CN108403711B

CN108403711B - 一种用于检测和治疗炎性肠病的microRNA

Info

Publication number: CN108403711B
Application number: CN201710073375.4A
Authority: CN
Inventors: 詹丽杏; 宋乐乐; 常人绪; 周荣敏
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: CN108403711A

Abstract

本发明涉及一种用于检测和治疗炎性肠病的microRNA。本发明揭示了一类直接参与肠炎发生的miRNA，以该类miRNA作为活性成分的药物组合物，以及该类miRNA的用途。

Description

一种用于检测和治疗炎性肠病的microRNA

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种用于检测和治疗结肠炎的microRNA。

背景技术

炎性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一类以肠道炎症为特征的疾病。其中，克罗恩病在胃肠道的任何部位均可发生，但好发于末端回肠和右半结肠；溃疡性结肠炎病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，病变多位于乙状结肠和直肠。炎性肠病病因目前尚不十分清楚，但是主要源于宿主因素和外界因素之间的复杂相互作用，包括多个方面，如肠道微生物系统、免疫系统、苏朱德遗传组成和特定的环境因素。全球接近400万人保守克罗恩病和溃疡性结肠炎的痛苦，我国炎性肠病发病率近年来明显增加。

炎性肠病与肠炎相关的肠癌往往有密切的因果关系。结肠癌中只有20％左右可以归结为家族的遗传突变所致，所以除去遗传因素以外，环境中的多种因子极可能是促进其发生发展的风险因子。研究表明，溃疡性肠炎可使病人罹患结肠癌的风险增加18-20％，而克罗恩氏病会增加8％的罹患结肠癌风险。患者罹患结肠癌的机率和其炎症性肠病患病种类，炎症程度，患病时间以及抗炎症药物的治疗史密切相关。因此，肠道的不可控炎症是促进结肠癌发生的一个重要因素。

MicroRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的，长度约18-26个剪辑的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些miRNA上的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。

microRNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约为60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。Pre-miRNA转运至胞质后，被Dicer酶进一步剪切成长约22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物，与互补的mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或抑制其表达。

尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在生物体的发育、炎症发生发展以及炎症相关肿瘤发生发展中所起的作用不可忽视。

目前，炎性肠病和炎性肠病相关的肠癌相关的microRNA绝大部分都知之甚少，因此本领域迫切需要探究microRNA在炎性肠病以及炎性肠病相关的肠癌中的作用，以及开发出有效的治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测和治疗结肠炎的microRNA，其是microRNA-miR-494-3p。

在本发明的第一方面，提供活性成分在制备缓解或治疗肠炎的药物组合物中的用途；其中，所述的活性成分选自下组：

(a)miR-494-3p，或经修饰的miR-494-3p衍生物，或miR-494-3p类似物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-494-3p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成miR-494-3p，或能在宿主内加工成miR-494-3p；

(d)表达构建物，所述的表达构建物含有(a)中所述的miR-494-3p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的miR-494-3p的激动剂。

在一个优选例中，所述的miR-494-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的经修饰的miR-494-3p衍生物，或miR-494-3p类似物与miR-494-3p的序列同源性≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥99％。

在另一优选例中，所述的miR-494-3p来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠。

在另一优选例中，所述的宿主为：人或啮齿动物(如：大鼠、小鼠)。

在另一优选例中，所述的表达构建物为表达载体，包括但不限于：质粒、或病毒载体；更佳的，所述的病毒载体为腺病毒载体、或腺病毒相关载体。

在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物具有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 (I)

式(I)中，Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-494-3p的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入宿主后，形成式(II)所示的二级结构：

式(II)中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的碱基互补配对的关系。

在另一优选例中，所述的miR-494-3p的激动剂选自下组：促进miR-494-3p表达的物质、提高miR-494-3p活性的物质；较佳地，所述的miR-494-3p的激动剂是mir494-agomir。

在另一优选例中，(b)中所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的前体miRNA来源于人。

在另一优选例中，所述的肠炎是miR-494-3p表达下调导致的炎症性疾病；较佳地，所述的肠炎包括(但不限于)：炎性肠病，结肠炎。

在另一优选例中，所述的活性成分通过抑制JAK/stat3信号通路发挥作用，或通过抑制NF-κB信号通路发挥作用，或通过下调p-stat3、IKKβ和/或p-P65的表达发挥作用，或通过降低IL1-beta和IL-6的表达水平发挥作用。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合包括药学上可接受的载体和选自下组的一种或多种活性成分；

(a)miR-494-3p，或经修饰的miR-494-3p衍生物，或miR-494-3p类似物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-494-3p；

(e)(a)中所述的miR-494-3p的激动剂。

在另一优选例中，所述的一种和多种活性成分在药物组合物中的含量是有效量。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于缓解或治疗肠炎。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。

在另一优选例中，所述的药学上的可接受的载体包括：脂质体。纤维素、纳米凝胶。

在本发明的另一方面，提供一种检测肠炎的方法，所述方法包括：分别检测待测样本和对照样本miR-494-3p的表达水平，如果与对照样本相比，待测样本的miR-494-3p的表达水平存在显著性降低，则是潜在的结肠炎患病样本；其中，所述的对照样本呈现正常的miR-494-3p表达水平或健康者的miR-494-3p表达水平。

