WO2023199951A1 - 抗ｖｅｇｆ機能を有する多能性幹細胞及びその分化細胞 - Google Patents

抗ｖｅｇｆ機能を有する多能性幹細胞及びその分化細胞 Download PDF

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WO2023199951A1
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cells
vegf
pluripotent stem
nucleic acid
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雅子 岡
晋 羽藤
智子 佐矢野
慎二 吉崎
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株式会社セルージョン
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to pluripotent stem cells having anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) function and differentiated cells thereof.
  • the invention also relates to pluripotent stem cells or endothelial cells having anti-VEGF function.
  • CECSi cells Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells
  • PLACSi cells Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells
  • CECSi cells have the characteristic that differentiated endothelial cells can be mass-produced from iPS cells in a short period of time (about two weeks) with uniform quality and highly adhesive to cells, extracellular matrix, etc. If we can take advantage of this feature and impart additional functions to CECSi cells through gene editing or gene introduction, we can aim to expand the application not only to corneal treatment but also to other disease areas.
  • Gene transfer technology can be broadly divided into non-viral transfer methods and transfer methods using viruses. In gene therapy, gene transfer technology using viruses is used, and many viral vectors have been developed. ing.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF is expressed in macrophages and tumor cells, and has the effect of promoting vascular permeability and angiogenesis. Due to its ability to inhibit the action of VEGF, for example, aflibercept (Eylea), a recombinant soluble VEGF receptor (sVEGFR), is currently being used to treat age-related macular degeneration, diabetic macular edema, and choroidal neovascularization due to pathological myopia. , macular edema associated with retinal arteriovenous occlusion, and neovascular glaucoma.
  • aflibercept a recombinant soluble VEGF receptor
  • Bemacizumab (Avastin), an anti-VEGF antibody, is effective against colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, malignant glioma, ovarian cancer, and cervical cancer. It has been recognized that it is effective against hepatocellular carcinoma.
  • Patent Document 4 Attempts have been made to impart anti-VEGF function to cells, and a method has been reported in which sVEGFR genes and anti-VEGF antibody genes are introduced into cells and the proteins encoded by these genes are expressed and secreted by the cells (Patent Document 4) -6, Non-Patent Documents 1-3).
  • Patent Document 7 discloses cells modified by recombinant technology to secrete soluble VEGF receptors.
  • Patent Document 8 discloses cells modified by recombinant technology to express anti-VEGF antibodies.
  • An object of the present invention is to provide pluripotent stem cells endowed with new functions and differentiated cells thereof.
  • an object of the present invention is to provide corneal endothelial substitute cells derived from pluripotent stem cells, particularly iPS cells, and endowed with new functions.
  • the present inventors first attempted to impart an anti-VEGF function to the corneal endothelial substitute cells that the present inventors have been developing.
  • the VEGFR gene was introduced into iPS cells, the iPS cells into which the gene was introduced were induced to differentiate into corneal endothelial substitute cells, and the obtained corneal endothelial substitute cells were confirmed to express the VEGFR gene and secrete VEGFR protein.
  • the present invention was completed.
  • the present invention provides the following.
  • Pluripotent stem cells or endothelial cells having anti-VEGF function [2] The cell according to [1] above, wherein the endothelial cell is a cell induced to differentiate from a pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell is an iPS cell.
  • the endothelial cell is a corneal endothelial cell.
  • the anti-VEGF function is caused by VEGFR.
  • [6] The cell according to any one of [1] to [4] above, wherein the anti-VEGF function is caused by an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • a method for producing cells expressing VEGFR comprising the step of introducing a nucleic acid encoding VEGFR into the cell, wherein the cell is a pluripotent stem cell or an endothelial cell.
  • a method for producing a cell expressing an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising the step of introducing a nucleic acid encoding the anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof into the cell, wherein the cell is a pluripotent stem cell. or endothelial cells.
  • a method for producing a cell expressing VEGFR comprising: a pluripotent stem cell or an endothelial cell.
  • pluripotent stem cells are iPS cells.
  • endothelial cells are corneal endothelial cells.
  • a pharmaceutical composition comprising the cell according to any one of [1] to [8] above.
  • CECSi cells were able to have anti-VEGF function.
  • Ophthalmic diseases involving new blood vessels caused by CECSi cells with anti-VEGF function (age-related macular degeneration, diabetic macular edema, diabetic retinopathy, choroidal neovascularization due to pathological myopia, corneal neovascularization, corneal fatty degeneration, retinal arteriovenous) macular edema associated with obstruction, neovascular glaucoma, etc.) or cancer/malignant tumors (colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, malignant glioma, ovarian cancer, cervical cancer, This will enable the development of new cell therapies such as anti-neovascular therapy for metastatic cancer, peritoneal dissemination, pleural dissemination, cancerous lymphangiopathy, hepatocellular carcinoma, etc.).
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of an sVEGFR-1 expression viral vector (AAV vector).
  • a serotype 1 AAV expression vector pAAV1-sVEGFR1 in which an sVEGFR-1 sequence is added after the CAG promoter is shown.
  • a serotype 2 AAV expression vector pAAV2-sVEGFR1 in which the sVEGFR-1 sequence is added behind the EF1 ⁇ promoter is shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of RT-PCR confirmation of sVEGFR-1 gene expression in cells 3 days after infection.
  • FIG. 1 AAV1-sVEGFR1 expressing virus
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting to confirm the secretion of sVEGFR-1 protein in the culture supernatant on day 3 after transfecting CECSi cells with sVEGFR-1 expressing AAV vectors (pAAV1-sVEGFR1, pAAV2-sVEGFR1). Virus-uninfected cells (empty) were used as a control.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting to confirm the secretion of sVEGFR-1 protein into the culture supernatant over time after CECSi cells were infected with sVEGFR-1 expressing viruses (AAV1-sVEGFR1, AAV2-sVEGFR1). .
  • As a control cells infected with the control vector shown in FIG. 2 were used.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of ELISA evaluation of the amount of sVEGFR-1 protein secreted into the culture supernatant of CECSi cells infected with a sVEGFR-1 expressing virus (AAV2-sVEGFR1).
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method of tube formation assay using vascular endothelial cells HUVEC. After infecting CECSi cells with sVEGFR-1 expressing viruses (AAV1-sVEGFR1, AAV2-sVEGFR1), sVEGFR-1 secreted from the infected cells into the culture supernatant (CM) is transferred to the lumen of vascular endothelial cells (HUVEC).
  • CM culture supernatant
  • sVEGFR1 AAV1
  • AAV2 sVEGFR1
  • AAV2-sVEGFR1 AAV2-sVEGFR1.
  • NON non-virus-infected cells and serotype 1 AAV expression vectors were infected with a virus (GFP) prepared from a vector with an EGFP sequence added behind the CMV promoter (control vector in Figure 2). cells were used.
  • AAV1 has the same meaning as AAV1-sVEGFR1
  • AAV2 has the same meaning as AAV2-sVEGFR1.
  • CM means culture supernatant.
  • anti-VEGF function means a function that inhibits the action of vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF is a group of glycoproteins involved in vasculogenesis and angiogenesis. It primarily binds as a ligand to the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) on the surface of vascular endothelial cells, stimulating cell division, migration, and differentiation. It has the function of increasing the vascular permeability of microvessels. In addition, it is known to be involved in the activation of monocytes and macrophages.
  • VEGF-A Growth factors involved in vasculogenesis, angiogenesis, and lymphangiogenesis include VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF (placental growth factor)-1, and PlGF. -2, and these are collectively called the "VEGF family.”
  • VEGF family members have several subtypes due to alternative splicing.
  • VEGF-A normally has four types of amino acids in humans: 121 (VEGF-A 121 ), 165 (VEGF-A 165 ), 189 (VEGF-A 189 ), and 206 (VEGF-A 206 ).
  • VEGF-B 167 and VEGF-B 186 are known as VEGF-B.
  • "VEGF” is a concept that includes all of these.
  • anti-VEGF function as long as the biological effects expected by inhibiting the action of VEGF (e.g., suppression of angiogenesis, suppression of vascular hyperpermeability, suppression of inflammation) are observed, the degree of inhibition is limited. However, it also differs depending on the type of biological action that is an indicator of anti-VEGF function. It is sufficient if there is a significant difference between the case where the function is performed and the case where the function is not performed.
  • Preferable indicators of anti-VEGF function include inhibition of angiogenesis.
  • angiogenesis is defined herein as the physiological process by which new blood vessels are formed by branching out from existing blood vessels.
  • angiogenesis is defined herein as the physiological process during embryogenesis in which new blood vessels are created where none exist. Angiogenesis facilitates wound healing, hair and adipose tissue growth, nerve regeneration, and muscle and bone repair, but abnormal blood vessel formation can lead to tumor growth and metastasis, as well as harmful effects such as hemangiomas. It has an effect.
  • the anti-VEGF function is preferably a function caused by vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), an anti-vascular endothelial growth factor antibody (anti-VEGF antibody), or an antigen-binding fragment thereof. That is, it refers to the function of inhibiting the action of VEGF by VEGFR, an anti-VEGF antibody, or an antigen-binding fragment thereof.
  • VEGFR vascular endothelial growth factor receptor
  • anti-VEGF antibody anti-vascular endothelial growth factor antibody
  • VEGFR can be classified into three types: VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3.
  • VEGFR-1 is also known as fms-related tyrosine kinase 1 (FLT-1) and is specific to the VEGF family, including VEGF-A, VEGF-B and placental growth factor (PlGF).
  • VEGFR-2 also known as KDR (kinase insert domain receptor), is specific to the VEGF family, including VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, and VEGF-E.
  • VEGFR-3 is also known as fms-related tyrosine kinase 1 (FLT-4) and is specific to the VEGF family, including VEGF-C and VEGF-D.
  • FLT-4 fms-related tyrosine kinase 1
  • the anti-VEGF function of VEGFR in the case of VEGFR-1, is based on the following mechanism of action.
  • VEGFR-1 is synthesized through alternative splicing at the pre-mRNA level into two forms: a full-length membrane-bound receptor capable of signal transduction, and a soluble receptor (sVEGFR-1; sVEGFR-1). 1).
  • sVEGFR-1 is capable of interfering with signal transduction by forming dimers with the full-length receptor and/or by binding to ligands.
  • Free VEGFR can preferentially bind to circulating VEGF and prevent VEGF from binding to VEGFR on cells, thereby inhibiting VEGF function.
  • Recombinant human soluble VEGFR fusion protein in which part of the extracellular domain of human VEGFR-1 and -2 proteins is fused to the Fc portion of human IgG1 is known as aflibercept (trade name: Eylea).
  • Anti-VEGF antibodies or antigen-binding fragments thereof can be used, for example, to prevent binding of VEGF to a cellular receptor, to prevent activation of vascular endothelial cells after VEGF has bound to a cellular receptor, or to inhibit activation of vascular endothelial cells after VEGF has bound to a cellular receptor. It works by killing the cells that cause it.
  • the term "antigen-binding fragment” refers to an antibody fragment consisting of a portion of an anti-VEGF antibody and having the ability to bind to VEGF. The number of amino acids contained in the polypeptide constituting the antigen-binding fragment is not particularly limited as long as it has the ability to bind to VEGF. Examples of anti-VEGF antibodies or antigen-binding fragments thereof include ranibizumab (trade name: Lucentis), bevacizumab (trade name: Avastin), and prolucizumab (trade name: Beopyu).
  • the present invention provides cells having anti-VEGF function (hereinafter also simply referred to as cells of the present invention).
  • the cells include pluripotent stem cells and cells obtained by inducing differentiation from the pluripotent stem cells (hereinafter also simply referred to as differentiated cells), particularly endothelial cells such as corneal endothelial substitute cells.
  • Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, reproductive stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (embryonic germ cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Pluripotent stem cells also include Muse cells (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cells) obtained from mesenchymal stem cells (MSCs) and GS cells produced from germ cells (for example, testis).
  • ES cells can be produced by culturing an internal cell population on feeder cells or in a medium containing leukemia inhibitory factor (LIF). It can also be obtained from a designated organization or purchased commercially.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • ntES cells nuclear transfer ES cells
  • cloned embryos produced by transplanting the cell nucleus of a somatic cell into an egg from which the cell nucleus has been removed.
  • EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mouse stem cell factor (mSCF), LIF, and basic fibroblast growth factor (bFGF) (Cell, 70:841-847, 1992).
  • mSCF mouse stem cell factor
  • LIF mouse stem cell factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • iPS cells are cells whose pluripotency has been induced by reprogramming somatic cells using known methods.
