CN109718375B - Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质细胞再生的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质细胞再生的药物中的应用。本发明使用RNA干扰技术诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)的Numb基因敲减/过表达后注射入肝纤维化大鼠体内观察其作用，还使用RNA干扰技术促使肝卵圆细胞(WB‑F344)的Numb基因敲减，观察细胞的变化。结果证实，Numb敲减后促进WB‑F344细胞向胆管细胞表型分化，还促进BMSCs向胆管上皮细胞分化并显著促进肝纤维化的发展；而Numb过表达则促进BMSCs向肝细胞分化，促进纤维化肝脏修复。因此，Numb基因为治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质细胞再生的靶基因。

Description

Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质 细胞再生的药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和肝病防治领域，具体地说，涉及Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质细胞再生的药物中的应用。

背景技术

胆管上皮细胞的异常增殖是各种慢性肝病的主要病理特征之一，如原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、药物及化学因素导致的肝损伤等。当肝细胞或胆管持续受损时，胆管上皮细胞开始增殖，通过修复胆管树或向肝细胞转分化来修复肝损伤。然而，当受到持续的慢性炎症的刺激时，胆管反应可引起胆管异常增殖(也称为“导管反应”或“反应性胆管上皮细胞”)。胆汁淤积会促进肝纤维化并最终导致肝硬化。肝祖细胞，在啮齿动物中称为卵圆细胞或在人类中称为肝干细胞，可分化成肝细胞或胆管上皮细胞。我们的研究证实肝祖细胞是胆汁淤积性肝纤维化动物模型胆管上皮细胞的主要来源，抑制肝祖细胞向胆管上皮细胞分化对于胆汁淤积性肝纤维化的治疗非常有用。然而，目前尚没有能够有效地抑制胆管上皮细胞的异常活化与增殖的药物上市。

Notch信号是进化过程中高度保守的细胞间信号转导机制，对于胚胎发育，成熟，细胞特化和维持祖细胞特征至关重要，在调节细胞命运和维持器官形态方面发挥着关键作用。Notch信号通路与胆管上皮细胞的特异性密切相关，Notch信号的异常激活将促进肝祖细胞向胆管上皮细胞的分化。Numb(蛋白质Numb同系物)，位于真核细胞的内体中，是一种重要的细胞命运决定因素，对Notch信号通路具有负调控作用。在胚胎发育中的不对称细胞分裂期间，Numb拮抗Notch活性。

在慢性肝损伤期间，Numb可能起到“开关”作用，以决定肝祖细胞在此过程中分化为胆管细胞抑或肝细胞。此外，期刊文献《临床肿瘤细胞学杂志》2010年第15卷第11期刊出的论文“肝细胞癌组织中Numb、p53蛋白的表达及其意义”，采用免疫组化SP法检测30例HCC组织及其癌旁组织、8例肝硬化组织和9例正常肝组织中的Numb蛋白的表达情况，结果癌旁组织、肝硬化组织及正常肝组织Numb蛋白阳性表达率分别为90.0％、87.5％和88.9％，在HCC组织中的阳性表达率为44.7％，明显低于癌旁组织、肝硬化组织及正常肝组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。中南大学2009年硕士论文“Numb在原发性肝细胞癌中的表达及意义”，收集了自2001年至2005年在中南大学湘雅二医院肝胆外科行肝叶切除术的35例原发性肝细胞癌病例的病理标本和临床资料，用免疫组化实验和定量RT-PCR实验来分别检验Numb蛋白及核酸分子的表达情况，并分析其与临床病理特征(如肿瘤细胞分化、肿瘤大小、肿瘤数目、门静脉癌栓等)之间的关系，结果：1、免疫组织化学实验结果：35例原发性肝细胞癌的非癌组织中，Numb高表达的26例(74.3％)，在与其相应的癌组织中，Numb高表达的15例(42.9％)。2、定量RT-PCR实验结果：Numb的mRNA的定量在肝硬化组织和中高分化肝细胞癌组织中较高，分别为慢性肝炎组织的39.6倍和37.6倍，而在低分化肝细胞癌组织中较低，为慢性肝炎组织的1.6倍。3、临床病理评估结果：Numb的高表达与临床病理特征中的肿瘤细胞分化程度(P＝0.001)二者之间存在显著性的相关。最后得出结论：Numb在原发性肝细胞癌的非癌组织和癌组织中均有高表达，Numb的高表达与肝癌临床病理特征中的肿瘤细胞分化程度二者之间存在显著性的相关。然而，目前尚不清楚Numb基因在肝纤维化、肝硬化及促进肝实质细胞再生的治疗中的作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Numb及其上调剂的新用途。