在另一优选例中，所述的显著性降低是指：与对照样本相比，所述miR-494-3p的表达水平的降低幅度≥10％，较佳地≥20％，较佳地≥50％，更佳地≥80％，最佳地≥100％。

在另一优选例中，所述的检测是不以获得疾病诊断结果为目的的。

在另一优选例中，所述的检测方法还包括：分别检测待测样本和对照样本IKKβ的表达水平，如果与对照样本相比，待测样本的IKKβ的表达水平存在显著性升高，则是潜在的结肠炎患病样本；其中，所述的对照样本呈现正常的IKKβ表达水平或健康者的IKKβ表达水平。

在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或治疗肠炎的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miR-494-3p的体系；和

(2)检测所述体系中miR-494-3p的表达情况；

其中，若所述候选物质可提高miR-494-3p的表达，则表明该候选物质是缓解或治疗肠炎的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-494-3p的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中miR-494-3p的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-494-3p的体系；

如果测试组中miR-494-3p的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是缓解或治疗肠炎的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系还表达IKKβ；步骤(2)还包括：检测测试组的体系中IKKβ的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达IKKβ的体系；如果测试组中IKKβ的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是缓解或治疗肠炎的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对miR-494-3p设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达miR-494-3p的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于缓解或治疗肠炎有用的物质。

在本发明的另一方面，提供了一种预防和治疗肠炎的方法，给需要的对象施用本发明的第一方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。

附图说明

下面附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示正常喂养条件下，miR-494-3p敲除(miR-494-3p-/-)不影响小鼠的体重和结肠组织结构。图1a显示miR-494-3p敲除小鼠结肠组织中miR-494-3p相对水平比野生型小鼠(miR-494-3p+/+)低上百倍，因此miR-494-3p敲除敲除成功；图1b显示正常喂养条件下，连续统计了2-8周的miR-494-3p-/-小鼠和野生型小鼠的体重，统计结构显示二者基本一致。图1c显示正常喂养条件下，8周龄miR-494-3p-/-小鼠与同龄野生型小鼠结肠组织结构类似。

图2显示DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p-/-的小鼠比野生型小鼠表现出了更严重的肠炎现象。图2a显示，2.5％DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠较野生型小鼠小鼠体重下降更明显；图2b显示，2.5％DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠的结肠长度显著低于野生型小鼠的结肠长度；图2c显示，2.5％DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠的临床评分(DAI)显著高于野生型小鼠；图2d和2e显示，2.5％DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠的结肠组织结构较野生型小鼠呈现更严重的粘膜上皮破坏和免疫细胞浸润，和组织学评分(2f)；图2f显示DSS喂养野生型小鼠7天后，小鼠结肠组织和血浆中miR-494-3p水平均显著降低；以上所述的附图中**P<0.01。

图3显示在DSS诱导小鼠结肠炎模型中，miR-494-3p-/-小鼠的结肠组织与野生型小鼠的相比，呈现更高水平的炎症细胞的浸润和促炎因子的表达。图3a显示，DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠血液中的白细胞总量以及嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞数量都显著高于野生型小鼠；图3b结肠组织切片免疫荧光显示，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中巨噬细胞(F4/80阳性标记)和嗜中性粒细胞(Ly6G阳性标记)浸润明显高于野生型小鼠；图3c显示miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中促炎因子IL1-beta、IL6、IFN-gamma、IL17c、IL23、CXCL1、Ccl12表达水平显著高于野生型小鼠；以上所述的附图中**P<0.01，***P<0.001。

图4显示DSS诱导小鼠肠炎模型中，miR-494-3p的敲除增加了小鼠结肠上皮细胞的通透性。图4a显示正常喂养的miR-494-3p-/-小鼠的结肠上皮通透性与野生型小鼠之间没有明显差异，但是在DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠结肠上皮的通透性比野生型小鼠明显增强；图4b显示DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠血浆中的FITC-dextran含量显著高于野生型小鼠；图4c显示DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中紧密连接蛋白claudin-1蛋白表达水平明显低于野生型小鼠；以上所述的附图中**P<0.01。

图5显示DSS诱导的结肠炎模型中，miR-494-3p敲除抑制了结肠组织细胞的增殖，促进了结肠组织细胞的凋亡。图5a显示DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中ki67(增殖的标记物)染色显著低于野生型小鼠；图b显示DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中凋亡细胞数量明显高于野生型小鼠。

图6显示DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p敲除活化了炎症相关信号通路NF-κB和JAK/STAT3信号通路的活化。图6a和6b显示DSS喂养小鼠7天后，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中p-stat3及其上游的p-JAK1和p-JAK2水平明显高于野生型小鼠；图6c显示DSS喂养小鼠7天后，与野生型小鼠相比，miR-494-3p-/-小鼠结肠组织中p-P65蛋白水平显著升高。

