CN108324946B - miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用 - Google Patents

miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108324946B
CN108324946B CN201710049442.9A CN201710049442A CN108324946B CN 108324946 B CN108324946 B CN 108324946B CN 201710049442 A CN201710049442 A CN 201710049442A CN 108324946 B CN108324946 B CN 108324946B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microrna
cells
myocardial
mirna301
cluster
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710049442.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108324946A (zh
Inventor
俞作仁
邓生琼
甄丽晓
赵倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai East Hospital
Original Assignee
Shanghai East Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai East Hospital filed Critical Shanghai East Hospital
Priority to CN201710049442.9A priority Critical patent/CN108324946B/zh
Publication of CN108324946A publication Critical patent/CN108324946A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108324946B publication Critical patent/CN108324946B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用。具体地，miRNA708、和/或301簇的微小RNA能够(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。

Description

miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用
技术领域
本发明属于心脏治疗领域。具体地，miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用。
背景技术
哺乳动物的心脏发育，在出生前心肌细胞经历了由快速增生过渡到肥厚的转变。出生后不久，心肌细胞的细胞周期终止，变为所谓的终末分化细胞，所以一直以来心脏被认为是终末分化器官。哺乳动物成体心脏心肌细胞的增殖处于停滞状态且成年心肌干细胞也处于静息期，故在心脏发生病理损伤后，心肌细胞几乎无法再生，功能很难恢复。新的证据表明，在正常老化过程中心肌细胞仍有极低的逆转率，并且成体心脏具备一定的再生潜力，特别是某些病理情况下，或基因调控下，能激活处于静息状态的心肌干细胞或心肌祖细胞，或者重新启动部分心肌细胞细胞周期，再生新的心肌细胞。
研究报道已经证实，侧群(SP)细胞,c-kit(+)细胞，Sca-1(+)细胞，Isl1(+)细胞均可作为心肌干细胞或者心脏前体细胞，它们具有共同的细胞干性特征，包括自我更新，克隆形成和分化多潜能性。这些心肌干细胞在体外诱导下，能够分化为心脏主要细胞类型，包括心肌细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。这些心肌干细胞在体内移植到受损心脏，能够有效提高心脏收缩功能，减少心肌梗死面积。
传统的药物治疗、介入治疗和搭桥手术等方法虽能够暂时改善心肌梗死和心衰患者的预后，但无法挽救已经死亡的心肌细胞、无法逆转心室重构及后续的心力衰竭。尽管心脏移植被视为治疗终末期心力衰竭的有效手段，但由于供体来源的局限，限制了其临床应用和推广。所有的这些药物或外科手术方法只具有有限的心脏功能恢复和心脏再生的作用。尽管干细胞研究为心脏再生提供了一个新的、有前途的方法，但临床试验移植外源性的干细胞到受损心脏，在心脏保留的存留的细胞数量、如何诱导移植的干细胞在受者体内分化为心肌细胞，及新分化的心肌细胞和内源性心肌细胞功能性整合等问题，都是现实的巨大挑战，这些均妨碍了基于干细胞治疗的发展。
微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA分子，调节多种生物学过程(比如包括细胞命运决定、细胞周期进展、干细胞自我更新和分化等)及疾病发生和发展的调控(比如癌症、心血管疾病等)。
因此本领域迫切需要为心肌受损患者找到新的潜在的临床治疗靶点。
发明内容
本发明提供了为找到新的潜在的临床治疗靶点，用来改善心肌受损患者的心脏功能。
本发明第一方面提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：
(a)miRNA708簇的微小RNA，
其中，所述miRNA708簇的微小RNA选自下组：
(a1)miRNA708类微小RNA，所述的miRNA708类微小RNA选自下组G1:miRNA708；
(a2)经修饰的miRNA708类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA708类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)miRNA301簇的微小RNA，
其中，所述miRNA301簇的微小RNA选自下组：
(b1)miRNA301类微小RNA，所述的miRNA301类微小RNA选自下组G1:miRNA301a；
