CN114276998B - 脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用，是一种干预脂肪来源间充质干细胞(AMSC)衰老的修饰方法，通过表观调控TRAF3基因转录后水平的修饰策略来抑制AMSC衰老，基于该修饰可抵抗复制性衰老，化疗药物、毒素、氧化应激、辐照等诱导的细胞衰老，以及老年个体或代谢性疾病个体来源细胞本身的衰老负荷。并进一步通过小鼠肝衰竭模型等体内实验明确TRAF3KD修饰对于提高衰老AMSC肝病疗效的作用。本发明提供的制备肝病治疗的生物制剂，其制备周期更短，并且可消除AMSC衰老相关细胞功能损伤带来的不良效应，进而提升该细胞制剂在肝病临床治疗中的应用潜能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用，具体涉及通过表观遗传学修饰抑制TRAF3翻译来抑制脂肪来源间充质干细胞衰老，进而可提高其增殖能力和疗效的方法，并提供TRAF3KD修饰的AMSC(AMSC-TRAF3KD)在制备肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。。
背景技术
肝衰竭是一类由各种病因引起的肝细胞大量坏死而导致的肝脏功能的严重损害，表现为高胆红素血症、凝血功能障碍、腹水、肝性脑病等临床症候群。在我国，乙型肝炎病毒感染是引发肝衰竭的主要因素，乙肝急性发作或慢乙肝的重症化转归均可能导致肝衰竭的发生。由于我国乙肝患者人群基数庞大，因此肝衰竭等重症肝脏疾病的人数众多。肝衰竭具有极高的病死率，严重威胁患者的健康。目前，针对肝衰竭的治疗主要以内科支持和对症治疗为主，但治疗效果常常不佳，需要配合人工肝系统或进行肝移植。而血浆及肝源短缺大大制约了人工肝系统和肝移植在肝衰竭治疗中的应用。因此，探寻有效的治疗新靶位和新方法来降低其病死率十分关键。
间充质干细胞(MSC)已被证实具有强大的分化潜能、自我更新能力、免疫调节作用以及靶向治疗功能。基于MSC的治疗手段能缓解肝脏炎症、促进肝细胞再生，已在动物实验中显示出良好的疗效。并且小样本的临床研究显示，输注MSC的耐受性良好，可显著改善肝脏功能、降低Child-Pugh和MELD评分、减少腹水及总死亡率。虽然MSC在再生医学及肝病治疗中的作用已备受肯定，但其疗效仍存在局限性。其中许多缺陷，如增殖、迁移和分化能力差等，可能与其细胞衰老有关。在MSC移植前往往需要进行体外扩增，这就为复制所诱导的细胞衰老提供了机会。此外，从老年人及代谢性疾病患者身上获取的MSCs也会具有更高的衰老负担。因此，缓解甚至抑制MSC衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，有望显著提高MSC移植后的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是要提供脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法，是一种对AMSC中TRAF3进行表观遗传学抑制，并制备相应脂肪来源间充质干细胞(AMSC-TRAF3KD)的制备方法，是一种抑制AMSC细胞衰老，提高AMSCs肝病疗效的构建方法。所述的细胞衰老包括但不限于传代扩增导致的复制性衰老，化疗药物、毒素、氧化应激、辐照等诱导的细胞衰老，老年个体或代谢性疾病个体来源细胞本身的衰老负荷。
本发明脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法通过以下技术方案实现：
1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：
小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELLTM公司的小鼠和人MesenCultTM扩增试剂盒(货号：#05513，#05411)再添加2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素作为完全培养基进行培养扩增。AMSC增殖接近75％融合时，进行消化、传代。
2.TRAF3KD修饰的AMSC的构建：
以TRAF3KD慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-TRAF3KD感染AMSC。TRAF3KD修饰的mAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列如SEQ:NO.1所示，其特征为包含TRAF3mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列：
SEQ:NO.1
