JP2017023130A - 加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管形成及び癌における抗血管新生療法用の幹細胞 - Google Patents
加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管形成及び癌における抗血管新生療法用の幹細胞 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)遺伝子を保有する組換えベクターを有し、VEGFRポリペプチドを発現する、遺伝子操作された間葉系幹細胞(MSC)であって、ヒトの体内において血管新生を阻害する、幹細胞。当該幹細胞は、黄斑変性症、角膜血管形成、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、並びに脈絡膜新生血管形成に罹患している患者において治療するために、血管新生を阻害するのに使用される幹細胞。VEGFR遺伝子がVEGFR1であり、VEGFRポリペプチドが可溶型のVEGFRであり、VEGFRポリペプチドがヒトFLT−1タンパク質である、幹細胞。
【選択図】図2
Description
間葉系幹細胞(MSC)は、臍帯、骨髄、脂肪組織又は筋肉などの出生後又は成体の組織に由来する。供給源の性質に起因して、MSCでは倫理的問題が提起されないので、MSCは胚性幹細胞よりも疾患の治療に対する許容度が高い。
本発明のある実施形態によると、抗血管新生タンパク質を発現する遺伝子操作されたMSCを使用して、ヒトの体における血管新生を阻害する。血管新生の阻害は、黄斑変性症、リンパ脈管新生及び子宮内膜症などの、血管の異常な形成によって直接引き起こされる疾患又は障害に罹患している患者において望まれる。また、進行のために血液供給を必要とする他の疾患及び障害、すなわち癌及び転移も、血管新生を阻害することによって治療することができる。
本発明の一実施形態では、血管新生を阻害するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、VEGFRを発現する遺伝子操作された幹細胞及び薬学的に許容される担体で構成される。上記医薬組成物は、血管新生の阻害を必要とする疾患の治療、特に黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症の治療に使用される。
この試験において使用するプライマーは、sFLT−1及びグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子に基づいて設計した。GAPDH遺伝子を、細胞における発現が一定である対照(ハウスキーピング遺伝子)として使用する。FastPCR 4.0.13ソフトウェア(Institute of Biotechnology、University of Helsinki、Finland)を使用してプライマーを設計した。全てのプライマーがFirst Base Laboratories、Malaysiaにより合成された。プライマー配列を表1に列挙する。
可溶型のヒトFLT−1(VEGFR−1)ORFを発現するpBLAST−hsFLT−1(インビボジェン(登録商標)により製造されたもの)。pBLASTは、in vitro及びin vivoにおいて血管新生抑制タンパク質及び血管新生タンパク質を産生する、血管新生抑制因子、血管新生因子、増殖因子、又は分化阻害剤ファミリーに由来する目的の遺伝子を含有する既成の発現ベクターである。
WJ−MSCを液体窒素から取り出し、37℃のウォーターバスで継続的に旋回させることにより、わずかな量の氷が残る状態まで解凍した。アルコールを用いてバイアルをきれいにした後にキャップを開けた。細胞懸濁液1mLを、VascuLife(登録商標)EnGS Medium(LifeLine、US)5mLを含有する25cm2のT型フラスコに移した。F12培地(Gibco、USA)が10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)(Gibco、USA)で補充した。フラスコを37℃でインキュベートし、翌日、培地を除去し、新鮮な培地を添加した。継代培養のために、培地をフラスコから除去し、1×PBS(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa2HPO4、1.47mMのKH2PO4、pH7.4)ですすぎ、フラスコを穏やかに前後に揺らした。予め温めたTrypLE(登録商標)(Gibco、USA)1mlをフラスコに添加し、37℃で5分インキュベートした。フラスコを穏やかにたたいてフラスコ表面に接着した残りの細胞を取り除いた。完全成長培地5mLを添加し、細胞をピペットによって繰り返し再懸濁させて、存在し得るあらゆる凝集塊を破壊した。血球計算器を使用して細胞を計数し、継代培養のために細胞を1:3の比で新しいフラスコに分割した。細胞濃度は次式によって決定した(Liddell及びCryer、1991年)。
WJ−MSCを、細胞の90%超が生存可能である対数期の間保管した。1ml当たり細胞5×105個の濃度の細胞を200×gで10分にわたって遠心分離した。遠心分離からのペレットを、20%(v/v)FBS及び10%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有するチルド凍結培地2mLに穏やかに再懸濁させた。細胞をクライオバイアルに分注し、スチロフォームの箱に入れた。細胞を−20℃で1時間維持し、−80℃に移して一晩置いた後、長期保管のために液体窒素に移した。