  • iPS cells include somatic cells differentiated into fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells, etc., such as Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Examples include cells that have been reprogrammed to induce multipotency by expressing multiple genes selected from a group of reprogramming genes including Nanog, Sall4, lin28, Esrrb, and the like.
  • Yamanaka et al. established induced pluripotent stem cells using mouse cells (Cell, 2006, 126(4) pp.663-676).
  • Induced pluripotent stem cells were also established in human fibroblast cells in 2007, and have pluripotency and self-renewal ability similar to embryonic stem cells (Cell, 2007, 131(5) pp.861-872; Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106).
  • induced pluripotent stem cells can also be induced from somatic cells by adding compounds, etc. (Science, 2013, 341, pp.651- 654).
  • the somatic cells used in producing induced pluripotent stem cells are not particularly limited, but include tissue-derived fibroblasts, blood cells (e.g. peripheral blood mononuclear cells, T cells, etc.), hepatocytes, and pancreatic cells. Examples include cells, intestinal epithelial cells, smooth muscle cells, and the like.
  • Means for expressing genes include, for example, infection methods using viral vectors (e.g., retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors), plasmid vectors (e.g., plasmid vectors, episodic virus vectors), etc.
  • viral vectors e.g., retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors
  • plasmid vectors e.g., plasmid vectors, episodic virus vectors
  • Gene introduction methods using RNA vectors e.g. calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, electroporation method
  • gene introduction methods using RNA vectors e.g. calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method
  • Examples include direct injection method.
  • the iPS cells include 201B7, 201B7-Ff, 253G1, 253G4, 1201C1, 1205D1, 1210B2, 836B3, FF-I14s03, FF-I01s04, MH09s01, Ff-XT18s02, Ff-WIs03, Ff-WJs513, Ff-CLs14, Ff-KVs09, QHJI14s03, QHJI01s04, RWMH09s01, DRXT18s02, RJWIs03, YZWJs513, ILCLs14, GLKVs09, Ff-XT28s05-ABo_To,Ff-I01s04-ABII-KO,Ff-I14s0 4-ABII-KO (both iPS Academia) Japan Inc., or Kyoto University iPS Research Foundation), Tic (JCRB1331 shares), Dot
  • “Mammals” include rodents, ungulates, felids, lagomorphs, primates, and the like. Rodents include mice, rats, hamsters, guinea pigs, and the like. Ungulates include pigs, cows, goats, horses, sheep, and the like. The order Cats includes dogs, cats, and the like. Lagomorpha includes rabbits and the like. "Primate” refers to mammals belonging to the order Primates, and primates include the suborder Prosimians, such as lemurs, lorises, and treehoppers, and the suborder Prosimians, such as monkeys, great apes, and humans.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are mammalian pluripotent stem cells, preferably rodent (e.g. mouse, rat) or primate (e.g. human, monkey) pluripotent stem cells, most preferably are human pluripotent stem cells.
  • rodent e.g. mouse, rat
  • primate e.g. human, monkey
  • the differentiated cells used in the present invention include those induced to differentiate from the above-mentioned pluripotent stem cells.
  • corneal endothelium-like cells developed by the present inventors so-called corneal endothelial substitute cells
  • an iPS cell-derived cornea which has properties and functions similar to corneal endothelial cells, and is characterized by enhanced gene expression of NR3C2 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 2). Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells; CECSi cells (Patent Document 3).
  • the medium for inducing differentiation from pluripotent stem cells to CECSi cells contains IGF1 (2 to 500 ng/ml), STAT3 activators IL-6 and LIF (0.1 to 50 ng/ml).
  • IGF1 2 to 500 ng/ml
  • STAT3 activators IL-6 0.1 to 50 ng/ml
  • LIF 0.1 to 50 ng/ml
  • An example of a method for producing corneal endothelial substitute cells includes the following method. iPS cells are cultured for one week in a culture dish coated with iMatrix-511 (0.6 ⁇ g/cm 2 ) using StemFit® AK03N medium (Ajinomoto).
  • the iMatrix-511 (0.3 ⁇ g/cm 2 )-coated culture dish was seeded again, and the iPS cells were cultured to induce differentiation into corneal endothelial substitute cells using the following differentiation induction medium (Table 1). Do this for 14 days.
  • cryopreserved iPS cells thaw the iPS cells and culture them in a culture dish coated with iMatrix-511 (0.6 ⁇ g/cm 2 ) for 18 days using StemFit (registered trademark) AK03N medium (Ajinomoto). After culturing (expanding culture by passage twice in the middle), differentiation is induced.
  • the corneal endothelial cell-like properties and functions possessed by the corneal endothelial substitute cells include the following characteristics (i) to (iv), and at least one, preferably two, or more of these characteristics. Preferably it has three characteristics, more preferably all four characteristics.
  • Cell-cell adhesion is composed of N-cadherin.
  • Tight junctions are formed between cells.
  • Expression of transcription factor PITX2 is observed in the cell nucleus. Whether or not intercellular adhesion is composed of N-Cadherin can be confirmed by immunostaining for N-Cadherin.
  • Whether or not tight junctions are formed between cells can be confirmed by observing the presence of ZO-1, a protein that constitutes tight junctions, by immunostaining for ZO-1. It can also be confirmed by directly observing the structure using an electron microscope. Whether or not Na,K-ATPase ⁇ 1 subunit (ATP1A1) is expressed on the cell membrane can be confirmed by immunostaining for ZO-1 and Na,K-ATPase ⁇ 1 subunit by co-staining of both. . Whether the transcription factor PITX2 is expressed in the cell nucleus can be confirmed by immunostaining for PITX2.
  • the cells of the present invention are the above-mentioned pluripotent stem cells and their differentiated cells, particularly endothelial cells, to which an anti-VEGF function is imparted.
  • the process of imparting anti-VEGF function to cells will be described in detail in "2. Cell manufacturing method” below, but specifically, VEGFR is added to the above-mentioned pluripotent stem cells and their differentiated cells, especially endothelial cells. This is carried out by introducing a nucleic acid encoding an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the cells of the present invention are cells that express VEGFR or an anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • VEGFR expressed by the cells of the present invention is not particularly limited as long as it binds to the ligand VEGF and inhibits its function, and may be a fusion protein of full-length VEGFR or a portion thereof and another protein.
  • a fusion protein (fusion protein 1) having the following amino acid sequence may be mentioned.
  • the anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof expressed by the cells of the present invention is not particularly limited as long as it binds to VEGF and inhibits its function. It may also be a fusion protein of a full-length anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof or a portion thereof and another protein. Examples include fusion proteins having the following amino acid sequences (fusion proteins 2 to 4).
  • the present invention provides a method for producing cells having anti-VEGF function (hereinafter also simply referred to as the method for producing cells of the present invention).
  • the method for producing cells of the present invention is characterized by imparting anti-VEGF function to the cells.
  • the cells include pluripotent stem cells and their differentiated cells, particularly endothelial cells such as corneal endothelial substitute cells.
  • Anti-VEGF function may be imparted to cells at any stage.
  • the anti-VEGF function may be imparted to pluripotent stem cells, or the anti-VEGF function may be imparted to differentiated cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells, particularly endothelial cells.
  • Examples of the endothelial cells include the corneal endothelial substitute cells developed by the present inventors described in the section "1. Cells" above.
  • a nucleic acid encoding VEGFR or an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof is inserted into an appropriate expression vector (two types of expression vectors may be used if necessary). At that time, it is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region, such as an enhancer or a promoter. Next, cells are transformed with this expression vector to express VEGFR or anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • An embodiment of the cell production method of the present invention includes the following method. (1) Inserting a nucleic acid encoding VEGFR into an expression vector to produce an expression vector containing the nucleic acid, (2) a step of introducing the nucleic acid into a cell using an expression vector containing the nucleic acid to produce a cell containing the expression vector; and (3) a step of culturing the cell containing the expression vector.
  • a method for producing a cell expressing VEGFR comprising: a pluripotent stem cell or an endothelial cell.
  • Another embodiment of the cell production method of the present invention includes the following method. (1) Inserting a nucleic acid encoding an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof into an expression vector to produce an expression vector containing the nucleic acid; (2) a step of introducing the nucleic acid into a cell using an expression vector containing the nucleic acid to produce a cell containing the expression vector; and (3) a step of culturing the cell containing the expression vector.
  • a method for producing a cell expressing an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising: a pluripotent stem cell or an endothelial cell.
  • Vectors can be viral or non-viral vectors.
  • viral vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, vaccinia virus vectors, and the like.
  • retrovirus vectors, lentivirus vectors, and adeno-associated virus vectors the target gene inserted into the vector is integrated into the host chromosome, and stable and long-term expression can be expected.
  • Non-viral vectors include plasmid vectors, liposome vectors, and positively charged liposome vectors (Felgner, PL, Gadek, TR, Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987 ), YAC vectors, BAC vectors, artificial chromosome vectors, etc.
  • the expression vector is introduced into the cell by infection with a virus.
  • non-viral vectors such as plasmids
  • conventional methods such as electroporation, lipofection, calcium phosphate, and nucleofection can be used for introduction into cells, and lipofection is preferably used.
  • Anti-VEGF function may be imparted to cells by genome editing.
  • Gene editing is a technology that intentionally modifies a target gene or genomic region using principles such as site-specific cleavage of genomic DNA strands using nucleases or chemical conversion of bases.
  • Site-specific nucleases include zinc finger nucleases (ZFNs), TALENs, CRISPR/Cas9, and the like.
  • a nucleic acid encoding VEGFR or a nucleic acid encoding an anti-VEGF antibody or an antigen-binding fragment thereof is introduced into pluripotent stem cells or their differentiated cells, particularly endothelial cells, using genome editing technology.
  • the nucleic acid encoding VEGFR or the nucleic acid encoding anti-VEGF antibody or its antigen-binding fragment introduced to impart anti-VEGF function to cells is a protein desired by the cell (the former is VEGFR, the latter is anti-VEGF antibody or There are no particular limitations as long as the antigen-binding fragment) can be expressed.
  • the protein to be expressed is the above-mentioned fusion proteins 1 to 4, examples of the base sequence of the introduced nucleic acid include the following.
  • the cell culture in the subsequent expansion culture is preferably carried out in a medium for pluripotent stem cell culture.
  • Known media for pluripotent stem cells can be used, and are not particularly limited as long as they do not inhibit the proliferation of pluripotent stem cells, such as DMEM, DMEMHG, EMEM, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM ( Glasgow's MEM), RPMI-1640, ⁇ -MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, Medium 199, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's
  • the thus obtained pluripotent stem cells having anti-VEGF function can be induced to differentiate to obtain desired differentiated cells. Differentiation induction is appropriately determined depending on the type of targeted differentiated cells, and is carried out using known materials/methods. For example, by inducing differentiation of pluripotent stem cells having anti-VEGF function as described in Patent Documents 1 to 3, corneal endothelial substitute cells, which are corneal endothelium-like cells, can be obtained. The obtained corneal endothelial substitute cells have anti-VEGF function.
  • the cells used in the step of imparting anti-VEGF function to cells are differentiated cells induced to differentiate from pluripotent stem cells, preferably endothelial cells, particularly corneal endothelial substitute cells
  • the cell culture in the subsequent expansion culture is differentiated. It is preferred to carry out in a medium for culturing cells, preferably endothelial cells, especially corneal endothelial substitute cells.
  • any known medium can be used as such a medium, and is not particularly limited as long as it does not inhibit the proliferation of differentiated cells, but examples include DMEM, DMEMHG, EMEM, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's MEM), RPMI-1640, ⁇ -MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, Medium 199, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15 , RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's MB752/1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, and a mixed medium thereof.
  • induction of differentiation from pluripotent stem cells into differentiated cells itself can be carried out by a known method.
  • induction of differentiation from pluripotent stem cells into corneal endothelial substitute cells can be carried out according to the descriptions in Patent Documents 1 to 3.
  • compositions having anti-VEGF function as an active ingredient.
  • the cells having an anti-VEGF function that can be included as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention are the cells described in the above section "1. Cells”, and the cells are the cells described in the above "2. Cell manufacturing method” method. The cells were produced by
  • the pharmaceutical composition of the present invention can usually be prepared by mixing the active ingredient, the cell of the present invention, with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to diluents, adjuvants, excipients, stabilizers, etc. that are non-toxic to the cells exposed thereto at the dosages and concentrations employed. agent, vehicle or support.
