CN111110691A

CN111110691A - 人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用

Info

Publication number: CN111110691A
Application number: CN202010135579.8A
Authority: CN
Inventors: 张伟丽; 王淑婷; 陈宇; 杨淑均; 陈禹同
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明公开了人参皂苷Rb2(Ginsenoside Rb2)在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用以及提供一种预防和/或治疗与血管细胞功能障碍相关的动脉粥样硬化的药物组合物。进一步，发明人还公开了一种microRNA‑216a(miR‑216a)抑制剂，以及其在动脉粥样硬化中的应用。本发明阐明了人参皂苷Rb2可通过靶向结合miR‑216a，延缓其介导的血管内皮细胞和巨噬细胞衰老，减轻巨噬细胞的脂质蓄积和炎症反应，证实人参皂苷Rb2对miR‑216a介导的血管细胞功能障碍有改善作用，可用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物开发，为传统中草药治疗动脉粥样硬化疾病提供重要依据。

Description

人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医药技术领域，具体涉及人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化是多种心血管疾病的重要病理基础，动脉粥样硬化斑块破裂是心肌梗死、脑卒中等发病和死亡的主要原因。血管内皮细胞衰老及功能障碍促使其分泌粘附因子及趋化因子，招募外周血循环中的单核细胞浸润至血管内膜下并促进其分化为巨噬细胞，激活后的巨噬细胞通过分泌炎症因子等机制调控动脉粥样硬化的发生和发展。巨噬细胞具有表型异质性和可塑性，主要分为两种类型：M1促炎亚型和M2型抗炎亚型。M1型巨噬细胞在斑块中大量存在，通过分泌单核细胞趋化因子(monocytechemotacticprotein1，MCP1)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNFα)、白介素(interleukin，IL)1β(IL1β)和IL6等促进动脉粥样硬化进展；反之，M2型巨噬细胞可以通过分泌抗炎因子IL10发挥抑制斑块进展的作用。巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白后分化为泡沫细胞是形成动脉粥样硬化易损斑块的关键步骤，衰老巨噬细胞促进炎症因子和基质金属蛋白酶局部高表达是诱导动脉粥样硬化斑块破裂的重要因素。因此抑制内皮细胞和单核-巨噬细胞的衰老和炎症反应，减轻巨噬细胞的脂质吞噬，是治疗动脉粥样硬化疾病的重要途径。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的单链非编码分子，可通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区(Untranslatedregion，UTR)来调控生物体内的基因表达和功能。microRNA-216a(miR-216a)位于人类2号染色体非编码基因DA73的第二个内含子上，在前体miR-216a加工过程中，miR-216a-3p降解，生成成熟体miR-216a-5p，在人、小鼠、大鼠、斑马鱼等物种间保守表达。发明人前期研究发现，miR-216a在衰老的血管内皮细胞和巨噬细胞中高表达，通过作用于Smad3/NF-κB信号通路，激活细胞炎症反应，并促进巨噬细胞的脂质吞噬能力，从而增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性；且血浆miR-216a水平在具有动脉粥样硬化易损斑块的人群中特异性高表达(J Cell Mol Med.2018,22(5):2739-2749；BBA-MOL BASIS DIS.2019,1865(7):1772-1781.)。这些工作提示miR-216a可能作为抗动脉粥样硬化的潜在治疗靶点，但目前尚无以miR-216a为靶点干预动脉粥样硬化进程的药物开发。

目前临床上已有基于miRNAs的药物开发，多种miRNAs的模拟物和抑制剂开发药物已进入到临床实验阶段，如通过靶向抑制miR-122促进丙型肝炎基因组的降解来治疗丙型肝炎病毒感染患者的锁核酸Miravirsen药物；通过miR-34a抑制多种致癌途径和刺激肿瘤免疫反应来治疗癌症的脂质纳米颗粒MRX34药物等。但目前miRNAs抑制剂和模拟物的药物治疗还存在如药物合成和治疗方式不便、脱靶效应等诸多挑战，化学小分子药物靶向调控miRNAs进行疾病治疗可有效克服上述问题。

人参皂苷Rb2(GinsenosideRb2)是从人参根部提取出的一种固醇类化合物，是人参中的主要活性成分。研究发现人参皂苷Rb2在小鼠胰岛素敏感性、成骨细胞分化和肿瘤进展中发挥重要调控作用，影响细胞的代谢、自噬及炎症反应。人参皂苷Rb2在动脉粥样硬化中的作用尚无报道。发明人根据miR-216a的序列和结构特征，通过生物信息学手段分析发现人参皂苷Rb2可能与miR-216a有高度亲和力。因此，本发明阐明了人参皂苷Rb2以miR-216a为作用靶点，对血管内皮细胞和巨噬细胞衰老、炎症反应以及巨噬细胞脂质吞噬能力的影响，明确了人参皂苷Rb2在改善动脉粥样硬化相关的血管功能障碍中的应用，期望找到预防和/或治疗动脉粥样硬化的新手段。

发明内容

本发明的目的之一在于针对解决上述技术问题，阐明人参皂苷Rb2通过靶向结合miR-216a分子对血管内皮细胞和/或巨噬细胞功能障碍相关的动脉粥样硬化疾病的影响，为治疗血管功能障碍相关动脉粥样硬化提供一种新途径。

本发明的目的之二在于提供人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化相关的血管功能障碍(血管内皮细胞衰老和巨噬细胞衰老、炎症反应及脂质蓄积)的产品中的应用以及提供一种治疗动脉粥样硬化的药物组合物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了人参皂苷Rb2可通过靶向结合miR-216a，延缓其介导的血管内皮细胞和巨噬细胞衰老、减轻巨噬细胞的脂质蓄积和炎症反应，证实人参皂苷Rb2可抑制血管内皮细胞和巨噬细胞内的miR-216a表达水平，并对miR-216a介导的血管细胞功能障碍有改善作用，可用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物开发，为传统中草药治疗动脉粥样硬化疾病提供重要依据。