第一方面，本发明提供了Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化或肝硬化疾病的药物中的应用。

作为一个优选例，所述疾病为慢性肝病。

作为另一优选例，所述疾病为胆汁淤积性肝病、病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、药物及化学因素损伤等。

作为另一优选例，所述胆汁淤积性肝病为原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎。

作为另一优选例，所述上调剂选自小分子化合物或生物大分子。

第二方面，本发明提供了一种治疗肝纤维化或肝硬化疾病的药物组合物，所述药物组合物以Numb或其上调剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

作为一个优选例，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

第三方面，本发明提供了一种筛选治疗肝纤维化或肝硬化疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达Numb的体系；和

(2)检测所述体系中Numb的表达；

若所述候选物质可提高Numb的表达，则表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。

第四方面，本发明提供了Numb或其上调剂在制备促进肝实质细胞再生的药物中的应用。

作为一个优选例，所述上调剂选自小分子化合物或生物大分子。

第五方面，本发明提供了Numb或其上调剂在制备实验试剂中的应用，所述实验试剂用于：

(1)抑制WB-F344细胞向胆管细胞分化，或

(2)促进BMSCs向肝细胞分化。

本发明优点在于：

本发明通过使用RNA干扰技术诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)的Numb基因敲减/过表达后注射入肝纤维化大鼠体内观察其作用，体外使用RNA干扰技术促使肝卵圆细胞(WB-F344细胞)的Numb基因敲减，观察细胞的变化。结果证实，本发明所述靶基因Numb敲减后促进WB-F344细胞向胆管细胞表型分化，还促进骨髓间充质干细胞向胆管上皮细胞的分化从而显著促进肝纤维化的发展；而Numb过表达则促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，促进纤维化肝脏修复。因此，Numb基因为治疗肝纤维化、肝硬化的靶基因，Numb及其上调剂可用于制备治疗肝纤维化、肝硬化疾病以及促进肝实质细胞再生的药物，应用存在Numb的体系可以筛选治疗肝纤维化或肝硬化疾病的潜在物质。

附图说明

图1是本发明实施例1的BMSC的细胞形态。

图2是本发明实施例1的BMSC的相关表面标志的流式鉴定结果。

图3是本发明实施例1的BMSC的成骨成脂诱导结果。

图4是本发明实施例1的BMSC的细胞周期结果。

图5是本发明实施例1的RNA干扰技术敲减BMSC的Numb基因的结果；其中，BMSC代表单一BMSC组；KD-NC代表Numb基因敲减阴性对照组；BMSC^Numb-KD代表BMSCNumb基因敲减组；OE-NC代表Numb基因过表达阴性对照组；BMSC^Numb-OE代表BMSCNumb基因过表达组。

图6是本发明实施例1的各组大鼠肝组织HE染色照片(×200)；其中，Sham代表假手术组；BDL代表胆总管结扎组；BMSC代表脾脏注射单一BMSC组；BMSC^KD-NC代表BDL+BMSC^KD-NC脾脏注射组；BMSC^Numb-KD代表BDL+BMSC^Numb-KD脾脏注射组；BMSC^OE-NC代表BDL+BMSC^OE-NC脾脏注射组；BMSC^Numb-OE代表BDL+BMSC^Numb-OE脾脏注射组。

图7是本发明实施例1的各组大鼠肝组织天狼星红胶原染色照片(×200)；其中，Sham代表假手术组；BDL代表胆总管结扎组；BMSC代表脾脏注射单一BMSC组；BMSC^KD-NC代表BDL+BMSC^KD-NC脾脏注射组；BMSC^Numb-KD代表BDL+BMSC^Numb-KD脾脏注射组；BMSC^OE-NC代表BDL+BMSC^OE-NC脾脏注射组；BMSC^Numb-OE代表BDL+BMSC^Numb-OE脾脏注射组。

