CN109735570A

CN109735570A - Xist修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备及其应用

Info

Publication number: CN109735570A
Application number: CN201910122549.0A
Authority: CN
Inventors: 刘艳宁; 楼国华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109735570B

Abstract

本发明提供XIST修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备及其应用。通过构建XIST修饰的AMSC，制备其外泌体，并在细胞水平通过ELISA，WB，流式等实验明确AMSC‑XIST‑Exo对巨噬细胞功能表型的调控优势，并通过体内实验明确XIST修饰的AMSC来源外泌体对肝脏疾病的疗效及对肝脏巨噬细胞功能表型调控的作用优势。本发明提供的制备肝病治疗生物制剂，其AMSC‑XIST‑Exo的有效剂量可低至1mg/kg。可极大降低exosome治疗所需剂量(降低数十倍)，提升AMSC‑Exo甚至MSC‑Exo在肝病临床治疗中的应用潜能。

Description

XIST修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及间充质干细胞来源外泌体的制备及应用，具体涉及XIST(X非活性特异性转录物)修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-XIST-Exo)的制备及其应用。

背景技术

肝脏炎症的发生机制十分复杂，涉及病因、宿主遗传、机体免疫以及临床干预等多方面因素，其中机体的免疫反应在肝脏炎症的发生和发展过程中起决定性作用。各种天然免疫细胞，如单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞在炎症肝脏中募集、活化和增生，提示天然免疫系统在肝脏免疫炎症反应中具有十分重要的地位和作用。肝脏巨噬细胞占机体总巨噬细胞80％以上，占肝脏非实质细胞35％，其在肝脏免疫炎症反应中具有十分重要的地位和作用。肝脏炎症损伤时，肝脏巨噬细胞通过识别病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关模式分子(damage-associatedmolecular patterns，DAMPs)而活化，释放大量前炎症介质(如TNF-α、IFN-γ、ROS、HMGB-1等)介导剧烈的炎症反应。另一方面，巨噬细胞分泌保护性蛋白(如TGF-β1，IL-10)和血管内皮生长因子等，发挥免疫调节、炎症修复、纤维化形成和血管再生的作用。由此可见，巨噬细胞的功能状态可影响肝脏炎症反应的结局，其功能改变会直接影响肝脏疾病的发生发展。

肝脏巨噬细胞根据其起源和功能可以分为不同亚群，它们在肝损伤修复中发挥不同的功能。受到损伤因素刺激后，肝脏定居型巨噬细胞凋亡坏死，骨髓来源单核/巨噬细胞向肝脏浸润。后者表现很强的功能异质性和可塑性，能整合肝脏微环境信号重塑调节其表型。传统的巨噬细胞分型可根据其功能表型分为促炎型巨噬细胞(M1型)和抗炎型巨噬细胞(M2型)，但其并非简单的M1或M2两种极化状态，而是存在一个动态的演变过程。近来研究显示在肝损伤的不同阶段，可以分为ly6C^high和ly6C^low两个不同功能状态的亚群。ly6C^high巨噬细胞表现为促炎促损伤的作用，而ly6C^low巨噬细胞则表现为促纤维降解和促修复作用，因此肝脏中ly6C^high/ly6C^low比例也可作为评价肝脏巨噬细胞整体功能的重要指标。鉴于肝脏巨噬细胞在保持肝脏自稳态，损伤识别，促进炎症和纤维化，炎性消退和纤维降解，以及慢性肝损伤向肝细胞肝癌的转化过程均具有中枢性作用。因此，对于肝脏炎症、脂肪肝及肝纤维化/肝硬化等多种肝脏疾病的治疗，肝脏巨噬细胞可作为一个有效的治疗靶标。研发针对肝脏疾病的巨噬细胞靶向治疗策略，除阻断单核/巨噬细胞招募外，干预巨噬细胞分化过程、调控其细胞因子分泌亦是两种重要方式。

