CN103849601B - 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。具体地,miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124对于成纤维细胞转分化为神经元细胞是不可缺少的,所述的转化过程没有经过明显的干细胞克隆阶段,采用逆转录病毒系统,在人成纤维细胞中稳定高效地过表达上述的miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,从而调节细胞的一系列生化反应,将成纤维细胞转分化为神经元细胞。本发明还提供了miRNA组合(miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124)的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和神经发育领域,具体地,本发明涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。
背景技术
神经系统疾病,特别是中枢神经系统退行性疾病是临床中的常见病和多发病,严重危害着人类的健康。世界卫生组织2007年2月发布的报告指出,全球超过10亿人承受着神经退行性疾病的痛苦,2005年全球有2400多万人患有阿尔茨海默病;其它中枢神经系统退行性疾病,如多发性硬化,亨廷顿氏症和帕金森氏综合症,也给患者带来极大的痛苦。
由于这些患者的某些神经细胞不可逆的损伤,又很难由自体的神经干细胞补充,除了常规药物治疗之外,细胞替代性治疗具有良好的应用前景,已经成为生物医学研究的热点。
生物细胞移植疗法是将体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养的人体生物细胞种进行移植,从而替代患者体内已经丧失功能的细胞,以达到缓解症状以至于治愈疾病的目的。用于移植的神经细胞的来源是神经退行性疾病细胞替代性治疗研究的一个重点,然而,由于无法像骨髓造血干细胞那样进行有效的动员和采集,临床治疗所需神经细胞的来源受到很大的限制。理想的供体细胞应该能直接从病人身上取得原始细胞,并能够进行大量的扩增,并具有特定的生物学功能,进入体内后能够发挥相应的生理作用。
胚胎干细胞具有体外增殖和多向分化的特点,可以作为临床用种子的来源,然而其不可避免的产生的免疫排斥反应,制约了其进一步的应用。
2007年,科学家将皮肤细胞转换成诱导性多潜能干细胞,它与胚胎干细胞具有相似功能,同时回避了胚胎干细胞的伦理争议,还解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题。相较于克隆和胚胎干细胞的限制性,诱导性多潜能干细胞无疑更进一步,但它的缺点也很明显。它不易获取,成功率极低;耗时久且稳定性相对欠缺,具有致癌风险。
为了解决这些潜在的隐患,直接将皮肤细胞转化为神经元是一个良好的研究方向。将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法具有巨大的应用前景,因此迫切需要进行相应的开发。
发明内容
本发明的目的就是提供一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。
在本发明的第一方面,提供了一种miRNA组合的用途,所述的miRNA组合包括:miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124;并且,所述的miRNA组合用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞,或用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂。
在另一优选例中,所述的miRNA组合还具有任选自下组的特征或其组合:
(1)miRNA-302/367簇的前体具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列;
(2)miRNA-9的前体具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列;
(3)miRNA-124的前体具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列;
(4)miRNA-302/367簇具有SEQIDNO.:4-8任一所示的成熟的核苷酸序列;
(5)miRNA-9具有SEQIDNO.:9所示的成熟的核苷酸序列;
(6)miRNA-124具有SEQIDNO.:10所示的成熟的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂为:质粒、黏粒、或病毒载体。
在本发明的第二方面,提供了一种核苷酸载体,所述的载体上整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的核苷酸载体为病毒载体,较佳地为慢病毒载体。
在本发明的第三方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有第二方面所述的核苷酸载体,或所述的宿主细胞的染色体整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的宿主细胞来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为成纤维细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为人皮肤成纤维细胞。
在本发明的第四方面,提供了一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法,包括步骤:
(1)在所述的成纤维细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,获得miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124均过表达的成纤维细胞;
(2)将步骤(1)获得的成纤维细胞诱导分化为神经元细胞。
在另一优选例中,所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。
在另一优选例中,在步骤(1)中,包括步骤:用分别具有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体,转染所述的成纤维细胞。
在另一优选例中,具有编码miRNA-302/367簇的核苷酸序列的病毒载体还包括EF-1α启动子,和/或报告基因。
在另一优选例中,具有编码miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体还包括H1α启动子,和/或报告基因。
在另一优选例中,所述的报告基因为GFP报告基因。
在本发明的第五方面,提供了一种神经元细胞,所述的细胞是使用第四方面所述的方法制备的。
在另一优选例中,所述的神经元细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124。