图7显示DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p类似物保护了小鼠的结肠组织。图7a显示miR-494-3p类似物治疗DSS诱导的小鼠结肠炎操作路线；图7b显示miR-494-3p类似物尾静脉注射后，显著增加了结肠组织中的miR-494-3p表达；图7c显示miR-494-3p类似物处理后，小鼠体重明显回复；图7d显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠的结肠长度明显增长；图7e显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠的临床评分(DAI)显著降低；图7f显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠的结肠组织破坏程度以及组织学评分显著降低；以上所述的附图中*P<0.05，**P<0.01。

图8显示DSS诱导小鼠结肠炎模型中，miR-494-3p类似物治疗的小鼠结肠组织中，炎症细胞浸润和促炎因子表达明显降低。图8a显示miR-494-3p类似物治疗DSS诱导结肠炎后，小鼠结肠组织中巨噬细胞(F4/80阳性标记)和中性粒细胞(Ly6G阳性标记)数量明显减少；图8b和8c显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠结肠组织中促进炎症相关的细胞因子(8b)和趋化因子(8c)表达水平显著降低；以上所述的附图中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图9显示DSS诱导小鼠结肠炎模型中，miR-494-3p类似物治疗促进了结肠组织细胞的增殖并抑制了其凋亡。图9a显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠结肠组织ki67(增殖标记物)染色阳性的细胞明显增加；图9b显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠结肠组织凋亡细胞数目明显减少。

图10显示DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p类似物抑制了炎症相关信号通路NF-κB和JAK/STAT3信号通路的活化。图10a和10b显示miR-494-3p类似物处理后，小鼠结肠组织中p-stat3及其上游p-JAK 1和p-JAK 2蛋白水平显著降低；图10c显示miR-494-3p类似物治疗后，小鼠结肠组织中p-P65的蛋白水平明显被抑制。

图11显示IKKβ是miR-494-3p的靶基因。图11a显示利用TargetScan软件预测了IKKβ中miR-494-3p的靶位点，与miR-494-3p“seed sequence”互补的核苷酸用方框框处，数字代表在3’UTR的位点；图11b显示鼠源的IKKβ能够被miR-494-3p所调控；图11c显示在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，miR-494-3p敲除上调了结肠组织中IKKβ的蛋白表达；图11d显示miR-494-3p类似物治疗小鼠结肠炎中，miR-494-3p类似物下调了结肠组织中IKKβ的蛋白水平；以上所述的附图中*P<0.05。

图12显示脂多糖(lps)处理原代结肠上皮细胞后，miR-494-3p模拟物(miR-494-3pmimic)抑制了NF-κB和JAK/STAT3信号通路的活化以及炎症细胞因子的表达。图12a显示miR-494-3p mimic在IEC细胞中成功地上调了miR-494-3p的水平，并且伴随着lps处理时间的延长miR-494-3p的表达显著被下调；图12b显示lps处理后，miR-494-3p过表达的原代结肠上皮细胞中p-stat3、p-P65和miR-494-3p靶基因IKKβ均显著被下调；图12c显示miR-494-3p过表达的原代结肠上皮细胞中IL1-beat和IL6的水平明显降低；以上所述的附图中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现一类miRNA：miR-494-3p、经修饰的miR-494-3p衍生物、或miR-494-3p类似物；该类miRNA能直接参与肠炎的发生，在肠炎发生过程中，miR-494-3p保护结肠上皮细胞间紧密连接来维持正常的肠上皮通透性；在肠炎发生中，miR-494-3p的低表达增加了结肠组织中巨噬细胞的浸润和炎症相关细胞因子的分泌；在小鼠体内注射miR-494-3p类似物可以缓解DSS引发的结肠炎；肠炎发生过程中，miR-494-3p被下调。因此，miR-494-3p可以作为肠炎的检测或治疗靶点。

MiRNA及其前体

如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(优选地约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。miRNA可被从细胞中分离。

miRNA可从前体miRNA(Precursor mirRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文中所用的，“基本上互补”是指核酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少70％的核苷酸是互补的；优选的，至少80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称为发夹结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA包括：miR-494-3p，或经修饰的miR-494-3p衍生物，或miR-494-3p类似物。其中，miR-494-3p的核苷酸如SEQ ID NO:1所示。

本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR-494-3p进行修饰，修饰的方式包括(但不限于)：烃基修饰、糖基化修饰、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、甲基化修饰、甲氧基化修饰、硫代修饰、胆固醇修饰、烷基修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、和/或磷酸骨架由磷脂连接代替的修饰等。其中，糖基化修饰基团包括：2-甲氧基-糖基、烃基-糖基、糖环基等。为了提高miRNA的稳定性或其他性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护碱基，如“TT”等，或在miR-494-3p序列的基础上改变一个到多个核苷酸而得到miR-494-3p的类似物。

所述经修饰的miR-494-3p衍生物可以是具有式(III)结构的单体或多聚体：

(X)n-(Y)m 式(III)