MSCs来源的exosome(外泌体)(MSCs-Exo)输注已在心血管、肾脏、肺部、神经系统等疾病治疗中表现出显著疗效。由于exosome较之MSCs本身，其免疫原性更低，稳定性更好、保存方便，无输注毒性，因此MSCs-Exo在临床治疗应用中更具优势。并且，我们在前期研究中已证实，脂肪组织来源MSCs(AMSCs)可通过其分泌的exosomes而在肝纤维化中发挥治疗作用。进一步的研究发现经荧光染料DiIC16(3)标记的AMSC-Exo尾静脉输注后，可与肝脏巨噬细胞共定位。提示AMSC-Exo可作为靶向巨噬细胞的肝病治疗策略的有效工具。

虽然AMSC-Exo在安全性及稳定性方面更具优势，且已在肝病动物模型中显示出了令人鼓舞的疗效，但同等疗效下其需要量远超AMSCs移植量，达到较好疗效的单只小鼠的AMSC-Exo输注量需要小鼠近1/3的脂肪组织。而由于现今MSC-Exo制备技术所限，满足临床治疗剂量的MSC-Exo尚难大量制备。因此，其临床应用推广尚有赖于通过改造提高其效力。

发明内容

本发明的目的是要提供一种XIST修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-XIST-Exo)的制备方法，是一种提高AMSC-Exo调控肝脏巨噬细胞功能表型能力的构建方法

本发明通过以下技术方案实现：

1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：

小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC用含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)培养，hAMSC采用含2％MSC培养无血清替代物(EliteCell,EPA-050)的MSC培养基进行培养。AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3-8代细胞用于后续实验。

2.XIST修饰的AMSC的构建：

XIST慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-XIST感染AMSC。表达质粒包含部分XIST目的片段序列如SEQ:NO.1所示，其特征为包含miR-155的sponge(海绵)序列，而对miR-17的sponge序列进行部分突变。

AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用。随后OPTI-MEM培养基200μl，加入Enhanced Infection Solution(感染增强液)50μl，随后加入10μlXIST慢病毒(滴度为10⁸TU/ml，MOI值＝10)(MOI：感染复数)，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSCs，培养8-12h观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养。24h后换成含5μg/ml polybrene(聚凝胺)的完全培养基筛选培养3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100％后则可撤除polybrene。所述感染增强液选用HitransG感染增强液。

3.AMSC-XIST-Exo分离

上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心(4℃,300g，10分钟)；取上清后再次离心(4℃，2000g，10分钟)；再次取上清进行离心(4℃，10,000g，30分钟)。弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟；收集沉淀用PBS重悬后，再次离心(100,000g，70分钟)，所得沉淀即为AMSC-XIST-Exo。

4.AMSC-XIST-Exo鉴定

通过NTA法(Nanoparticle Tracking Analysis:纳米颗粒跟踪分析法)分析其粒径，范围在67-142nm。并采用Western Blot或磁珠法(流式细胞术)检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。

5.采用荧光定量PCR法鉴定其中XIST的表达：

采用ncRNA试剂盒抽提RNA，然后进行逆转录。逆转录体系：RNA模板-1μg；RandomPrimer(随机引物200μM)-1μl；Oligo(dT)(25μM)-1μl；5×RT buffer-2μl；RTase Mix-2μl；RNase-free水-补至10μl。逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min。

再进行荧光定量PCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green Mix-10μl；XIST上游引物序列如见SEQ:NO.2所示：gtcaattgagagctttctatcagagcattattg)5μM-0.8μl；XIST下游引物序列如SEQ:NO.3所示：ggaaagaagaatgcagagccctgtacaaccttccttcctg，5μM-0.8μl；模板-2ul；dd水-补至20μl。PCR条件为：95℃预变性10min，然后95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环。

PCR结果分析：经XIST修饰的mAMSC，其XIST的表达水平明显高于对照组。

本发明的设计思路是构建XIST修饰的AMSC，制备其外泌体，并在细胞水平通过ELISA，WB，流式等实验明确AMSC-XIST-Exo对巨噬细胞功能表型的调控优势，并通过体内实验明确XIST修饰的AMSC来源外泌体对肝脏疾病的疗效及对肝脏巨噬细胞功能表型调控的作用优势。并进一步制备经疗效改进的肝脏巨噬细胞靶向生物制剂或药物。

本发明的另一个目的是提供XIST修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-XIST-Exo)在制备肝脏巨噬细胞靶向治疗制剂及肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。