(b2)经修饰的miRNA301类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA301类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(c)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA；和/或(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；
(d)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(c)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；和/或(b)中所述的微小RNA；
(e)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA、(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；或(c)中所述的前体miRNA、或(d)中所述的多核苷酸；
(f)(a)、(b)中所述的微小RNA的激动剂；
其中，所述的活性成分用于：
(i)制备促进心肌功能的药物组合物；和/或
(ii)制备治疗缺血性心肌病的药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物还用于
(iii)促进心肌细胞增殖；
(iv)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；
(v)降低心肌细胞凋亡和死亡；
(vi)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或
(vii)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。
在另一优选例中，所述药物组合物还用于改善心肌收缩功能。
在另一优选例中，所述的miRNA708簇的微小RNA为miRNA708，其序列如SEQ IDNO.:1所示。
在另一优选例中，所述miRNA301簇的微小RNA为miRNA301a，其序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述miRNA708簇的微小RNA、miRNA301簇的微小RNA来源于哺乳动物，优选地，来源于人、大鼠、或小鼠。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他的促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧应急能力，诱导心肌干细胞增殖及分化，降低心肌细胞凋亡和死亡，保护低氧刺激对心肌细胞损伤的药物。
在另一优选例中，所述其他的促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧应急能力，降低心肌细胞凋亡和死亡，保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的药物选自下组：复方丹参制剂、银杏叶制剂、洋地黄制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述miRNA708簇的微小RNA、和/或miRNA301簇的微小RNA包括分离的或人工合成的。
在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。
在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或
所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或
所述的核酸修饰包括“TT”修饰。
在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：
(X)n-(Y)m
式I，
在式I中，
各X为(a)中所述的微小RNA；
各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；
Y连接于X的左侧、右侧或中间；
n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；
m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；
各“-”表示接头、化学键、或共价键。
在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。
在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。
在另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II，
式II中，
Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
Figure BDA0001215198040000041
式III，
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中，(e)中所述miRNA708、和/或301簇的微小RNA的激动剂选自下组：促进miRNA708、和/或301簇的微小RNA表达的物质、提高miRNA708、和/或301簇的微小RNA活性的物质、或其组合。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
(i)第一活性成分，所述的活性成分选自下组：
(a)miRNA708簇的微小RNA，
其中，所述miRNA708簇的微小RNA选自下组：
(a1)miRNA708类微小RNA，所述的miRNA708类微小RNA选自下组G1:miRNA708；
(a2)经修饰的miRNA708类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA708类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)miRNA301簇的微小RNA，
其中，所述miRNA301簇的微小RNA选自下组：
(b1)miRNA301类微小RNA，所述的miRNA301类微小RNA选自下组G1:miRNA301a；