式(III)中，

X为序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

n为任选自1-50的(较佳地1-20，如5，10，15)正整数；例如，n为1、2、3、4或5；

Y为促进微小RNA施药稳定性的修饰物，其与X共价连接或偶联或附着于X；

m为1-1500的正整数，较佳地1-200，如10，20，50，100，150。

在另一优选例中，所述Y包括但不限于：胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的miRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被宿主(如人细胞)剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的miR-494-3p多核苷酸构建物含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 (I)

式(I)中，Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-494-3p的核苷酸序列；Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

式(I)所示的结构在转入细胞后，形成式(II)所示的二级结构：

通常，所述的多核苷酸构建位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起始点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：(a)miR-494-3p，或经修饰的miR-494-3p衍生物，或miR-494-3p类似物；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-494-3p；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录成(b)中所述的前体 miRNA，并加工形成miR-494-3p，或能在宿主内加工成miR-494-3p；(d)表达构建物，所述的表达构建物含有(a)中所述的miR-494-3p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；(e)(a)中所述的miR-494-3p的激动剂。

作为本发明的优选方式，所述的miR-494-3p来源于人或非人哺乳动物。

作为本发明的优选方式，(a)中所述的经修饰的miRNA衍生物具有如前所述的式(III)所示的结构。

作为本发明的优选方式，(c)中所述的多核苷酸具有如前所述的式(II)所示的结构。

作为本发明的优选方式，所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。

如本发明所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且被人和/或动物所接受的量。

如本文中所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂与给药方式匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领有普通技术人员根据各因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括(但不限于)：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：脂质体、纤维素、纳米凝胶载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备诊断和治疗肠炎的药物。所述的肠炎是miR-494-3p表达下调导致的炎症性疾病；较佳地，所述的肠炎包括(但不限于)：炎性肠病，结肠炎。

诊断方法

本发明还提供了一种诊断结肠炎的方法，在一个优选例中，包括步骤：分别检测待测样本和对照样本miR-494-3p的表达水平，如果与对照样本相比，待测样本的miR-494-3p的表达水平存在显著性降低，则是潜在的结肠炎患病样本；其中，所述的对照样本呈现正常的miR-494-3p表达水平或健康者的miR-494-3p表达水平。较佳地，所述的显著性降低是指：与对照样本相比，所述miR-494-3p的表达水平的降低幅度≥10％，较佳地≥20％，较佳地≥50％，更佳地≥80％，最佳地≥100％。

药物筛选

在得知了miR-494-3p与肠炎的密切相关性后，可以基于该特征来筛选上调miR-494-3p的表达的物质。可从所述的物质中找到对于缓解或治疗肠炎有用的(潜在)物质。

因此，本发明提供一种筛选缓解或治疗肠炎的潜在物质的方法，所述的方法包括：(1)用候选物质处理表达miR-494-3p的体系；和(2)检测所述体系中miR-494-3p的表达情况；其中，若所述候选物质可提高iR-494-3p的表达，则表明该候选物质是缓解或治疗肠炎的潜在物质。

所述的表达miR-494-3p的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-494-3p的细胞；或可以是重组表达miR-494-3p的细胞。所述的表达miR-494-3p的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-494-3p的表达的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-494-3p的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于缓解或治疗肠炎真正有用的物质。

本发明对于miR-494-3p的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的定量或半定量检测技术。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的缓解或治疗肠炎的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于上调miR-494-3p的表达和活性，进而缓解或治疗肠炎有用的物质。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明揭示了miRNA在DSS诱导的小鼠结肠炎中的调控作用，证明了miRNA直接参与结肠炎的发生，将miRNA和结肠炎的发生直接联系在一起；

(2)在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，组织以及血浆中miR-494-3p的表达水平会伴随着结肠炎的发生而降低；

(3)在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，miR-494-3p敲除小鼠比野生型小鼠表现出更严重的炎症反应(包括：体重下降和结肠缩短更明显，结肠粘膜层破坏更严重，炎症因子表达更高)以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的活化。

(4)在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，给小鼠尾静脉注射miR-494-3p类似物可以显著缓解结直肠炎的发生以及抑制NF-κB和JAK/STAT3信号通路的活化。

(5)miR-494-3p下调IKKβ的表达，miR-494-3p和IKKβ都可以作为结直肠炎的诊断或治疗靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

C57BL/6背景的miR-494-3p^-/-小鼠胚胎干细胞购自美国MMRRC(Mutant MouseResource&Research Centers)并委托南方模式生物公司进行胚胎解冻和胚胎移植。C57BL/6购买自上海灵畅生物科技有限公司。

293T(购自ATCC)，其培养基：DMEM(Hyclone)+10％胎牛血清(BI)+1％青链霉素双抗溶液(Gibco)。

原代结肠上皮细胞，其培养基：DMEM/F12(Hyclone)+10％胎牛血清(BI)+2％青链霉素双抗溶液(Gibco)+0.2％insulin(Sigma)。