本发明还公开了AMSC-XIST-Exo在调控巨噬细胞功能表型以及治疗肝脏疾病中的作用及优势，具备以下作用中的任一项或多项：较之天然AMSC-Exo，AMSC-XIST-Exo可更为有效地(1)调控巨噬细胞表型：促进抗炎修复表型，抑制促炎损伤表型；(2)抑制巨噬细胞炎症因子分泌；(3)促进巨噬细胞自噬；(4)减少巨噬细胞程序性坏死(坏死性凋亡)；(5)降低血清ALT、AST水平；(6)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死程度；(7)减少肝细胞脂肪变性，减少肝组织炎性细胞浸润。

优选地，所述肝脏疾病包括但不限于急慢性肝损伤、肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化。所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。

本发明提供的制备肝病治疗生物制剂，其AMSC-XIST-Exo的有效剂量可低至1mg/kg。可极大降低exosome治疗所需剂量(降低数十倍)，提升AMSC-Exo甚至MSC-Exo在肝病临床治疗中的应用潜能。

所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。

本发明的XIST修饰的AMSC来源外泌体的优点有：(1)较之天然AMSC来源外泌体具有更好的巨噬细胞功能表型调控作用；(2)所述的外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果；(3)所述的外泌体用于制备肝病治疗制剂或药物，其有效剂量大大降低，亦可显著减少用于外泌体制备的AMSC所需量。

附图说明

图1：XIST的表达分析：采用XIST特殊引物进行qRT-PCR分析，显示AMSC-XIST-Exo及AMSC-XIST-Exo处理的巨噬细胞中含高水平XIST。**P＜0.01。

图2：AMSC-XIST-Exo对巨噬细胞表型的影响：同剂量的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地上调巨噬细胞M2表型相关分子Arg1和Fizz-1的表达，而下调M1表型相关分子CD86和iNOS的表达。且AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。*P＜0.05，**P＜0.01。

图3：AMSC-XIST-Exo对巨噬细胞炎症因子分泌的影响：同剂量的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地降低诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。且AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。*P＜0.05，**P＜0.01。

图4：不同序列XIST修饰的AMSC-Exo对巨噬细胞炎症因子分泌的影响：常规XIST序列修饰的AMSC-Exo(AMSC-XIST*-Exo)，不能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-1β分泌。本发明所述的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-XIST*-Exo具有显著优势。*P＜0.05，**P＜0.01。

图5：AMSC-XIST-Exo对巨噬细胞自噬水平的影响：同剂量的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地促进巨噬细胞自噬，上调LC3Ⅱ/Ⅰ比例，下调p62水平，上调Atg5水平。且AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-XIST-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。

图6：AMSC-XIST-Exo对小鼠肝炎模型中肝脏巨噬细胞的调控作用：同剂量的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地调控肝脏巨噬细胞表型。AMSC-XIST-Exo在1mg/kg剂量时仍具有调控作用。a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-XIST-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。

图7：AMSC-XIST-Exo对小鼠脂肪肝模型中肝脏巨噬细胞的调控作用：同剂量的AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地调控肝脏巨噬细胞表型。AMSC-XIST-Exo在1mg/kg剂量时仍具有调控作用。a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-XIST-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 AMSC-XIST-Exo可介导XIST向巨噬细胞传递

采用ncRNA试剂盒分别抽提AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo的RNA，再行逆转录。逆转录体系：RNA模板-1μg；200μM随机引物-1μl；25μM Oligo(dT)-1μl；5×逆转录缓冲液-2μl；逆转录酶混合液-2μl；无RNA酶水-补至10μl。逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min。再进行荧光定量PCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green Mix-10μl；XIST上游引物序列如见SEQ:NO.2所示：gtcaattgagagctttctatcagagcattattg)5μM-0.8μl；XIST下游引物序列如SEQ:NO.3所示：ggaaagaagaatgcagagccctgtacaaccttccttcctg，5μM-0.8μl；模板-2ul；dd水-补至20μl。PCR条件为：95℃预变性10min，然后95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环。如图1所示，AMSC-XIST-Exo中含高水平的XIST。

巨噬细胞RAW264.7中分别加入AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，24h后收集细胞，进行XIST水平的qPCR分析。

qPCR结果显示AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能显著上调巨噬细胞的XIST水平。

实施例2 AMSC-XIST-Exo调控巨噬细胞表型

巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，24h后收集细胞，进行巨噬细胞表型相关分子的qPCR分析。