GGTCCTATTATTTGCAATCAGTAACAAAGATTCATCCTTGTGTCAATCATACAACACGGAGAGTCTTTGTCACTCAGTGTAATTAATAGCCTTCACCTCAGTAACAAAGATTCCAGAGGATACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTACCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGGCCCAGTGTTTAACCGCAGGGAAAATGAGGGACTTTTGGGGGCAGATGTGTTTCCATTCCGCTATCATAATGCCCCTAAAAATCCTTATTGCTCTTGCATAATGCCCCTAAAAGGCCTCTCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCTGAAGGCACGCGGTGAATGCC。
TRAF3KD修饰的hAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列SEQ:NO.2：GTTCTGTTATTTGCAGTCAGTAACAAAGATTCATCCTTGTGTCCATCATGCAACAAGGAGAATCTTTGTCACTTAGTGTAATTAATAGCTGGACTCAGTAACAACCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGGCCAGTGTTTCCATTACTGTTGCTAATATGCAACTCTGTTGAATATAAATTGGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATGGATTGCACT
2代AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用。随后OPTI-MEM培养基200μl，加入HitransG感染增强液50μl，随后加入10μlpLVX-IRES-ZsgGeen1-TRAF3KD慢病毒(滴度为108TU/ml，MOI值＝10)(MOI：感染复数)，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSC，培养8-12小时观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养。24小时后换成含5μg/mlpolybrene(聚凝胺)的完全培养基筛选培养3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100％后则可撤除polybrene。
3.AMSC-TRAF3KD中TRAF3表达水平分析：
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中TRAF3的蛋白表达水平。具体步骤如下：
(1)消化离心收集细胞，于细胞沉淀中加入适量含蛋白酶抑制剂的RIPI裂解液(普利莱，货号：C1053)，并充分混匀，12000g，4℃，离心5分钟，收集上清。
(2)采用BCA试剂盒(Thermo，货号：23228)进行蛋白定量。
(3)上样前吹走4-20％梯度浓度预制胶(GenScript)每孔中的甘油，细胞蛋白样本按40ug/空的蛋白量上样，电压140V跑胶约1小时，然后用自动转膜机转膜(GenScript，Trans-Blot Turbo)约15min。
(4)再在5％BSA(Servicebio，货号：G5001-100G)中封闭约1小时，然后孵育TRAF3一抗(CST，货号4729S，1:1000稀释)，4℃过夜。
(5)TBST洗膜3次，每次10分钟分钟；然后用HRP标记的抗兔二抗孵育1小时，再用TBST洗膜3次，每次10分钟。
(6)最后用ECL(BI，货号20-500-120)曝光。条带采用ChemiScope Western Blot成像系统(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(RawakSoftware,Inc.Germany)进行灰度比值分析。
结果显示，经TRAF3KD修饰的AMSC，其TRAF3蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSCs。
4.在体外培养传代诱导的细胞复制衰老模型中分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞衰老表型：
成人脂肪组织来源的天然hAMSC、hAMSC-Ctrl和hAMSC-TRAF3KD细胞分别传至第25代，小鼠脂肪来源的天然mAMSC、mAMSC-Ctrl和mAMSC-TRAF3KD细胞分别传至第9代。光镜下观察可见，天然hAMSC、hAMSC-Ctrl细胞显著增大并呈扁平化，细胞核变大，且出现空泡化；电镜下观察天然hAMSC、hAMSC-Ctrl细胞中的线粒体也明显融合增大，具有典型的衰老细胞特征。而hAMSC-TRAF3KD细胞则仍能维持经典的MSC细胞的长梭型特征，细胞核及线粒体形态较之传代早期的细胞(如2代细胞)也无明显改变。同样的，小鼠脂肪来源的mAMSC在体外培养传代后也具有类似表现。表明TRAF3KD修饰可有效避免AMSC细胞衰老。