首先，本发明提供了人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

优选的，所述人参皂苷Rb2与miR-216a特异性结合，可竞争性解除miR-216a对靶基因Smad3的抑制作用。

优选的，所述人参皂苷Rb2抑制miR-216a活性和/或表达。

在本发明中，人参皂苷Rb2以miR-216a为作用靶点，抑制miR-216a介导的内皮细胞衰老以及单核细胞-内皮细胞之间的粘附能力；并抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老、炎症反应和巨噬细胞脂质蓄积作用，从而改善动脉粥样硬化相关的血管功能障碍。

本发明所述的人参皂苷Rb2为人参提取物，所述人参皂苷Rb2分子式为：C53H90O22。

进一步地，本发明提供了人参皂苷Rb2在如下任一产品中的应用：

(a1)在制备抑制血管内皮衰老以及单核细胞-内皮细胞之间的粘附作用；

(a2)在制备抑制巨噬细胞端粒酶激活和衰老；

(a3)在制备抑制细胞中miR-216a的表达并促进下游Smad3和IκBα抗炎蛋白表达，以及抑制炎症反应；

(a4)在制备抑制巨噬细胞脂质蓄积作用。

本发明所述参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞端粒酶激活及衰老相关基因p21和p16的表达，减轻巨噬细胞的衰老状态，通过上调miR-216a靶基因Smad3及炎症抑制因子NF-κB抑制剂α(NF-κBinhibitorα，IκBα)的表达，继而降低炎症因子的表达水平。

优选的，所述人参皂苷Rb2抑制巨噬细胞脂质蓄积作用是通过抑制miR-216a介导的巨噬细胞脂质吞噬作用，抑制巨噬细胞分化为泡沫细胞，同时促进胆固醇流出，从而减轻巨噬细胞内的脂质蓄积水平。

进一步地，本发明还提供了一种预防和/或治疗与血管细胞功能障碍相关的动脉粥样硬化的药物组合物，人参皂苷Rb2作为所述药物组合物的单一活性成分或与其他miR-216a抑制剂共同作为活性成分。

优选的，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体。

优选的，所述药学可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

优选的，所述药物组合物可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液或贴剂等。

优选的，所述的药物组合物可以通过口服、注射、喷雾吸入或经胃肠道等途径进行给药。

本发明的药物组合物给药的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。

优选的，有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：人参皂苷Rb2的药代动力学参数、受治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。

更进一步地，本发明提供人参皂苷Rb2在制备miR-216a抑制剂中的应用。

进而，本发明提供了一种miR-216a抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括治疗有效量的人参皂苷Rb2。

再进一步，本发明提供所述抑制剂在制备预防和/或治疗miR-216a过表达的疾病的产品中的应用。

优选的，所述miR-216a过表达的疾病包括动脉粥样硬化疾病。

有益效果

本发明公开了人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用，以及提供预防和/或治疗动脉粥样硬化相关的血管内皮细胞衰老及巨噬细胞功能障碍产品中的应用。进一步，本发明提供了人参皂苷Rb2在制备miR-216a抑制剂中的应用。

本发明阐明了人参皂苷Rb2可通过靶向结合miR-216a，延缓其介导的血管内皮细胞和巨噬细胞衰老，减轻巨噬细胞的脂质蓄积和炎症反应，证实人参皂苷Rb2对miR-216a介导的血管细胞功能障碍有改善作用，因此，可用于预防和/或治疗血管功能障碍相关动脉粥样硬化的新药物开发，为传统中草药治疗动脉粥样硬化疾病提供重要依据。

附图说明

图1人参皂苷Rb2的化学结构式。

图2采用微量热泳动法检测人参皂苷Rb2与miR-216a的结合反应。A.人参皂苷Rb2与miR-216a野生型(wild-type)呈特异性结合；B.人参皂苷Rb2与miR-216a突变型(mutant-type)无结合。

图3采用荧光素酶报告系统实验进一步验证人参皂苷Rb2与miR-216a的结合反应。A.在HEK293T细胞中共表达miR-216a和PMIR-Smad3-3’UTR野生型报告载体；B.在HEK293T细胞中共表达miR-216a和PMIR-Smad3-3’UTR突变型报告载体。*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

图4采用实时荧光定量PCR法检测人参皂苷Rb2抑制HUVECs的miR-216a表达水平。*P<0.05；n＝5。

图5采用SA-β-gal染色法检测人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的HUVECs衰老。A.SA-β-gal染色图；B.SA-β-gal染色阳性细胞计数。比例尺：200μM；*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

图6人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的内皮细胞粘附功能异常。A.采用单核-内皮细胞粘附实验检测人参皂苷Rb2对miR-216a介导的HUVECs粘附功能的影响；B.采用实时荧光定量PCR法检测HUVECs粘附分子VCAM1的mRNA表达水平。比例尺：200μM；**P<0.01；^##P<0.01；n＝5。

图7采用实时荧光定量PCR法检测人参皂苷Rb2抑制巨噬细胞的miR-216a表达水平。**P<0.01；^##P<0.01；n＝5。

图8人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞端粒酶激活。A.采用端粒重复扩增法(TRAP)检测巨噬细胞的端粒酶活性；B.采用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞hTERT基因表达水平；**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

图9人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老。A.采用SA-β-gal染色法检测Rb2对miR-216a介导的巨噬细胞衰老的影响；B.采用实时荧光定量PCR法检测衰老相关基因p21和p16的mRNA表达水平。比例尺：50μM；*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；；n＝5。

图10人参皂苷Rb2上调miR-216a靶基因Smad3及炎症抑制因子IκBα蛋白的表达。A.采用Westernblot法检测Smad3蛋白表达水平；C.采用Westernblot法检测IκBα蛋白表达水平；*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

图11采用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞中炎症因子TNFα、MCP-1、IL-1β的表达水平。*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

图12人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞脂质蓄积功能。A.采用油红O染色法检测Rb2对巨噬细胞脂质吞噬能力的影响；B.采用胆固醇流出实验检测Rb2对胆固醇流出功能的影响；C.采用实时荧光定量PCR法检测脂质吞噬相关基因CD36、SR-A1和LOX-1的表达变化；D.采用实时荧光定量PCR法检测胆固醇流出相关基因ABCG1的表达变化。比例尺：50μM；*P<0.05，**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；n＝5。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