相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地上调巨噬细胞M2表型相关分子Arg1和Fizz-1的表达，而下调M1表型相关分子CD86和iNOS的表达。AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著影响M1/2表型相关分子表达，而AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo在80μg/mL浓度时才能明显调控M1/2表型相关分子的表达(图2)。

实施例3 AMSC-XIST-Exo调控巨噬细胞炎症因子分泌

巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo处理(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)24h，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)；再以LPS(100ng/mL)刺激12h，然后采用ELISA检测细胞上清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地降低LPS所诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著抑制巨噬细胞炎症因子分泌，其抑制效果与80μg/mL浓度的AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当(图3)。

并且，常规XIST序列修饰的AMSC-Exo(AMSC-XIST*-Exo)，并不能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子(如IL-1β)分泌，显示本发明的XIST序列具有特异性，经该XIST序列修饰的AMSC-XIST-Exo在调控巨噬细胞功能中具有特别的优势(图4)。

实施例4 AMSC-XIST-Exo促进巨噬细胞自噬

巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)处理24h，然后收集细胞，进行细胞自噬相关分子的Western Blot检测，WB条带采用ChemiScope Western Blot成像系统(Clinx ScienceInstruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。

相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地促进巨噬细胞自噬，具体表现为上调LC3Ⅱ/Ⅰ比例，下调p62水平，上调Atg5水平。AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著提高巨噬细胞自噬水平，其效果与80μg/mL浓度的AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当(图5)。

实施例5 AMSC-XIST-Exo抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞程序性坏死

U937细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，分别加入梯度浓度的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)预处理24h，再以TNF-α/zVAD诱导细胞凋亡、坏死。作用2h后收集细胞，进行细胞坏死相关分子的Western Blot检测，WB条带采用ChemiScope Western Blot Imaging System(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。并在作用6h后收集细胞，进行PI流式检测。

相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞坏死，具体表现为降低PI阳性的细胞比例，下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。AMSC-XIST-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著抑制巨噬细胞程序性坏死，其效果与80μg/mL浓度的AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当，见表1。

表1

注：数值为MEAN±SE；a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-XIST-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。

实施例6 AMSC-XIST-Exo对小鼠肝炎模型具有更好的疗效

梯度剂量(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo、天然AMSC-Exo分别尾静脉输注C57小鼠，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，隔天注射，共注射3次。第3次注射3h后小鼠腹腔注射LPS/GalN(10μg/kg的LPS+500mg/kg的D-GalN)建立急性肝损伤模型。造模6h后，处死小鼠并收集血清、肝组织等进行肝功能、肝脏病理、炎症因子及免疫荧光检测等。血清ALT、AST检测分别采用FUJI DRI-CHEMSlide GFP/ALT-PIII和GOT/AST-PIII试剂盒，用DRI-CHEM 4000ie(FUJIFILM)测定。肝脏病理采用HE检测。血清炎症因子采用相应ELISA试剂盒进行检测。CD206阳性或iNOS阳性巨噬细胞采用相应抗体进行免疫荧光检测，其比例通过计算CD206或iNOS阳性占DAPI阳性比例而得出，再以Vehicle组的比例设为1，计算出相对水平。

相同常规剂量条件下(25mg/kg、50mg/kg)，AMSC-XIST-Exo对小鼠急性肝损伤的疗效显著优于AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平；提高肝脏CD206阳性巨噬细胞比例，下调肝脏iNOS阳性巨噬细胞比例(图6)。

并且在低剂量条件下(1mg/kg、5mg/kg)，AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-XIST-Exo仍能部分改善肝功能、肝脏病理。

在APAP、CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤模型中，同样显示AMSC-XIST-Exo具有更好的疗效，并且其发挥疗效的有效剂量远低于AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo。