进一步采用细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(C0602，碧云天)比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞的染色情况。
结果显示，天然hAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达29.5～33.4％、hAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达33.1～41.4％，而hAMSC-TRAF3KD细胞的蓝染阳性率仅为6.2～9.0％。天然mAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达59.2～75.6％、mAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达61.8～82.1％，而mAMSC-TRAF3KD细胞的蓝染阳性率仅为17.2～28.5％。
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中p21和p16蛋白表达水平。条带采用ChemiScope Western Blot成像系统(Clinx ScienceInstruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。
5.TRAF3KD修饰纠正老年小鼠和代谢性疾病小鼠AMSC的衰老表型：
分离培养得到的16月龄老年小鼠AMSC(oAMSC)按[0007]2.TRAF3KD修饰的AMSC的构建方法，采用[0008]SEQ:NO.1，构建TRAF3KD修饰的细胞(oAMSC-TRAF3KD)，同样以感染空慢病毒载体的oAMSC细胞(oAMSC-Ctrl)作为对照，并分离培养6周龄年轻小鼠AMSC(yAMSC)作为比较。
分离代谢性疾病小鼠(由高脂饮食和STZ处理诱导2型糖尿病合并脂肪肝模型小鼠，mdAMSC)，按上述方案构建TRAF3KD修饰的细胞(mdAMSC-TRAF3KD)，同样以感染空慢病毒载体的mdAMSC细胞(mdAMSC-Ctrl)作为对照。并以同周龄正常小鼠来源AMSC(ncAMSC)作为比较。
采用如前所述的SA-β-gal染色，Western Blot检测p21和p16蛋白表达水平，以及MitoSOXTM Red染色(Thermofisher，M36008)分析线粒体ROS水平，活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天)分析细胞ROS水平等，比较yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-TRAF3KD，ncAMSC、mdAMSC、mdAMSC-Ctrl和mdAMSC-TRAF3KD细胞的衰老表型。
本发明的另一个目的是提供TRAF3KD修饰的AMSC(AMSC-TRAF3KD)在制备肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。
本发明还公开了AMSC-TRAF3KD细胞制剂在治疗肝脏疾病中的作用及优势，具备以下作用中的任一项或多项：较之同等细胞数量的天然AMSC，AMSC-TRAF3KD可更为有效地(1)发挥对肝损伤及肝脏疾病的疗效；(2)抑制炎性小体激活及炎性因子分泌；(3)降低血清ALT、AST水平；(4)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死程度。并且较之天然AMSC，AMSC-TRAF3KD在长期培养和多次传代后仍可保持稳定高效的细胞扩增率，尤其是高代数细胞，TRAF3KD修饰可使细胞扩增效率提高2-4倍。
优选地，所述肝脏疾病包括但不限于药物或毒素诱导的急性肝损伤、肝炎、肝衰竭、肝纤维化。所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。
所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。
发明人在前期研究已成功建立了从脂肪组织分离培养MSC的技术。脂肪来源的MSC(AMSC)较之骨髓来源的MSC，其来源更为丰富，获取更为方便，扩增效率更高，因此在临床上具有良好的应用前景。但是我们在小鼠(mAMSC)及人的AMSCs(hAMSC)的体外培养扩增过程中均发现，随着体外传代次数的增加，AMSC表现出明显的衰老特征，如SA-β-gal染色增加，胞内p21和p16的蛋白表达水平升高，细胞上清中细胞衰老相关分泌表型(SASP)有关的一系列细胞因子水平也显著增加。另外，细胞中肿瘤坏死因子受体相关蛋白3(TRAF3)表达水平也显著提高。TRAF3属于TRAF(TNF受体相关因子)家族，该家族是一个多功能接头蛋白家族，可结合表面受体，并募集其他蛋白形成能够促进细胞反应的多蛋白信号转导复合体。该家族在细胞存活、增殖、分化和应激反应调控中发挥重要作用。提示，对TRAF3表达的干预，有望作为抑制AMSC衰老的调控策略。表观遗传学修饰作为一种在不改变DNA序列情况下，对基因功能的可逆修饰，较之基因编辑具有更高的安全性。因而，本发明旨在提供一种基于对AMSC中TRAF3的表观遗传学修饰而影响其表达，从而抑制AMSC衰老，进而提高AMSC在肝衰竭等重大肝脏疾病中的治疗潜能的方法。