  • Carriers often include aqueous pH buffer solutions, antioxidants, low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, hydrophilic polymers, amino acids, monosaccharides, disaccharides, chelating agents such as EDTA, sodium, etc. salt-forming counterions of
  • a preferred carrier is saline solution.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the cell of the present invention as an active ingredient, and the cell of the present invention is capable of secreting a therapeutically effective amount of VEGFR or anti-VEGF antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a therapeutically effective amount means that when the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a subject, it is possible to obtain a therapeutic effect on the above-mentioned diseases compared to a subject who is not administered the pharmaceutical composition. This is as much as possible.
  • a specific therapeutically effective amount is appropriately determined depending on the administration method, purpose of use, age, weight, symptoms, etc. of the subject.
  • cells with anti-VEGF function can be used to inhibit angiogenesis such as angiogenesis or lymphatic vessels within the human body.
  • angiogenesis such as angiogenesis or lymphatic vessels within the human body.
  • Inhibition of angiogenesis is preferred in patients suffering from diseases or disorders directly caused by abnormal formation of blood vessels, such as macular degeneration, lymphangiogenesis and endometriosis.
  • Other diseases and disorders that require blood supply, angiogenesis, or blood or lymph flow for progression, such as cancer, metastasis, and dissemination, can also be treated by inhibiting angiogenesis.
  • Diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention can be applied include various diseases for which inhibition of angiogenesis and lymphangiogenesis is known to be useful for prevention and treatment, and specifically age-related macular degeneration.
  • Example 1 Production of corneal endothelial substitute cells (CECSi cells) that secrete sVEGFR-1 protein iPS cells were coated with iMatrix-511 (0.6 ⁇ g/cm 2 ) in StemFit® AK03N medium (Ajinomoto). After seeding on a culture dish and culturing for 1 day, a plasmid vector carrying a soluble VEGFR-1 (sVEGFR-1) gene was introduced into iPS cells by lipofection.
  • the plasmid vector is the expression vector (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries #163-25601 pCAG- Neo vector).
  • Cells into which the sVEGFR-1 gene had been introduced were selected based on drug resistance of the iPS cells into which the gene had been introduced. It was confirmed by Western blotting and ELISA that sVEGFR-1 protein was secreted into the culture supernatant of the sVEGFR-1-introduced iPS cells (FIG. 1). For Western blotting, proteins were separated from culture supernatant containing 20 ⁇ g of protein by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a PVDF membrane, and detected using Abcam's Anti-VEGF Receptor 1 antibody [Y103] #ab32152.
  • Enzo (#ALX-850-264) Human sVEGFR-1 Platinum ELISA kit was used. According to the protocol, the culture supernatant was placed in a microplate immobilized with anti-human sVEGFR-1 antibody, and then biotin-conjugated anti-human sVEGFR-1 antibody was added and reacted, followed by detection using Streptavidin-HRP.
  • This gene-introduced iPS cell clone was subsequently expanded and cultured in the above-mentioned medium (culture period: 1 week), and then re-seeded on a culture dish coated with iMatrix-511 (0.3 ⁇ g/cm 2 ), and the differentiation-inducing medium ( (See Table 1 above), induction of differentiation from iPS cells to corneal endothelial substitute cells (CECSi cells) was started (Day 0).
  • sVEGFR-1 was secreted from the culture supernatant of sVEGFR-1-introduced corneal endothelial substitute cells after differentiation induction (Day 6) (0.19 to 0.29 ng/mL). Furthermore, the expression level of the undifferentiated marker OCT4 in the cells after differentiation induction (Day 10) was 3% or less of the OCT4 expression level in the iPS cells as the raw material, confirming differentiation into endothelial cells. From the above results, it was confirmed that corneal endothelial substitute cells secreting sVEGFR-1 protein were produced.
  • Example 2 Expression of sVEGFR-1 gene in CECSi cells
  • Viruses were produced from two types of viral vectors.
  • the serotype 1 (AAV1) vector has a structure in which a partial sequence of the extracellular domain of VEGFR-1 is added behind the CAG promoter to the pAAV expression vector (Fig. 2A, pAAV1-sVEGFR1).
  • the vector has a structure in which a partial sequence of the extracellular domain of VEGFR-1 is added behind the EF1 ⁇ promoter to the pAAV expression vector (FIG. 2B, pAAV2-sVEGFR1).
  • Viruses were produced using these vectors at Vector Builder.
  • a virus produced from a serotype 1 vector is also referred to as AAV1-sVEGFR1
  • a virus produced from a serotype 2 vector is also referred to as AAV2-sVEGFR1.
  • CECSi cells hereinafter also referred to as ATCC-CECSi cells
  • ATCC-BYS0112 Human [Non-Hispanic Caucasian Male] Induced Pluripotent Stem (IPS) Cells (ATCC ACS-1026) purchased from ATCC were once After cryopreservation, they were seeded at 1.2 ⁇ 10 5 cells in 24 wells and infected with AAV1sVEGFR1 or AAV2sVEGFR1 (MOI: 200,000, 66,000, 22,000).
  • sVEGFR1 gene in ATCC-CECSi cells was confirmed on the third day after infection (second day after medium exchange). Differentiation into CECSi cells was induced by a conventional method, for example, the method described in Patent Document 3, or a method similar thereto.
  • mRNA was extracted from the infected ATCC-CECSi cells using Qiagen RNeasy mini (#74004), and 0.3 ⁇ g of mRNA was reverse transcribed using RevaTraAce reverse transcriptase (Takara) to prepare cDNA.
  • the sVRGFR-1 primers used are as follows. Forward primer: GCAACGTGCTGGTTATTGTG (SEQ ID NO: 14) Reverse primer: GTGCTGGGTGCCTTTTAAACTC (SEQ ID NO: 15) The GAPDH primers used are as follows. Forward primer: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 16) Reverse primer: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 17)
  • Example 3 Secretion of sVEGFR-1 protein into CECSi cell culture supernatant Lipofectamine 3000 was used for ATCC-CECSi cells prepared in a 24-well plate using 1 ⁇ g each of pAAV1-sVEGFR1 and pAAV2-sVEGFR1 constructed in Example 2. The secretion of sVEGFR-1 protein in the culture supernatant over time was confirmed by Western blotting. Samples were prepared by adding a 6-fold concentrated SDS sample buffer (Nacalai) with a reducing agent (b-me) to 15 ⁇ l or 20 ⁇ l of the culture supernatant to make a 1-fold sample buffer.
  • a 6-fold concentrated SDS sample buffer Nacalai
  • b-me reducing agent
  • An e-PAGEL mini size ready-made gel (5 to 20%) was prepared on ATTO Pagelan Ace, the entire sample was applied, and electrophoresis was performed at 21 mA for 60 minutes. After the electrophoresis was completed, the protein was transferred to the membrane using ATTO Powered Blot 2M (WSE-4125) at 25 mV for 20 minutes. After the transfer, the membrane was subjected to blocking treatment with Blocking One (Nacalai) at room temperature for 30 minutes or more, and then the primary antibody sVEGFR1 (Abcam #Ab32152) was diluted 1000 times and reacted overnight at 4°C.
  • Blocking One Nacalai
  • Abcam #Ab32152 the primary antibody sVEGFR1
  • sVEGFR-1 was gene introduced into ATCC-CECSi cells, and 3 days later, expression of sVEGFR-1 protein was confirmed in the culture supernatant.
  • Example 4 Secretion of sVEGFR-1 protein into CECSi cell culture supernatant
  • a vector was constructed at Vector Builder, and the virus was purchased.
  • the virus is a product that guarantees an infection efficiency of 2x100000000000.
  • ATCC-CECSi cells were seeded in 24 wells at 1.2 ⁇ 10 5 cells and infected with AAV1-sVEGFR1 virus or AAV2-sVEGFR1 virus at an MOI of about 250,000.
  • a medium DMEM/F12, ITS, IGF-1
  • the culture supernatant at the time of exchange was collected, centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes, and used as a sample, and Western blotting was performed on the supernatant on the 2nd, 8th, and 12th day after infection.
  • the results are shown in Figure 5. A slight secretion was observed from the 2nd day, and an increasing trend was observed on the 8th and 12th days.
  • Example 5 Secretion of sVEGFR-1 protein into CECSi cell culture supernatant (long-term secretion)
  • a vector was constructed at Vector Builder Co., Ltd. in the same manner as in Example 2, and the virus was purchased.
  • the virus is a product that guarantees an infection efficiency of 2x100000000000.
  • One-passage ATCC-CECSi cells were seeded at 1.5 x 10 cells in 24 wells, and the AAV2-sVEGFR1 virus was used at three points (300,000, 100,000, 30,000) at varying concentrations of 1/3 from approximately MOI: 300,000. ) infection was carried out.
  • the culture supernatant at the time of exchange was collected, centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes, and used as samples, and Western blotting was performed on the supernatants on the 6th, 11th, 16th, and 21st days after infection. However, even on the 21st day, a band was observed, confirming secretion.
  • the results are shown in FIG.
  • Example 6 Measurement of secreted amount of sVEGFR-1 protein in culture supernatant by ELISA Using samples whose secretion was confirmed by Western blotting, the secreted amount in culture supernatant was measured. Specifically, it is as follows. A vector was constructed at Vector Builder Co., Ltd. in the same manner as in Example 2, and the virus was purchased. The virus is a product that guarantees an infection efficiency of 2x100000000000. One-passage ATCC-CECSi cells were seeded in 24 wells at 1.5 x 105 cells, and the AAV2-sVEGFR1 virus was added to three points (200,000, 66,000, 22,000) at varying concentrations of 1/3 from approximately MOI: 200,000. infection was carried out.
  • Example 7 Functional evaluation of secreted sVEGFR-1 protein
  • Assay Tube assay formation
  • the method of this assay is as follows. A schematic diagram is shown in FIG. (Method) (1) Add the EBM substrate attached to the Cultrex In vitro Angiogenesis Assay kit (R&D: 3470-096-K) to a 96-well plate, and prepare cells while solidifying in a 5% CO 2 incubator at 37°C. .
  • Corneal endothelial substitute cells with anti-VEGF function can be used to treat ophthalmic diseases involving neovascularization (age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinal artery occlusion, retinal vein occlusion, neovascular glaucoma, etc.) or malignant tumors. It will become possible to develop new cell treatments such as neovascular therapy.
  • neovascularization age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinal artery occlusion, retinal vein occlusion, neovascular glaucoma, etc.
  • This application is based on a U.S. provisional application (No. 63/330,625, filing date: April 13, 2022) filed in the United States, the contents of which are fully incorporated herein. .

Abstract

本発明は、新たな機能が付与された多能性幹細胞及びその分化細胞（特に内皮細胞）を提供することを課題とする。本発明は、抗ＶＥＧＦ機能を有する多能性幹細胞又は抗ＶＥＧＦ機能を有する多能性幹細胞から誘導された角膜内皮細胞を提供し、該細胞は種々の疾患の治療に有用である。

Description

抗ＶＥＧＦ機能を有する多能性幹細胞及びその分化細胞
　本発明は、抗ＶＥＧＦ(vascular endothelial growth factor;血管内皮細胞増殖因子)機能を有する多能性幹細胞及びその分化細胞に関する。本発明は、また、抗ＶＥＧＦ機能を有する、多能性幹細胞又は内皮細胞に関する。
　ｉＰＳ細胞由来治療用角膜内皮代替細胞(CECSi cells; Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells；ＣＥＣＳｉ細胞)は従来、水疱性角膜症への治療目的で開発された細胞である（特許文献１～３）。一方、ＣＥＣＳｉ細胞には、ｉＰＳ細胞から短期間（約２週間）で、均一な品質で、細胞や細胞外基質等へ高接着性の、分化した内皮細胞を大量生産できるという特徴がある。
　この特徴を生かしつつ、ＣＥＣＳｉ細胞に遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加の機能を付与することができれば、角膜領域の治療だけでなく、他の疾患領域への適応拡大を目指すことができる。遺伝子編集技術としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が開発されている。遺伝子導入技術としては、非ウイルス的な導入法と、ウイルスを用いた導入法に大別されるが、遺伝子治療においては、ウイルスを用いた遺伝子導入技術が使用され、多くのウイルスベクターが開発されている。
　導入する遺伝子も種々のものが試みられている。その一つとして、血管新生を抑制するタンパク質をコードする遺伝子がある。
　血管新生は血管の過剰な成長を伴うがんの拡散の主要な因子であることが知られている。また、がん以外にも新生血管が関与する疾患は多い。例えば、新生血管が関与する眼科疾患（加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、新生血管緑内障、等）に加え、悪性腫瘍等が挙げられる。
　血管新生を制御する主要な増殖因子として血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が知られている。ＶＥＧＦはマクロファージや腫瘍細胞で発現し、血管透過性と血管新生の促進作用を有する。ＶＥＧＦの作用を阻害する機能により、たとえば、現在、遺伝子組み換え可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ）であるアフリベルセプト（アイリーア）は、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視による脈絡膜新生血管、網膜動静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、血管新生緑内障へ、抗ＶＥＧＦ抗体であるベマシズマブ（アバスチン）は、結腸・直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、子宮頸癌、肝細胞癌への効果功能が認められている。
　抗ＶＥＧＦ機能を細胞に付与する試みが為され、ｓＶＥＧＦＲ遺伝子や抗ＶＥＧＦ抗体遺伝子を細胞に導入し、それらの遺伝子がコードするタンパク質を細胞に発現・分泌させる方法が報告されている（特許文献４～６、非特許文献１～３）。
　又、眼及び細胞の増殖障害を治療するために、可溶性ＶＥＧＦ受容体を眼に送達するための細胞療法が報告されている（特許文献７）。特許文献７には、組換え技術によって可溶性ＶＥＧＦ受容体を分泌するように改変された細胞が開示されている。特許文献８には、組み換え技術によって抗ＶＥＧＦ抗体を発現するように改変された細胞が開示されている。
ＷＯ／２０１３／０５１７２２ ＷＯ／２０１６／０９３３５９ ＷＯ／２０１９／１４２８３３ 特表２０１４－５３３２８９ 特開２０１７－２３１３０ ＷＯ／２０１９／０９８２６４ ＷＯ／２００９／１４９２０５ ＷＯ／２００５／０００８９５
BMC Cancer. 2008; 8 306. Cell Death and Disease (2013) 4, e781 Cancer Sci. 2013 Aug; 104(8) 1107_1111.