在本发明的第六方面,提供了第五方面所述的神经元细胞的用途,所述的神经元细胞用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病为神经退行性疾病。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病选自下组:亨廷顿氏症、帕金森氏症、阿尔茨海默病。
在本发明的第七方面,提供了一种组合物,所述的组合物包括:第五方面所述的神经元细胞。
在另一优选例中,所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了组织块培养法获得的人类皮肤成纤维细胞;其胞体较大,细胞界限清楚,立体感强,以梭形为主,也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞。
图2显示了慢病毒感染后的各miRNA表达情况;图2a为miRNA302-abcd/367的相对表达量;图2b为miRNA-9的相对表达量;图2c为miRNA-124的相对表达量;对照组为感染空载体的皮肤成纤维细胞;从图中可以看出,感染后的皮肤成纤维细胞中,相对应的miRNA表达均有显著提高。
图3显示了皮肤成纤维细胞感染后的变化情况;从图3a到图3c分别显示报道基因GFP的荧光表达,皮肤成纤维细胞感染后随着时间的变化情况;其中图3a表示7天时的细胞形态;图3b表示14天时的细胞形态;图3c表示21天时的细胞形态;从图中可以看出,14天的时候有少量神经元样细胞开始出现,随后逐渐增加,21天的时候有大量神经元出现。
图4为本发明一个具体实施例中所获得的神经元;神经元胞体小,有多种形式的树突和轴突,明显区别于成纤维细胞的形态。
图5为神经元的免疫荧光鉴定;图5a为MAP2的免疫荧光染色,图5b为β-ⅢTubulin的免疫荧光染色。
图6为过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124实验组的流式检测结果,结果表明,33.04%的细胞表达神经细胞特有的标记物MAP2。
图7显示所获得的神经元的离子电流分析,表明所述神经元具有钠电流以及钾电流。
图8为仅表达miRNA-9和miRNA-124实验组的流式检测结果,结果表明,表达神经细胞特有的标记物MAP2的细胞比例为2.31%,远远低于组合使用miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的效率。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124对于成纤维细胞转分化为神经元细胞是不可缺少的,所述的转化过程没有经过明显的干细胞克隆阶段。采用逆转录病毒系统,在人成纤维细胞中稳定高效地过表达上述的miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,从而调节细胞的一系列生化反应,将成纤维细胞转分化为神经元细胞。在此基础上完成了本发明。
miRNA及其前体
本发明提供了涉及用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞一组microRNA或miRNA,microRNA与miRNA可以互换使用。
如本文所用,所述的“miRNA”是指一类RNA分子,从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有19~25个核苷酸(nt),也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(PrecursormiRNA,Pre-miRNA)加工而来,所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构,所述的茎环结构长度一般在50~100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构,茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成成熟的miRNA,所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用,“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的,可以以一种可预见的方式发生相互作用,如形成二级结构(如茎环结构)。通常,两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的;优选的,至少有80%的核苷酸是互补的;更优选的,至少有90%的核苷酸是互补的;进一步优选的,至少有95%的核苷酸是互补的;如98%、99%或100%。一般地,两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸;优选的,具有最多30个不匹配的核苷酸;更优选的,具有最多20个不匹配的核苷酸;进一步优选的,具有最多10个不匹配的核苷酸,如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用,“茎环”结构也被称作“发夹”结构,是指一种核苷酸分子,其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构,所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成,两个区域分列双链部分的两侧;其还包括至少一个“环”结构,包括非互补的核苷酸分子,即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的,核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如,插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构,然而,该两个区域仍可基本上互补,并在可预见的方式中发生相互作用,形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的,通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后,本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的一组miRNA是指:
1.miRNA302/367簇、或经修饰的miRNA302/367簇衍生物、或与miRNA302/367功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物;
2.miRNA9、或经修饰的miRNA9衍生物、或与miRNA9功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物;
3.miRNA124、或经修饰的miRNA124衍生物、或与miRNA124功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物.