本发明的TRAF3KD修饰的AMSCs的优点有：(1)较之天然AMSC扩增效率更高，并抵抗复制、化疗药物、辐射等多种因素诱导的细胞衰老；(2)可纠正老年个体或代谢性疾病患者脂肪组织来源AMSC的细胞衰老表型，消除衰老相关的AMSC细胞功能损伤，进而提高该类AMSC的治疗潜能；(3)所述的AMSC及其所制备的肝病治疗制剂或药物具有更好的肝脏疾病治疗效果。
附图说明
图1：AMSC细胞中TRAF3蛋白及mRNA表达水平：A.TRAF3KD修饰可降低小鼠mAMSC及成人hAMSC细胞中TRAF3蛋白表达水平。B.TRAF3KD修饰对TRAF3的mRNA水平无影响。ns表示无统计学差异。
图2：TRAF3KD修饰对AMSC衰老相关分泌表型(SASP)的影响：TRAF3KD修饰可降低复制衰老模型的AMSC中SASP相关分子的表达水平。**P＜0.01，ns表示无统计学差异。
图3：TRAF3KD修饰逆转老年小鼠AMSC的衰老表型：经TRAF3KD干预修饰的oAMSC，其SA-β-gal染色阳性率(A)，及其p21和p16蛋白表达水平(B)均显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近。yAMSC:6周龄年轻小鼠AMSC；oAMSC：16月龄老年小鼠AMSC。*P＜0.05，**P＜0.01。
图4：TRAF3KD修饰增强AMSC对巨噬细胞炎性小体通路的调控作用：AMSC-TRAF3KD较之AMSC-Ctrl和天然AMSC，能更为显著地抑制NLRP3炎症小体通路的活化，表现为降低NLRP3、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-IL-1β的水平和Pellino 2蛋白的表达。**P＜0.01，ns表示无统计学差异。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1 TRAF3KD修饰降低AMSC细胞中TRAF3蛋白表达水平：
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中TRAF3的蛋白表达水平。并采用PCR法检测上述细胞中TRAF3的mRNA表达水平。
如图1所示，经TRAF3KD修饰的mAMSC(mAMSC-TRAF3KD)，其TRAF3蛋白表达水平明显低于对照组mAMSC-Ctrl和天然mAMSC；同样的，经TRAF3KD修饰的hAMSC(hAMSC-TRAF3KD)，其TRAF3蛋白表达水平也明显低于对照组hAMSC-Ctrl和天然hAMSC；而成人或小鼠脂肪组织来源的AMSC细胞中的TRAF3 mRNA水平在经TRAF3KD修饰后，差异均不显著。
实施例2 TRAF3KD修饰抵抗培养传代诱导的AMSC细胞衰老：
小鼠及成人脂肪组织来源的天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞分别传至第9代(mAMSC)和第25代(hAMSC)，建立培养传代诱导的细胞复制衰老模型。
采用SA-β-gal染色法比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞的染色情况。光学显微镜计数5个视野的染色情况，并进行统计分析。结果显示，天然hAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达32.5±3.4％、hAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达37.5±4.4％，而hAMSC-TRAF3KD细胞的蓝染阳性率仅为7.5±1.3％。天然mAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达67.5±8.1％、mAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达71.5±9.7％，而mAMSC-TRAF3KD细胞的蓝染阳性率仅为25.2±4.9％。
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中p21和p16蛋白表达水平。结果显示，经TRAF3KD修饰的AMSC，其p21和p16蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC。
采用相对定量Real-time PCR法分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中衰老相关分泌表型Mmp3、Mmp13、PAI-1、MCP-1和TNF-ɑ的表达水平。结果显示，经TRAF3KD修饰的AMSC，其SASP相关分子表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC(图2)。