(a2)经修饰的miRNA301类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA301类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(c)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA；和/或(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；
(d)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(c)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；和/或(b)中所述的微小RNA；
(e)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA、(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；或(c)中所述的前体miRNA、或(d)中所述的多核苷酸；
(f)(a)、(b)中所述的微小RNA的激动剂；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分为其他的促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧应急能力，降低心肌细胞凋亡和死亡，保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的药物；和
(iii)药学上可接受的载体。
本发明第三方面提供了一种筛选(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)将加入候选化合物的细胞培养体系作为实验组；将不加入候选化合物的细胞培养体系作为对照组，其中，所述的细胞为心肌细胞；和
(b)测试实验组和对照组中心肌细胞内miRNA708、和/或301簇的表达活性；
其中，当实验组中心肌细胞内miRNA708、和/或301簇的表达活性E1显著高于对照组E2，则表明该候选化合物为(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的物质。
在另一优选例中，所述心肌细胞选自下组：原代心肌细胞、心肌细胞株、心肌干细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述心肌细胞来自人或非人哺乳动物。
在另优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。
在另一优选例中，步骤(b)中还包括：
进一步测试所获得化合物对实验组或对照组中心肌功能的促进作用。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。
本发明第四方面提供了一种体外非治疗性的(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；和/或(iv)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的方法，包括步骤：
向细胞培养体系中加入miRNA708、和/或301簇的微小RNA，从而(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。
本发明第五方面提供了一种(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的方法，包括步骤：
向需要的对象施用本发明第二方面所述的药物组合物，从而(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。
在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、或大鼠。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了基因筛查发现在新生鼠心肌细胞高表达的两个miRNA分子：miR-708和miR-301a。
图2显示了体外细胞实验证明，miR-708和miR-301a过表达可以促进心肌细胞H9C2的增殖能力。
图3显示了体外细胞实验证明，miR-708和miR-301a过表达可以促进大鼠新生鼠原代心肌细胞的增殖能力。NC：阴性对照。
图4显示了体外细胞实验证明，miR-708和miR-301a过表达可以提高心肌细胞H9C2的KI67阳性率。KI67是细胞增殖的生物标志物,其阳性率代表了细胞的增殖能力。
图5显示了体外利用100uM ISO处理H9C2细胞诱导细胞凋亡，发现miR-708和miR-301a过表达可以提高H9C2对抗ISO刺激的应激能力，细胞凋亡比例和死亡比例均显著低于对照组。
图6显示了利用25mg/kg的异丙肾上腺素ISO连续处理实验小鼠6天，造成心衰小鼠动物模型。发现给药第三天开始，直到第21天，实验小鼠度表现为心脏功能降低，EF值降低。第28天心脏功能逐步恢复。
图7显示了A：利用25mg/kg的异丙肾上腺素ISO连续处理实验小鼠6天，造成心衰小鼠动物模型。同时给予miR-708及对照。B：心脏超声检查发现，ISO处理组小鼠心脏功能受损，同时给予miR-708，可有效保护心肌细胞免于受损或者促进恢复。C：ISO降低了小鼠心脏EF值，miR-708可以促进EF值的恢复。D：ISO降低了小鼠心脏FS值，miR-708可以促进FS值的恢复。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外的发现，miRNA708、301簇的微小RNA能够(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。在此基础上，发明人完成了本发明。
miRNA301、708簇
miRNA301及708簇微小RNA是只有23个碱基长度的单链RNA，在哺乳动物序列保守。已有文献报道表明二者均与癌症发生和调控有关，miRNA301还与免疫功能相关。但miRNA301、708簇微小RNA与心脏发育、心血管疾病发生发展的调控关系尚未知。
代表性的miRNA301、708簇(miRNA301a和miRNA708)的具体序列如下：
5’-3’ SEQ ID NO.：
miRNA301、708簇 miRNA708 aaggagcuuacaaucuagcuggg 1