本发明的整体实验方案如下：

发明人前期研究发现，miroRNA-216a(miR-216a)在衰老的血管内皮细胞和M1型巨噬细胞中高表达，它通过作用于靶基因Smad3/NF-κB信号通路，激活细胞炎症反应，并促进巨噬细胞脂质吞噬，增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性。发明人根据miR-216a的序列和结构特征，通过生物信息学手段分析发现人参皂苷Rb2可能与miR-216a有高亲和力。人参皂苷Rb2是从人参根部提取出的一种固醇类化合物，是人参中的主要活性成分。因此，本发明中，发明人证实人参皂苷Rb2以miR-216a为作用靶点，对血管内皮细胞和巨噬细胞衰老、炎症反应以及巨噬细胞脂质吞噬能力的影响，明确了人参皂苷Rb2在改善动脉粥样硬化相关的血管功能障碍中的应用。

本发明首先采用微量热泳动法和荧光素酶报告系统实验检测人参皂苷Rb2和miR-216a的结合反应，证实人参皂苷Rb2和miR-216a特异性结合。接着，发明人通过体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并给予人参皂苷Rb2刺激，发现其可抑制HUVECs的miR-216a表达水平；继而构建了pre-miR-216a重组慢病毒(Lv-miR-216a)的HUVECs细胞株，发现人参皂苷Rb2可抑制miR-216a介导的内皮细胞衰老以及单核细胞-内皮细胞之间的粘附能力。

本发明通过体外培养人单核细胞系THP-1(human acute monocytic leukemiacell line)，诱导其分化为巨噬细胞，并给予人参皂苷Rb2刺激，发现其可抑制巨噬细胞的miR-216a表达水平。为了探究人参皂苷Rb2对miR-216a介导的巨噬细胞功能的影响，发明人同时给予miR-216a模拟物(mimics)和人参皂苷Rb2刺激，应用端粒重复扩增法(TRAP)、实时荧光定量PCR法、衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)染色法、westernblot法等手段检测，发现人参皂苷Rb2可抑制miR-216a介导的巨噬细胞端粒酶激活及衰老相关基因p21和p16的表达，减轻巨噬细胞的衰老状态，上调miR-216a靶基因Smad3及炎症抑制因子NF-κB抑制剂α(NF-κBinhibitorα，IκBα)的表达，继而降低炎症因子的表达水平；进一步，发明人检测巨噬细胞的脂质吞噬能力和胆固醇流出能力，发现人参皂苷Rb2可降低miR-216a介导的巨噬细胞脂质蓄积水平并促进其胆固醇流出功能。综上所述，发明人证实人参皂苷Rb2对miR-216a介导的内皮细胞和巨噬细胞功能障碍有改善作用，为治疗血管功能障碍相关动脉粥样硬化提供一种新途径。

本发明涉及的miR-216a核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述miR-216a模拟物(mimics)序列如SEQ ID NO.7-8所示。

本发明涉及的人参皂苷Rb2的分子式为：C₅₃H₉₀O₂₂，化学结构式如图1所示。

本发明的数据统计分析方法：

采用SPSS Statistics20.0(SPSS Inc，Chicago，USA)软件进行数据分析。计量数据用均值±标准差表示，多组间差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD-t检验及SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1人参皂苷Rb2与miR-216a结合反应

1、人参皂苷Rb2的化学结构式

人参皂苷Rb2的分子式为C₅₃H₉₀O₂₂，化学结构式如图1所示。

2、微量热泳动法检测人参皂苷Rb2与miR-216a的结合反应

本发明应用微量热泳动实验检测人参皂苷Rb2与miR-216a的体外结合反应。首先，将5’羧基荧光素(5’FAM，绿色荧光)的miR-216a探针(Ribo Biotechnology，Guangzhou，China)用DEPC水溶解后制成50μM储存液，按照1:10的比例分别稀释为5μM、500nM、50nM和5nM，每个浓度取20μL加载到毛细管Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries(Cat#MO-K002，Nano Temper Technologies，Munich，Germany)中，使用Nano-Blue激发光检测不同浓度miR-216a探针的荧光强度。本发明中，miR-216a探针浓度为500nM时，检测的荧光强度约为400，用于后续实验。

接着，将人参皂苷Rb2(Cat.#HY-N0040，MedChemExpress，Monmouth，NJ，USA)用DEPC水溶解配制成1mM储存液，按照1:2的比例稀释为16个浓度梯度(最低浓度为30nM，最高浓度为1mM)，每个梯度体积10μL。然后，将等体积miR-216a(500nM)与不同浓度的人参皂苷Rb2混合均匀，在室温(约25℃)孵育5min后，加载到毛细管中，使用Monolith NT.115微量热泳动仪(Nano Temper Technologies，Munich，Germany)检测荧光强度。最后，使用NanoTemper Analysis软件(v.1.4.23)分析数据，选择Kd模型拟合数据，根据信噪比(signal tonoise)是否≥5来判断Rb2与miR-216a是否结合。

其中，miR-216a野生型(wide-type)探针的核苷酸序列为：

5’-UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-3’，SEQ ID NO.1；

miR-216a突变型(mutant-type)探针的核苷酸序列为：

5’-UAUAGAGUGCUGGCAACUGUGA-3’，SEQ ID NO.2。

3、荧光素酶报告系统实验进一步验证人参皂苷Rb2与miR-216a结合

本发明应用荧光素酶报告系统实验检测人参皂苷Rb2是否通过与miR-216a的竞争性结合反应，进而影响miR-216a与其靶基因Smad3的3’UTR区结合。

(1)首先构建PMIR-Smad3-3’UTR野生型和突变型载体：Smad3基因的3’UTR序列(ENST00000327367.8)包含一个miR-216a结合位点(790-796bps)。本发明以内皮细胞cDNA为模板，PCR扩增Smad3基因的3’UTR序列，全长2002bps，上游引物5'-CTCAACGCGTGCGTCTGCTCTGGTGGCT-3'SEQ ID NO.3；下游引物5'-GGCGCAAGCTTCACCTGGAGTAAGACACGACTTC-3'SEQ ID NO.4；然后将克隆片段插入pMIR-REPORTTM载体(Ambion，Austin，TX，USA)中荧光素酶基因的下游，构建PMIR-Smad3-3’UTR野生型载体。将Smad3基因3’UTR序列中与miR-216a的结合位点(790-796bps)突变，构建PMIR-Smad33’UTR突变型载体。