在本发明的一个优选例中,miRNA302/367簇前体的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。
在本发明的一个优选例中,miRNA9前体的核苷酸序列如SEQIDNO.:2所示。
在本发明的一个优选例中,miRNA124前体的核苷酸序列如SEQIDNO.:3所示。
miRNA302/367簇可以在宿主细胞内剪切为5个成熟的序列,核苷酸序列如SEQIDNO.:4-8任一所示。
miRNA9前体的核苷酸序列可以在宿主细胞内剪切为成熟的序列,核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。
miRNA124前体的核苷酸序列可以在宿主细胞内剪切为成熟的序列,核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示。
在另一优选例中,所述的miRNA来源于人或非人哺乳动物,较佳地为人。
所述的“与miRNA功能相同或基本相同”是指保留了所述miRNA的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的生物学功能。
本发明还包括各个miRNA变体和衍生物,本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA进行修饰,修饰方式包括(但不限于):甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
根据本发明所提供的miRNA序列,可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物,也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。
由此,本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物),所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA可被宿主细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式,所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构:
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中,
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;或者,Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列,并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补;
式I所示的结构在转入细胞后,形成式III所示的二级结构:
式III
式III中,Seq正向、Seq反向和X的定义如上述;
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常,所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此,本发明还包括一种载体,它含有所述的miRNA,或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
miRNA组合及其应用
本发明提供了一种miRNA组合,包括:miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,并且
(1)miRNA-302/367簇的前体具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列;或,miRNA-302/367具有SEQIDNO.4-8任一所示的成熟的核苷酸序列;
(2)miRNA-9的前体具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列;或,miRNA-9具有SEQIDNO.:9所示的成熟的核苷酸序列;
(3)miRNA-124的前体具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列;或,miRNA-124具有SEQIDNO.:10所示的成熟的核苷酸序列。
本发明所述的miRNA组合用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞,或用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂。
所述用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂为:质粒、黏粒、或病毒载体。
本发明还提供了一种核苷酸载体,所述的载体上整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
优选地,所述的核苷酸载体为病毒载体,较佳地为慢病毒载体。
本发明还提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有所述的核苷酸载体,或所述的宿主细胞的染色体整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
优选地,所述的宿主细胞来源于人或非人哺乳动物。
或优选地,所述的宿主细胞为成纤维细胞。
更优选地,所述的宿主细胞为人皮肤成纤维细胞。
应用
本发明提供了一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法,包括步骤:
在所述的成纤维细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,获得miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124均过表达的成纤维细胞;将获得的成纤维细胞诱导分化为神经元细胞。所述的成纤维细胞优选人皮肤成纤维细胞。
优选地,用分别具有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体,转染所述的成纤维细胞。
优选地,具有编码miRNA-302/367簇的核苷酸序列的病毒载体还包括EF-1α启动子,和/或报告基因;优选地,具有编码miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体还包括H1α启动子,和/或报告基因;所述的报告基因优选GFP报告基因。
由此,本发明还提供了一种使用所述的方法制备的神经元细胞;在所述的神经元细胞制备过程中,miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124是过表达的。
所制备的神经元细胞用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
所述的神经系统疾病选自下组:亨廷顿氏症、帕金森氏症、阿尔茨海默病。