　本発明の課題は、新たな機能が付与された多能性幹細胞及びその分化細胞を提供することにある。特に、本発明は、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞から誘導された、新たな機能が付与された角膜内皮代替細胞を提供することを課題とする。
　上記課題に鑑み、本発明者らはまず、本発明者らがこれまで開発を進めてきた角膜内皮代替細胞に抗ＶＥＧＦ機能を付与することを試みた。ＶＥＧＦＲ遺伝子をｉＰＳ細胞に導入し、該遺伝子導入されたｉＰＳ細胞を角膜内皮代替細胞へと分化誘導し、得られた角膜内皮代替細胞がＶＥＧＦＲ遺伝子を発現し、ＶＥＧＦＲタンパク質を分泌することを確認して本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］抗ＶＥＧＦ機能を有する、多能性幹細胞又は内皮細胞。
［２］内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、上記［１］記載の細胞。
［３］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、上記［１］又は［２］記載の細胞。
［４］内皮細胞が角膜内皮細胞である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の細胞。
［５］抗ＶＥＧＦ機能がＶＥＧＦＲに起因する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の細胞。
［６］抗ＶＥＧＦ機能が抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片に起因する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の細胞。
［７］ＶＥＧＦＲを発現する上記［１］～［５］のいずれかに記載の細胞。
［８］抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する上記［１］～［４］及び［６］のいずれかに記載の細胞。
［９］ＶＥＧＦＲをコードする核酸を細胞に導入する工程を含む、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
［１０］抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を細胞に導入する工程を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
［１１］核酸の細胞への導入が遺伝子導入又はゲノム編集によるものである、上記［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、上記［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、上記［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］内皮細胞が角膜内皮細胞である、上記［９］～［１３］のいずれかに記載の方法。

［１５］（１）ＶＥＧＦＲをコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
（２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
（３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
を含む、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
［１６］（１）抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
（２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
（３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
［１７］内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、上記［１５］又は［１６］記載の方法。
［１８］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、上記［１５］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］内皮細胞が角膜内皮細胞である、上記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］上記［１］～［８］のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。
［２１］加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病網膜症、病的近視による脈絡膜新生血管、角膜新生血管、角膜脂肪変性、網膜動静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、血管新生緑内障、結腸・直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、子宮頸がん、（血行性）転移性がん、腹膜播種、胸膜播種、癌性リンパ管症、及び肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも１種の治療用である、上記［２０］記載の医薬組成物。
　本発明によりＣＥＣＳｉ細胞に抗ＶＥＧＦ機能を持たせることができた。抗ＶＥＧＦ機能を有するＣＥＣＳｉ細胞により新生血管が関与する眼科疾患（加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病網膜症、病的近視による脈絡膜新生血管、角膜新生血管、角膜脂肪変性、網膜動静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、血管新生緑内障、等）あるいは、がん・悪性腫瘍（結腸・直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、子宮頸がん、（血行性）転移性がん、腹膜播種、胸膜播種、癌性リンパ管症、肝細胞がん、等）に対する抗新生血管療法などへの新規細胞治療の開発が可能となる。
可溶性ＶＥＧＦＲ－１（ｓＶＥＧＦＲ－１）遺伝子を導入したｉＰＳ細胞の培養上清中にＶＥＧＦＲ－１が分泌されていることをウエスタンブロッティング（上段）及びＥＬＩＳＡ（下段）で確認した結果を示す図である。 ｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）の構造を示す図である。セロタイプ１のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＡＧプロモーターの後ろにｓＶＥＧＦＲ－１配列を付与したベクター（ｐＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１）を示す。 セロタイプ２のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＥＦ１αプロモーターの後ろにｓＶＥＧＦＲ－１配列を付与したベクター（ｐＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）を示す。 セロタイプ１のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの後ろにＥＧＦＰ配列を付与したコントロールベクターを示す。 ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルス（ＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１）を感染させた。感染後３日目の細胞におけるｓＶＥＧＦＲ－１遺伝子発現をＲＴ－ＰＣＲで確認した結果を示す図である。コントロールとして、ウイルス非感染（Ｕｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の細胞、及びセロタイプ１のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの後ろにＥＧＦＰ配列を付与したベクター（図２のコントロールベクター）から作製されたウイルス（ＧＦＰ）を感染させた細胞を用いた。ｎ＝２。 ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１発現ＡＡＶベクター（ｐＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１、ｐＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）をトランスフェクションした３日目の培養上清中のｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。コントロールとしてはウイルス非感染の細胞（ｅｍｐｔｙ）を用いた。 ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルス（ＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１、ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）を感染させた後、ｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の培養上清中への分泌をウエスタンブロッティングで経時的に確認した結果を示す図である。コントロールとしては図２のコントロールベクターを感染させた細胞を用いた。 ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルス（ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）を感染させた後、ｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の培養上清中への分泌をウエスタンブロッティングで経時的に長期間に亘って確認した結果を示す図である。コントロールとして、図２のコントロールベクターと同様にして、セロタイプ２のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの後ろにＥＧＦＰ配列を付与したベクターから作製されたウイルス（ＧＦＰ）を感染させた細胞を用いた。 ｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルス（ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）を感染させたＣＥＣＳｉ細胞の、培養上清中へのｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌量をＥＬＩＳＡで評価した結果を示すグラフである。上段は、感染後６日目の結果を、下段は、感染後２１日目の結果をそれぞれ示す。コントロールとして、ウイルス非感染（ＮＯＮ）の細胞、及び図２のコントロールベクターと同様にして、セロタイプ２のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの後ろにＥＧＦＰ配列を付与したベクターから作製されたウイルス（ＡＡＶ２－ＧＦＰ）を感染させた細胞を用いた。ｎ＝２。 血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いたTube formation assayの方法の概略を示した図である。 ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１発現ウイルス（ＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１、ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）を感染させた後、感染細胞から培養上清（ＣＭ）中に分泌されたｓＶＥＧＦＲ－１が血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成を阻害することを示した図である。図中、ｓＶＥＧＦＲ１（ＡＡＶ１）はＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１と、ｓＶＥＧＦＲ１（ＡＡＶ２）はＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１と、それぞれ同義である。 ＨＵＶＥＣ細胞により形成された管腔の長さを計測した結果を示すグラフである。管構造の長さはImageJで計測した。管腔の長さの総長を示す。コントロールとして、ウイルス非感染（ＮＯＮ）の細胞、及びセロタイプ１のＡＡＶ発現ベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの後ろにＥＧＦＰ配列を付与したベクター（図２のコントロールベクター）から作製されたウイルス（ＧＦＰ）を感染させた細胞を用いた。図中、ＡＡＶ１はＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１と、ＡＡＶ２はＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１と、それぞれ同義である。ＣＭは培養上清を意味する。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
　本発明において「抗ＶＥＧＦ機能」とは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の作用を阻害する機能を意味する。ＶＥＧＦは、脈管形成や血管新生に関与する一群の糖タンパクで、主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）にリガンドとして結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きを有する。加えて、単球・マクロファージの活性化にも関与することが知られている。脈管形成や血管新生、リンパ管新生に関与する増殖因子にはＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子　placental growth factor）－１、ＰｌＧＦ－２の７つがあり、これらはまとめて「ＶＥＧＦファミリー」と呼ばれている。さらにいくつかのＶＥＧＦファミリーメンバーには、オルタナティブスプライシング（Alternative splicing）によりいくつかの亜型が存在する。例えばＶＥＧＦ－Ａは、ヒトでは通常アミノ酸数が１２１個（ＶＥＧＦ－Ａ１２１）、１６５個（ＶＥＧＦ－Ａ１６５）、１８９個（ＶＥＧＦ－Ａ１８９）、２０６個（ＶＥＧＦ－Ａ２０６）の４種類が存在する他、ＶＥＧＦ－Ａ１４５、ＶＥＧＦ－Ａ１８３といった稀な亜型も報告されている。ＶＥＧＦ－ＢにはＶＥＧＦ－Ｂ１６７、ＶＥＧＦ－Ｂ１８６が知られている。
　本明細書において、特に明記しない場合には、「ＶＥＧＦ」はこれら全てを包含する概念である。
　抗ＶＥＧＦ機能において、ＶＥＧＦの作用を阻害することにより期待される生物学的作用（例、血管新生の抑制、血管透過性亢進の抑制、炎症の抑制）が認められる限り、その阻害の程度は限定されず、抗ＶＥＧＦ機能の指標となる生物学的作用の種類によっても異なる。当該機能が発揮された場合と発揮されない場合との間に有意な差があればよい。
　抗ＶＥＧＦ機能の指標として好ましくは血管新生の抑制が挙げられる。「血管新生」という用語は、本明細書では、既存の血管から分枝伸長して新しい血管が形成される生理的プロセスと定義される。「脈管形成」という用語は、本明細書では、胚形成期に、血管がないところに新たに血管がつくられる生理的プロセスと定義される。血管新生により、創傷治癒、毛髪及び脂肪組織の成長、神経再生、並びに筋肉及び骨の修復が容易になるが、異常な血管の形成には、腫瘍の成長、及び転移、並びに血管腫などの有害作用がある。
　本発明において、抗ＶＥＧＦ機能は、好ましくは血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）や抗血管内皮増殖因子抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）又はその抗原結合断片に起因する機能である。すなわち、ＶＥＧＦＲや抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片によってＶＥＧＦの作用を阻害する機能をいう。
　ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２及びＶＥＧＦＲ－３の３種類に分類することができる。ＶＥＧＦＲ－１は、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）としても公知であり、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ及び胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）等のＶＥＧＦファミリーに特異的である。ＶＥＧＦＲ－２は、ＫＤＲ（kinase insert domain receptor）としても知られているが、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ等のＶＥＧＦファミリーに特異的である。ＶＥＧＦＲ－３は、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－４）としても公知であり、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ等のＶＥＧＦファミリーに特異的である。
　ＶＥＧＦＲの抗ＶＥＧＦ機能は、ＶＥＧＦＲ－１の場合、以下の作用機序に基づく。
　ＶＥＧＦＲ－１は、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）レベルでの選択的スプライシングを介して２つの形態：シグナル伝達可能な全長の膜結合受容体、及び、可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ　ＶＥＧＦＲ－１；ｓＶＥＧＦＲ－１）として発現する。ｓＶＥＧＦＲ－１は、全長受容体との二量体を形成し、及び／またはリガンドとの結合により、シグナル伝達を妨げることが可能である。遊離したＶＥＧＦＲは、循環血中のＶＥＧＦに優先的に結合し、細胞上のＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合を妨げ、それによりＶＥＧＦの機能を阻害することができる。