其中Smad33’UTR790-796bps野生型序列为5'-AGAGAUU-3'；Smad3 3’UTR790-796bps突变型序列为5'-UCUCUAA-3'。

(2)进一步应用荧光素酶报告系统实验检测人参皂苷Rb2是否与miR-216a竞争性结合并影响Smad3表达水平。首先用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Cat.#10099141C，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的DMEM高糖培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium-high glucose)(Cat.#D5796，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)培养HEK293T细胞(China Infrastructure of Cell Line Resources，Beijing，China)，并在细胞对数生长期以1×10⁴/孔接种至96孔细胞培养板。

pMIR-Smad3-3’UTR野生型载体的实验分组为：阴性对照(negative control，NC)组、miR-216a组、NC+Rb2组和miR-216a+Rb2组。根据Lipofectamine 3000(Cat.#L3000015，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂盒说明书，将50nMmiR-216amimics或NC(GenePharma,Suzhou，China)与100ngPMIR-Smad3-3’UTR野生型载体共转染HEK293T细胞，同时转染1ng海肾荧光素酶质粒pRL作为内参。

pMIR-Smad3-3’UTR突变型载体的实验分组与上述一致。用Lipofectamine 3000将50nM miR-216a mimics或NC与100ng PMIR-Smad3-3’UTR突变型载体共转染HEK293T细胞，同时转染1ng海肾荧光素酶质粒pRL作为内参。

将HEK293T细胞在37℃、5％CO₂细胞培养箱(Thermo Scientific，Massachusetts，USA)中孵育12h，更换含10％FBS的DMEM培养基，并加入10μM人参皂苷Rb2，继续培养48h。接着，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒(Cat.#E1910，Promega，Madison，WI，USA)裂解HEK293T细胞，利用Infinite M200 Pro光栅型多功能酶标仪(Tecan，Zurich，Switzerland)检测各组的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对荧光强度(Relative luciferase activity，RLU)。

其中，NC序列为：正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’SEQ ID NO.5，反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’SEQ ID NO.6。

miR-216a mimics序列为：

正义链5’-UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-3’SEQ ID NO.7，反义链5’-ACAGUUGCCAGCUGAGAUUAUU-3’SEQ ID NO.8。

4、结果

本发明中，微量热泳动实验结果显示，人参皂苷Rb2与野生型miR-216a探针的kd模型信噪比为9.6，表明两者特异性结合(图2A)；反之，突变型miR-216a与Rb2无结合反应(图2B)。

荧光素酶报告系统实验的结果显示，在HEK293T细胞中共表达miR-216a和PMIR-Smad3-3’UTR报告载体，与阴性对照比较，miR-216a显著抑制荧光素酶活性35％(P<0.001)；在给予人参皂苷Rb2刺激后，荧光素酶活性相对于miR-216a组上调38％(P<0.01)(图3A)。进一步，在HEK293T细胞中共表达miR-216a和PMIR-Smad3-3’UTR突变型报告载体时，miR-216a和人参皂苷Rb2对荧光素酶活性均无显著影响(图3B)。提示人参皂苷Rb2和miR-216a特异性结合，可竞争性解除miR-216a对靶基因Smad3的抑制作用。

实施例2人参皂苷Rb2抑制HUVECs的miR-216a表达水平

1、HUVECs(人脐静脉内皮细胞)的培养

将离体新生儿脐带浸泡入4℃生理盐水中保存，并于2h内进行标本处理。在无菌条件下，用磷酸盐缓冲液(PBS)(Cat.#806544，Sigma-Aldrich，SaintLouis，MO，USA)灌注清洗脐静脉2次，然后将0.1％的I型胶原酶(Cat.#C0130-100MG，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)灌注入脐带内，并两端结扎，放入37℃水浴的烧杯中消化15min。收集胶原酶细胞消化混合液，800rpm室温离心5min，弃去上清，用含5％FBS的ECM培养基(Endothelial CellMedium)(Cat.#1001，ScienCell，San Diego，CA，USA)重悬细胞，随后将细胞悬液转移T25细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂条件的细胞培养箱中孵育12h，换液，去上清培养基，用PBS清洗2次，加入新鲜培养基继续培养。

当细胞密度达90％以上时使用0.25％胰酶消化细胞，并按1:4传代培养。群体倍增水平(Population-doubling levels，PDLs)用于描述连续传代水平，计算公式为PDL＝log₂(Ch/Cs)(Ch表示终末细胞数，Cs表示初始接种数)。

2、实时荧光定量PCR法检测miR-216a的表达水平

本发明采用实时荧光定量PCR法检测人参皂苷Rb2对HUVECs内miR-216a表达水平的影响。将PDL8HUVECs接种于12孔细胞培养板中，待细胞融合度达90％时，更换新鲜的细胞培养基，并给予不同浓度(0.1μM、1μM、10μM和100μM)人参皂苷Rb2刺激24h。然后，使用Trizol(Cat.#15596-026，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取细胞总RNA，接着使用miRNAs提取和检测试剂盒All-in-one^TMmiRNA qRT-PCR Detection System(Cat.#QP015，GeneCopoeia，Rockville，MD，USA)，置于ABI 7500 System(Applied Biosystems，FosterCity，CA，USA)检测miR-216a表达水平。miRNA检测以U6为内参，ΔΔCt法计算相对表达量。

其中，miR-216a的引物序列为：5’-TCTCAGCTGGCAACTGTGAAA-3’SEQ ID NO.9。

3、结果

在PDL8HUVECs中，采用实时荧光定量PCR检测人参皂苷Rb2对miR-216a表达水平影响。结果显示，与对照组比较，给予1μM、10μM和100μM人参皂苷Rb2刺激后，可显著降低HUVECs的miR-216a表达水平，分别下降39％、30％和33％(P<0.05)(图4)。