药物组合物
本发明提供了一种包括本发明所述神经元细胞的组合物。
优选地,所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
本发明的药物组合物,包括药学上可接受的载体和有效量活性成分:本发明所述的神经元细胞。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途,用于预防或治疗神经系统疾病。
本发明的主要优点包括:
(1)皮肤成纤维细胞取材容易,能获得足够的原始细胞;
(2)用本发明方法得到的神经元可以大量产生;
(3)本发明对特异疾病的药物筛选及神经疾病的研究和治疗有重要作用;
(4)miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124对于成纤维细胞转分化为神经元细胞是不可缺少的,所述的转化过程没有经过明显的干细胞克隆阶段。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
质粒和菌株
病毒表达载体LV3和LV4均购自上海吉玛基因股份有限公司(货号C06003,C06004),大肠杆菌top10购自Invitrogen,293T购自ATCC。
试剂
DMEM/F12、胎牛血清、0.05%胰酶、N2添加剂、B27添加剂购自gibco公司,Tizol购自Invitrogen。
多聚赖氨酸、laminin、阿糖胞苷、聚凝胺购自SIGMA。
免疫荧光用单克隆抗体购自abcam公司。
实施例1
原代皮肤成纤维细胞的获得及培养
在手术室无菌条件下,切取新鲜的人皮肤组织,去除表皮和皮下组织,盐水反复冲洗后放入含双抗的DMEM/F12培养液内,带回细胞间。把组织块置培养皿内,PBS漂洗三遍后,眼科剪反复剪切组织块至合适大小,用镊子取组织块接种至6cm培养皿上,组织块间留约0.3-0.5cm的间距。放入37℃培养箱内30分钟,使培养的组织小块微干。从温箱中取出培养瓶,向皿底轻轻注入含成纤维细胞培养液3ml(90%DMEM/F12,10%FBS),让培养液慢慢覆盖附瓶壁上的组织小块,注意不要让细胞块漂浮,置37℃温箱内培养。3天后换液,加5ml培养液继续培养,三天换一次液。待原代培养细胞生长基本融合片时即可使用胰酶消化传代。
图1显示了组织块培养法获得的人类皮肤成纤维细胞培养物。
实施例2
miRNA-302/367簇表达载体的构建和逆转录病毒的制备
根据miRNA-302/367簇的序列,设计两条引物:
正向引物5’GCTCCCTTCAACTTTAACA3’(SEQIDNO:11)
反向引物5’-CCATCACCATTGCTAAAGT3’(SEQIDNO:12)
由英潍捷基公司人工合成上述的引物序列。
利用1mltrizol消化实施例1中获得的皮肤成纤维细胞,加入0.2ml氯仿,混匀,10000g离心15min,弃去水相,加0.3ml无水乙醇,混匀,2,000×g离心5min,弃上清,用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。混匀静置30min,2,000×g离心5min,弃上清,75%乙醇洗涤两次,2,000×g离心5min,弃上清,干燥后加10μl8mM的NaOH溶解,随后用90μlTE缓冲液稀释。
以此得到的基因组DNA为模板进行PCR反应,获得miRNA-302/367簇序列,该基因簇位于人类基因组上4号染色体113569030-113569713号碱基之间,序列如SEQIDNO:1所示。
用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化的PCR产物,按照质粒和目的片段之比为1∶6,用T4DNA连接酶将其连接到T载体上,转化大肠杆菌top10感受态细胞,涂布到含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)、blue-gal(40μg/ml)的LB琼脂板上上,37℃培养过夜,第二天挑取单克隆,PCR鉴定并挑选阳性克隆送往英潍捷基测序。
用常规方法将含有目的基因的T载体完成病毒载体的构建以及包装。骨架质粒采用lentivirus4(使用EF-1α启动子以及携带GFP报告基因)。表达质粒lentivirus4和包装质粒(envvector以及pacvector)共同转染293T细胞,48小时收上清,超滤浓缩备用。
实施例3
miRNA-9和miRNA-124表达载体的构建和逆转录病毒的制备
合成miRNA-9的前体序列,miRNA-9前体序列如SEQIDNO:2所示。
合成miRNA-124的前体序列,miRNA-124前体序列如SEQIDNO:3所示。
将miRNA-9和miRNA-124的前体序列插入lentivirus3质粒中(使用H1启动子以及携带GFP报告基因),表达质粒lentivirus3和包装质粒(envvector以及pacvector)共同转染293T细胞,48小时收上清,超滤浓缩备用。
实施例4
逆转录病毒的滴度测量以及感染后miRNA的表达测量
传代293T细胞至96孔板,采用有限稀释法,在荧光显微镜下测量所获得的逆转录病毒的滴度。
当hFib细胞的生长融合度达80%时,胰酶消化传代。控制细胞密度在1×105个每孔(6孔板)。孵育12h后进行病毒感染。加入终浓度为5μg/ml的聚凝胺以提高感染效率。
感染复数(MOI)设置为:1、5、10、20、50。经试验确定MOI值为10的时候已经可以达到好的感染效果。
感染后,RNAeasykit(购自QIAGEN公司)提取总RNA,反向茎环引物进行反转,随后进行定量PCR,确定miRNA的表达。
结果(图2)显示了慢病毒感染后的各个miRNA表达情况,其中,将对照组的表达量均设置为1,从图中可以看出实验组相对于对照组的相对表达量倍数。从图中可以看出感染后的皮肤成纤维细胞中,相对应的各个miRNA表达均有显著提高。
实施例5
组合感染皮肤成纤维细胞,诱导其转分化为神经元
传代皮肤成纤维细胞至6孔板,过夜贴壁后加入含miRNA-302/367簇、miRNA-9、miRNA-124的病毒感染,MOI值为10,加入终浓度为5μg/ml的聚凝胺,24h后换新鲜培养基。24h后重复感染一次。
六孔板以0.01%多聚赖氨酸处理1h,PBS洗两遍。再以20μg/mllaminin处理1h,PBS洗两遍,干燥10min备用。将感染后的成纤维细胞接种在处理过的6孔板上,过夜培养后更换神经培养基。
神经培养基配方(N2培养基:B27培养基=1∶1)
N2培养基:DMEM/F12,1%N2添加剂,1%L-谷氨酰胺,1%NEAA,0.5mMβ巯基乙醇。
B27培养基:NeuroBasal基础培养基,2%B27添加剂,1%L-谷氨酰胺,1%NEAA,0.5mMβ巯基乙醇。
每隔两天换液。在14天的时候以2.5μg/mL阿糖胞苷对培养物进行24h干预,随后更换新鲜培养基。
结果(图3)显示了皮肤成纤维细胞感染后的变化情况;从中可以看出,14天(图3b)的时候有少量神经元样细胞开始出现,随后逐渐增加,21天(图3c)的时候有大量神经元出现。
实施例6
神经元的鉴定
本发明中制备的神经元细胞具有神经元所特有的形态学特征,本领域的普通技术人员可以使用常规方法鉴别这些特征,例如,细胞形态、细胞特异性标记物、神经元的动作电位等。