细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

PCR用KOD-plus试剂盒购自TOYOBO公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB，葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MP Biomedicals司；胶原酶(Collagenase type XI)和分散酶(Dispase)购自Sigma公司；红细胞裂解液购自碧云天公司；Matrigel购自BD公司；LPS购自Sigma公司；TUNEL用TUNEL FITC Apoptosis Detection试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)购自Sigma公司；粪便隐血检测试纸购自艾康生物技术有限公司。

miR-494-3p敲除小鼠基因型鉴定引物序列见表1。

表1

SEQ ID NO:	引物方向	引物序列(5’-3’)
			3	正向	GGTCGCTTCTCATCACCCAC
4	反向1	AGTAGAAGGTGGCGCGAAGG
			41	反向2	GGGAAGCAGCCAATGATTTG

Q-PCR引物见表2。

表2

克隆3’UTR序列所用的引物见表3。

表3

克隆3’UTR突变序列所用的引物见表4。

表4

质粒构建

所有的3’UTR序列都是通过PCR扩增自C57BL/6小鼠结肠组织的cDNA，并接入市售的pGL6-miR载体(购自碧云天生物技术公司)，获得Luciferase报告质粒。所有的3’UTR突变序列则是通过PCR扩增自已构建好的pGL3.1-3’UTR 重组质粒，并接入市售的pGL6-miR载体，获得Luciferase报告质粒。

miR-494-3p模拟物(miR-494-3p mimic)和miR-494-3p类似物都由锐博生物公司合成。

miR-494-3p敲除小鼠(miR-494-3p-/-)的建立

C57BL/6背景的miR-494-3p^-/-小鼠胚胎干细胞购自美国MMRRC(Mutant MouseResource&Research Centers)：简单来讲，将靶向载体LoxP-F3-PGK-EM7-PuroΔtk-bpA-LoxP-FRT转染到野生型小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中，靶向载体的序列通过同源重组的方法置换野生型小鼠中的胚胎干细胞中的miR-494序列，进而得到中靶的ES细胞。中靶的胚胎干细胞可以在EM7/PGK启动子的作用下表达puromycin/thymidine kinase活性进而成功抵抗puromycin的筛选。购买的胚胎干细胞委托上海南方模式生物公司构建基因敲除小鼠：首先将胚胎干细胞显微注射入小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕小鼠的子宫内即可繁殖得到嵌合体小鼠，雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配即可繁殖得到基因敲除小鼠。

miR-494-3p类似物的制备

miR494-agomir序列为：UGAAACAUACACGGGAAACCUC(SEQ ID NO:42)，该序列经过甲基化和胆固醇修饰。

Control-agomir序列为：UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA(SEQ ID NO:43)，该序列经过甲基化和胆固醇修饰。

DSS诱导的结肠炎模型

将相应的6-8周龄雄性小鼠标记并纪录初始体重，每组小鼠8-10只，将小鼠笼内饮用水换置成2.5％的DSS溶液。每天更换饮用水并记录小鼠体重，连续喂养7天后将小鼠杀掉。在喂养过程中，每天收集小鼠粪便并按照以下临床评分标准予以评分以评估肠道炎症水平。

粪便隐血评分：0＝隐血检测试纸无法检测出出血；1＝隐血检测试纸可以检测出出血；2＝肉眼可以觉察到的粪便血迹；3＝明显的直肠出血。

粪便粘度评分：0＝完整的粪便颗粒；1＝不粘在肛门上的半成型的粪便；2＝粘在肛门上的半成型的粪便；3＝粘在肛门上的液化粪便。

小鼠原代结肠上皮细胞的分离和培养

在无菌环境下将小鼠结肠组织径向剪开，除去粪便后置于新的无菌PBS中，PBS含有1％(vol/vol)FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。用无菌剪刀将结肠剪成1到2mm2的组织块，继续用上述PBS溶液洗涤三次后，将组织块置于25ml配制好的肠道组织消化液中并置于37℃消化3小时。肠道组织消化液用含有1％(vol/vol)FBS，collagenase type XI(75U/ml)，dispase(20mg/ml)，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)的DMEM培养基配制而成。消化完成后，室温静置1分钟以使得大块未消化组织沉淀。此时消化液上清中含有肠道上皮细胞隐窝(Crypt)结构，小心吸取上清并转移至新的离心管中，加入等体积的S-DMEM溶液(含有5％(v/v)FBS，2％(v/v)D-山梨醇，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)的DMEM培养基)，轻轻颠倒混匀后室温200g离心4分钟。弃去上清，将沉淀用S-DMEM溶液重悬后继续室温200g离心4分钟，重复该步骤至少五次，直到上清清澈无杂质。将沉淀用5％(v/v)FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)的DMEM培养基重悬，并将其分到预先用Matrigel 4℃包被过夜的细胞培养板内，待细胞贴壁24小时后更换新鲜培养基以供后续实验。

细胞转染

质粒DNA和合成的miR-494-3p mimic分别使用Lipofectamine2000和Fugen转染，方法参照产品说明书。对于6孔板的一个孔，转染剂量为5ul miR-494-3p mimic。为了检测miR-494-3p对原代结肠上皮细胞的影响，在转染后24小时，再分别在特定时间点加入等量的LPS处理细胞。