线粒体融合增大是MSC衰老的一个重要标志。电镜观察细胞线粒体形态，并采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中线粒体融合相关基因MFN1和MFN2蛋白表达水平。结果显示，经TRAF3KD修饰的AMSC，其线粒体融合增大程度明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC；并且，经TRAF3KD修饰的AMSC，其MFN1和MFN2蛋白表达水平亦明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC。
采用CCK8法比较AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞的增殖情况。结果显示，AMSC-TRAF3KD细胞的增殖速度明显高于AMSC和AMSC-Ctrl细胞，尤其在多次传代后，细胞增殖速度的差异更为显著。第25代(P25)hAMSC-TRAF3KD细胞较之hAMSC和hAMSC-Ctrl细胞，其增殖速度分别提高约2.8倍和3.3倍；第9代(P9)mAMSC-TRAF3KD细胞较之mAMSC和mAMSC-Ctrl细胞，其增殖速度分别提高约3.4倍和3.7倍。
实施例3 TRAF3KD修饰抑制化疗药物及辐照诱导的AMSC衰老：
采用多柔比星(Doxorubicin,Dox)诱导细胞衰老。AMSC铺6孔板，过夜培养，再加入200nM Dox处理48小时，然后换普通培养基再培养6天，收集细胞，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中p21和p16蛋白表达水平。
结果显示，TRAF3KD修饰可显著降低化疗药物诱导的AMSC细胞中p21和p16蛋白表达升高。另外，在5-FU、D-半乳糖、H2O2诱导的细胞衰老模型中，以及137Csγ射线诱导的辐照细胞衰老模型中也具有类似现象。表明TRAF3KD修饰对化疗药物诱导的AMSC衰老也有保护作用。
实施例4 TRAF3KD修饰纠正老年小鼠及代谢性疾病小鼠AMSC的衰老表型：
16月龄老年小鼠AMSC(oAMSC)感染TRAF3KD慢病毒以构建TRAF3KD修饰的细胞(oAMSC-TRAF3KD)，以感染空慢病毒载体的oAMSC细胞(oAMSC-Ctrl)作为对照，并以6周龄年轻小鼠AMSC(yAMSC)作为比较。
采用SA-β-gal染色法比较yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-TRAF3KD细胞的染色情况。结果显示，yAMSC细胞的蓝染阳性率达显著低于oAMSC；而经TRAF3KD修饰的oAMSC，其蓝染阳性率达显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近(图3A)。
采用Western Blot方法检测天然yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-TRAF3KD细胞中p21和p16蛋白表达水平。结果显示，yAMSC细胞中p21和p16蛋白表达水平显著低于oAMSC；而经TRAF3KD修饰的oAMSC，其p21和p16蛋白表达水平显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近(图3B)。
通过MitoSOXTM Red染色(Thermofisher，M36008)分析线粒体ROS水平。结果显示，yAMSC细胞中线粒体ROS水平(根据红色荧光值分析)显著低于oAMSC；而oAMSC-TRAF3KD的线粒体ROS水平显著低于oAMSC和oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近。细胞总ROS水平的分析也表明TRAF3KD修饰可纠正衰老所致的ROS升高。
另外，对ncAMSC、mdAMSC、mdAMSC-Ctrl和mdAMSC-TRAF3KD细胞的SA-β-gal染色、p21和p16蛋白表达水平检测、线粒体ROS和细胞总ROS水平的检测，均显示TRAF3KD修饰还能纠正代谢性疾病小鼠AMSC的衰老表型。
实施例5TRAF3KD修饰对AMSC中细胞干性/原癌基因的蛋白表达水平的影响：
基于细胞复制衰老模型，研究TRAF3KD修饰对AMSC中细胞干性/原癌基因的蛋白表达水平的影响。采用Western Blot(WB)方法检测天然AMSCs、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中OCT4、SOX2、NANOG、C-MYC等细胞干性蛋白表达水平。WB条带采用ChemiScope WesternBlot成像系统(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(RawakSoftware,Inc.Germany)进行灰度比值分析。结果显示，TRAF3KD修饰可显著缓解复制衰老导致的AMSC细胞中OCT4、SOX2和NANOG蛋白的表达降低。而对C-MYC蛋白的表达影响不大。由于C-MYC又是一个重要的原癌基因，其持续表达与肿瘤发生发展亦密切相关。表明TRAF3KD修饰在抵抗AMSC细胞衰老的同时，不会增加AMSC的成瘤性风险。