miRNA301a cagugcaauaguauugucaaagc 2
miRNA及其前体
微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。本发明提供了一类涉及促进心肌功能、治疗缺血性心肌病的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA是指：(a)miRNA708簇的微小RNA，其中，所述miRNA708簇的微小RNA选自下组：(a1)miRNA708类微小RNA，所述的miRNA708类微小RNA选自下组G1:miRNA708；(a2)经修饰的miRNA708类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA708类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；(b)miRNA301簇的微小RNA，其中，所述miRNA301簇的微小RNA选自下组：(b1)miRNA301类微小RNA，所述的miRNA301类微小RNA选自下组G1:miRNA301a；
(b2)经修饰的miRNA301类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA301类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的miRNA301、708簇的序列完全一致。所述的“功能与miRNA301、708簇相同或基本相同”是指保留了miRNA302-367簇的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的促进心肌功能、治疗缺血性心肌病的功能。
本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA301、708簇进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-27b的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：
Figure BDA0001215198040000111
式III
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“活性成分”指的是可用于本发明的miRNA301、708簇、miRNA301、708簇衍生物或其前体序列、或含有其的表达载体。优选地，所述的活性成分选自下组：
(a)miRNA708簇的微小RNA，
其中，所述miRNA708簇的微小RNA选自下组：
(a1)miRNA708类微小RNA，所述的miRNA708类微小RNA选自下组G1:miRNA708；
(a2)经修饰的miRNA708类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA708类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)miRNA301簇的微小RNA，
其中，所述miRNA301簇的微小RNA选自下组：
(b1)miRNA301类微小RNA，所述的miRNA301类微小RNA选自下组G1:miRNA301a；
(a2)经修饰的miRNA301类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA301类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(c)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA；和/或(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；
(d)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(c)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；和/或(b)中所述的微小RNA；
(e)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA708簇的微小RNA、(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；或(c)中所述的前体miRNA、或(d)中所述的多核苷酸；
(f)(a)、(b)中所述的微小RNA的激动剂；
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约1-50g/g动物体重(较佳的5-10g/g动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中miRNA301、708簇可被用于制备促进心肌功能、治疗缺血性心肌病的药物组合物。例如，miRNA301、708簇的衍生物或其激动剂可被用于制备一种药物组合物，所述组合物用于促进心肌功能、治疗缺血性心肌病，此外，所述组合物还可以用于(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤。此外，本发明药物组合物中还可以含有其他的促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧应急能力，提高心肌干细胞活力，诱导心肌干细胞增殖能力及分化能力，降低心肌细胞凋亡和死亡，保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的药物。例如，优选的其他的促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧应急能力，降低心肌细胞凋亡和死亡，保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的药物包括复方丹参制剂、银杏叶制剂、洋地黄制剂等等
本发明的优点主要包括：
1.miR-708和301a在活跃状态的心肌细胞，表达量高。
2.miR-708和301a可有效促进心肌细胞的增殖能力。
3.miR-708和301a可增强心肌细胞的抗缺氧损伤能力，提高心肌细胞应激能力。
4.miR-708和301a有激活处于静息状态的心肌干细胞，以及促进心肌干细胞增殖和分化的潜力。