实施例7 AMSC-XIST-Exo对小鼠脂肪肝模型具有更好的疗效

小鼠采用胆碱蛋氨酸缺乏饲料(methionine-choline deficient，MCD)喂养建立脂肪肝模型，梯度剂量(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)的AMSC-XIST-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo分别尾静脉输注C57小鼠，每周注射2次；并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。8周后处死小鼠，收集血清和肝组织，进行生化指标、肝脏病理及巨噬分型相关分子等分析检测。血清ALT、AST及肝脏病理检测同实施例5。甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)采用全自动生化仪分析。肝脏巨噬细胞通过肝组织单细胞悬液经流式分选CD45+F4/80+的细胞所得，然后常规抽提RNA，qPCR分析iNOS和Arg1表达水平。经CD45+F4/80+分选的巨噬细胞通过流式分析ly6C^high/ly6C^low比例，再以Vehicle组的比例设为1，计算出相对水平。

相同常规剂量下，AMSC-XIST-Exo对小鼠非酒精性脂肪肝的疗效显著优于AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清TG、TC(表2)；减少肝细胞脂肪变性比例，减少肝组织炎性细胞浸润；降低血清ALT、AST水平；下调巨噬细胞iNOS表达水平，上调Arg1表达水平；下调巨噬细胞ly6C^high/ly6C^low比例(图7)。

并且在低剂量条件下，AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-XIST-Exo仍能部分改善生化指标、肝功能及肝脏病理，见表2。

表2

序列表

<110> 浙江大学

<120> XIST修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2400

<212> DNA

<213> XIST片段(X-inactive specific transcript)