　ヒトＶＥＧＦＲ－１及び－２タンパク質の細胞外ドメインの一部がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した、組換えヒト可溶性ＶＥＧＦＲ融合タンパク質（Holashら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(17):11393-11398；ＷＯ００／７５３１９Ａ１号）がアフリベルセプト（商品名：アイリーア）として知られている。
　抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ＶＥＧＦの細胞受容体への結合を妨げること、ＶＥＧＦが細胞受容体に結合した後の血管内皮細胞の活性化を妨げること、又はＶＥＧＦによって活性化される細胞を死滅させることによって作用する。本明細書において「抗原結合断片」とは抗ＶＥＧＦ抗体の一部からなる抗体断片であって、かつＶＥＧＦとの結合能を有するものを意味する。ＶＥＧＦとの結合能を有する限り、抗原結合断片を構成するポリペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されるものではない。抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片としては、例えばラニビズマブ（商品名：ルセンティス）、ベバシズマブ（商品名：アバスチン）及びプロルシズマブ（商品名：ベオピュ）が挙げられる。
１．細胞
　本発明は、抗ＶＥＧＦ機能を有する細胞（以下、単に本発明の細胞とも称する）を提供する。ここで、細胞としては、多能性幹細胞や該多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞（以下、単に分化細胞とも称する）、特に角膜内皮代替細胞のような内皮細胞が挙げられる。
　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Embryonic stem cell）、ＥＧ細胞（Embryonic germ cell）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell：ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）、及び生殖細胞（例えば精巣）から作製されるＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。
　ＥＳ細胞は、内部細胞集団をフィーダー細胞上又はleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる。また、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。ＥＳ細胞の１つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞核を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、ＬＩＦ及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる（Cell, 70:841-847, 1992）。
　ｉＰＳ細胞とは、体細胞を公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。ｉＰＳ細胞としては、具体的には線維芽細胞、末梢血単核球等に分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4) pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5) pp.861-872; Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106）。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341, pp.651-654）。
　人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば末梢血単核球、Ｔ細胞等）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子（例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＭｙｃの４因子）の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。遺伝子を発現させるための手段としては、例えばウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。
　また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能である。具体的には、ｉＰＳ細胞としては、201B7、201B7-Ff、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2、836B3、FF-I14s03、FF-I01s04、MH09s01、Ff-XT18s02、Ff-WIs03、Ff-WJs513、Ff-CLs14、Ff-KVs09、QHJI14s03、QHJI01s04、RWMH09s01、DRXT18s02、RJWIs03、YZWJs513、ILCLs14、GLKVs09、 Ff-XT28s05-ABo_To,Ff-I01s04-ABII-KO,Ff-I14s04-ABII-KO（いずれもｉＰＳアカデミアジャパン社、又は京都大学ｉＰＳ研究財団）、Tic(JCRB1331株)、Dotcom（JCRB1327株)、Squeaky(JCRB1329株)、及びToe（JCRB1338株)、Lollipop（JCRB1336株)（以上成育医療センター、医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部・ＪＣＲＢ細胞バンク）、UTA-1株及びUTA-1-SF-2-2株（いずれも東京大学）、21526、21528、21530、21531、31536、31538株（いずれもフジフイルム・セルラー・ダイナミクス社）、ATCC-DYP0730、ATCC-DYP0250、ATCC-HYR0103、ATCC-DYR0100、ATCC-DYR0530、ATCC-DYS0530、ATCC-DYP0530、ATCC-DYS0100、ATCC-HYS0103、ATCC-CYS0105、KYOU-DXR0109B、ATCC-BYS0110、ATCC-BYS0111、ATCC-BYS0112、ATCC-BYS0113、ATCC-BXS0114、ATCC-BXS0115、ATCC-BXS0116、ATCC-BXS0117（いずれも非営利法人American Type Culture Collection）等を用いることができる。
　「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、ウサギ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。ウサギ目には、ウサギ等が含包される。「霊長類」とは、霊長目に属する哺乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目、及びサル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が含まれる。
　本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例えばマウス、ラット）又は霊長類（例えばヒト、サル）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒトの多能性幹細胞である。
　本発明において使用する分化細胞としては、上記多能性幹細胞から分化誘導したものが挙げられる。好ましくは、本発明者らによって開発された角膜内皮様の細胞、所謂角膜内皮代替細胞であり、特許文献１～３に記載の方法によって製造、調製することができる。好ましくは、角膜内皮細胞様の性状及び機能を有し、且つ、ＮＲ３Ｃ２（nuclear receptor subfamily 3, group C, member 2）の遺伝子発現量が増強されていることを特徴とする、ｉＰＳ細胞由来の角膜内皮代替細胞（Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells；ＣＥＣＳｉ細胞）である（特許文献３）。多能性幹細胞からＣＥＣＳｉ細胞への分化誘導用の培地には、ＩＧＦ１（２～５００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＴＡＴ３活性化物質であるＩＬ－６及びＬＩＦ（０．１～５０ｎｇ／ｍｌ）が含まれていることが好ましい。
　角膜内皮代替細胞を製造する方法の一例としては以下の方法が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞をｉＭａｔｒｉｘ－５１１（０．６μｇ／ｃｍ２）をコートした培養皿で、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素）を用いて1週間培養する。その後、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（０．３μｇ／ｃｍ２）をコートした培養皿に播種しなおして、下記の分化誘導培地（表１）を用いて、ｉＰＳ細胞から角膜内皮代替細胞への分化誘導培養を１４日間行う。凍結保存したｉＰＳ細胞を用いる場合には、ｉＰＳ細胞を解凍し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（０．６μｇ／ｃｍ２）をコートした培養皿で、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素）を用いて１８日間培養（途中２回継代して拡大培養）したのち、分化誘導を行う。
　角膜内皮代替細胞が有する角膜内皮細胞様の性状及び機能としては、具体的には以下の特徴（i）～（iv）が挙げられ、これらの特徴のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、いっそう好ましくは４つ全ての特徴を有する。
(i)細胞間接着がN-cadherinで構成されている。
(ii)細胞間にtight junctionが形成されている。
(iii)細胞膜上にNa,K-ATPase α1 subunitを発現する。
(iv)細胞核に転写因子PITX2の発現が観察される。
　細胞間接着がN-Cadherinで構成されているか否かは、N-Cadherinに対する免疫染色で確認することができる。
　細胞間にtight junctionが形成されているか否かは、tight junctionを構成するタンパク質であるZO-1の存在を、ZO-1に対する免疫染色で観察することにより確認することができる。また、電子顕微鏡により直接構造を観察することによって確認することもできる。
　細胞膜上にNa,K-ATPase α1 subunit（ATP1A1）を発現しているか否かは、ZO-1とNa,K-ATPase α1subunitに対する免疫染色により、両者が共染色されることで確認することができる。
　細胞核に転写因子PITX2が発現しているか否かは、PITX2に対する免疫染色で確認することができる。
　本発明の細胞は、上記多能性幹細胞やその分化細胞、特に内皮細胞に抗ＶＥＧＦ機能が付与されたものである。細胞に抗ＶＥＧＦ機能を付与する工程については後述の「２．細胞の製造方法」にて詳述されるが、具体的には、上記多能性幹細胞やその分化細胞、特に内皮細胞に、ＶＥＧＦＲをコードする核酸、又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を導入することで実施される。従って、本発明の細胞は、ＶＥＧＦＲ、又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片を発現する細胞である。
　本発明の細胞が発現するＶＥＧＦＲは、リガンドであるＶＥＧＦと結合し、その機能を阻害する限り特に限定されず、ＶＥＧＦＲ全長又はその一部と他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。例えば下記アミノ酸配列を有する融合タンパク質（融合タンパク質１）が挙げられる。
・融合タンパク質１
SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI PDGKRIIWDS
RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT IIDVVLSPSH GIELSVGEKL
VLNCTARTEL NVGIDFNWEY PSSKHQHKKL VNRDLKTQSG SEMKKFLSTL TIDGVTRSDQ
GLYTCAASSG LMTKKNSTFV RVHEKDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
YTQKSLSLSP GK（配列番号２）
　本発明の細胞が発現する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片は、ＶＥＧＦと結合し、その機能を阻害する限り特に限定されない。抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片の全長又はその一部と他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。例えば下記アミノ酸配列を有する融合タンパク質（融合タンパク質２～４）が挙げられる。
・融合タンパク質２
Ｌ鎖
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS 
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC（配列番号４）
Ｈ鎖
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY 
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT 
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 
QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL 
LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS 
REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK 
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK（配列番号６）
・融合タンパク質３
MEIVMTQSPS TLSASVGDRV IITCQASEII HSWLAWYQQK PGKAPKLLIY LASTLASGVP 
SRFSGSGSGA EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ NVYLASTNGA NFGQGTKLTV LGGGGGSGGG 
GSGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCTASGFS LTDYYYMTWV RQAPGKGLEW 
VGFIDPDDDP YYATWAKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTAVYYCAG GDHNSGWGLD 
IWGQGTLVTV SS（配列番号８）
・融合タンパク質４
Ｌ鎖 
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS 
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC（配列番号１０）
Ｈ鎖断片
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY 
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT 
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 
QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH L（配列番号１２）
２．細胞の製造方法
　本発明は、抗ＶＥＧＦ機能を有する細胞の製造方法（以下、単に本発明の細胞の製造方法とも称する）を提供する。
　本発明の細胞の製造方法は、細胞に抗ＶＥＧＦ機能を付与することを特徴とする。ここで、細胞としては、多能性幹細胞やその分化細胞、特に角膜内皮代替細胞のような内皮細胞が挙げられる。
　抗ＶＥＧＦ機能の細胞への付与は、どの段階で行われてもよい。例えば、多能性幹細胞に抗ＶＥＧＦ機能を付与しても、多能性幹細胞を分化誘導して得られた分化細胞、特に内皮細胞に抗ＶＥＧＦ機能を付与してもよい。内皮細胞としては、上記「１．細胞」の項で述べた本発明者らが開発した角膜内皮代替細胞等が挙げられる。
　具体的にはＶＥＧＦＲ又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を適当な発現ベクターに挿入する（必要に応じて２種類の発現ベクターを用いてもよい）。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより細胞を形質転換し、ＶＥＧＦＲ又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片を発現させる。
　本発明の細胞の製造方法の一実施態様として下記の方法が挙げられる。
（１）ＶＥＧＦＲをコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
（２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
（３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