5.miR-708和301a有激活处于静息状态的心肌细胞，促使心肌细胞重新进入细胞周期的潜力。
6.miR-708和301a可有效干预心肌损伤后心室重塑，促进受损心脏心功能的恢复。
7.miR-708和301a可作为潜在的基因药物或者靶点，治疗缺血性心肌病以及各类原因造成的心力衰竭。
7.miR-708和301a可作为潜在的基因药物或者靶点，预防心肌纤维化，促进心梗等疾病之后的心功能恢复。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
在本发明中，如果没有特殊说明，实施例中所用的材料均为市售产品。
实验方法
1心肌细胞分离
①新生小鼠或者大鼠(d3)(购自上海杰思婕实验动物有限公司)用剪刀剪开胸腔，迅速取出心脏，放入盛有冰冷PBS的100mm培养皿中。在EP管中，将心脏剪成1mm3小块，PBS洗3次。
②将组织块倒入50ml离心管，加入2～3倍消化液，充分吹匀，37℃水浴中轻摇8分钟。去除上清，重复步骤3，8～9次直至组织块完全消化。
③收集上清于收集管中，1200rpm离心3min。去上清，培养基重悬，滤网过滤未消化的组织块。
④将过滤后的细胞放入37℃培养箱中2h,差速贴壁法去除成纤维细胞。同时将要使用的孔板/皿用1％gelatin coating,放置37℃培养箱。
⑤从37℃取出coating的培养皿/24孔板，吸去gelatin。将未贴壁的细胞转移至离心管中，1200rpm离心3～5min，加培养基(含10％FBS和0.1mMBrdu)，种于培养皿/孔板中。培养后48h，可用心肌细胞做实验。
2 c-kit(+)心肌干细胞的分离
①500μl上述分离的原代心肌细胞(单细胞悬液置于15ml离心管
②加入10μl c-kit-PE(BD),4℃避光30分钟
③加入1ml PBS,重悬细胞后，1200rpm，离心5分钟。
④去掉上清，加入1mlPBS,上流式细胞仪进行分选。
⑤分选出来的细胞按照心肌干细胞培养条件继续培养进行后续实验。
3 miRNA定量检测
利用市售miRNA荧光定量PCR试剂盒，检测miRNA表达。
检测用上游引物序列：miRNA708：5’gagcuuacaaucuagcug 3’(SEQ ID NO.:1)；
检测用上游引物序列：miRNA301a：5’ccagtgcaatagtattg 3’(SEQ ID NO.:2)。
4 miR-mimic和对照转染
①对数期生长的细胞以1×105铺于6孔板，培养24小时后进行转染，转染时细胞融合度为50～60％。
②以单个培养孔为例：用100μl Opti-MEM稀释60pmol miRNA708 mimic或者对照，颠倒混匀数次，室温下静置5min。
③稀释混合液中加入12μl HiPerFect转染试剂轻轻颠倒混匀，室温静置15min。
④转染复合物滴加至6孔培养板中，100μl/孔，前后上下轻摇混合均匀。
⑤将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，转染4～6h后可更换新鲜培养基。
⑥转染24～48小时后用于后续实验。
5细胞增殖能力检测(MTT)
①生长状MTT态良好的H9C2细胞(购自ATCC)转染miR-708/miR-NC 24小时后，消化细胞，并计数。
②调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞密度为3000个细胞/孔，共铺3个96孔板(0h、24h、48h)。
③常规细胞培养贴壁后测定0小时细胞活性，每孔中加入10μl 0.5％MTT溶液(5mg/ml)，空白对照组不加MTT。
④5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育3～4h，倒置显微镜观察。
⑤终止培养，小心吸弃孔内培养液。
⑥每孔加入80μl盐酸-异丙醇，轻拍孔板，使其溶解，避光放置于摇床上，室温240speed/min摇荡10min，使结晶物充分溶解。
⑦设置好调零孔，对照孔后在酶联免疫检测仪OD570nm波长处测量各孔吸光值。
6免疫荧光检测ki67的表达
细胞爬片
①清洗玻片，高压灭菌，烘干待用
②取出灭菌的玻片，置6孔板中，紫外灭菌15min
③在6孔细胞培养板上每孔的盖玻片加入500μl 1％明胶(galetin)，孵育玻片，37℃，孵育20min，吸走galetin，晾干备用。
④消化细胞，取5×104个细胞接种于明胶包被的玻片上。
固定细胞
①吸去培养基，37℃PBS清洗2次，每次2分钟。
②加入500μl4％PFA，固定15min。移除4％PFA，PBS冲洗2遍。
免疫荧光染色。
①取出盖玻片，置于载玻片上，细胞面朝上，免疫组化笔画框，圈内进行封闭，孵育。
②PBST(0.5％Tween in PBS)清洗3次，移除PBST，用3％BSA(PBST稀释30％BSA)室温封闭30min。
③PBST清洗3次，加入稀释好的一抗工作液抗ki67(1：500；abcam)，4度过夜。
④以下步骤均在暗盒内操作，PBST清洗3次，用封闭液将所需的二抗1:500的比例稀释，分别滴加适量到盖玻片细胞上，全程避光操作，室温孵育1h。
⑤PBST清洗3次，加入DAPI(1：1000)，室温孵育15分钟,DA PI染色结束，0.5％PBST洗涤3次，每次3min。
⑥封片，取洁净的载玻片，滴加少量封片剂，将含有细胞的一面朝下，注意不要产生气泡，用荧光显微镜进行图像采集。
7细胞凋亡
①常规PBS清洗收集各组细胞，使用胰蛋白酶消化细胞，制成5×105～1×106个/ml细胞悬液。
②细胞悬液离心后弃除上清，加入冷PBS混匀细胞悬液离心后弃除上清液，重复两次。
③将细胞重悬于200μl Binding buffer缓冲液。
④加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀之后避光室温静置15分钟。
⑤一小时内应用流式细胞仪测定细胞凋亡率，上机前加300μl Binding buffer，检测区分活细胞和坏死细胞，凋亡早中晚期细胞。
8 ISO诱导心衰小鼠模型的建立
C57小鼠(购自斯莱克实验动物中心)每日接受25mg/kg的ISO(异丙肾上腺素)腹腔注射，连续注射6天，对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。分别于注射后1,3,7，14,21,28天进行心脏超声评估心脏功能。
9 NLE-miR-708 mimic包装及尾静脉注射