实施例3人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的内皮细胞衰老

血管内皮细胞衰老及功能障碍促使其分泌粘附因子及趋化因子，招募外周血循环中的单核细胞浸润至血管内膜下并促进其分化为巨噬细胞，启动动脉粥样硬化的发生发展。本发明为了明确人参皂苷Rb2对内皮细胞衰老的影响，实验分为4组：稳定转染阴性对照(Lv-NC)组、稳定转染miR-216a(Lv-miR-216a)组、Lv-NC+Rb2组、Lv-miR-216a+Rb2组。

1、建立长期稳定过表达miR-216a的HUVECs细胞株

为了建立稳定过表达miR-216a的细胞株，PDL4HUVECs分别感染pre-miR-216a重组慢病毒(Ubi-EGFP-MCS-IRES-puromycin)和阴性对照(negativecontrol，NC)病毒载体(Genechem,Shanghai,China)。3天后，给予400ng/mL嘌呤霉素(Cat.#8833，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)进行筛选。当感染效率达到95％以上时(即绿色荧光蛋白表达细胞数超过95％)进行后续实验。将稳定表达miR-216和阴性对照的细胞株进行连续传代并计算PDLs。对HUVECs通过细胞形态分析以及衰老相关β-半乳糖甘酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)染色法来鉴定内皮细胞衰老程度。

2、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

本发明使用原位SA-β-gal染色试剂盒(Cat.#C0602，Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)鉴定HUVECs细胞衰老状态。在12孔板中培养的细胞融合度达90％时，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入β-gal染色固定液500μL，室温固定细胞15min；然后吸除细胞固定液，用PBS洗2次，每次3min；接着，每孔加入β-gal染色工作液500μL，用保鲜膜封住12孔板以避免接触空气，在37℃、无CO₂的分子杂交箱(UVP，Jena，Germany)中避光孵育约12h。去除染色工作液，用PBS洗2次，在Lecia DMI-4000B光学显微镜下观察，SA-β-gal阳性细胞的胞浆呈靛蓝色。每组随机选取5个视野进行拍照并计数，计算SA-β-gal阳性细胞的比例。

3、人参皂苷Rb2对内皮细胞衰老的影响

将稳定表达miR-216和阴性对照的HUVECs细胞株进行连续培养、传代并计算PDLs。随着传代次数的增加，稳定过表达miR-216a的PDL25HUVECs出现明显的肥大和生长阻滞等衰老相关表型，SA-β-gal阳性细胞比例达到50％以上，显示miR-216a显著促进内皮细胞衰老。继而，将PDL25HUVECs以1×10⁵/孔的比例接种在12孔细胞培养板中，培养24h后，更换完全培养基，同时给予10μM人参皂苷Rb2，继续培养24h。使用原位SA-β-gal染色试剂盒鉴定细胞衰老状态。

4、结果

在PDL25 HUVECs中，与阴性对照(Lv-NC)组比较，稳定表达miR-216a可显著促进内皮细胞衰老(图5A)，SA-β-gal阳性细胞比例增加约1倍(P<0.01)(图5B)；给予人参皂苷Rb2后，可显著减轻miR-216a诱导引起的内皮细胞衰老状态(图5A)，Lv-miR-216a+Rb2组中SA-β-gal阳性细胞比例较Lv-miR-216a组下降16％(P<0.01)(图5B)。

实施例4人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的内皮细胞粘附功能异常

为了明确人参皂苷Rb2对内皮细胞粘附功能的影响，实验分4组：稳定转染阴性对照(Lv-NC)组、稳定转染miR-216a(Lv-miR-216a)组、Lv-NC+Rb2组、Lv-miR-216a+Rb2组。所述PDL25HUVECs与实施例3相同。

1、单核-内皮细胞粘附实验

本发明应用单核-内皮粘附实验检测人参皂苷Rb2对miR-216a介导的HUVECs粘附功能的影响。将PDL25HUVECs接种于12孔培养板中，待细胞融合度达90％时进行粘附实验。

THP-1单核细胞悬浮液的制备：收集THP-1单核细胞(China Infrastructure ofCell Line Resources，Beijing，China)，用无血清RPMI-1640培养基重新悬浮至1×10⁶个/mL，1mL THP-1细胞中加入5μLCellTrackerCM-Dil红色荧光染料(Cat.#C7000，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，置于37℃、含有5％CO₂的细胞培养箱中孵育30min，并每隔10min轻柔混匀一次。标记后的THP-1细胞用PBS洗2次，800rpm离心3min，去除上清，随后用RPMI-1640培养基重悬。

单核-内皮细胞粘附实验：在培养HUVECs的12孔板中，每孔加入200μL上述THP-1单核细胞，置于IncuCyteZOOM(EssenBioScience，Michigan，USA)孵育30min后，用PBS洗2次。应用IncuCyteZOOM进行拍照，计算5个随机视野粘附的THP-1单核细胞数。

2、实时荧光定量PCR法检测基因表达水平

本发明应用实时荧光定量PCR法检测内皮细胞粘附因子：血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)的基因表达水平。

使用TRIzol试剂提取PDL25 HUVECs的总RNA，使用PrimeScript ReverseTranscriptase assay(Cat.#RR036A，Takara，Dalian，China)将mRNA逆转录成cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix试剂(Cat.#11202ES08，YEASEN，Shanghai，China)，置于ABI 7500System荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)检测基因表达水平。以GAPDH为内参，ΔΔCt法计算相对表达量。

VCAM1：上游引物5’-GATACAACCGTCTTGGTCAGCCC-3’SEQ ID NO.10，下游引物5’-CGCATCCTTCAACTGGCCTT-3’SEQ ID NO.11。

3、结果

结果显示，与阴性对照(Lv-NC)组相比，miR-216a显著增加THP-1单核细胞向HUVECs的粘附数量达2.8倍(P<0.01)；给予人参皂苷Rb2后，可显著抑制miR-216a诱导引起的THP-1单核-内皮细胞粘附作用，降低约2.6倍(图6A)。