を含む、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
　本発明の細胞の製造方法の別の一実施態様として下記の方法が挙げられる。
（１）抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
（２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
（３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
　用いることのできる発現ベクターとしては、挿入した遺伝子を安定に保持するものであれば種類に特に制限はなく、様々な種類のベクターが利用可能である。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が挙げられる。この中でもレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターでは、ベクターに組み込んだ目的遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。各ウイルスベクターは、常法に従い、または市販される専用のキットを用いて、作製することができる。非ウイルスベクターとしては、プラスミドベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、YACベクター、BACベクター、人工染色体ベクター等が挙げられる。
　細胞への発現ベクターの導入は、ウイルスベクターの場合、ウイルスの感染により細胞に導入される。プラスミドなどの非ウイルスベクターの場合、細胞への導入のため、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ヌクレオフェクション法等の常法を用いることができ、好ましくはリポフェクション法により導入される。
　抗ＶＥＧＦ機能の細胞への付与は、ゲノム編集によって行われてもよい。「ゲノム編集」とは、ヌクレアーゼを用いた部位特異的なゲノムＤＮＡ鎖の切断、又は塩基の化学的変換等の原理により標的遺伝子もしくはゲノム領域を意図的に改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等が挙げられる。ゲノム編集技術を用いることにより、特定の遺伝子を欠失したノックアウト細胞株、特定の遺伝子座に人工的に別の配列を挿入したノックイン細胞株等を作製することができる。本発明ではゲノム編集の技術を用いて、多能性幹細胞又はその分化細胞、特に内皮細胞にＶＥＧＦＲをコードする核酸又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を導入する。
　抗ＶＥＧＦ機能を細胞に付与する為に導入されるＶＥＧＦＲをコードする核酸又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸は、それぞれ細胞に所望するタンパク質（前者はＶＥＧＦＲ、後者は抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片）を発現させ得る限り特に限定されない。発現させるタンパク質が上述の融合タンパク質１～４である場合、導入される核酸の塩基配列の例としてとして以下のものが挙げられる。
・融合タンパク質１をコードする遺伝子
TCTGATACTGGTCGTCCATTCGTTGAAATGTATTCTGAAATTCCAGAAATTATTCACATG
ACTGAAGGTCGTGAATTAGTTATTCCATGTCGTGTTACTTCTCCAAACATTACTGTTACT
TTAAAAAAATTCCCATTAGATACTTTAATTCCAGATGGTAAACGTATTATTTGGGATTCT
CGTAAAGGTTTCATTATTTCTAACGCTACTTATAAAGAAATTGGTTTATTAACTTGTGAA
GCTACTGTTAACGGTCACTTATATAAAACTAACTATTTAACTCACCGTCAAACTAACACT
ATTATTGATGTTGTTTTATCTCCATCTCACGGTATTGAATTATCTGTTGGTGAAAAATTA
GTTTTAAACTGTACTGCTCGTACTGAATTAAACGTTGGTATTGATTTCAACTGGGAATAT
CCATCTTCTAAACACCAACACAAAAAATTAGTTAACCGTGATTTAAAAACTCAATCTGGT
TCTGAAATGAAAAAATTCTTATCTACTTTAACTATTGATGGTGTTACTCGTTCTGATCAA
GGTTTATATACTTGTGCTGCTTCTTCTGGTTTAATGACTAAAAAAAACTCTACTTTCGTT
CGTGTTCACGAAAAAGATAAAACTCACACTTGTCCACCATGTCCAGCTCCAGAATTATTA
GGTGGTCCATCTGTTTTCTTATTCCCACCAAAACCAAAAGATACTTTAATGATTTCTCGT
ACTCCAGAAGTTACTTGTGTTGTTGTTGATGTTTCTCACGAAGATCCAGAAGTTAAATTC
AACTGGTATGTTGATGGTGTTGAAGTTCACAACGCTAAAACTAAACCACGTGAAGAACAA
TATAACTCTACTTATCGTGTTGTTTCTGTTTTAACTGTTTTACACCAAGATTGGTTAAAC
GGTAAAGAATATAAATGTAAAGTTTCTAACAAAGCTTTACCAGCTCCAATTGAAAAAACT
ATTTCTAAAGCTAAAGGTCAACCACGTGAACCACAAGTTTATACTTTACCACCATCTCGT
GATGAATTAACTAAAAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTTAAAGGTTTCTATCCATCT
GATATTGCTGTTGAATGGGAATCTAACGGTCAACCAGAAAACAACTATAAAACTACTCCA
CCAGTTTTAGATTCTGATGGTTCTTTCTTCTTATATTCTAAATTAACTGTTGATAAATCT
CGTTGGCAACAAGGTAACGTTTTCTCTTGTTCTGTTATGCACGAAGCTTTACACAACCAC
TATACTCAAAAATCTTTATCTTTATCTCCAGGTAAA（配列番号１）
・融合タンパク質２をコードする遺伝子
Ｌ鎖
GATATTCAAATGACTCAATCTCCATCTTCTTTATCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACT
ATTACTTGTTCTGCTTCTCAAGATATTTCTAACTATTTAAACTGGTATCAACAAAAACCA
GGTAAAGCTCCAAAAGTTTTAATTTATTTCACTTCTTCTTTACACTCTGGTGTTCCATCT
CGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGATTTCACTTTAACTATTTCTTCTTTACAACCA
GAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAACAATATTCTACTGTTCCATGGACTTTCGGTCAA
GGTACTAAAGTTGAAATTAAACGTACTGTTGCTGCTCCATCTGTTTTCATTTTCCCACCA
TCTGATGAACAATTAAAATCTGGTACTGCTTCTGTTGTTTGTTTATTAAACAACTTCTAT
CCACGTGAAGCTAAAGTTCAATGGAAAGTTGATAACGCTTTACAATCTGGTAACTCTCAA
GAATCTGTTACTGAACAAGATTCTAAAGATTCTACTTATTCTTTATCTTCTACTTTAACT
TTATCTAAAGCTGATTATGAAAAACACAAAGTTTATGCTTGTGAAGTTACTCACCAAGGT
TTATCTTCTCCAGTTACTAAATCTTTCAACCGTGGTGAATGT（配列番号３）
Ｈ鎖
GAAGTTCAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGTTTAGTTCAACCAGGTGGTTCTTTACGTTTA
TCTTGTGCTGCTTCTGGTTATACTTTCACTAACTATGGTATGAACTGGGTTCGTCAAGCT
CCAGGTAAAGGTTTAGAATGGGTTGGTTGGATTAACACTTATACTGGTGAACCAACTTAT
GCTGCTGATTTCAAACGTCGTTTCACTTTCTCTTTAGATACTTCTAAATCTACTGCTTAT
TTACAAATGAACTCTTTACGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTAAATATCCA
CACTATTATGGTTCTTCTCACTGGTATTTCGATGTTTGGGGTCAAGGTACTTTAGTTACT
GTTTCTTCTGCTTCTACTAAAGGTCCATCTGTTTTCCCATTAGCTCCATCTTCTAAATCT
ACTTCTGGTGGTACTGCTGCTTTAGGTTGTTTAGTTAAAGATTATTTCCCAGAACCAGTT
ACTGTTTCTTGGAACTCTGGTGCTTTAACTTCTGGTGTTCACACTTTCCCAGCTGTTTTA
CAATCTTCTGGTTTATATTCTTTATCTTCTGTTGTTACTGTTCCATCTTCTTCTTTAGGT
ACTCAAACTTATATTTGTAACGTTAACCACAAACCATCTAACACTAAAGTTGATAAAAAA
GTTGAACCAAAATCTTGTGATAAAACTCACACTTGTCCACCATGTCCAGCTCCAGAATTA
TTAGGTGGTCCATCTGTTTTCTTATTCCCACCAAAACCAAAAGATACTTTAATGATTTCT
CGTACTCCAGAAGTTACTTGTGTTGTTGTTGATGTTTCTCACGAAGATCCAGAAGTTAAA
TTCAACTGGTATGTTGATGGTGTTGAAGTTCACAACGCTAAAACTAAACCACGTGAAGAA
CAATATAACTCTACTTATCGTGTTGTTTCTGTTTTAACTGTTTTACACCAAGATTGGTTA
AACGGTAAAGAATATAAATGTAAAGTTTCTAACAAAGCTTTACCAGCTCCAATTGAAAAA
ACTATTTCTAAAGCTAAAGGTCAACCACGTGAACCACAAGTTTATACTTTACCACCATCT
CGTGAAGAAATGACTAAAAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTTAAAGGTTTCTATCCA
TCTGATATTGCTGTTGAATGGGAATCTAACGGTCAACCAGAAAACAACTATAAAACTACT
CCACCAGTTTTAGATTCTGATGGTTCTTTCTTCTTATATTCTAAATTAACTGTTGATAAA
TCTCGTTGGCAACAAGGTAACGTTTTCTCTTGTTCTGTTATGCACGAAGCTTTACACAAC
CACTATACTCAAAAATCTTTATCTTTATCTCCAGGTAAA（配列番号５）
・融合タンパク質３をコードする遺伝子
ATGGAAATTGTTATGACTCAATCTCCATCTACTTTATCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTT
ATTATTACTTGTCAAGCTTCTGAAATTATTCACTCTTGGTTAGCTTGGTATCAACAAAAA
CCAGGTAAAGCTCCAAAATTATTAATTTATTTAGCTTCTACTTTAGCTTCTGGTGTTCCA
TCTCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTGCTGAATTCACTTTAACTATTTCTTCTTTACAA
CCAGATGATTTCGCTACTTATTATTGTCAAAACGTTTATTTAGCTTCTACTAACGGTGCT
AACTTCGGTCAAGGTACTAAATTAACTGTTTTAGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT
GGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGAAGTTCAATTAGTTGAATCTGGT
GGTGGTTTAGTTCAACCAGGTGGTTCTTTACGTTTATCTTGTACTGCTTCTGGTTTCTCT
TTAACTGATTATTATTATATGACTTGGGTTCGTCAAGCTCCAGGTAAAGGTTTAGAATGG
GTTGGTTTCATTGATCCAGATGATGATCCATATTATGCTACTTGGGCTAAAGGTCGTTTC
ACTATTTCTCGTGATAACTCTAAAAACACTTTATATTTACAAATGAACTCTTTACGTGCT
GAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTGGTGGTGATCACAACTCTGGTTGGGGTTTAGAT
ATTTGGGGTCAAGGTACTTTAGTTACTGTTTCTTCT（配列番号７）
・融合タンパク質４をコードする遺伝子
Ｌ鎖
GATATTCAATTAACTCAATCTCCATCTTCTTTATCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACT
ATTACTTGTTCTGCTTCTCAAGATATTTCTAACTATTTAAACTGGTATCAACAAAAACCA
GGTAAAGCTCCAAAAGTTTTAATTTATTTCACTTCTTCTTTACACTCTGGTGTTCCATCT
CGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGATTTCACTTTAACTATTTCTTCTTTACAACCA
GAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAACAATATTCTACTGTTCCATGGACTTTCGGTCAA
GGTACTAAAGTTGAAATTAAACGTACTGTTGCTGCTCCATCTGTTTTCATTTTCCCACCA
TCTGATGAACAATTAAAATCTGGTACTGCTTCTGTTGTTTGTTTATTAAACAACTTCTAT
CCACGTGAAGCTAAAGTTCAATGGAAAGTTGATAACGCTTTACAATCTGGTAACTCTCAA
GAATCTGTTACTGAACAAGATTCTAAAGATTCTACTTATTCTTTATCTTCTACTTTAACT
TTATCTAAAGCTGATTATGAAAAACACAAAGTTTATGCTTGTGAAGTTACTCACCAAGGT
TTATCTTCTCCAGTTACTAAATCTTTCAACCGTGGTGAATGT（配列番号９）
Ｈ鎖断片
GAAGTTCAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGTTTAGTTCAACCAGGTGGTTCTTTACGTTTA
TCTTGTGCTGCTTCTGGTTATGATTTCACTCACTATGGTATGAACTGGGTTCGTCAAGCT
CCAGGTAAAGGTTTAGAATGGGTTGGTTGGATTAACACTTATACTGGTGAACCAACTTAT
GCTGCTGATTTCAAACGTCGTTTCACTTTCTCTTTAGATACTTCTAAATCTACTGCTTAT
TTACAAATGAACTCTTTACGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTAAATATCCA
TATTATTATGGTACTTCTCACTGGTATTTCGATGTTTGGGGTCAAGGTACTTTAGTTACT
GTTTCTTCTGCTTCTACTAAAGGTCCATCTGTTTTCCCATTAGCTCCATCTTCTAAATCT
ACTTCTGGTGGTACTGCTGCTTTAGGTTGTTTAGTTAAAGATTATTTCCCAGAACCAGTT
ACTGTTTCTTGGAACTCTGGTGCTTTAACTTCTGGTGTTCACACTTTCCCAGCTGTTTTA
CAATCTTCTGGTTTATATTCTTTATCTTCTGTTGTTACTGTTCCATCTTCTTCTTTAGGT
ACTCAAACTTATATTTGTAACGTTAACCACAAACCATCTAACACTAAAGTTGATAAAAAA
GTTGAACCAAAATCTTGTGATAAAACTCACTTA（配列番号１１）
　抗ＶＥＧＦ機能の細胞への付与工程で用いる細胞が多能性幹細胞の場合は、その後の拡大培養における細胞培養は、多能性幹細胞培養用の培地中で実施することが好ましい。多能性幹細胞用の培地としては公知のものを用いることができ、多能性幹細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されないが、例えばDMEM、DMEMHG、EMEM、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、GMEM（Glasgow's MEM）、RPMI-1640、α-MEM、Ham's Medium F-12、Ham's Medium F-10、Ham's Medium F12K、Medium 199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy's 5A、Leibovitz's L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth's MB752/1、CMRL-1066、Williams' medium E、Brinster's BMOC-3 Medium、E8 medium（Nature Methods, 2011, 8, 424-429）、ReproFF2培地（リプロセル社）、StemFit（登録商標）ＡＫ培地（味の素）及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　かくして得られた抗ＶＥＧＦ機能を有する多能性幹細胞を分化誘導し、所望の分化細胞を得ることができる。分化誘導は目的とする分化細胞の種類に応じて適宜決定され、既知の材料／方法によって実施される。例えば抗ＶＥＧＦ機能を有する多能性幹細胞を特許文献１～３の記載に従って分化誘導することで、角膜内皮様の細胞である、角膜内皮代替細胞を得ることができる。得られた角膜内皮代替細胞は、抗ＶＥＧＦ機能を有する。