图8是本发明实施例2的RNA干扰技术敲减WB-F344细胞的Numb基因的结果；其中，N代表正常组；NC代表Numb基因空载质粒转染组；Numb-KD代表Numb基因敲减组。

图9是本发明实施例2的Numb基因对WB-F344细胞转化为胆管上皮细胞的影响的结果；其中，N代表正常组；SB代表丁酸钠组；NC代表丁酸钠+Numb基因空载质粒转染组；Numb-KD代表丁酸钠+Numb基因敲减组。

具体实施方式

Numb

Numb(蛋白质Numb同系物)，位于真核细胞的内体中，是一种重要的细胞命运决定因素。

在本发明保护的技术方案中，所述的Numb可以为Numb蛋白或Numb基因。

在本发明中，所用的Numb蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的Numb蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组Numb蛋白。优选的，本发明可采用重组的Numb蛋白。

任何适合的Numb蛋白均可用于本发明。所述的Numb蛋白包括全长的Numb蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的Numb蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_001005743.1所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Numb蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。Numb蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。

任何一种Numb蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Numb蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Numb蛋白的全部或部分功能。优选的，所述的生物活性片段至少保持50％的全长Numb蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Numb蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的Numb蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Numb蛋白。所述经过修饰或改良的Numb蛋白可以是一种Numb蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Numb蛋白可以是与天然存在的Numb蛋白具有较小的共同点，但也能缓解糖尿病血管内皮的功能障碍或加强DNA损伤修复，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响Numb蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

根据Numb蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选的，所述的Numb蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_001005743.1所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同。

上调剂

如本文所用，所述的Numb的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高Numb蛋白的活性、维持Numb蛋白的稳定性、促进Numb蛋白的表达、促进Numb蛋白的分泌、延长Numb蛋白有效作用时间、或促进Numb的转录和翻译的物质均可用于本发明。

作为本发明的优选方式，所述的Numb蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)Numb的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码Numb的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，Numb多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Numb的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

用途

本发明提供Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化疾病或促进肝实质细胞再生的药物中的用途。

肝纤维化是多种慢性肝损害(如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、胆汁淤积性肝病、药物及化学因素损伤等)引起的肝内细胞外间质成分过度异常沉积的病理改变。

肝硬化是严重危害人类健康的常见慢性病之一。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。肝硬化的常见病因有病毒性肝炎、酒精中毒、营养障碍、工业毒物、药物、循环障碍、代谢障碍、胆汁淤积、血吸虫病等。肝纤维化是肝硬化的病理学基础。

肝细胞再生是对病毒性、化学性、缺血性和免疫性损伤及部分肝切除术后的一种高度代偿性反应，在再生的过程中，肝实质细胞及间质细胞(如内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞等)经历多次DNA合成和细胞分裂增生，最后达到恢复肝脏缺失的肝实质及细胞外基质的效果。

胆汁淤积性肝病是由各种原因引起的胆汁生成、分泌和排泄障碍，不能主动经胆小管排至肠腔，在肝内淤积，反流入血，而引起的一系列器质性损害、代谢失调和功能紊乱的肝胆系统疾病。引起胆汁淤积原因较多，常见病因主要有病毒、细菌、寄生虫、药物和/或毒物、自身免疫、酒精、结石、肿瘤和遗传代谢等，任何能引起肝细胞和胆管细胞损害及胆道系统梗阻因素均可导致胆汁淤积发生。在慢性肝病患者中，胆汁淤积更容易出现在原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)、原发性硬化性胆管炎(primarysclerosing cholangitis，PSC)中。原发性胆汁性胆管炎是一种特异性针对肝内中、小胆管的慢性胆汁淤积性肝病。原发性硬化性胆管炎是一种以胆管的进行性炎症、纤维化和多发性狭窄为主要病理特征的慢性胆汁淤积性肝病，可以波及到肝内外胆管。

本发明还提供一种Numb作为靶点筛选治疗肝纤维化或肝硬化疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：用候选物质处理表达Numb的体系；和检测所述体系中Numb的表达；若所述候选物质可提高Numb的表达，则表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。所述的表达Numb的体系可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达Numb的细胞；或可以是重组表达Numb的细胞。所述的表达Numb的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Numb的表达的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Numb的体系。