①根据需要量将试剂盒提供的Sterile RNase-Free 10×PBS加入SterileRNase-Free Water稀释为1×溶液。
②将100μg miRNA mimic加入MaxSuppresorTM In Vivo小瓶中，小剂量注射使用不超过100μl的体积，miRNA的使用浓度为1mg/ml。
③根据下表总体用量，加入适量的PBS与灭菌水，制成miR-mimic脂质体乳剂。
④将脂质体乳剂充分混匀，室温静置15分钟。
⑥水浴超声5分钟，将脂质体乳剂从分充分打散。
⑦将制好的miR-mimic脂质体乳剂按照设计剂量以每只10mg剂量通过尾静脉注射入小鼠体内。连续注射6天。
10小鼠超声心动图检测
使用高分辨率的Vevo 770影像系统平台进行超声心动图检测。小鼠称重后,按0.02ml/g剂量腹腔注射2.5％三溴乙醇麻醉。待小鼠麻醉后,用脱毛剂将小鼠胸前区毛脱去,并将小鼠腹部向上放置于恒温鼠板(40°0,四肢固定于四个电极上,监测心电图、呼吸和心率。使用30MHz探头,做M-Mode超声检测,分别测定舒张期左室前壁厚度(LVAW；d)；收缩末期左室前壁厚度(LVAW；s)；舒张末期左室后壁厚度(LVPW；d)；收缩末期左室后壁厚度(LVPW；s)；舒张末期左室内径(LVID；d)；收缩末期左室内径aVID；s)；左室质量指数(LVMass/BW)；左室射血分数(EF％)；短轴缩短率(FS％)。每只小鼠在每个切面上检测2次,每次连续读取5个心动周期的数值,取平均值。
实验结果
通过比较心肌再生能力的新生鼠心肌细胞以及终末分化的成年鼠心肌细胞，比较二者的miRNA表达谱，筛选到在新生鼠心肌细胞特异高表达的两个miRNA基因，miR-708和miR-301a(图1).
后续功能学实验证明，在体外这两个miRNA分子能够促进胚胎心脏来源的心肌细胞系H9C2的增殖能力(图2).
利用新生大鼠心脏分离的原代心肌细胞，体外培养时，过表达miR-708及miR-301a,能够有效促进新生鼠心肌细胞的增殖能力(图3)。
利用细胞增殖生物标志物KI67染色实验，证明H9C2细胞体外培养时，过表达miR-708及miR-301a,能够有效促进KI67阳性率，进一步证实了这两个miRNA分子促进心肌细胞增殖的功能(图4)。
利用异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)刺激H9C2心肌细胞，造成心肌细胞低氧损伤，通过Annexin V实验量化处于凋亡和死亡状态的细胞比例，发现这两个miRNA分子能够促进H9C2细胞的抗缺氧应激能力，降低细胞的凋亡和死亡，有效保护低氧刺激对心肌细胞的损伤(图5)。
利用25mg/kg异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)连续六天给药处理实验小鼠，造成心衰模型动物，心脏超声检查证明模型的成功制备(图6)。
上述心衰小鼠模型中，同时给予脂质体包裹的miR-708，心脏超声实验证明，miR-708能够可有效保护心肌细胞免于受损，改善试验小鼠的心肌收缩功能(图7)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市东方医院
<120> miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用
<130> P2017-0018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggagcuua caaucuagcu ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagugcaaua guauugucaa agc 23

Claims (2)

1.一种活性成分的用途，其特征在于，所述的活性成分选自下组：
(b)miRNA301簇的微小RNA，
其中，所述miRNA301簇的微小RNA选自下组：
(b1)miRNA301类微小RNA，所述的miRNA301类微小RNA选自下组G1:miRNA301a，其序列如SEQ ID NO.:2所示；
(e)表达载体，所述表达载体含有(b)中所述的miRNA301簇的微小RNA；
其中，所述的活性成分制备治疗缺血性心肌病的药物组合物。
2.一种体外非治疗性的(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；和/或(iv)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤的方法，其特征在于，包括步骤：
向细胞培养体系中加入miRNA301簇的微小RNA，从而(i)促进心肌细胞增殖；(ii)提高心肌细胞抗缺氧应急能力；(iii)降低心肌细胞凋亡和死亡；(iv)诱导心肌干细胞增殖及分化；和/或(v)保护低氧刺激对心肌细胞的损伤；
其中所述的miRNA301簇的微小RNA选自下组G1：miRNA301a，其序列如SEQ ID NO.:2所示。
CN201710049442.9A 2017-01-20 2017-01-20 miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用 Active CN108324946B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710049442.9A CN108324946B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710049442.9A CN108324946B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108324946A CN108324946A (zh) 2018-07-27
CN108324946B true CN108324946B (zh) 2022-02-18

Family

ID=62922792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710049442.9A Active CN108324946B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108324946B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102083980A (zh) * 2008-02-21 2011-06-01 得克萨斯系统大学董事会 调节平滑肌增殖和分化的微小rna及其用途