免疫荧光染色以及拍照

小鼠结肠组织切片免疫荧光染色按照常用的方法操作；为了更好的脱蜡，石蜡切片事先在65℃烘箱中放置30min-1h；为了获得更好的抗原活性，所有实验采用高压锅修复抗原。免疫荧光图像使用Olympus BX61激光共聚焦显微镜拍摄。

双荧光报告实验

miRNA mimic RNA(20um)、含有相应基因的3’UTR的firefly luciferase报告质粒和Renilla luciferase质粒的转染比例为2:1:0.1。HEK293T细胞转染24 小时后使用Dual-luciferase Reporter Assay System(Promega)测定firefly Luciferase强度，Renillaluciferase强度作为内参。

反转录PCR(RT-PCR)和实时定量PCR(Real-time Q-PCR)

小鼠结肠组织使用TRIzol reagent(TaKaRa)裂解，并按照说明书操作提取总RNA。每个样品取1ug RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Prefect Real Time)试剂盒(TaKaRa)反转录。实时定量PCR使用HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(翊圣生物科技公司)，在Applied Biosystems 7900sequence Detection System上进行。反应体系为10ul，包含2ul RT-PCR产物、0.5uM引物和5ul HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix。反应条件为95℃5分钟，(95℃10秒，60℃30秒)×40。所有的反应重复3次，使用GAPDH作为内参。miR-494-3p的定量使用U6作为内参。

免疫印迹分析

小鼠的结肠组织或转染后细胞，使用RIPA裂解液裂解30min，冷冻离心后取上清为蛋白裂解液。蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳。电泳后将蛋白转移到硝酸纤维膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，随后与相应的一抗(稀释于3％BSA-TBST)在4℃孵育过夜。次日洗去多余的一抗，并与相应的二抗室温孵育1小时，先用TBST洗涤，再用水洗去TBST，使用ECL化学发光液(Sigma)和X胶片(Kodak)检测抗体信号。

小鼠肠上皮通透性检测

DSS喂养小鼠第7天，按照0.6mg(70Kda FITC-Dextran)/g(小鼠体重)的剂量给小鼠灌胃，4小时后收集小鼠的结肠组织和血浆。结肠组织做冰冻切片以便后续荧光显微镜拍照，血浆与磷酸缓冲液(PBS)等体积稀释后取100ul至96孔板中490nm检测荧光发光数值。

数据统计

本文统计数据为3次独立实验结果的平均值±S.D.，使用非配对t检验(unpairedStudent’s T-test)来检验实验差别的显著性，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。显著性检验和绘图使用Graphpad5.0软件。

实施例1、正常喂养条件下miR-494-3p敲除不影响小鼠的体重和结肠组织结构

在本实施例中，利用qPCR分别检测miR-494-3p-/-小鼠和野生型小鼠结肠组织中miR-494-3p的相对含量以确保miR-494-3p在小鼠体内成功被敲除(图1a)。接下来，通过连续统计2-8周的miR-494-3p-/-小鼠和野生型小鼠的体重，观察miR-494-3p的敲除是否影响小鼠体重(图1b)。观察20周龄的miR-494-3p敲除小鼠和同龄的野生型小鼠的结肠组织以便确定miR-494-3p敲除是否会导致小鼠自发肠炎，HE染色结果显示(图1c)，miR-494-3p敲除小鼠的结肠组织与正常小鼠相似，并未有自发肠炎出现。

图1的结果表明，正常喂养条件下miR-494-3p敲除不影响小鼠的体重和结肠组织结构。

实施例2、miR-494-3p敲除促进了DSS诱导的小鼠结肠炎的发生发展

本实施例试图检验miR-494-3p是否与DSS诱导的结肠炎有关。发明人在miR-494-3p-/-小鼠和野生型小鼠中建立DSS诱导结肠炎小鼠模型。DSS喂养的7天中，每天观察并记录小鼠的体重、粪便和隐血情况。喂养7天后收集小鼠的结肠组织、血浆进行后续试验。发明人通过观察并统计小鼠的体重、结肠长度、临床评分、结肠组织切片HE染色和组织学评分，发现miR-494-3p-/-小鼠的结肠炎比野生型小鼠更严重，并且具有显著性差异(图2a-e)。

另一方面，为了检测DSS诱导的结肠炎模型中，miR-494-3p自身的表达量是否与变化，发明人利用qPCR分别检测了DSS喂养的野生型小鼠和正常喂养的小鼠的结肠组织和血浆中的miR-494-3p相对含量，发现DSS诱导结肠炎后miR-494-3p表达显著下调(图2f)。

进一步，为了确认miR-494-3p敲除后的促炎作用，发明人检测了小鼠的血常规，miR-494-3p-/-小鼠血液中白细胞总量是对照组的3倍左右；其中中性粒细胞上调倍数最大，其次是单核细胞和淋巴细胞(图3a)。此外，免疫荧光检测到miR-494-3p-/-小鼠结肠组织切片中浸润的巨噬细胞和中性粒细胞的阳性信号比野生型小鼠中的强(图3b)。qPCR检测促炎因子的表达水平发现miR-494-3p-/-小鼠中的表达水平明显比野生型小鼠高(图3c)。