　抗ＶＥＧＦ機能の細胞への付与工程で用いる細胞が多能性幹細胞から分化誘導した分化細胞、好ましくは内皮細胞、特に角膜内皮代替細胞である場合には、その後の拡大培養における細胞培養は、分化細胞、好ましくは内皮細胞、特に角膜内皮代替細胞培養用の培地中で実施することが好ましい。このような培地としては、公知のものを用いることができ、分化細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されないが、例えばDMEM、DMEMHG、EMEM、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、GMEM（Glasgow's MEM）、RPMI-1640、α-MEM、Ham's Medium F-12、Ham's Medium F-10、Ham's Medium F12K、Medium 199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy's 5A、Leibovitz's L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth's MB752/1、CMRL-1066、Williams' medium E、Brinster's BMOC-3 Medium及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　なお、多能性幹細胞から分化細胞への分化誘導自体は公知の方法で実施することができる。例えば多能性幹細胞から角膜内皮代替細胞への分化誘導は特許文献１～３の記載に従って実施することができる。
３．医薬組成物
　本発明は、抗ＶＥＧＦ機能を有する細胞を有効成分として含む医薬組成物（以下、単に本発明の医薬組成物とも称する）を提供する。本発明の医薬組成物に有効成分として含められる抗ＶＥＧＦ機能を有する細胞は、上記「１．細胞」の項に記載した細胞であり、上記「２．細胞の製造方法」の項に記載した方法により製造された細胞である。
　本発明の医薬組成物は、通常、有効成分である本発明の細胞と医薬上許容され得る担体とを混合して製することができる。「医薬上許容され得る担体」という用語は、本明細書で使用される場合、使用される投与量及び濃度でそれにさらされる細胞に対して非毒性である希釈剤、アジュバント、賦形剤、安定剤、ビヒクル又は支持体を包含する。多くの場合、担体は、水性ｐＨ緩衝溶液、抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、親水性ポリマー、アミノ酸、単糖、二糖、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、ナトリウムなどの塩形成性対イオン；並びにツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（登録商標）などの非イオン性界面活性物質であり、特に、静脈内に投与される組成物に関しては、好ましい担体は生理食塩水溶液である。
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明の細胞を含有し、該本発明の細胞は、治療有効量のＶＥＧＦＲ又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片を分泌し得る。治療有効量とは、本発明の医薬組成物を被験体に投与した場合に、該医薬組成物を投与していない被験体と比較して前記のような疾患に対して治療効果を得ることができる量である。具体的な治療有効量としては、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜決定される。
　本発明の一実施態様において、抗ＶＥＧＦ機能を有する細胞を使用してヒト体内での血管新生あるいはリンパ管等の脈管新生を阻害することが可能になる。血管新生の阻害は、黄斑変性症、リンパ脈管新生及び子宮内膜症などの、血管の異常な形成によって直接引き起こされる疾患又は障害に罹患している患者において好ましい。また、進行のために血液供給、脈管新生あるいは血流やリンパ流を必要とする他の疾患及び障害、すなわち癌、転移及び播種も、血管新生を阻害することによって治療することができる。本発明の医薬組成物が適用可能な疾患としては、血管新生やリンパ管新生の阻害がその予防や治療に有用であることが知られている各種疾患であり、具体的には加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病網膜症、病的近視による脈絡膜新生血管、角膜新生血管、角膜脂肪変性、網膜動静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、血管新生緑内障、等）あるいは、がん・悪性腫瘍（結腸・直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、子宮頸がん、（血行性）転移性がん、腹膜播種、胸膜播種、癌性リンパ管症、肝細胞がん、等）が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。本明細書中で用いた略語は特に断りの無い限り、当分野で通常用いられるものと同様である。
実施例１：ｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質を分泌する角膜内皮代替細胞（ＣＥＣＳｉ細胞）の製造
　ｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素）中、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（０．６μｇ／ｃｍ２）をコートした培養皿に播種して１日培養後、可溶性ＶＥＧＦＲ－１（ｓＶＥＧＦＲ－１）遺伝子を導入したプラスミドベクターをリポフェクション法によりｉＰＳ細胞に導入した。プラスミドベクターは、Mighty TA-cloning kit (TaKaRa #6028)でクローニングしたｓＶＥＧＦＲ－１遺伝子（GeneBank Accession No. NM_001159920.2；配列番号１３）を、発現ベクター(富士フイルム和光純薬 #163-25601 pCAG-Neo vector) に入れて製造した。
　遺伝子を導入したｉＰＳ細胞を薬剤耐性により、ｓＶＥＧＦＲ－１遺伝子が導入されている細胞の選択を行った。そしてこのｓＶＥＧＦＲ－１導入ｉＰＳ細胞の培養上清中にｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質が分泌されていることをウエスタンンブロッティング及びＥＬＩＳＡで確認した（図１）。ウエスタンブロッティングはタンパク質２０μｇ分の培養上清をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Abcam社 Anti-VEGF Receptor 1抗体［Ｙ１０３］＃ａｂ３２１５２により検出した。ＥＬＩＳＡは、Enzo (#ALX-850-264) Human sVEGFR-1 Platinum ELISA kitを用いた。プロトコールに従って、抗ヒトｓＶＥＧＦＲ－１抗体を固相化したマイクロプレートに培養上清を入れ、続いてビオチン結合抗ヒトｓＶＥＧＦＲ－１抗体を添加し反応させた後、Streptavidin-HRPにより検出を行った。
　この遺伝子導入したｉＰＳ細胞クローンを上述の培地で引き続き拡大培養し（培養期間１週間）、さらにｉＭａｔｒｉｘ－５１１（０．３μｇ／ｃｍ２）をコートした培養皿に播種しなおして、分化誘導培地（上記、表１参照）中、ｉＰＳ細胞から角膜内皮代替細胞（ＣＥＣＳｉ細胞）への分化誘導を開始した（Ｄａｙ０）。
ｓＶＥＧＦＲ１の遺伝子配列
atggt cagctactgg gacaccgggg tcctgctgtg cgcgctgctc agctgtctgc 
ttctcacagg atctagttca ggttcaaaat taaaagatcc tgaactgagt ttaaaaggca 
cccagcacat catgcaagca ggccagacac tgcatctcca atgcaggggg gaagcagccc 
ataaatggtc tttgcctgaa atggtgagta aggaaagcga aaggctgagc ataactaaat 
ctgcctgtgg aagaaatggc aaacaattct gcagtacttt aaccttgaac acagctcaag 
caaaccacac tggcttctac agctgcaaat atctagctgt acctacttca aagaagaagg 
aaacagaatc tgcaatctat atatttatta gtgatacagg tagacctttc gtagagatgt 
acagtgaaat ccccgaaatt atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc 
gggttacgtc acctaacatc actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc 
ctgatggaaa acgcataatc tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt 
acaaagaaat agggcttctg acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa 
actatctcac acatcgacaa accaatacaa tcatagatgt ccaaataagc acaccacgcc 
cagtcaaatt acttagaggc catactcttg tcctcaattg tactgctacc actcccttga 
acacgagagt tcaaatgacc tggagttacc ctgatgaaaa aaataagaga gcttccgtaa 
ggcgacgaat tgaccaaagc aattcccatg ccaacatatt ctacagtgtt cttactattg 
acaaaatgca gaacaaagac aaaggacttt atacttgtcg tgtaaggagt ggaccatcat 
tcaaatctgt taacacctca gtgcatatat atgataaagc attcatcact gtgaaacatc 
gaaaacagca ggtgcttgaa accgtagctg gcaagcggtc ttaccggctc tctatgaaag 
tgaaggcatt tccctcgccg gaagttgtat ggttaaaaga tgggttacct gcgactgaga 
aatctgctcg ctatttgact cgtggctact cgttaattat caaggacgta actgaagagg 
atgcagggaa ttatacaatc ttgctgagca taaaacagtc aaatgtgttt aaaaacctca 
ctgccactct aattgtcaat gtgaaacccc agatttacga aaaggccgtg tcatcgtttc 
cagacccggc tctctaccca ctgggcagca gacaaatcct gacttgtacc gcatatggta 
tccctcaacc tacaatcaag tggttctggc acccctgtaa ccataatcat tccgaagcaa 
ggtgtgactt ttgttccaat aatgaagagt cctttatcct ggatgctgac agcaacatgg 
gaaacagaat tgagagcatc actcagcgca tggcaataat agaaggaaag aataagatgg 
ctagcacctt ggttgtggct gactctagaa tttctggaat ctacatttgc atagcttcca 
ataaagttgg gactgtggga agaaacataa gcttttatat cacagatgtg ccaaatgggt 
ttcatgttaa cttggaaaaa atgccgacgg aaggagagga cctgaaactg tcttgcacag 
ttaacaagtt cttatacaga gacgttactt ggattttact gcggacagtt aataacagaa 
caatgcacta cagtattagc aagcaaaaaa tggccatcac taaggagcac tccatcactc 
ttaatcttac catcatgaat gtttccctgc aagattcagg cacctatgcc tgcagagcca 
ggaatgtata cacaggggaa gaaatcctcc agaagaaaga aattacaatc agaggtgagc 
actgcaacaa aaaggctgtt ttctctcgga tctccaaatt taaaagcaca aggaatgatt 
gtaccacac（配列番号１３）
　分化誘導後（Ｄａｙ６）のｓＶＥＧＦＲ－１導入角膜内皮代替細胞の培養上清からｓＶＥＧＦＲ－１が分泌していることをＥＬＩＳＡにて確認した（０．１９～０．２９ｎｇ／ｍＬ）。さらに、分化誘導後（Ｄａｙ１０）の細胞における未分化マーカーＯＣＴ４の発現量は、原料であるｉＰＳ細胞におけるＯＣＴ４発現量の３％以下となっており、内皮細胞への分化が確認された。
　以上の結果より、ｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質を分泌する角膜内皮代替細胞が製造されたことが確認できた。
実施例２：ＣＥＣＳｉ細胞におけるｓＶＥＧＦＲ－１遺伝子の発現
　２種類のウイルスベクターからウイルスを作製した。セロタイプ１（ＡＡＶ１）のベクターは、ｐＡＡＶの発現ベクターにＣＡＧプロモーターの後ろにＶＥＧＦＲ－１の細胞外ドメインの一部の配列を付加した構造（図２Ａ、ｐＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１）で、セロタイプ２（ＡＡＶ２）のベクターは、ｐＡＡＶの発現ベクターに、ＥＦ１αプロモーターの後ろにＶＥＧＦＲ－１の細胞外ドメインの一部の配列を付加した構造（図２Ｂ、ｐＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１）である。これらのベクターを用いてベクタービルダー社にてウイルスを作製した。本明細書中、セロタイプ１のベクターから作製したウイルスをＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１、セロタイプ２のベクターから作製したウイルスをＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１とも称する。
　ＡＴＣＣより購入したｉＰＳ細胞（ATCC-BYS0112 Human [Non-Hispanic Caucasian Male] Induced Pluripotent Stem (IPS) Cells (ATCC ACS-1026)）から分化誘導したＣＥＣＳｉ細胞（以下、ＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞とも称する）を一度凍結保存した後、２４ウェルに１．２×１０５個で播種し、ＡＡＶ１ｓＶＥＧＦＲ１又はＡＡＶ２ｓＶＥＧＦＲ１で感染を行った（ＭＯＩ：２０００００、６６０００、２２０００）。２４時間後にウイルスを除去し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，ＩＴＳ，ＩＧＦ－１（５０μｌ））に培地交換した。感染後３日目（培地交換後２日目）のＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞におけるｓＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を確認した。
　ＣＥＣＳｉ細胞への分化誘導は常法、例えば特許文献３に記載の方法、又はそれに準じた方法により実施した。
　感染後のＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞からQiagen RNeasy mini（#74004）を用いてｍＲＮＡを抽出し、０．３μｇのｍＲＮＡをRevaTraAce逆転写酵素（Takara）で逆転写しｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲシステム、StepOne（Applied Biosystems）にてｑＰＣＲを行い、ｄｄＣＴ法で解析したところ、感染３日目でもＭＯＩ依存的にｓＶＥＧＦＲ１遺伝子発現が確認できた。結果を図３に示す。
使用したｓＶＲＧＦＲ－１プライマーは以下の通り。
Forward primer：GCAACGTGCTGGTTATTGTG（配列番号１４）
Reverse primer：GTGCTGGGTGCCTTTTAAACTC（配列番号１５）
使用したGAPDHプライマーは以下の通り
Forward primer：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配列番号１６）
Reverse primer：GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号１７）
実施例３：ＣＥＣＳｉ細胞培養上清中へのｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌
　実施例２で構築したｐＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１及びｐＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１をそれぞれ１μｇ用いて２４ウェルプレートに準備したＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００を用いてトランスフェクションし、時間経過に伴う培養上清中のｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌をウエスタンブロッティングにて確認した。