药物组合物

本发明的药物组合物可含有本文所述的活性试剂和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用于制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。在选择适用于投递合成肽的赋形剂时，主要需考虑此药物组合物的给药方式，本领域技术人员熟知此项技术。可根据不同的治疗用途确定本发明药物中所述活性试剂的含量。可根据已知的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版公司(MackPublishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚(1985))一书中有详细的记载。本发明的药物可以是各种合适的剂型，包括但不限于胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液等。

治疗方法

本发明提供一种治疗肝纤维化或肝硬化的方法，所述方法包括给予需要的对象Numb或其上调剂。给予的量为治疗有效量，可根据个体的年龄、体重、性别、疾病种类和严重程度加以确定。对象可以是哺乳动物，尤其是人、鼠、兔子、猪、羊和狗等。给药方法是本领域常规的方法，例如口服、注射等，并可针对不同的试剂进行调整。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

运用胆总管结扎(BDL)诱导的大鼠肝纤维化模型证实本发明靶基因在肝纤维化的进展中起重要作用。

1.RNA干扰(RNAi)技术敲减BMSC的Numb基因

1.1材料和方法

1.1.1动物

SD雄性大鼠5只，清洁级，体重80～100g，用于分离BMSCs，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。

1.1.2主要试剂

DMEM-L培养基：GIBCO公司，Lot：1891448；1×PBS：Hyclone公司，Lot：AC10257442；0.25％胰蛋白酶：GIBCO公司，Lot：1868744；青霉素/链霉素混合溶液(含青霉素10000U/ml，链霉素10000μg/ml)：Hyclone公司，Lot：J130061；胎牛血清(FBS)：GIBCO公司，Lot：1908121；SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒(美国cyagen)货号：RASMx-90031；SD大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒(美国cyagen)货号：RASMx-90021。

主要引物及序列如下：

1.1.3统计学方法

计量资料用Mean±SD表示，采用SPSS16.0统计软件处理数据，组间比较采用方差分析，P<0.05为具有统计学意义。

1.2SD大鼠BMSC的分离和培养

无菌条件下分离大鼠的股骨以及胫骨，剪开股骨或胫骨两端，使骨髓腔暴露，用10ml注射器抽取DMEM-L反复冲洗，直至将所有骨髓冲出，收集骨髓悬液，移液枪移至50ml离心管中。反复吹打直至细胞均匀，1500rpm，5min，室温离心，弃液。加入15％FBS/DMEM-L8ml，轻轻吹打质细胞均匀，移入25cm²培养皿，在37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，标记为P1。培养24h半量换液，48h首次换液。每3-5天传代。

1.2.1结果

1.2.2成功分离SD大鼠BMSC

采用全骨髓贴壁法从SD大鼠大腿骨及胫骨分离的BMSC在形态上符合骨髓间充质干细胞的形态特征：长梭形，旋涡状生长(图1)。P1为细胞分离第二天，显微镜下观察有少许贴壁细胞，培养液中有大量悬浮细胞。P2为培养第4天，可见大量贴壁细胞，形状呈长梭形，生长速度缓慢。P3为培养2周，细胞融合达80％，呈旋涡状生长，细胞形态均一，生长速度明显增加。

1.2.3细胞流式技术鉴定SD大鼠BMSC

将培养至P3的BMSC采用流式细胞仪鉴定，结果显示：CD10，0.03％；CD34，0.016％；CD45，0.01％；CD29，99.5％；CD90，95.0％。表明分离的BMSC纯度理想(图2)。

1.2.4SD大鼠BMSC成骨成脂诱导

为了检测分离所得的SD大鼠BMSC的多项分化能力，进行了成骨成脂诱导(图3)。(a)为成骨诱导4周后茜素红染色结果，可见有大量的钙化结节沉积，细胞形态由梭型变成多边形。(b)为成脂诱导3周后油红O染色结果，可见有橘红色脂滴出现，细胞出现空泡脂滴样变。1.2.5SD大鼠BMSC细胞周期检测