实施例3、DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p的敲除增加了结肠上皮通透性

为了检测miR-494-3p敲除促进结肠炎的具体机制，发明人使用FITC-Dextran灌胃的方法来检测小鼠结肠上皮的通透性。

灌胃后，发明人通过激光共聚焦显微镜观察小鼠结肠上皮FITC的含量以及分布，结果发现DSS喂养的miR-494-3p-/-小鼠结肠中FITC荧光强度更大，分布也渗入到黏膜甚至黏膜下层(图4a)，但是正常喂养条件下miR-494-3p-/-小鼠与野生型小鼠没有差异。

通过收集小鼠血浆，检测血浆内FITC含量发现DSS喂养的miR-494-3p-/-小鼠血浆中FITC信号比对照组高约4倍，但是正常喂养的小鼠中二者之间没有明显变化(图4b)。

为了进一步确认小鼠肠上皮通透性的变化，发明人检测了与肠上皮通透性密切相关的紧密蛋白claudin1的表达，发现DSS喂养小鼠模型中，claudin1在miR-494-3p-/-小鼠结肠中表达量更少(图4c)。

实施例4、DSS诱导的结肠炎模型中，miR-494-3p的敲除抑制结肠上皮细胞的增殖并促进其增殖

为了考察miR-494-3p除了影响肠上皮通透性之外是否还调控了肠上皮细胞的其他方面。发明人通过免疫荧光检测小鼠结肠组织增殖和凋亡情况，发现miR-494-3p-/-小鼠中ki67荧光信号更弱，TUNEL检测凋亡的荧光信号更强(图5)。说明小鼠结肠组织细胞的增殖在miR-494-3p-/-小鼠中发生显著下降，凋亡发生显著上升。

实施例5、DSS诱导的结肠炎模型中，miR-494-3p的敲除活化了JAK/stat3和NF-κB信号通路

为了探究miR-494-3p在DSS诱导的结肠炎中发挥作用的分子机制，发明人检测了和炎症反应紧密相关的信号通路的活化情况。通过免疫印迹和免疫荧光实验，发现在DSS诱导的结肠炎模型中miR-494-3p的敲除导致了p-stat3(stat3的活化形式)及其上游p-JAK1、p-JAK2(分别是JAK1和JAK2的活性形式)表达水平的升高(图6a，图6b)。另外，发明人还检测了炎症反应经典信号通路NF-κB的活化情况，发现miR-494-3p的敲除造成p-P65的上调(P65的活性形式)(图6c)。

实施例6、DSS诱导结肠炎模型中，miR-494-3p类似物的治疗缓解了结肠炎的发生

为了进一步确认miR-494-3p在结肠炎中的作用，在DSS喂养过程中，发明人通过尾静脉注射miR-494-3p类似物(图7a)，使其过表达，以期达到治疗结肠炎的目的。

确认miR-494-3p在结肠组织中过表达(图7b)后，分别观察并统计了小鼠的体重、结肠长度、临床评分、结肠组织结构和组织学评分(图7c-图7f)，发现miR-494-3p过表达小鼠中结肠炎有明显减轻的趋势。此外，发明人还检测了结肠组织炎症细胞的浸润和促炎因子的表达，也发现与对照组相比miR-494-3p过表达小鼠中巨噬细胞和中性粒细胞的荧光强度明显减弱，同时促炎因子表达水平的显著降低(图8)。

接下来，发明人还检测了miR-494-3p过表达后对小鼠结肠上皮细胞的增殖和凋亡的影响，发现miR-494-3p的过表达促进了结肠上皮细胞的增殖并抑制了凋亡的发生(图9)。

为了确认miR-494-3p在结肠炎中发挥作用的分子机制，发明人检测了miR-494-3p过表达后小鼠结肠组织中NF-κB和JAK/STAT3，发现miR-494-3p过表达后p-stat3及其上游p-JAK1、p-JAK2和p-P65的表达量都有下降(图10)。

以上结果表明，miR-494-3p类似物在结肠炎模型中起到显著的治疗作用。

实施例7、miR-494-3p下调IKKβ的表达

在本实施例中，利用软件TargetScan分析了多种基因的3’UTR区，发现在IKKβ的3’UTR上有潜在的miR-494-3p作用位点(图11a)。发明人通过双荧光报告基因证明合成的miR-494-3p mimic可以抑制带有IKKβ的3’UTR的荧光素酶的表达；当把一个位点突变后荧光素酶的表达不再受到抑制(图11b)。

为了进一步确认miR-494-3p对IKKβ的下调作用，发明人利用免疫印迹检测了DSS诱导结肠炎模型中结肠组织中IKKβ的表达，发现在miR-494-3p敲除小鼠中IKKβ表达被上调，但是当过表达miR-494-3p后IKKβ表达被下调(图11c)。