同样，与阴性对照(Lv-NC)组相比，miR-216a显著促进PDL25 HUVECs表达粘附因子VCAM1，增加约78％(P<0.01)；给予人参皂苷Rb2后，对miR-216a诱导的内皮细胞VCAM1表达有显著的抑制作用，降低66％(P<0.01)(图6B)。

实施例5人参皂苷Rb2促进巨噬细胞内miR-216a的降解

本发明为了明确人参皂苷Rb2是否抑制miR-216a表达，以及Rb2在细胞内结合miR-216a后是否促进其降解，在THP-1单核-巨噬细胞中瞬时转染miR-216a，同时给予人参皂苷Rb2药物。

1、THP-1单核-巨噬细胞的培养

用含10％FBS的RPMI-1640培养基(Cat.#R8758，Sigma-Aldrich，SaintLouis，MO，USA)培养THP-1单核细胞，并置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养传代。然后，将对数生长期的THP-1细胞按照4×10⁵/孔接种在12孔板中，并加入10ng/mL佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(Cat.#P1585，Sigma-Aldrich，SaintLouis，MO，USA)，静置培养24h，更换新鲜的培养基，继续培养24h，THP-1单核细胞分化为巨噬细胞。

实验分组为：阴性对照(negative control，NC)组、miR-216a组、NC+Rb2组和miR-216a+Rb2组。使用Lipofectamine 3000瞬时转染miR-216a mimics和NC，终浓度为100nM；转染8h后更换新鲜的培养基，加入10μM人参皂苷Rb2，继续培养48h。

2、实时荧光定量PCR法检测Rb2对miR-216a降解的影响

用TRIzol收集上述培养的巨噬细胞，采用实时荧光定量PCR法检测人参皂苷Rb2对巨噬细胞内miR-216a表达的影响。具体方法参照实施例2。

3、结果

结果显示，与阴性对照比较，人参皂苷Rb2可显著下调巨噬细胞中miR-216a的表达水平91％(P＝0.01)；在miR-216a过表达情况下，给予人参皂苷Rb2刺激后，miR-216a水平下调38％(P<0.05)，提示人参皂苷Rb2通过结合miR-216a促进其降解(图7)。

实施例6人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞端粒酶激活

miR-216a可通过促进巨噬细胞端粒酶激活而引发细胞的炎症反应，端粒酶是组织和细胞更新的重要调控者，参与动脉粥样硬化和心血管疾病的发生发展过程。本发明为了明确人参皂苷Rb2对巨噬细胞端粒酶活性的作用，在巨噬细胞中，使用Lipofectamine 3000(Cat.#L3000c015，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬时转染miR-216a mimics以及阴性对照(negative control，NC)，并同时给予人参皂苷Rb2。

THP-1单核-巨噬细胞的培养方法和实验分组，与实施例5所述相同。

本发明采用端粒重复扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)检测细胞内端粒酶活性。计数并收集1×10⁵个巨噬细胞，加入50μLCHAPS裂解液(Cat#11854666910，Roche，Mannheim，Germany)重悬，于冰上静置30min，12000rpm4℃离心30min，收集上清液作为荧光定量PCR反应的模板。端粒酶活性检测的引物序列为：

TS引物：5’-AATCCGTCGAGAACAGTT-3’SEQ ID NO.12；

CXa引物：5’-GTGTAACCCTAACCCTAACCC-3’SEQ ID NO.13。

每次PCR反应均使用CHAPS裂解液作为阴性对照，Hela细胞裂解液作为阳性对照，使用ΔΔCt的方法计算巨噬细胞端粒酶活性。

进一步，用TRIzol收集培养的巨噬细胞，提取细胞总RNA，应用实时荧光定量PCR法检测端粒酶的催化亚基--端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的基因表达水平。具体方法参照实施例4。

所述基因hTERT的引物序列为：

上游引物5’-CTGCGTTTGGTG GATGATTTCT-3’SEQ ID NO.14；

下游引物5’-GCCTCGTCTTCTACAGGGAAGTT-3’SEQ ID NO.15。

结果表明，与阴性对照比较，miR-216a可显著促进巨噬细胞的端粒酶活性61％(P<0.01)；而同时给予人参皂苷Rb2，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组的细胞端粒酶活性被抑制约4倍(P<0.01)(图8A)。进一步检测结果显示，miR-216a可促进hTERT基因的表达(P<0.01)，而人参皂苷Rb2可下调hTERT基因表达水平约2倍(P<0.01)(图8B)。

以上结果提示人参皂苷Rb2可抑制miR-216a介导的巨噬细胞端粒酶激活。

实施例7人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老

本发明使用原位SA-β-gal染色试剂盒鉴定巨噬细胞的衰老状态，计算SA-β-gal阳性细胞数。具体方法参照实施例3。

用TRIzol收集上述培养的巨噬细胞，提取细胞总RNA，应用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞内衰老相关基因p21、p16的表达水平。具体方法参照实施例4。

所述基因p21的引物序列为：

上游引物5’-GAGCAGGCTGAAGGGTCCCCAGGT-3’SEQ ID NO.16；

下游引物5’-CGTGTGGAGTATTTGGATGACAGA-3’SEQ ID NO.17。

所述基因p16的引物序列为：

上游引物5’-GCCCAACGCACCGAATAGTTACG-3’SEQ ID NO.18；

下游引物5’-CACCACCAGCGTGTCCAGGAA-3’SEQ ID NO.19。

本发明的结果显示，与阴性对照组(SA-β-gal阳性细胞比例12％)相比，过表达miR-216a可显著促进巨噬细胞衰老(SA-β-gal阳性细胞比例23％)(P<0.01)，而给予人参皂苷Rb2刺激后，SA-β-gal阳性细胞比例显著降低至5％(P<0.001)(图9A)，表明Rb2可抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老。

进一步，miR-216a可促进巨噬细胞中衰老相关基因p21、p16的表达水平分别升高50％和80％(P<0.01)，而给予人参皂苷Rb2刺激后，miR-216a+Rb2组的p21、p16表达水平均显著降低20％(P<0.05)(图9B)，表明Rb2可抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老相关基因表达。