<400> 1

gtccattgct tatcctatta tactgggata ttccgtttac ccttggcatt gctgatcttc 60

agtactgact ccttgaccat tttcagttaa tgcatacaat cccatttgtc tgtgatctca 120

ggacaaagaa tttccttact cggtacgttg aagttaggga atgtcaattg agagctttct 180

atcagagcat tattgcccac aatttgagtt acttatcatt ttctcgatcc cctgccctta 240

aaggagaaac catttctctg tcattgcttc tgtagtcaca gtcccaattt tgagtagtga 300

tcttttcttg tgtactgtgt tggccaccta aaactctttg cattgagtaa aattctaatt 360

ccctcctcca gaaattattg atgtgcaaaa tgcaatttcc ctatctgctg ttagtctggg 420

gtctcatccc ctcatattcc ttttgtctta cagcaggggg tacttgggac tgttaatgcg 480

cataattgca attatggtct tttccattaa attaagatcc caactgctca caccctctta 540

gcattacagt agagggtgct aatcacaagg acatttcttt tgtactgtta atgtgctact 600

tgcatttgtc cctcttcctg tgcactaaag accccactca cttccctagt gttcagcagt 660

ggatgacctc tagtcaagac ctttgcacta ggatagttaa tgtgaaccat ggcaactgat 720

cttttctttt aatattaatg tcataattgt atttgtggac ctgtgtagga gaaaaagacc 780

ctatgttcct cccattaccc tttggattgc tgctgagaag tgttaactac tcataatctc 840

agctcttgga caattaatag cattaataac aattatcaag ggcactgatc attagataag 900

actcctgctt cctcgttgct tacatcgggg gtactgaccc actaaggccc cttgtactgt 960

taatgtgaat atttgcaatt atatatgtct ccttctggta gagtgggata ttatgcccta 1020

gtatcccctt tgcattactg caggggctgc tgactactca aaacttctcc tgggactgtt 1080

aataggcaca atggcagtta tcaatggttt tctccctccc tgaccttgtt aagcaagcgc 1140

cccaccccac ccttagtttc ccatggcata ataaagtata agcattggag tattccatgc 1200

acttgtctat caaacagtgg tccatactcc caaccctttt gcattgcgcc agtgtgtaaa 1260

atcacaggta gccatggtgt catgctttat atacgaagtc ttccctctct ctgccccttg 1320

tgtgcccttg gccccttttt acagactatt gctcacaatc tcaggtgtcc atatttgcag 1380

ctattaggta agattgtgct gtctccctct tcccttccct ctgccctgcc ccttttgcct 1440

ctttgctggg taatgttgac cagacaaggc cctttctctt ggacttaaac aattctcagt 1500

ttacagggcc ttggtcccac ccattataca tgaacccctc tacttccttt cgcattgctt 1560

ctgagtatgc tgactaccca aagccccttc tgtgttatta ataaacacag tactgattgt 1620

cccatttttc agcccatcag tccaagatct ccctaccact ttggtgtgtt ggtgcagtgt 1680

tgactatgaa aagcaggcct gaactaggtg gataagcctt cactcatttt ctttcattta 1740

ttaatgatcc tagtttcaat tattgtcaga ttctggggac aagaaccatt cttgcccacc 1800

tgtgttactg ctttactgtg caaaatactg aaggcaagtc agacccaggg agctggattg 1860

ccatccttta ttttgtgttt ccagtgtaca ctataaaatt gtctccccag gaaggaaggt 1920

tgtacagggc tctgcattct tctttccaga gcagattgcc tggttaagaa tctcttgttg 1980

tcccctttgt atattgttat tgtaaagtgc caaatgccag gatacagcca gaaaaattgc 2040

ttattattat taaaaaaatt tttttaagaa agacatctgg attgtagggt ggactcgata 2100

atttttttct tcctgtttat gtgggaagtt gatttaaatg actgataatg tgtatgaaag 2160

cactgtaaaa cataagagaa aaaccaatta gtgtattggc aatcatgcag ttaacatttg 2220

aaagtgcagt gtaaattgtg aagcattatg taaatcaggg gtccacagtt tttctgtaag 2280

gggtcaaatc ataaatactt tagactgtgg gccatatggt ttctgttaca tatttgtttt 2340

ttaaacaacg tttttataag gtcaaaatca ttcttagttt ttgagccaat tggatttggc 2400

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> XIST上游引物(人工序列Unknow)

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<211> 40

<212> DNA

<213> XIST下游引物(人工序列Unknow)

<400> 3

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Claims

1.一种X非活性特异性转录物修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，通过以下技术方案实现：

(1)脂肪来源的间充质干细胞的制备：

小鼠的mAMSC和成人的hAMSC按常规方法分离，mAMSC用含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，hAMSC采用含2％MSC培养无血清替代物的MSC培养基进行培养，AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞备用；

(2)X非活性特异性转录物修饰的AMSC的构建：

X非活性特异性转录物慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-XIST感染AMSC，表达质粒包含部分X非活性特异性转录物目的片段序列如SEQ:NO.1所示，其特征为包含miR-155的sponge序列，而对miR-17的sponge序列进行部分突变；

AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用，随后OPTI-MEM培养基200μl，加入感染增强液50μl，随后加入滴度为10⁸TU/ml，感染复数值＝10的10μl X非活性特异性转录物慢病毒，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSCs，培养8-12h观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养；24h后换成含5μg/ml聚凝胺的完全培养基筛选培养3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到100％后撤除聚凝胺；

(3)AMSC-XIST-Exo分离

步骤(2)细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心，取上清后再次离心，再次取上清进行离心，弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心，所得沉淀即为AMSC-XIST-Exo；

(4)AMSC-XIST-Exo鉴定

通过纳米颗粒跟踪分析法分析其粒径，范围在67-142nm，并采用Western Blot或磁珠法检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81；

(5)采用荧光定量PCR法鉴定其中XIST的表达：

采用ncRNA试剂盒抽提RNA，然后进行逆转录，逆转录体系：RNA模板-1μg；200μM随机引物-1μl；25μM Oligo(dT)-1μl；5×逆转录缓冲液-2μl；逆转录酶混合液-2μl；无RNA酶水-补至10μl，逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min；

再进行荧光定量PCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green Mix-10μl；XIST上游引物序列如见SEQ:NO.2所示，5μM-0.8μl；XIST下游引物序列如SEQ:NO.3所示，5μM-0.8μl；模板-2ul；dd水-补至20μl；PCR条件为：95℃预变性10min，然后95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环；

2.根据权利要求1所述的一种X非活性特异性转录物修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，收集上清并于4℃,300g，10分钟离心，取上清后再次离心：4℃，2000g，10分钟，再次取上清进行离心：4℃，10,000g，30分钟，弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟；收集沉淀用PBS重悬后，再次离心：100,000g，70分钟，所得沉淀即为AMSC-XIST-Exo。

3.根据权利要求1所述方法提供的X非活性特异性转录物修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备肝脏巨噬细胞靶向治疗制剂及肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝脏疾病包括但不限于急慢性肝损伤、肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化，所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。