1.本方法制备的神经元胞体小,有多种形式的树突和轴突,明显区别于成纤维细胞的形态(图4)。
2.同时也可以根据细胞是否表达各种类型的神经细胞特有的表型标记而加以定性,相关的一些标记包括神经元特有的微管蛋白β-ⅢTubulin、微管相关蛋白MAP2。
免疫荧光方法:细胞以4%多聚甲醛37℃固定15分钟后,PBS洗涤。1%Triton溶液室温通透15min,用3%BSA封闭60min。用PBS稀释一抗,加入培养板中,37℃度孵育1h。PBS-T(PBS,0.5%Tween20)洗涤,加二抗孵育1h,洗涤后荧光显微镜观察。图5显示所获得的神经元表达神经细胞特有的标记物MAP2以及β-ⅢTubulin;图5a为MAP2的免疫荧光染色,图5b为β-ⅢTubulin的免疫荧光染色。
3.通过流式细胞术检测神经元的产生效率
细胞以0.05%胰酶消化后重悬,随后参照免疫荧光的方法,以MAP2进行免疫荧光染色,随后以流式细胞仪检测神经元细胞产生的效率。图6显示流式细胞术的检测结果,结果表明,33.04%的细胞表达神经细胞特有的标记物MAP2。
4.离子电流观察
细胞外液成分:NaCl140mM、KCl2.5mM、CaCl22.5mM、MgCl22mM、NaHPO41mM、葡萄糖20mM、HEPES10mM;
细胞内液成分:NaCl4mM、KCl20mM、Mg2ATP4mM、NaGTP0.3mM、Na2PCr10mM、EGTA0.5Mm、K-gluconate120mM、HEPES10mM。
图7显示所获得的神经元的离子电流分析,表明所述神经元具有钠电流以及钾电流。
5.因此,上述所有结果表明,用本方法可以成功地将人皮肤细胞转分化为具有生物活性的神经元细胞。
实施例7
对照试验
重复按照实施例1所述的原代皮肤成纤维细胞获得及培养的方法、实施例2-3所述的载体构建和病毒制备的方法、以及实施例4-6所述的转染及检测方法,所不同的是:
对照1:仅使用miRNA-302/367簇;
对照2:单独使用miRNA-9;
对照3:单独使用miRNA-124;
对照4:同时使用miRNA-9以及miRNA-124。
结果表明:对照1-对照3都没有观察到神经元细胞的出现;对照4发现了有少量神经元细胞的出现,但是效率非常低,图8显示对照4(同时使用miRNA-9以及miRNA-124组)的流式检测结果。结果表明,表达神经细胞特有的标记物MAP2的细胞比例为2.31%,远远低于组合使用的效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海生物制品研究所有限公司
<120>一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用
<130>P2012-1175
<160>12
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>684
<212>DNA
<213>智人(Homosapiens)
<400>1
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<211>89
<212>RNA
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<211>23
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<212>RNA
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<211>20
<212>RNA
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
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<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccatcaccattgctaaagt19
Claims (8)
1.一种miRNA组合的用途,其特征在于,所述的miRNA组合包括:miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124;并且,所述的miRNA组合用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞,或用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的miRNA组合还具有任选自下组的特征或其组合:
(1)miRNA-302/367簇的前体如SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列;
(2)miRNA-9的前体如SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列;
(3)miRNA-124的前体如SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列;
(4)miRNA-302/367簇如SEQIDNO.:4-8任一所示的成熟的核苷酸序列;
(5)miRNA-9如SEQIDNO.:9所示的成熟的核苷酸序列;
(6)miRNA-124如SEQIDNO.:10所示的成熟的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂为:质粒、黏粒、或病毒载体。
4.一种核苷酸载体,其特征在于,所述的载体上整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞含有权利要求4所述的核苷酸载体,或所述的宿主细胞的染色体整合有外源性编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
6.一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(1)在所述的成纤维细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124,获得miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124均过表达的成纤维细胞;
(2)将步骤(1)获得的成纤维细胞诱导分化为神经元细胞。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,包括步骤:用分别具有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体,转染所述的成纤维细胞。
8.一种神经元细胞,其特征在于,所述的细胞是使用权利要求6所述的方法制备的,且所述的神经元细胞中外源性过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124。
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