实施例8、miR-494-3p抑制结肠上皮细胞中JAK/stat3和NF-κB的活化

本实施例中，发明人分离了3周龄C57BL/6小鼠的结肠上皮细胞并进行体外培养。待细胞培养至汇合率70％左右时，将control-mimic和miR-494-3p mimic分别转染进细胞，转染24小时后取不同时间点加入1ug/ml脂多糖(使其处理时间分别为0，5.5小时，12.5小时)。通过qPCR检测miR-494-3p过表达效率，发现miR-494-3p mimic转染的细胞中miR-494-3p上调10倍左右，而且在control-mimic组中，随着脂多糖处理时间的延长，miR-494-3p水平逐渐降低(图12a)。免疫印迹检测信号通路JAK/stat3和NF-κB的活化情况发现miR-494-3p明显下调了p-stat3、IKKβ和p-P65的表达(图12b)。

另外，发明人检测了IL1-beta和IL-6的表达水平，发现miR-494-3p过表达后二者的水平分别比对照组降低50％和75％(图12c)。IL1-beta和IL-6作为诱发炎症反应的因子，它们的下调表明炎症反应显著缓解。

实施例9、药物筛选

取小鼠小肠隐窝并体外培养得到organoids，该细胞结构可内源性表达miR-494-3p。将该种细胞结构作为用于筛选缓解或治疗肠炎的药物的模型。

测试组：用候选化合物处理的上述organiods的培养物；

对照组：不用候选化合物处理的上述organiods的培养物。

在处理后适当时间，测定所述细胞的miR-494-3p的表达。如果与对照组相比，测试组中的miR-494-3p的表达显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解或治疗肠炎的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种用于检测和治疗炎性肠病的microRNA

<130> 170351

<160> 43

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 1

ugaaacauac acgggaaacc uc 22

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 2

ttgatacttg aaggagaggt tgtccgtgtt gtcttctctt tatttatgat gaaacataca 60

cgggaaacct cttttttagt atcaa 85

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ggtcgcttct catcacccac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

agtagaaggt ggcgcgaagg 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

acactccagc tgggtgaaac atacacggga 30

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

tgtaatgaaa gacggcacac c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

tcttctttgg gtattgcttg g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

gatggatgct accaaactgg at 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 10

ccaggtagct atggtactcc aga 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 11

cctctagctg gaacacagtg c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

gcggttctca tctgtgtcg 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 13

cagggagagc ttcatctgtg t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 14

gctgagcttt gagggatgat 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 15

cctctagctg gaacacagtg c 21

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 16

gcggttctca tctgtgtcg 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 17

ggctgcctta ctcctgctg 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 18

tcatcttgcc aggtgagact g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 19

tccgaggagt cagtgctaaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 20

agaacgtctt ccagggtgaa 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 21

cagcagctct ctcggaat 18

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 22

acaaccatct tcacactgga tacg 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 23

atgaacgcta cacactgcat c 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 24

ccatcctttt gccagttcct c 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 25

gatgctcttc cgagctgtg 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 26

ggattggaac agcaaggatt t 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 27

agactccagc cacactccaa 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 28

tgacagcgca gctcattg 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 29

cctggttcag aaaatcatcc a 21

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 30

cttccgttga gggacagc 18

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 31

atttccacac ttctatgcct cct 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 32

atccagtatg gtcctgaaga tca 23

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 33

aactgggtga aaagggctgt 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 34

gtccaattcc atcccaaaaa 20

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 35

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 36

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 37

actggtacct gtttccagac agcagac 27

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 38

actgagctcg aggcagcaat atccaca 27

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 39

cttctcccct ggtaaaacaa agaaccttct gtgctggt 38

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 40

accagcacag aaggttcttt gttttaccag gggagaag 38

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 41

gggaagcagc caatgatttg 20

<210> 42

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> miR494-agomir

<400> 42

ugaaacauac acgggaaacc uc 22

<210> 43

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Control-agomir

<400> 43

ucacaaccuc cuagaaagag uaga 24

Claims

1.活性成分在制备缓解或治疗肠炎的药物组合物中的用途；其中，所述的活性成分选自下组：

(a)miR-494-3p；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-494-3p；

(e)(a)中所述的miR-494-3p的激动剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-494-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(d)中所述表达构建物具有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 (I)

式(I)中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-494-3p的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-494-3p的激动剂是mir494-agomir。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(b)中所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肠炎是miR-494-3p表达下调导致的炎症性疾病。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肠炎包括：炎性肠病，结肠炎。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的活性成分通过抑制JAK/stat3信号通路发挥作用，或通过抑制NF-κB信号通路发挥作用，或通过下调p-stat3、IKKβ和/或p-P65的表达发挥作用，或通过降低IL1-beta和IL-6的表达水平发挥作用。

9.一种筛选缓解或治疗肠炎的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miR-494-3p的体系；和

(2)检测所述体系中miR-494-3p的表达情况；

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-494-3p的体系中；和/或

如果测试组中miR-494-3p的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是缓解或治疗肠炎的潜在物质。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系还表达IKKβ；

步骤(2)还包括：检测测试组的体系中IKKβ的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达IKKβ的体系；

如果测试组中IKKβ的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是缓解或治疗肠炎的潜在物质。