为了检测分离所得的SD大鼠BMSC的增殖能力，进行了细胞周期检测，结果显示72.36％的BMSC处在G1周期，表明分离的BMSC具有较强的增殖能力(图4)。

1.3RNA干扰(RNAi)技术敲减BMSC的Numb基因

1.3.1Numb基因RNAi慢病毒

本实验所用慢病毒产品购自上海吉凯化学技术有限公司。包括LV-Numb-RNAi(52618-1)、阴性对照慢病毒CON076(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)；LV-Numb-RNA(20910-4)、阴性对照慢病毒CON238(Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin)、Polybrene、Enhanced infection solution。LV-Numb-RNAi(52618-1)元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin；靶点序列：AAGAGAGGAGATCATGAAACA(SEQ ID NO:9)。LV-Numb-RNA(20910-4)元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin：过表达基因序列如SEQ ID NO:10所示(第67-1842bp是插入序列，第1-66bp、第1843-1979bp是载体序列，第54-58bp、第1843-1845bp是酶切位点)。

慢病毒构建方法：利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化和目的基因扩增产物配制反应系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

慢病毒包装：采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获(即未纯化的细胞上清液)，根据不同的实验需求，确定采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液。

1.3.2慢病毒转染后BMSC的Numb基因表达

取P3SD大鼠BMSC，胰酶消化，镜下观察，细胞蜷缩成卵圆型，加入15％FBS/DMEM-L终止消化，收集细胞至50ml离心管中，1500rpm，室温，5min。弃液，加入15％FBS/DMEM-L，吹打细胞至均匀，六孔板铺板，5×10³cells/well。分组如下(每组三个复孔)：

铺板24h，镜下观察细胞形态，细胞形态正常，贴壁良好，融合度达60％，即进行慢病毒转染。根据预实验结果，选用复感染指数(multiplicity of infection，MOI)＝80进行转染。转染10h后更换成正常培养液继续培养，待48h倒置荧光显微镜拍摄细胞形态和GFP绿色荧光。72h提取RNA，检测Numb基因表达情况。

1.3.3结果

1.3.3.1慢病毒转染后Numb基因表达

发现与Numb敲减阴性对照组相比，Numb-KD组的Numb基因表达明显下降(P＜0.01)；与OE-NC组相比，Numb-OE组的Numb基因表达明显上升(P＜0.01)(图5)。

2.脾脏注射Numb基因敲减/过表达的BMSC促进/抑制胆总管结扎(BDL)诱导的大鼠肝纤维化

2.1动物

SD雄性大鼠35只，清洁级，体重160～180g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。上海中医药大学实验动物中心饲养、造模和观察，自由饮食。

2.2肝纤维化模型的制备

参照Alpini G等方法造模(Alpini G,Lenzi R,Sarkozi L Tavoloni N.Biliaryphysiology in rats with bile ductular cell hyperplasia.Evidence for asecretory function of proliferated bile ductules.J Clin Invest.1988；81(2):569-578.)，分离大鼠胆总管、以及左、右肝管，分别结扎左、右肝管各一次，胆总管结扎二次。正常对照组仅分离胆总管及左、右肝管后关腹。BMSC移植组在胆管结扎后，立即脾脏注射细胞混悬液(1×10⁶cells/只)。

2.3分组与给药

35只大鼠随机分为假手术组(Sham)、胆总管结扎组(BDL)、胆总管结扎+脾脏注射BMSC组(BMSC)、胆总管结扎+脾脏注射BMSC Numb基因敲减阴性对照组(BMSC^KD-NC)、胆总管结扎+脾脏注射BMSC Numb基因敲减组(BMSC^Numb-KD)、胆总管结扎+脾脏注射BMSC Numb基因过表达阴性对照组(BMSC^OE-NC)和胆总管结扎+脾脏注射BMSC Numb基因过表达组(BMSC^Numb-OE)，每组各5只，第4周末取材。

2.4统计学方法

计量资料用Mean±SD表示，采用SPSS16.0统计软件处理数据，组间比较采用方差分析，P<0.05为具有统计学意义。

2.5结果

2.5.1肝组织病理学观察

HE染色显示，Sham组大鼠肝脏小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列，中央静脉、胆管和汇管区动、静脉结构正常，肝窦不扩张，肝窦内、汇管区周围可见少量的间质细胞。BDL组可见广泛胆管增生，新生胆管外周基底膜及胶原纤维层增厚，炎性细胞浸润及组织坏死较少。BMSC组较BDL组肝脏炎症浸润和外基质沉积明显减轻。BMSC^{Numb -KD}组较BMSC^KD-NC组肝脏炎症浸润和外基质沉积加重；BMSC^Numb-OE组较BMSC^OE-NC组肝脏炎症浸润和外基质沉积减轻(图6)。

