据荧光定量PCR试剂盒配制PCR反应体系(总反应体系体积为20μl):10μl的2×Mixture，10μm上/下游引物各0.4μl，cDNA模板2μl，RNase-free水7.2μl。分装结束后加入2μl对应的cDNA到定量八联管中，盖上盖子瞬离心后上机检测。采用两步法进行PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃(退火+延伸)30s，循环40次；扩增结束后进入溶解曲线分析，总反应结束后4℃保存。根据反应的CT值，以β-actin作为对照，采用2^－△△CT进行计算相对表达量。结果见图1，图1中的B和C：琼脂糖凝胶电泳检测hucMSC及对照细胞HFL中Ruvbl-2表达，证明该基因在两株细胞中均存在并进一步用实时荧光定量PCR进行定量分析，发现Ruvbl-2基因在hucMSC中高表达。引物信息如下表1。

表1引物信息

实施例2

Ruvbl2对HucMSC增殖和分化的影响

1.1.1.实施例2所使用的主要材料和来源分别如下：

1.1.1.1.HucMSC中Ruvbl2的慢病毒敲减的建立，主要试剂与仪器：

含有Ruvbl2双链核糖核酸序列(美国Sigma公司)、脂质体2000(美国Invitrogen公司)、嘌呤霉素(美国Sigma公司)。

1.1.1.2.细菌的计数和菌落形成主要试剂与仪器：

细胞培养皿(美国Corning)，24孔板(美国Corning)。

1.1.1.3.细胞生长曲线主要试剂与仪器：

磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司)、CCK-8试剂盒(美国MCE公司)、酶标仪(美国Bio-Rad公司)、二氧化碳培养箱(美国Forma公司)。

1.1.2.对本发明实施例2具体实施步骤描述如下:

1.1.2.1.HucMSC中Ruvbl2的慢病毒敲减的建立：

构建sh-Ruvbl2慢病毒质粒，阴性对照为sh-GFP双链核糖核酸。Sh-Ruvbl2载体是由Tet-pLKO-puro与Ruvbl2双链核糖核酸寡核苷酸连接而成。sh-Ruvbl2双链核糖核酸寡核苷酸序列为：

SEQ ID No.5正向：

5'-ccggcgagaaagacacgaagcagatctcgagatctgcttcgtgtctttctcgtttttg-3'；

SEQ ID No.6反向：

5'-aattcaaaaacgagaaagacacgaagcagatctcgagatctgcttcgtgtctttctcg-3'。

对照组双链核糖核酸序列为：

SEQ ID No.7正向：

5'-ccgggcaagctgaccctgaagttcatctcgagatgaacttcagggtcacgttgctttttg-3'；

SEQ ID No.8反向：

5'-aattcaaaaagcaagctgaccctgaagttcatctcgagatgaacttcagggtcacgttgc-3'。

利用脂质体2000将人胚胎肾细胞293T细胞与PLKO-GFP双链核糖核酸或PLKO-Ruvbl2双链核糖核酸、PU1562和PU1563质粒共转染，获得重组慢病毒(图2中A)。转染后48h和72h收集含病毒的上清液。HucMSC与准备的慢病毒转导(sh-Ruvbl2慢病毒载体或sh-GFP慢病毒载体)和选择1μg/毫升的嘌呤霉素(表达载体)共15天。双链核糖核酸表达式是通过添加80μg/毫升的强力霉素诱导。通过实时定量逆转录聚合酶链反应(操作同1.1.2.6.)和免疫印迹(操作同1.1.2.4)检测Ruvbl2基因的表达效率(Shi et al.，2017)结果见图2和3，图2中的B:Ruvbl-2敲减质粒构建成功并进行鉴定后，构建慢病毒并转染hucMSC，实时荧光定量PCR检测敲减细胞和对照细胞中Ruvbl-2基因的表达量，结果显示Ruvbl-2经慢病毒敲减后mRNA表达量明显下调。图3聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析敲减细胞中干性蛋白的表达情况，结果显示hucMSC中Ruvbl-2经慢病毒敲减后，Ruvbl-2的蛋白表达明显下调，同时干性基因Sall-4,β-Catenin,CD44,OCT4,Nanog,Sox2等标志hucMSC干性的蛋白表达量也下降。

1.1.2.2.细胞的计数和菌落形成：

收集用sh-Ruvbl2慢病毒载体或sh-GFP慢病毒载体转导的细胞并计数(图4中A)。总共有5000个细胞被接种在24孔板上，1000个细胞被接种3.5厘米的细胞培养皿上。每组每3天统计24孔板细胞数，一式3份直到15天完成。细胞计数使用之前描述的Cui L等人描述的程序(Cui et al.，2012)。3.5cm细胞培养皿培养至第7天，4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，结果见图4中A：Ruvbl-2敲减组hucMSC的细胞形态由长梭形变成短梭形，，图4中的B：细胞克隆的形成数量明显少于对照组。

1.1.2.3.细胞生长曲线:将转染24小时后的细胞消化计数，在96孔板中配制100μl细胞悬液，并用磷酸盐缓冲液填充周边的空白孔，置于二氧化碳培养箱中培养24小时。第二日待细胞贴壁后去掉上清，每孔加入新鲜的营养液90μl和10μl的CCK-8试剂(注意不要产生气泡)，将培养板置于培养箱中孵育1-4h，期间每隔30min用酶标仪在450nm处检测一次吸光度值，结果见图4中的C：Ruvbl-2敲减组细胞的生长曲线相比于对照组明显减缓。

从以上实施例可以得出，Ruvbl-2的表达调控了hucMSC细胞的干性特征，低表达Ruvbl-2削弱了hucMSC增殖分化的能力，本发明揭示Ruvbl-2可能对改变hucMSC增殖分化能力具有重要的调节作用，为干细胞的基因编程及安全应用提供了相应依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宜兴市人民医院

<120> Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞增殖和/或分化中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggagatcc gtgatgtaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctgtga atggcgtgtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacctgtacg ccaacacagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcaggagga gcaatgatct 20

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggcgagaa agacacgaag cagatctcga gatctgcttc gtgtctttct cgtttttg 58

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aattcaaaaa cgagaaagac acgaagcaga tctcgagatc tgcttcgtgt ctttctcg 58

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgggcaagc tgaccctgaa gttcatctcg agatgaactt cagggtcacg ttgctttttg 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattcaaaaa gcaagctgac cctgaagttc atctcgagat gaacttcagg gtcacgttgc 60

Claims

1.Ruvbl2在调控人脐带间质干细胞分化能力中的应用，其特征在于，敲除编码Ruvbl2的基因，人脐带间质干细胞的分化能力减弱。