　培養上清１５μｌまたは２０μｌに、６倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファー（ナカライ）に還元剤（ｂ－ｍｅ）を加えたものを使用し、１倍のサンプルバッファーになるよう加え、サンプル調製を行った。ＡＴＴＯパジェランＡｃｅ　にｅ－ＰＡＧＥＬ　ミニサイズ既製ゲル（５～２０％）を準備し、サンプルを全量アプライし、２１ｍＡ条件で６０分電気泳動した。泳動終了後、ＡＴＴＯパワードブロット２Ｍ（ＷＳＥ－４１２５）を用い、２５ｍＶ、２０分間の条件でタンパク質をメンブレンに転写した。転写後のメンブレンはブロッキングワン（ナカライ）で室温、３０分以上ブロッキング処理を施した後、１次抗体ｓＶＥＧＦＲ１（Ａｂｃａｍ＃Ａｂ３２１５２）を１０００倍に希釈し、４℃で一晩反応させた。１×ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎバッファーでメンブレンを洗浄後、２０００倍に希釈した２次抗体ラビットＩｇＧ（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　＃７０７４）とメンブレンを１時間から２時間反応させた。反応終了後、１×ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎバッファーでメンブレンを洗浄し、ＥＬＣ反応を行った。ＥＬＣ発光はＣｈｅｍｉＬｕｍｉ　ｕｌｔｒａ（ナカライテスク）を用い、化学発光の検出はｉＢｒｉｇｈｔ　ＦＬ１０００　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓを使用した。
　トランスフェクション後３日目の結果を図４に示す。ＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞にｓＶＥＧＦＲ－１を遺伝子導入し、３日後に培養上清中でｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の発現を確認できた。
実施例４：ＣＥＣＳｉ細胞培養上清中へのｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌
　実施例２と同様にし、ベクタービルダー社にてベクターを構築し、ウイルスを購入した。ウイルスは感染効率２×１０００００００００００を保証する製品。
　凍結保存解凍後、あるいは１継代したＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞を２４ウェルに１．２×１０５個で播種し、ＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルス又はＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルスにより約ＭＯＩ：２５００００で感染を行った。翌日にウイルスを除去し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＴＳ、ＩＧＦ－１）に交換した後、２日ごとに３００μｌずつ培地交換を実施した。交換時の培養上清を回収し、１２０００ｒｐｍで２０分遠心したものをサンプルとして使用し、感染後２日目、８日目、及び１２日目の上清についてウエスタンブロッティングを行った。結果を図５に示す。２日目からわずかな分泌を確認し、８日目、１２日目と増加の傾向が確認された。
実施例５：ＣＥＣＳｉ細胞培養上清中へのｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌（長期間の分泌）
　実施例２と同様にし、ベクタービルダー社にてベクターを構築し、ウイルスを購入した。ウイルスは感染効率２×１０００００００００００を保証する製品。
　１継代したＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞を２４ウェルに１．５×１０５個で播種し、ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルスにより約ＭＯＩ：３０００００から１／３ずつ濃度を振って３点で（３０００００、１０００００、３００００）感染を行った。翌日にウイルスを除去し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＴＳ、ＩＧＦ－１）に交換した後、２日ごとに３００μｌずつ培地交換を実施した。交換時の培養上清を回収し、１２０００ｒｐｍで２０分遠心したものをサンプルとして使用し、感染後６日目、１１日目、１６日目、及び２１日目の上清についてウエスタンブロッティングを行ったところ、２１日目でもバンドがあり分泌が確認された。結果を図６に示す。
実施例６：培養上清中のｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の分泌量のＥＬＩＳＡによる測定
　ウエスタンブロッティングで分泌が確認されたサンプルを用いて、培養上清中の分泌量を測定した。具体的には以下の通り。
　実施例２と同様にし、ベクタービルダー社にてベクターを構築し、ウイルスを購入した。ウイルスは感染効率２×１０００００００００００を保証する製品。
　１継代したＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞を２４ウェルに１．５×１０５個で播種し、ＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルスにより約ＭＯＩ：２０００００から１／３ずつ濃度を振って３点（２０００００、６６０００、２２０００）で感染を行った。翌日にウイルスを除去し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＴＳ、ＩＧＦ－１）に交換した後、２日ごとに３００μｌずつ培地交換を実施した。交換時の培養上清を回収し、１２０００ｒｐｍで２０分遠心したものをサンプルとして使用し、感染後６日目及び２１日目のサンプルについて、ｓＶＥＧＦＲ－１（human）ＥＬＩＳＡキット(Enzo ALX-850-264-KI01)を用いてＥＬＩＳＡを実施した。結果を図７に示す。
　６日目（図７，上）ではすべてのＭＯＩの条件でウエスタンブロッティングと同様に分泌が確認され、約２０ｎｇ／ｍｌから７０ｎｇ／ｍｌのｓＶＥＧＦＲ－１の分泌量であった。また、感染後２１日目（図７、下）の培養上清中でも、ＭＯＩ２２０００と低い条件でも８ｎｇ／ｍｌ以上のｓＶＥＧＦＲ－１の分泌が確認された。
実施例７：分泌されたｓＶＥＧＦＲ－１タンパク質の機能評価
　トランスフェクション、並びにウイルス感染したＡＴＣＣ－ＣＥＣＳｉ細胞から分泌されるｓＶＥＧＦＲ－１の機能を解析する手法として、血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いた管腔形成アッセイ（Tube formation assay）を実施した。該アッセイの方法は以下の通り。概略を図８に示す。
（方法）
（１）Cultrex In vitro Angiogenesis Assay kit (R&D: 3470-096-K)に付属のＥＢＭ基材を９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて固めている間に細胞を調製する。
（２）ＨＵＶＥＣ細胞は２×１０４個ずつエッペンドルフチューブに入れ、１２００ｒｐｍ、５分間、遠心分離してペレットダウンしたのち上清を除去する。実験に用いる培養上清１００μｌで細胞を懸濁し、固まったＥＢＭ基材の上にゆっくり充填する。管腔形成を誘導する為にＶＥＧＦ－Ａ（R&D VEGF165, Human, recombinant, 293-VE-010、１５ｎｇ／ｍｌ）を培養上清に加えた。
（３）３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて静置し、２２時間後の管腔形成を観察する。
（結果）
　実施例４と同様にしてＡＡＶ１－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルス又はＡＡＶ２－ｓＶＥＧＦＲ１ウイルスにより感染を行い、感染後２日目、８日目、及び１０日目の上清（ＣＭ）について管腔形成アッセイを実施した。２２時間後の管腔形成の観察結果を図９に示す。実験開始後２２時間の状態をＫＥＹＥＮＣＥ（ＢＸ－８１０）で観察し写真を取得した。感染後２日目のｓＶＥＧＦＲ－１の分泌が弱い条件の培養上清では管腔形成の抑制はあまり観察されないが、分泌の多い８日目や１０日目では管腔形成の抑制が観察された。
　また、２２時間で撮影した写真中で確認された管腔の長さの合計を計測し、定量化を行った。結果を表２及び図１０に示す。１０日目の培養上清ではコントロール群に比べて顕著な減少が確認された。８日目以降、１０日目では顕著に、培養上清群で管腔形成の抑制が確認された。
　本発明によれば、角膜内皮代替細胞に抗ＶＥＧＦ機能を持たせることができた。抗ＶＥＧＦ機能を有する角膜内皮代替細胞により新生血管が関与する眼科疾患（加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、新生血管緑内障、等）あるいは、悪性腫瘍に対する抗新生血管療法などへの新規細胞治療の開発が可能となる。
　本出願は、米国で出願された米国仮出願（Ｎｏ．６３／３３０，６２５、出願日：２０２２年４月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (21)

  1. 　抗ＶＥＧＦ機能を有する、多能性幹細胞又は内皮細胞。
  2. 　内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項１に記載の細胞。
  3. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の細胞。
  4. 　内皮細胞が角膜内皮細胞である、請求項１に記載の細胞。
  5. 　抗ＶＥＧＦ機能がＶＥＧＦＲに起因する、請求項１に記載の細胞。
  6. 　抗ＶＥＧＦ機能が抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片に起因する、請求項１に記載の細胞。
  7. 　ＶＥＧＦＲを発現する請求項１に記載の細胞。
  8. 　抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する請求項１に記載の細胞。
  9. 　ＶＥＧＦＲをコードする核酸を細胞に導入する工程を含む、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
  10. 　抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を細胞に導入する工程を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
  11. 　核酸の細胞への導入が遺伝子導入又はゲノム編集によるものである、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項９又は１０に記載の方法。
  13. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項９又は１０に記載の方法。
  14. 　内皮細胞が角膜内皮細胞である、請求項９又は１０に記載の方法。
  15. （１）ＶＥＧＦＲをコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
    （２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
    （３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
    を含む、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
  16. （１）抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該核酸を含む発現ベクターを作製する工程、
    （２）前記核酸を含む発現ベクターを用いて細胞に該核酸を導入し、発現ベクターを含む細胞を作製する工程、及び
    （３）前記発現ベクターを含む細胞を培養する工程、
    を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞の製造方法であって、該細胞が多能性幹細胞又は内皮細胞である、方法。
  17. 　内皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
  19. 　内皮細胞が角膜内皮細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
  20. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
  21. 　加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病網膜症、病的近視による脈絡膜新生血管、角膜新生血管、角膜脂肪変性、網膜動静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、血管新生緑内障、結腸・直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、子宮頸がん、（血行性）転移性がん、腹膜播種、胸膜播種、癌性リンパ管症、及び肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも１種の治療用である、請求項２０に記載の医薬組成物。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010518871A (ja) * 2007-02-27 2010-06-03 ジェネグゼル−セイン インク． 成長因子と結合する融合タンパク質
JP2011502503A (ja) * 2007-11-09 2011-01-27 ペレグリン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の組成物および方法
JP2011505135A (ja) * 2007-11-30 2011-02-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
JP2016513669A (ja) * 2013-03-13 2016-05-16 ジェンザイム・コーポレーション Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合部分を含む融合タンパク質ならびにその使用方法
JP2017023130A (ja) * 2015-07-23 2017-02-02 クリオコード エスディーエヌ． ビーエイチディー．ＣｒｙｏＣｏｒｄ Ｓｄｎ． Ｂｈｄ． 加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管形成及び癌における抗血管新生療法用の幹細胞
WO2019098264A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 国立大学法人大阪大学 Ｃｄ３１陽性ｃｄ４５陰性ｃｄ２００陽性の哺乳動物細胞からなる細胞集団、およびその利用
WO2019142833A1 (ja) * 2018-01-16 2019-07-25 学校法人慶應義塾 ｉＰＳ細胞から角膜内皮代替細胞を誘導する方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010518871A (ja) * 2007-02-27 2010-06-03 ジェネグゼル−セイン インク． 成長因子と結合する融合タンパク質
JP2011502503A (ja) * 2007-11-09 2011-01-27 ペレグリン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の組成物および方法
JP2011505135A (ja) * 2007-11-30 2011-02-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
JP2016513669A (ja) * 2013-03-13 2016-05-16 ジェンザイム・コーポレーション Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合部分を含む融合タンパク質ならびにその使用方法
JP2017023130A (ja) * 2015-07-23 2017-02-02 クリオコード エスディーエヌ． ビーエイチディー．ＣｒｙｏＣｏｒｄ Ｓｄｎ． Ｂｈｄ． 加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管形成及び癌における抗血管新生療法用の幹細胞
WO2019098264A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 国立大学法人大阪大学 Ｃｄ３１陽性ｃｄ４５陰性ｃｄ２００陽性の哺乳動物細胞からなる細胞集団、およびその利用
WO2019142833A1 (ja) * 2018-01-16 2019-07-25 学校法人慶應義塾 ｉＰＳ細胞から角膜内皮代替細胞を誘導する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU M; YANG J-L; TENG H; JIA Y-Q; WANG R; ZHANG X-W; WU Y; LUO Y; CHEN X-C; ZHANG R; TIAN L; ZHAO X; WEI Y-Q: "Anti-angiogenesis therapy based on the bone marrow-derived stromal cells genetically engineered to express sFlt-1 in mouse tumor model", BMC CANCER, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, vol. 8, no. 1, 23 October 2008 (2008-10-23), LONDON, GB , pages 306, XP021042944, ISSN: 1471-2407, DOI: 10.1186/1471-2407-8-306 *

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