天狼猩红染色显示，Sham组大鼠肝组织仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维，BDL组大鼠肝内新生胆管周围有大量胶原沉积，并以汇管区为中心向肝实质内延伸。与BDL组比较，BMSC组肝组织内胶原沉积明显减轻；与BMSC^KD-NC组比较，BMSC^Numb-KD组胶原沉积和胆管增生明显加重；BMSC^Numb-OE组较BMSC^OE-NC组胶原沉积减轻(图7)。

2.5.2肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量

肝组织Hyp含量测定结果显示，与Sham组比较，BDL组大鼠的肝组织Hyp含量显著性增加(P<0.01)。与BDL对照组比较，BMSC组大鼠肝组织Hyp含量均显著降低(P<0.05)，而BMSC^Numb-KD组肝组织Hyp含量明显增加(P<0.01)。与BMSC^KD-NC组比较，BMSC^Numb-KD组大鼠肝组织Hyp含量显著增加(P<0.01)；与BMSC^OE-NC组比较，BMSC^Numb-OE组大鼠肝组织Hyp含量减少(P<0.05)，见表1。

表1肝组织Hyp含量变化(Mean±SD)

注：Sham，假手术组；BDL，胆总管结扎组；BMSC，BDL+BMSC脾脏注射组；BMSC^KD-NC，BDL+BMSC^KD-NC脾脏注射组；BMSC^Numb-KD，BDL+BMSC^Numb-KD脾脏注射组。与BDL组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与BMSC^KD-NC组比较，^##P＜0.01；与BMSC^OE-NC组比较，△P＜0.05。

实施例2

体外运用RNAi技术敲减WB-F344细胞的Numb基因证实本发明的靶基因减少可以显著促进WB-F344细胞向胆管细胞表型分化。

1.材料和方法

1.1细胞株

大鼠肝干细胞WB-F344，购自上海复祥生物技术有限公司。

1.2主要试剂及设备

DMEM培养基：GIBCO公司，Lot：11965-092；1×PBS：Hyclone公司，Lot：AC10257442；0.05％胰蛋白酶：GIBCO公司，Lot：25300-054；青霉素/链霉素混合溶液(含青霉素10000U/ml，链霉素10000ug/ml)：Hyclone公司，Lot：J130061；胎牛血清(FBS)：GIBCO公司，Lot：1908121；丁酸钠(SB)：SIGMA公司，Lot：B5887。

主要引物及序列如下：

1.3Numb基因RNAi慢病毒(同实施例1)

1.4分组与给药

正常组(N)，丁酸钠(SB)组，Numb-EV+SB：空载质粒+SB组，Numb-KD+SB：Numb基因敲减+SB组。SB浓度为3.75mM。

1.5建立WB-F344细胞的Numb-KD模型

六孔板铺板，3×10⁴cells/well，铺板24h镜下观察细胞形态良好，融合度达30％开始加入慢病毒，进行转染，转染6h更换成10％FBS/DMEM继续培养48h后加SB诱导，每2天换液1次，诱导共计6天。

1.6统计学方法

计量资料用Mean±SD表示，采用SPSS16.0统计软件处理数据，组间比较采用方差分析，P<0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1建立WB-F344的Numb-KD模型

由图可见，慢病毒转染后细胞形态维持正常，MOI＝50时，细胞转染率可达80％以上。Numb-KD组较正常细胞组的Numb基因表达明显下降(P<0.01)(图8)。

2.2Numb基因敲减促进WB-F344细胞向胆管细胞表型分化，表达CK19

结果显示，当予以丁酸钠刺激后，SB组的CK19表达显著提高(P<0.01)；当Numb基因敲减后，与SB组相比，Numb-KD+SB组的CK19mRNA表达显著提高(P<0.01)(图9)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海中医药大学附属曙光医院

<120> Numb或其上调剂在制备治疗肝纤维化、肝硬化或促进肝实质细胞再生的药物

中的应用

<130> /

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctactttcg atgccagtag aacca 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgttgccag gagccactga 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcacagtca aggctgagaa tg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggtggtga agacgccagt a 21

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatctgcgta gtgtgg 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaccaaac tggggatg 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcacagtca aggctgagaa tg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggtggtga agacgccagt a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagagaggag atcatgaaac a 21

<210> 10

<211> 1979

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttttttgtta gacgaagctt gggctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccggtc 60

gccaccatga acaaactacg gcagagtttc aggagaaaga aagatgttta cgtcccagag 120

gccagccgtc cacatcagtg gcagacagat gaagagggag tccgcactgg aaagtgcagc 180

ttcccagtta agtaccttgg ccacgtagag gttgatgagt caagaggaat gcacatctgt 240

gaagatgccg tcaaaagatt gaaagctacg ggaaagaaag cagtgaaggc cgttctgtgg 300

gtatcagcag atggactcag agttgtggat gaaaaaacta aggacctcat agttgaccag 360

acaatagaaa aagtttcttt ctgcgccccc gataggaact ttgacagagc cttttcttac 420

atatgtcgag atggcaccac tcggcgatgg atctgtcatt gcttcatggc tgtcaaagac 480

acgggggaaa gactgagcca tgccgtgggc tgtgcttttg cagcctgttt agagcgtaaa 540

cagaagcggg aaaaggagtg tggagtcact gctactttcg atgccagtag aaccactttt 600

acaagagaag gatcattccg tgtcacaact gccacagaac aagctgaaag agaggagatc 660

atgaaacagt tgcaagatgc caagaaagct gagacagata agaccgttgg tccatcagtg 720

gctcctggca acagtgctcc atcgccgtcc tctcccacct ccccaactct ggatcccact 780

gcttctttag agatgaacaa tcctcatgct atcccacgcc ggcatgcacc aattgaacag 840

cttgctcgcc aaggctcttt ccggggattt cctgctctta gccagaagat gtcacccttt 900

aaacgccagc tgtccctacg catcaatgag ctgccttcca ctatgcagag gaagactgat 960

ttcccaataa aaaacacagt gcctgaggtg gaaggagagg cagaaagcat cagctccctg 1020

tgctcccaga tcaccagtgc cttcagcaca ccctgtgagg accccttctc ctctgcccca 1080

atgaccaaac cagtgacatt agtggcacca cagtctcctg tgttacaagg gactgagtgg 1140

ggtcagtctt ctggtgctgc ctctccaggt ctcttccagg ctggtcacag acgcactccc 1200

tctgaggctg accgttggtt agaagaagta tcaaaaagtg tgcgggccca gcagccgcag 1260

gcctcagccg cccctctgca gccagttctg cagcctcctc cgcccgctgc cattgcccct 1320

ccagcacctc ctttccaagg acatgcattc ctcacttctc agcctgtgcc agtgggtgtg 1380

gtcccacccc tacaaccagc ctttgtctct acccagtcct accctgtggc caatgggatg 1440

ccctatccag cctctaatgt gcctgtagtg ggcatcaccc catcccagat ggtagccaat 1500

gtgtttggca ctgcaggcca tcctcaggcc actcatccac atcagtcccc aagcctggcc 1560

aagcagcaga cattccctca atatgagaca agtagtgcta ccaccagtcc cttctttaag 1620

ccttctgctc agcacctcaa tggttctgca gctttcaatg gtgtagacaa tagcgggcta 1680

gtctcaggaa acagacctgc acaagtccct ccaggcacct gcccagtgga tccttttgag 1740

gcccagtggg ctgcactaga aagcaagccc aagcagcgca ccaacccctc tcctaccaac 1800

cctttctcca gtgatgcaca gaaggcattt gaaatagagc ttggtatgga ctacaaggat 1860

gacgatgaca aggattacaa agacgacgat gataaggact ataaggatga tgacgacaaa 1920

tgagctagcc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagc 1979

Claims (2)

1.过表达Numb的骨髓间充质干细胞在制备治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁淤积性肝病为原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎。

Images