实施例6TRAF3KD修饰可增强AMSC对巨噬细胞炎性小体激活及炎性因子分泌的抑制作用：
巨噬细胞RAW264.7分别与天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞共培养，以AMSC培养基作为对照组(Vehicle)。再以LPS(100ng/mL)联合ATP刺激12h，然后采用ELISA检测细胞上清IL-1β、IL-1α和TNF-α水平；采用Western Blot(WB)方法检测细胞中NLRP3、Cleaved-Caspase-1,Cleaved-IL-1β和Pellino 2表达水平。WB条带采用ChemiScopeWestern Blot成像系统(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。
结果所示，AMSC-TRAF3KD较之AMSC-Ctrl和天然AMSC，能更为显著地降低LPS所诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-1α和TNF-α的分泌；并显著抑制NLRP3炎症小体通路的活化和Pellino 2的蛋白表达(图4)。
实施例7AMSC-TRAF3KD具有更好的肝病疗效：
C57小鼠腹腔注射LPS/GalN(10μg/kg的LPS+500mg/kg的D-GalN)建立急性肝衰竭模型。造模后即刻尾静脉输注5×105的yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-TRAF3KD细胞，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。造模6h后，处死小鼠并收集血清、肝组织等进行肝功能、肝脏病理、炎症因子检测等。血清ALT、AST检测分别采用FUJIDRI-CHEMSlide GFP/ALT-PIII和GOT/AST-PIII试剂盒，用DRI-CHEM 4000ie(FUJIFILM)测定。肝脏病理采用HE检测。血清炎症因子采用相应ELISA试剂盒进行检测。
结果显示，年轻小鼠AMSC(yAMSC)对小鼠急性肝衰竭的疗效显著优于老年小鼠AMSC(oAMSC)，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。
TRAF3KD修饰可显著提高oAMSC对肝衰竭小鼠模型的疗效，oAMSC-TRAF3KD较之oAMSC-Ctrl可更为有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。oAMSC-TRAF3KD对肝衰竭的治疗效果与yAMSC相当，甚至在降低血清炎症因子水平上效果更优。
另外，还比较了TRAF3KD修饰对于复制性衰老细胞及代谢性疾病小鼠来源AMSC的肝病疗效。结果显示，P8 mAMSC和P8 mAMSC-Ctrl细胞输注后不能有效改善肝脏病理，降低血清ALT、AST和炎症因子水平，和Vehicle组相比无显著差异；而P8 AMSC-TRAF3KD细胞输注后则能明显改善肝脏病理和肝功能，对肝脏炎症亦有明确的控制作用。
对ncAMSC、mdAMSC、mdAMSC-Ctrl和mdAMSC-TRAF3KD细胞肝衰竭疗效的比较显示，mdAMSC和mdAMSC-Ctrl细胞输注后和Vehicle组相比，非但不能有效改善肝脏病理，反而进一步导致血清ALT、AST和炎症因子水平的升高；而mdAMSC-TRAF3KD细胞输注后则能明显改善肝脏病理和肝功能，对肝脏炎症亦有明确的控制作用。
在APAP、ConA、CCl4等诱导的小鼠急性肝损伤模型中，同样显示TRAF3KD修饰可显著提高oAMSC的疗效。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 437
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
ggtcctatta tttgcaatca gtaacaaaga ttcatccttg tgtcaatcat acaacacgga 60
gagtctttgt cactcagtgt aattaatagc cttcacctca gtaacaaaga ttccagagga 120
tacctccact ccgtctaccc agtgtttaga ctacctgttc aggactccca aattgtacag 180
tagtctgcac attggttagg ctgggctggg ttagaccctc ggcccagtgt ttaaccgcag 240
ggaaaatgag ggacttttgg gggcagatgt gtttccattc cgctatcata atgcccctaa 300
aaatccttat tgctcttgca taatgcccct aaaaggcctc tctctccgtg ttcacagcgg 360