CN104027818A (zh) * 2005-12-12 2014-09-10 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 调节肌细胞增殖和分化的microrna

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104027818A (zh) * 2005-12-12 2014-09-10 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 调节肌细胞增殖和分化的microrna
CN102083980A (zh) * 2008-02-21 2011-06-01 得克萨斯系统大学董事会 调节平滑肌增殖和分化的微小rna及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"MiR-301a promotes embryonic stem cell differentiation to cardiomyocytes";Li-Xiao Zhen等;《World J Stem Cells》;20191226;第11卷(第12期);第1130-1141页 *
"Neonatal Heart-Enriched miR-708 Promotes Differentiation of Cardiac Progenitor Cells in Rats";Shengqiong Deng等;《Int. J. Mol. Sci.》;20161231;第17卷;参见摘要、图1、图2、图3、第880页倒数第1-2段、第881页第3段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108324946A (zh) 2018-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sánchez-Sánchez et al. miR-4732-3p in extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells is cardioprotective during myocardial ischemia
Yang et al. Ablation of lncRNA Miat attenuates pathological hypertrophy and heart failure
ES2644574T3 (es) MicroARN para la regeneración cardíaca mediante la inducción de proliferación de miocitos cardíacos
Valkov et al. MicroRNA-1-mediated inhibition of cardiac fibroblast proliferation through targeting cyclin D2 and CDK6
CN110177578A (zh) modRNA的细胞特异性表达
CN105209617B (zh) 微囊泡及其制造方法
CN104011208A (zh) 作为治疗靶的miRNA-212/132家族
CN108486060B (zh) 一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用
CN103849601B (zh) 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用
Tafaleng et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha 2 messenger RNA reprograms liver‐enriched transcription factors and functional proteins in end‐stage cirrhotic human hepatocytes
CN110384801B (zh) miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用
CN110917357B (zh) 人gsdmb基因的用途及相关产品
CN111110691A (zh) 人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用
CN108324946B (zh) miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用
CN104995300B (zh) Rna活性和血管通透性的调节
CN111850107A (zh) microRNA-200簇微小RNA在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的应用
CN107913284B (zh) miRNA302-367簇的微小RNA在靶向抑制血管新生和肿瘤生长的应用
US10881683B2 (en) Nucleic acid molecule
Song et al. Upregulation of PTPN1 aggravates endotoxemia-induced cardiac dysfunction through inhibiting mitophagy
CN113171459A (zh) Fundc1在制备防治血管、肿瘤疾病药物中的用途
CN108403711B (zh) 一种用于检测和治疗炎性肠病的microRNA
CN111686124A (zh) miR-486-3p在制备治疗SAH导致的神经炎症产品中的应用
Tai et al. CREG improves cardiac function by regulating cardiomyocytes’ autophagy in diabetic myocardial infarction rats.
CN110938691A (zh) 人dus4l基因的用途及相关产品
CN113713107B (zh) miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant