JP7176766B2 - Cd31陽性cd45陰性cd200陽性の哺乳動物細胞からなる細胞集団、およびその利用 - Google Patents
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- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
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Description
[1]細胞表面マーカーCD31およびCD200が陽性であり、CD45が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
[2]細胞表面マーカーCD31、CD157およびCD200が陽性であり、CD45が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
[3]血管内皮幹細胞を含む前記[1]または[2]に記載の細胞集団。
[4]前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む前記[1]または[2]に記載の細胞集団。
[5]哺乳動物がヒトである前記[1]~[4]のいずれかに記載の細胞集団。
[6]細胞表面マーカーCD31が陽性、CD157およびCD200の少なくとも一方が陽性、CD45が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞。
[7]導入遺伝子を発現する前記[6]に記載の血管内皮幹細胞。
[8]哺乳動物がヒトである前記[6]または[7]に記載の血管内皮幹細胞。
[9]前記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞集団または前記[6]~[8]のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬。
[10]血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用、臓器再生促進用、または血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および/または治療用である前記[9]に記載の医薬。
[11]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である前記[10]に記載の医薬。
[12]前記[4]に記載の細胞集団または前記[7]に記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および/または治療用医薬。
[13]導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である前記[12]に記載の医薬。
[14]被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
(1)被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて前記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
(2)培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
(3)被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。
本発明者らは、筋肉組織の血管から取得した血管内皮細胞中に、薬剤(異物)排出能が高い細胞(SP細胞集団)が1%程度存在し、この中に血管内皮幹細胞様の細胞が存在すること、薬剤(異物)排出能が低い大多数の血管内皮細胞(MP細胞集団)には、血管内皮幹細胞様の細胞はほぼ存在しないことを見出した(非特許文献1)。その後本発明者らは、肝臓の血管から取得した血管内皮細胞も同様に、薬剤(異物)排出能が高いSP細胞集団画分と低いMP細胞集団画分に分けることができ、SP細胞集団中に血管内皮幹細胞様の細胞が10%程度存在し、MP細胞集団中にはほぼ存在しないことを確認した。今回、本発明者らは、血管内皮幹細胞様の細胞を他の血管内皮細胞と効率よく区別できるマーカー分子を見出すために、肝臓のSP細胞集団とMP細胞集団を用いて、MP細胞集団と比べSP細胞集団で発現が高い遺伝子を網羅的に解析し、100を超えるSP細胞集団高発現遺伝子の中から、血管内皮幹細胞様の細胞(以下、「血管内皮幹細胞」と記す)を特定できる細胞表面マーカーを見出した。
本発明は、上記本発明の細胞集団を有効成分とする医薬を提供する。本発明者らは、肝血管障害モデルマウスの肝臓に本発明の細胞集団を移植すると、本発明の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞によって血管が再生されることを確認している(実施例1参照)。また、本発明は、上記本発明の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬を提供する。本発明者らは、本発明の血管内皮幹細胞を1個、レシピエントマウスの肝臓に移植すると血管を構成する血管内皮細胞として定着、増殖し長期間維持されることを確認している(実施例5参照)。
本発明は、上記本発明の細胞集団を用いる血管毒性の評価方法を提供する。本発明の血管毒性評価方法は、被験物質を上記本発明の細胞集団に接触させ、細胞増殖レベルを測定することにより実施することができる。具体的には、例えば、以下の工程を含む方法が挙げられる。
(1)被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて前記[1]~[3]のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
(2)培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
(3)被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
[A]前記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞集団または前記[6]~[8]のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を投与する工程を含む血管再生方法。
[B]虚血および低栄養を改善する[A]に記載の方法。
[C]血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する[A]に記載の方法。
[D]臓器の再生を促進する[A]に記載の方法。
[E]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する[A]に記載の方法。
[F]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である[E]に記載の方法。
[G]血管の再生に使用するための前記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞集団または前記[6]~[8]のいずれかに記載の血管内皮幹細胞。
[H]虚血および低栄養を改善する[G]に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
[I]血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する[G]に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
[J]臓器の再生を促進する[G]に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
[K]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する[G]に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
[L]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である[K]に記載の細胞集団または血管内皮幹細胞。
[M]血管再生用医薬を製造するための前記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞集団または前記[6]~[8]のいずれかに記載の血管内皮幹細胞の使用。
[N]血管再生用医薬が、虚血および低栄養を改善する[M]に記載の使用。
[O]血管再生用医薬が、血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する[M]に記載の使用。
[P]血管再生用医薬が、臓器再生を促進する[M]に記載の使用。
[Q]血管再生用医薬が、血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する[M]に記載の使用。
[R]血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である[Q]に記載の使用。
[S]前記[4]に記載の細胞集団または前記[7]に記載の血管内皮幹細胞を投与する工程を含む導入遺伝子産物により改善される疾患の治療方法。
[T]導入遺伝子産物により改善される疾患の治療に使用するための前記[4]に記載の細胞集団または前記[7]に記載の血管内皮幹細胞。
[U]導入遺伝子産物により改善される疾患の治療用医薬を製造するための、前記[4]に記載の細胞集団または前記[7]に記載の血管内皮幹細胞の使用。
マウス肝臓の血管内皮細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)から取得したSP細胞集団およびMP細胞集団を用いて、MP細胞集団と比べSP細胞集団で発現が高い遺伝子を網羅的に解析し、100を超える遺伝子を見出した。これらの遺伝子の中から、SP細胞集団中に10%程度存在する血管内皮幹細胞の細胞表面マーカーの特定を試みた。
(1)使用動物および細胞調製
C57BL/6マウスおよびC57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウス(通称グリーンマウス)を日本エスエルシーから購入した。8~12週齢のマウスを実験に使用した。麻酔下でマウスを開腹し、肝臓を摘出した。肝臓を細切した後、Dispase II(Roche Applied Science社製)、collagenase(Wako社製)およびtypeII collagenase(Worthington Biochemical Corp.社製)の混合溶液に浸漬し、37℃で振盪して細胞外マトリックスを消化した。消化後の肝臓を孔径40μmのフィルターに通し、分散した細胞懸濁液を得た。ACK(Ammonium-Chloride-Potassium)溶液(0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, and 0.1mM Na2-EDTA)で赤血球を溶血させ、残りの細胞を以下の実験に供した。
上記(1)で調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。モノクローナル抗体として、抗CD31抗体(clone MEC13.3, BD Biosciences社製)、抗CD45抗体(Clone 30-F11, BD Biosciences社製)、抗CD157抗体(clone BP3, Biolegend社製)、抗CD200抗体(clone OX90, Biolegend社製)を使用した。フローサイトメトリー解析において死細胞を除去するために、染色した細胞にPropidium iodide(PI, 2μg/mL, Sigma-Aldrich社製)を加え死細胞の核を染色した。フローサイトメトリー解析には、FACS Aria II SORP(BD Bioscience社製)およびFlowJo Software(Treestar Software社製)を使用した。
結果を図1に示した。(A)のドットプロットの枠内の細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)を肝臓の血管内皮細胞として回収した。続いて回収した細胞におけるCD157発現量(X軸)とCD200発現量(Y軸)を解析した結果を(B)のドットプロットに示した。その結果、肝臓の血管内皮細胞は、CD157陽性CD200陽性の画分A、CD157陰性CD200陽性の画分BおよびCD157陰性CD200陰性の画分Cの3つの画分に分かれることが明らかになった。そこで、各画分をそれぞれ回収し、以下の実験を行った。
(1)実験方法
画分A(CD157陽性CD200陽性)、画分B(CD157陰性CD200陽性)および画分C(CD157陰性CD200陰性)の細胞を24ウェル培養プレートに播種した。OP9ストローマ細胞(RIKEN cell bank)をフィーダー細胞とし、それぞれ5000個/ウェルを播種した。培地には、10%FCSおよびVEGF(10 ng/mL; PeproTech社製)を含むRPMI培地(Sigma-Aldrich Japan)を用いた。10日間培養後、ウェルの細胞を固定して、抗CD31抗体(BD Biosciences社製)で染色した。なお、画分Aの細胞集団が本発明の第2の細胞集団であり、画分Aと画分Bの混合細胞集団が本発明の第1の細胞集団である。
結果を図2に示した。左は画分C、中央は画分B、右は画分Aの結果である。画分AのCD157陽性CD200陽性細胞は、CD31陽性の大型のコロニーを多数形成した。画分BのCD157陰性CD200陽性細胞は、コロニー形成能を有しているが、コロニーの大きさや数は、画分Aの細胞に及ばなかった。画分CのCD157陰性CD200陰性細胞は、CD31陽性細胞として生存していたが、コロニー形成能はほぼ消失していた。これらの結果から、CD157陽性CD200陽性細胞(画分A)が血管内皮細胞幹細胞画分であり、この細胞からスタートして、CD157陰性CD200陽性(画分B)の幹細胞機能を一部残した血管内皮前駆細胞へ分化し、CD157陰性CD200陰性の成熟血管内皮細胞に終末分化すると考えられた。すなわち、本発明の第2の細胞集団は血管内皮細胞幹細胞を主とする細胞集団、本発明の第1の細胞集団は血管内皮細胞幹細胞と、幹細胞機能を一部残した血管内皮前駆細胞との混合細胞集団であると考えられた。
(1)肝血管障害モデルマウス
C57BL/6マウスにモノクロタリン(Sigma-Aldrich 社製)を300mg/kgの用量で腹腔内投与し、同日に30rads/gの放射線を全身照射して、肝血管障害モデルマウスを作製した。
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの肝臓から回収した画分A(CD157陽性CD200陽性)、画分B(CD157陰性CD200陽性)および画分C(CD157陰性CD200陰性)の細胞を使用した。各画分の細胞2×104個を、それぞれ肝血管障害モデルマウスの脾静脈から肝臓に移植した。移植後4週間目に、麻酔下でマウスを開腹し、肝臓を蛍光実体顕微鏡(Leica社製)で観察した。さらに、肝臓を摘出して上記1-1(1)に記載の方法で細胞懸濁液を調製し、抗CD31抗体、抗CD157抗体および抗CD200抗体で免疫蛍光染色して、フローサイトメトリー解析を行った。
結果を図3に示した。左側は肝臓の蛍光実体顕微鏡観察像である。画分AのCD157陽性CD200陽性細胞を移植した肝臓(上段)では、GFP陽性領域が非常に広く、GFP陽性の移植細胞が無数の血管領域を構築していることが明らかになった。画分BのCD157陰性CD200陽性細胞を移植した肝臓(中段)のGFP陽性領域は、画分Aの細胞を移植した場合より小さかった。すなわち、画分Bの細胞は、血管領域を構築する能力を維持しているが、その能力は画分Aの細胞より劣っていることが明らかになった。画分CのCD157陰性CD200陰性細胞を移植した肝臓(下段)では、移植した細胞がGFP陽性細胞として生存していることのみが観察され、画分Cの細胞には新たな血管領域を構築する能力はないことが明らかになった。
以上の解析結果から、血管内皮細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)をCD157とCD200によって分画すると、CD157陽性CD200陽性の血管内皮細胞が、幹細胞として血管形成に大いに貢献できる細胞であることが判明した。当該CD157陽性CD200陽性の血管内皮幹細胞が分化して、CD157陰性CD200陽性になった細胞は、幹細胞には及ばないが、未だ増殖能を保有した細胞(一部幹細胞機能を残した、いわゆる血管内皮前駆細胞)であり、CD157陰性CD200陰性となった細胞は、増殖活性が極めて減弱している終末分化した血管内皮細胞であると考えられた。この研究成果により、本発明者らは、血管内皮細胞の中に階層性が存在し、血管内皮幹細胞から血管内皮前駆細胞、さらに終末分化した血管内皮細胞への分化系譜を血管システムが有していることを、世界で初めて発見した。
なお、データを示していないが、本発明者らは、移植したCD157陽性CD200陽性細胞により形成された血管は、移植後1年を経過したマウスでも減少することなく残存していることを確認している。
幹細胞は、未分化性を維持しつつ、終末分化した体細胞を継続的に産生していくことから、血管内皮幹細胞と考えられるCD157陽性CD200陽性細胞を移植すれば、長期的に血管内皮細胞として貢献し続けることが期待できる。それゆえ、血管内皮細胞の機能不全に起因する疾患患者にこの細胞を移植すれば、当該疾患を完治できる可能性があると考えられる。そこで、血友病Aモデルマウスの肝臓に正常なCD157陽性CD200陽性細胞を移植し、血友病Aモデルマウスの出血傾向を抑制できるかについて検討した。
血友病Aモデルマウス(凝固第VIII因子遺伝子欠損マウス)は、Jackson Laboratory社から購入した。CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞およびCD157陰性CD200陰性血管内皮細胞は、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの肝臓から、実施例1の1-1に記載の方法で調製した。血友病Aモデルマウスの肝臓に、C57BL/6-TgマウスのCD157陽性CD200陽性血管内皮細胞およびCD157陰性CD200陰性血管内皮細胞をそれぞれ脾静脈から移植し、6週間後に採血し血漿を回収した。これら以外に、野生型マウス、凝固第VIII因子遺伝子ヘテロ欠損マウス、細胞を移植していない凝固第VIII因子遺伝子欠損マウスからも採血を行い、血漿を回収した。血漿中の凝固第VIII因子の測定には、Thrombocheck FVIII kit(Sysmex Corporation社製)を使用した。
CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞を移植した血友病Aモデルマウスの肝臓の凍結切片を抗EGFP抗体および抗CD31抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図4に示した。移植されたEGFP陽性の血管内皮細胞によって血管が構築されており、類洞様血管網がEGFP陽性の血管によって置き換わっていることが明らかになった。
これらの結果から、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞(血管内皮幹細胞)の移植は、血管内皮細胞の機能不全に起因する疾患の治療に有効であることが明らかになった。
近年、血管内皮細胞から分泌される分子が、組織の恒常性維持や組織再構築に重要な機能を果たすことが報告されており、肝臓についても肝臓の類洞血管の血管内皮細胞による肝細胞の維持機構が明らかにされている。CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞は、肝臓の類洞血管の形成に大きく貢献することが明らかになったため、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞の移植により、肝臓の再生が促進するかどうかを検討した。
(1)実験方法
C57BL/6マウスに対して定法に従い70%部分肝切除術を行った。CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞およびCD157陰性CD200陰性血管内皮細胞は、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの肝臓から、実施例1の1-1に記載の方法で調製した。70%部分肝切除したマウスの肝臓に、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞およびCD157陰性CD200陰性血管内皮細胞を、それぞれ脾静脈を介して移植し、8日後に麻酔下でマウスから肝臓を取り出し、重量を測定した。
データを示していないが、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞を移植したマウスは、CD157陰性CD200陰性血管内皮細胞を移植したマウスに比べ肝臓の再生が促進されていることが明らかになった。したがって、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞(血管内皮幹細胞)の移植は、例えば肝線維症、肝硬変などの疾患の治療に有効であると考えられる。
(1)実験方法
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの肝臓から、実施例1の1-1(1)に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。得られた細胞にヘキスト染色と免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。ヘキスト染色は、1×106細胞/mLの細胞懸濁液に、ヘキスト染色液(2% FBS (Sigma-Aldrich), 1mM HEPES (Gibco), 5μg/mL Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)含有DMEM (Sigma-Aldrich))を添加して、37℃で90分間行った。免疫蛍光染色には、実施例1で使用した抗CD31抗体および抗CD45抗体と同じモノクローナル抗体を使用した。染色した細胞にPI(2μg/mL, Sigma-Aldrich社製)を加え死細胞の除去を行った。CD31陽性CD45陰性PI陰性細胞(死細胞を除去した血管内皮細胞)を回収し、ヘキスト解析をフローサイトメーターで行った。フローサイトメトリー解析には、FACS Aria II SORP(BD Bioscience社製)およびFlowJo Software(Treestar Software社製)を使用した。CD31陽性CD45陰性でヘキスト染色されない細胞をSP細胞集団として回収し、CD31陽性CD45陰性でヘキスト染色される細胞をMP細胞集団として回収した。SP細胞集団の約70%はCD157陽性CD200陽性であり、MP細胞集団にはCD157陽性CD200陽性はほとんど含まれないことが本発明者らにより確認されている。
Wnt2
5'-AAGGACAGCAAAGGCACCTT-3'(配列番号1)
5'-GAGCCACTCACACCATGACA-3'(配列番号2)
HGF
5'-ACCCTGGTGTTTCACAAGCA-3'(配列番号3)
5'-CAAGAACTTGTGCCGGTGTG-3'(配列番号4)
GAPDH
5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'(配列番号5)
5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'(配列番号6)
蛍光顕微鏡による観察結果を図7に示した。(A)がSP細胞集団の細胞を移植した肝臓の結果、(B)がMP細胞集団の細胞を移植した肝臓の結果である。SP細胞集団の細胞を移植した肝臓ではGFP陽性細胞が血管を形成していることが観察されたが、MP細胞集団の細胞を移植した肝臓ではGFP陽性細胞がほとんど観察されなかった。
肝臓では、CD31陽性CD45陰性CD157陽性CD200陽性細胞を指標として、臓器内の血管内皮幹細胞を単離できることが判明した。そこで、肝臓以外の臓器においても、このような血管内皮幹細胞が存在するかどうかを検討した。
8週齢のC57BL/6マウスから、網膜、脳、心臓、皮膚、筋肉、肺を採取した。実施例1の1-1(1)に記載の方法で細胞懸濁液をそれぞれ調製した。各細胞懸濁液を抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗CD157抗体および抗CD200抗体で免疫蛍光染色して、CD31陽性CD45陰性CD157陽性CD200陽性細胞(CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞)およびCD31陽性CD45陰性CD157陰性CD200陰性細胞(CD157陰性CD200陰性血管内皮細胞)を回収した。これらの細胞を用いて、実施例1の1-2(1)に記載の方法で、コロニー形成アッセイを行った。
結果を図10に示した。(A)は網膜、(B)は脳、(C)は心臓、(D)は皮膚(真皮)、(E)は筋組織、(F)は肺の結果である。いずれの臓器においても、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞を回収することができ、この細胞はCD31陽性の大型のコロニーを多数形成した。一方、CD157陰性CD200陰性血管内皮細胞のコロニー形成能は乏しいものであった。
血管は臓器において特徴的な構造を維持し、その臓器の機能を支持している。したがって、各臓器の血管内皮幹細胞は当該臓器の再生を誘導し得ると考えられる。
遺伝子導入された血管内皮幹細胞を移植することで、移植された血管内皮幹細胞およびそれから分化した血管内皮細胞が、導入された遺伝子産物を継続的かつ持続的に発現するかどうかを検討した。
実施例1の1-1に記載の方法で、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの肝臓から、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞を調製した。このCD157陽性CD200陽性血管内皮細胞200個を、10ng/mLのVEGFを添加した4000μLの4%ウシ胎児血清(FBS、Sigma-Aldrich)含有リン酸緩衝食塩水(PBS、ThermoFisher)に懸濁した。ピペットマン(商品名、GILSON)を用いて20μLの細胞懸濁液を96ウェルプレート(ThermoFisher)に分注した。1個の細胞が入っているウェルを顕微鏡(DM IL LED、Leica)で肉眼的に選別して、さらに蛍光顕微鏡(DMi8、Leica)でGFPが発現していることを確認した。
レシピエントマウスの肝臓の実体蛍光顕微鏡画像を図11に示した。GFPの発現を維持している血管構造が観察された。
マウスの肝臓で確認された血管内皮幹細胞が、ヒトにも存在するかどうかを検討した。
(1)実験方法
ヒト肝臓組織を用いて、実施例1の1-1(1)に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。続いて実施例1の1-1(2)に記載の方法で、得られた細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。
結果を図14に示した。(A)のドットプロットの枠内の細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)を肝臓の血管内皮細胞として回収した。続いて回収した細胞におけるCD157発現量(X軸)とCD200発現量(Y軸)を解析した結果を(B)のドットプロットに示した。図14(B)に示されたように、ヒト肝臓の血管内皮細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)は、CD200の発現量により、CD200陰性とCD200陽性の2つの画分に分かれることが示された。一方、CD157陽性細胞数は非常に少ないが存在することが確認された。
(1)実験方法
図14(B)のCD200陽性画分(本発明の第1の細胞集団:CD31陽性CD45陰性CD200陽性細胞)およびCD200陰性画分(CD31陽性CD45陰性CD200陰性細胞)をそれぞれ回収し、実施例1の1-2(1)に記載の方法で、コロニー形成アッセイを行った。
結果を図15に示した。(A)がCD200陽性画分の結果、(B)がCD200陰性画分の結果である。(B)のCD200陰性画分には、CD31陽性のコロニーを形成する細胞は存在しなかったが、(A)のCD200陽性画分には、CD31陽性のコロニーを形成する細胞が含まれることが示された。すなわち、ヒト肝臓のCD31陽性CD45陰性CD200陽性細胞には、血管内皮細胞コロニー形成能を有する血管内皮幹細胞が含まれることが明らかになった。なお、本実施例ではCD157陽性CD200陽性血管内皮細胞(本発明の第2の細胞集団)の細胞数が少なかったため、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞を用いてコロニー形成アッセイを行わなかったが、ヒトの場合もマウスと同様に、CD157陽性CD200陽性血管内皮細胞集団(本発明の第2の細胞集団)は血管内皮細胞幹細胞を主とする細胞集団であると考えられる。
マウスでは、いずれの臓器、器官、組織においても血管内皮幹細胞はCD157を発現していることが明らかになった(実施例4)。ヒトの肝臓においては、CD200陽性細胞中に血管内皮幹細胞の存在が確認されたが、CD157陽性細胞の存在は明確ではなかった。そこで、肝臓以外のヒト組織にCD157陽性血管内皮細胞の存在を確認できるかどうか検討した。
ヒト腎臓組織およびヒト胎盤組織から、実施例1の1-1(1)に記載の方法で、それぞれ細胞懸濁液を調製した。得られた細胞に、抗CD31抗体(clone WM59, BioLegend社製)、抗CD45抗体(Clone HI30, BioLegend社製)および抗CD157抗体(clone SY11B5, BD社製)を用いて免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリー解析には、FACS Aria II SORP(BD Bioscience社製)およびFlowJo Software(Treestar Software社製)を使用した。
ヒト腎臓組織の結果を図16に、ヒト胎盤組織の結果を図17にそれぞれ示した。図16および17とも、(A)は抗CD31抗体と抗CD45抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、(B)は(A)の枠内の細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)中のCD157陽性細胞のフローサイトメトリー解析を行った結果である。腎臓および胎盤共に、(A)の枠内の細胞(CD31陽性CD45陰性細胞)を抗CD157抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果、CD157陽性血管内皮幹細胞画分の存在が観察された。
本発明者らは、マウス血管内皮細胞中にside population細胞(SP細胞集団)が存在することを確認している(非特許文献1)。しかし、ヒト組織においては、血管内皮細胞中にSP細胞集団が存在することは未だ確認されていない。そこで、ヒト組織においても、血管内皮細胞中にSP細胞集団の存在を確認できるかどうか検討した。
ヒト皮膚組織から、実施例1の1-1(1)に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。得られた細胞にヘキスト染色と免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。ヘキスト染色は、1×106細胞/mLの細胞懸濁液に、ヘキスト染色液(2% FBS (Sigma-Aldrich), 1mM HEPES (Gibco), 5μg/mL Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)含有DMEM (Sigma-Aldrich))を添加して、37℃で90分間行った。免疫蛍光染色には、抗CD31抗体(clone WM59, BioLegend社製)および抗CD45抗体(Clone HI30, BioLegend社製)を使用した。染色した細胞にPI(2μg/mL, Sigma-Aldrich社製)を加え死細胞の除去を行った。CD31陽性CD45陰性PI陰性細胞(死細胞を除去した血管内皮細胞)を回収し、ヘキスト解析をフローサイトメーターで行った。フローサイトメトリー解析には、FACS Aria II SORP(BD Bioscience社製)およびFlowJo Software(Treestar Software社製)を使用した。
結果を図18に示した。ヒト皮膚組織にSP細胞集団画分(破線枠内)が存在することを確認した。
Claims (14)
- 細胞表面マーカーCD31およびCD200が陽性であり、CD45が陰性である哺乳動物細胞からなる、細胞集団。
- 細胞表面マーカーCD31、CD157およびCD200が陽性であり、CD45が陰性である哺乳動物細胞からなる、細胞集団。
- 前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む請求項1または2に記載の細胞集団。
- 哺乳動物がヒトである請求項1~3のいずれかに記載の細胞集団。
- 請求項1~4のいずれかに記載の細胞集団を有効成分とする医薬。
- 血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用である請求項5に記載の医薬。
- 臓器再生促進用である請求項5に記載の医薬。
- 血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および/または治療用である請求項5に記載の医薬。
- 血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である請求項8に記載の医薬。
- 請求項3に記載の細胞集団を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および/または治療用医薬。
- 導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である請求項10に記載の医薬。
- 被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
(1)被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて請求項1~4のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
(2)培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
(3)被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。 - 単離した臓器を消化・分散して細胞懸濁液を調製する工程(I)と、CD31およびCD200が陽性であり、CD45が陰性である細胞を回収する工程(II)を含むことを特徴とする血管内皮幹細胞の調製方法。
- 前記工程(II)において、CD31、CD157およびCD200が陽性、CD45が陰性である細胞を回収することを特徴とする請求項13に記載の方法。
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