accttgattt aaatgtccat acaattaagg cacgcggtga atgccaagaa tggggctgaa 420
ggcacgcggt gaatgcc 437
<210> 2
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
gttctgttat ttgcagtcag taacaaagat tcatccttgt gtccatcatg caacaaggag 60
aatctttgtc acttagtgta attaatagct ggactcagta acaaccagag gacacctcca 120
ctccgtctac ccagtgttta gactatctgt tcaggactcc caaattgtac agtagtctgc 180
acattggtta ggctgggctg ggttagaccc tcggccagtg tttccattac tgttgctaat 240
atgcaactct gttgaatata aattggaatt gcactttagc aatggtgatg gattgcact 299
Claims (2)
1.一种非疾病治疗目的的脂肪来源间充质干细胞的抗衰老修饰方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）脂肪来源的间充质干细胞的制备：
小鼠AMSC和成人AMSC按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELL™公司的小鼠和人MesenCult™扩增试剂盒再添加2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml 青霉素和100U/ml 硫酸链霉素作为完全培养基进行培养扩增，AMSC增殖接近75%融合时，进行消化、传代；
（2）TRAF3KD修饰的AMSC的构建：
以TRAF3KD慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-TRAF3KD感染AMSC，TRAF3KD修饰的mAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列如SEQ:NO.1所示，包含TRAF3 mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列，TRAF3KD修饰的hAMSC的慢病毒表达载体包含特异片段序列如SEQ:NO.2所示；
（3）AMSC-TRAF3KD中TRAF3表达水平分析：采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中TRAF3的蛋白表达水平；具体步骤如下：
（a）消化离心收集细胞；
（b）采用BCA试剂盒进行蛋白定量；
（c）上样前吹走4-20%梯度浓度预制胶每孔中的甘油，细胞蛋白样本跑胶，然后转膜；
（d）再在5% BSA中封闭约1小时，然后孵育TRAF3一抗，过夜，
（e）用TBST洗膜，然后用HRP标记的抗兔二抗孵育，再用TBST洗膜；
（f）最后用ECL曝光，条带扫描后，再进行灰度比值分析，结果显示，经TRAF3KD修饰的AMSC，其TRAF3蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSCs；
（4）在体外培养传代诱导的细胞复制衰老模型中分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞衰老表型；采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞的染色情况，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-TRAF3KD细胞中p21和p16蛋白表达水平，条带采用ChemiScope Western Blot成像系统扫描后，再进行灰度比值分析；
（5）TRAF3KD修饰纠正老年小鼠和代谢性疾病小鼠AMSC的衰老表型：
分离培养得到的16月龄老年小鼠AMSC（oAMSC）按步骤（2）的方法构建TRAF3KD修饰的细胞(oAMSC-TRAF3KD)，同样以感染空慢病毒载体的oAMSC细胞（oAMSC-Ctrl）作为对照，并分离培养6周龄年轻小鼠AMSC（yAMSC）作为比较。
2.权利要求1所述方法提供的TRAF3KD修饰的AMSC在制备治疗肝脏疾病生物制剂中的应用，其特征在于，通过TRAF3KD修饰的AMSC抵抗复制、化疗药物、辐射诱导的细胞衰老，纠正老年个体或代谢性疾病患者脂肪组织来源AMSC的细胞衰老表型，消除衰老相关的AMSC细胞功能损伤，进而提高该类AMSC的疗效；所述肝脏疾病为药物或毒素诱导的急性肝损伤、药物或毒素诱导的急性肝衰竭。
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2021
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