实施例8人参皂苷Rb2对miR-216a靶基因smad3及NF-κB炎症信号通路表达水平的影响

衰老巨噬细胞促进炎症因子高表达是诱导动脉粥样硬化斑块破裂的重要因素。本发明为了明确人参皂苷Rb2是否可影响miR-216a介导的Smad3/NF-κB炎症信号通路的表达水平，在巨噬细胞中，使用Lipofectamine3000(Cat.#L3000c015，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬时转染miR-216amimics以及阴性对照(negativecontrol，NC)，并同时给予人参皂苷Rb2。

1、应用Westernblot法检测人参皂苷Rb2对miR-216a介导的Smad3和IκBα(NF-κBinhibitoralpha)蛋白表达变化。

收集巨噬细胞，使用RIPA裂解液(Cat.#C3702，Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂(Cat.#04693159001，Roche，Mannheim，Germany)，置于冰上裂解30min，离心取上清；使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat.#P0012，Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)检测样品蛋白浓度。然后将蛋白与5×上样缓冲液充分混合，于100℃煮沸5min；每个蛋白样品上样量为50μg，使用10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，随后转移到硝酸纤维素膜上(Cat.#HATF00010，Millipore，Boston，MA，USA)，用10％脱脂奶粉封闭2h后，于4℃孵育一抗过夜。

一抗包括兔多克隆抗体anti-Smad3(1:1000)(Cat.#12747)和兔抗体anti-IκBα(1:1000)(Cat.#9242)，二抗为过氧化物辣根酶标记的anti-rabbit(1:5000)(Cat.#7074)，均购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA，USA)。以鼠抗体anti-GAPDH(1:1000)(Cat.#TA-08)作为内参，相应的二抗为过氧化物辣根酶标记的anti-mouse(1:2000)(Cat.#ZB-2305)(均购自ZSGB-BIO，Beijing，China)。二抗室温孵育1h。使用FluorChemR,M and ESystems(ProteinSimple，SiliconValley，CA，USA)进行条带显色，并使用AlphaViewSoftware(Alpha Innotech，Santa Clara，CA，USA)进行灰度扫描并计算相对表达量。

2、应用实时荧光定量PCR法检测人参皂苷Rb2对巨噬细胞炎症反应的影响。

本发明检测促炎因子MCP1、TNFα和IL1β的mRNA表达水平。具体方法参照实施例4。

所述基因MCP1的引物序列为：

上游引物5’-CAAACTGAAGCTCGCACTCTCGCC-3’SEQ ID NO.20，

下游引物5’-ATTCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCA-3’SEQ ID NO.21；

所述基因TNFα的引物序列为：

上游引物5’-CCGAGTGACAAGCCTGTA-3’SEQ ID NO.22，

下游引物5’-GGACCTGGGAGTAGATGAG-3’SEQ ID NO.23；

所述基因IL1β的引物序列为：

上游引物5’-CAGCTACGAATCTCCGACCAC-3’SEQ ID NO.24，

下游引物5’-GGCAGGGAACCAGCATCTTC-3’SEQ ID NO.25；

3、结果

Westernblot结果表明与阴性对照相比，miR-216a过表达可显著抑制靶基因Smad3及抗炎蛋白IκBα的表达水平(P<0.05)；而同时给予人参皂苷Rb2干预后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中Smad3和IκBα蛋白表达上调(P<0.05)(图10)。

实时荧光定量PCR法检测结果表明，与阴性对照组相比，miR-216a可显著促进炎症因子TNFα、MCP1、IL1β的表达水平(P<0.01)；而同时给予人参皂苷Rb2干预后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中MCP1和TNFα的表达水平分别降低20％和43％(P<0.05)(图11)。

以上结果提示，人参皂苷Rb2可逆转miR-216a诱导的炎症信号通路激活，抑制巨噬细胞中炎症因子的表达。

实施例9人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的巨噬细胞脂质蓄积

巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白后分化为泡沫细胞是形成动脉粥样硬化易损斑块的关键步骤。本发明应用泡沫细胞形成实验和胆固醇流出实验来明确人参皂苷Rb2是否可抑制miR-216a介导的巨噬细胞脂质蓄积。在巨噬细胞中，使用Lipofectamine 3000(Cat.#L3000c015，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬时转染miR-216a mimics以及阴性对照(negative control，NC)，并同时给予人参皂苷Rb2。

1、油红O染色法观察泡沫巨噬细胞的脂质吞噬能力

取对数生长期的THP-1单核细胞以3×10⁵/孔的密度接种在预先放有玻璃爬片的12孔细胞培养板中，经PMA诱导后分化为巨噬细胞。按照实验分组，给予人参皂苷Rb2干预36h，更换为含1％BSA的RPMI-1640培养基，每孔加入50μL氧化低密度脂蛋白(Cat.#YB-002，Yiyuan Biotech，Guangzhou，China)孵育12h，诱导巨噬细胞形成泡沫细胞；取出爬片，用PBS洗3次。爬片上的细胞用0.3％油红O染液(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)室温染色2min，用PBS洗3次，随后用苏木素(ZSGO-BIO,Beijing,China)染液复染细胞核15s，甘油封片。使用Leica DM6000B光学显微镜(Leica Microsystem，Germany)观察拍照，脂滴呈红色，细胞核呈蓝紫色。

2、胆固醇流出实验检测巨噬细胞内胆固醇流出能力

将对数生长期的THP-1单核细胞以2×10⁴/孔接种在96孔细胞培养板中，经PMA诱导后分化为巨噬细胞。按照实验分组，给予人参皂苷Rb2干预36h，更换为含0.2％BSA的RPMI-1640培养基，同时每孔加入50μg/mL乙酰化低密度脂蛋白(Cat.#YB-004，YiyuanBiotech，Guangzhou，China)和5μg/mLNBD胆固醇(Cat.#N1148，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，37孵育12h；用无血清的RPMI-1640培养基洗3次，随后更换为含0.2％BSA的RPMI-1640培养基孵育4h，诱导胆固醇流出。使用Infinite M200 Pro光栅型多功能酶标仪(Tecan，Zurich，Switzerland)检测荧光强度，并计算细胞胆固醇流出率。

3、实时荧光定量PCR法

进一步，本发明应用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞中脂质吞噬相关基因：清道夫受体36(CD36)、氧化性低密度脂蛋白受体(lectin-like oxidized low densitylipoprotein receptor-1，LOX-1)、A1类清道夫受体(scavenger receptor class typeA1，SR-A1)，以及胆固醇流出相关基因ATP结合盒转运体G1(ATP-binding cassettetransport G1，ABCG1)的表达水平。具体方法参照实施例4。

所述引物如下：

CD36：上游引物5’-TGATGAACAGCAGCAACA-3’SEQ ID NO.26，

下游引物5’-CACAGCCAGATTGAGAACT-3’SEQ ID NO.27；

LOX-1：上游引物5’-TTGTTGAAGTTCGTGACTG-3’SEQ ID NO.28，

下游引物5’-TTGCTTGCTCTTGTGTTAG-3’SEQ ID NO.29；

SR-A1：上游引物5’-GATGCTCGCTCAATGACA-3’SEQ ID NO.30，

下游引物5’-GGTGGTGTTCTTCCTCATT-3’SEQ ID NO.31；

ABCG1：上游引物5’-CGGCTTCCTCTTCTTCTC-3’SEQ ID NO.32，

下游引物5’-CCAGTAGTTCAGGTGTTCC-3’SEQ ID NO.33。

4、结果

采用油红O染色法检测巨噬细胞的脂质吞噬功能，结果发现与阴性对照组相比，miR-216a可显著促进巨噬细胞泡沫化；而给予人参皂苷Rb2后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中巨噬细胞的脂质吞噬能力被显著抑制(图12A)。

应用胆固醇流出实验检测巨噬细胞内的胆固醇流出能力，结果发现与阴性对照组相比，miR-216a过表达后巨噬细胞胆固醇流出比率下降7％(P<0.05)；而给予人参皂苷Rb2后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中巨噬细胞内的胆固醇流出率升高13％(P<0.01)(图12B)。

进一步应用实时荧光定量PCR法检测脂质吞噬和胆固醇流出相关基因的表达水平。结果显示，与阴性对照组比较，miR-216a可显著促进巨噬细胞的脂质吞噬作用，相关基因CD36、SR-A1和LOX-1的表达水平分别上调50％、45％和60％(P<0.01)；而给予人参皂苷Rb2后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中巨噬细胞的脂质吞噬能力显著下降，CD36和SR-A1的表达水平分别降低17％(P<0.05)和20％(P<0.01)(图12C)。

同样，miR-216a可显著抑制胆固醇流出相关基因ABCG1的表达，其mRNA表达水平降低33％(P<0.01)；给予人参皂苷Rb2后，与miR-216a组比较，miR-216a+Rb2组中巨噬细胞ABCG1表达水平增加30％(P<0.05)(图12D)。

以上结果提示，人参皂苷Rb2可抑制miR-216a介导的巨噬细胞脂质吞噬作用，抑制巨噬细胞分化为泡沫细胞，同时促进胆固醇流出，从而减轻巨噬细胞内的脂质蓄积水平。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院阜外医院

<120> 人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用

<130> P200126

<141> 2020-03-02

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-216a（wide-type）

<400> 1

uaaucucagc uggcaacugu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-216a（mutant-type）

<400> 2

uauagagugc uggcaacugu ga 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctcaacgcgt gcgtctgctc tggtggct 28

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggcgcaagct tcacctggag taagacacga cttc 34

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

uaaucucagc uggcaacugu ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

acaguugcca gcugagauua uu 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tctcagctgg caactgtgaa a 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gatacaaccg tcttggtcag ccc 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

cgcatccttc aactggcctt 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

aatccgtcga gaacagtt 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gtgtaaccct aaccctaacc c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ctgcgtttgg tggatgattt ct 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gcctcgtctt ctacagggaa gtt 23

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gagcaggctg aagggtcccc aggt 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

cgtgtggagt atttggatga caga 24

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

gcccaacgca ccgaatagtt acg 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

caccaccagc gtgtccagga a 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

caaactgaag ctcgcactct cgcc 24

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

attcttgggt tgtggagtga gtgttca 27

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

ccgagtgaca agcctgta 18

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ggacctggga gtagatgag 19

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

cagctacgaa tctccgacca c 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ggcagggaac cagcatcttc 20

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

tgatgaacag cagcaaca 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

cacagccaga ttgagaact 19

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

ttgttgaagt tcgtgactg 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ttgcttgctc ttgtgttag 19

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

gatgctcgct caatgaca 18

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

ggtggtgttc ttcctcatt 19

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

cggcttcctc ttcttctc 18

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

ccagtagttc aggtgttcc 19

Claims

1.人参皂苷Rb2在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rb2与miR-216a特异性结合。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rb2抑制miR-216a活性和/或表达。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rb2抑制miR-216a介导的内皮细胞衰老以及单核细胞-内皮细胞之间的粘附能力；并抑制miR-216a介导的巨噬细胞衰老、炎症反应和巨噬细胞脂质蓄积作用，从而改善动脉粥样硬化相关的血管功能障碍。

5.人参皂苷Rb2在如下任一产品中的应用：

(a2)在制备抑制巨噬细胞端粒酶激活和衰老；

(a3)在制备抑制细胞中miR-216a的表达及促进下游Smad3和炎症抑制因子IκBα蛋白表达，以及抑制炎症反应；

(a4)在制备抑制巨噬细胞脂质蓄积作用。

6.一种预防和/或治疗与血管细胞功能障碍相关的动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于，人参皂苷Rb2作为所述药物组合物的单一活性成分或与其他miR-216a抑制剂共同作为活性成分。

7.人参皂苷Rb2在制备miR-216a抑制剂中的应用。

8.一种miR-216a抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括治疗有效量的人参皂苷Rb2。

9.权利要求8所述的抑制剂在制备预防和/或治疗miR-216a过表达的疾病的产品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述miR-216a过表达的疾病包括动脉粥样硬化疾病。