ブラストサイジン(Invivogen、USA)のWJ−MSCに対する毒性濃度を決定した後、安定にトランスフェクトした。WJ−MSCを6ウェルプレート(Nunc、USA)に1mL当たり細胞1×105個の密度で播種し、90%集密まで成長させた。2μg/mL〜10μg/mLの間の範囲の各濃度のブラストサイジンをWJ−MSCに添加し、5日間インキュベートした。細胞密集度の百分率を評価することによって細胞傷害効果を決定した。WJ−MSCの成長を完全に阻害するブラストサイジンの最低濃度は10μg/mLであることが見いだされた。
カチオン性脂質トランスフェクションを使用してWJ−MSCを形質転換した。トランスフェクションの前日に、抗生物質を伴わないVascuLife(登録商標)EnGS Medium(LifeLine、US)を伴う6ウェルプレートにWJ−MSCを播種して、トランスフェクション時の90〜95%集密を実現した。精製したプラスミドDNA3μgをOPTI−MEM I reduced−serum medium(Gibco、USA)100μLに希釈してDNA溶液を調製し、リポフェクタミン(Lipofectamine)(登録商標)(Invitrogen、USA)試薬6μLをOPTI−MEM(登録商標)I reduced−serum mediumに100μLに希釈して脂質溶液を調製した。希釈したDNAを希釈した脂質試薬と穏やかに混合し、その後、両方の溶液を室温で30分インキュベートした。次いで、両方の溶液を混合し、室温で15分インキュベートしてDNA−脂質複合体を形成させた。複合体が形成されるのを待つ間、血清によりリポフェクタミン(登録商標)試薬の働きが低下し得るので、血清を伴わない予め温めたVascuLife(登録商標)EnGS Medium(LifeLine、US)培地でWJ−MSCをすすいだ。OPTI−MEM(登録商標)I培地2mLをDNA−脂質複合体に添加し、穏やかに混合した。すすいだ細胞の上にDNA−脂質複合体をゆっくりと乗せた。37℃で5時間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を除去せずに、20%血清を含有するVascuLife(登録商標)EnGS medium(LifeLine、US)2mLを細胞に添加した。翌日、細胞培地を除去し、10%FBS血清を伴うVascuLife(登録商標)EnGS Medium(LifeLine、US)を添加した。DNA溶液とリポフェクタミン(登録商標)を3μg対6μgの比の組合せで用いるとFLT−1遺伝子を用いたWJ−MSCのトランスフェクションの効率が高くなる。
WJ−MSC細胞ホモジネートおよそ400μLとTRIzol試薬(Gibco、USA)750μLを1.5mLのエッペンドルフチューブ(Eppendorf tube)(登録商標)中で混合し、室温(RT)で5分インキュベートすることによってRNA抽出を行った。クロロホルム200μLを添加し、15秒間混合した。これを室温で15分インキュベートした。次いで、混合物を4℃、12000×gで20分にわたって遠心分離した。水相を新しい1.5mLのエッペンドルフチューブ(登録商標)に移し、イソプロパノール800μLを添加することによってRNAを沈殿させた。RTで10分インキュベートした後、混合物を4℃、12000×gで15分にわたって遠心分離した。上清を除去し、得られたペレットを、100%エタノール1mLを添加することによって洗浄し、4℃、12000×gで15分にわたって遠心分離した。再度上清を除去し、100%エタノール1mLを添加し、さらなる使用のために−70℃で維持したか、又は、4℃、12000×gで5分にわたって遠心分離し、風乾し、RNaseフリー水20μLに懸濁させた。抽出したRNAを、DNase I(Sigma、UK)2μLを用いて37℃で30分にわたって処理した。50mMのEDTA2μL及び56℃で10分間の熱失活を用いて反応を停止させ、RNAをさらなる分析に供した。
WJ−MSCに対してRT−PCR分析を実施して、mRNA転写物の存在を決定した。この分析は表1に列挙されているプライマーを使用することによって行った。AMV/Tfl 1×反応緩衝液(Promega、USA)5μL、0.2mMのdNTP混合物(Promega、USA)0.5μL、3mMのMgSO4、3μL、0.5μMの各プライマー(Vivantis、Malaysia)0.5μL、0.8μ/μLのRNasin(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(Ribonuclease Inhibitor)(Promega、USA)0.5μL、0.1μ/μLのAMVリバーストランスクリプターゼ(AMV Reverse Transcriptase)(Promega、USA)0.5μL、0.1U/μLのTfl DNAポリメラーゼ(DNA Polymerase)(Promega、USA)0.5μL、RNA(10μg/μL)1μL及びヌクレアーゼフリー水(Nuclease−Free water)13μLを含有するRT−PCR混合物、合計25μL。アニーリング温度、MgSO4の濃度及びサイクリングパラメータについてアッセイを最適化した。再現性を実証するためにアッセイを2連で行った。混合物をRTでボルテックスし、微量遠心機で遠心分離することによって適正に混合した。エッペンドルフ(Eppendorf)(登録商標)サーマルサイクラーPCRシステム(Thermal Cycler PCR system)(Eppendorf、USA)において、最初の実行に関して逆転写として45℃で45分を1サイクル、及び、34サイクルまで、95℃で2分の予備変性ステップ、95℃で30秒の変性、50〜65℃で44秒のアニーリング、68℃で2分の伸長、その後、68℃で10分の最終的な伸長で勾配PCRを実施した。全てのプライマーセットについて、55℃のアニーリング温度が最大の産物収率及び特異性をもたらすと評価された。RT−PCR産物をアガロースゲルに流し、80Vで50分にわたって電気泳動に供した。ゲルレッド(GelRed)(商標)(Biotium、USA)を用いてゲルを染色し、バイオスペクトラム(BioSpectrum)(登録商標)(UVP、USA)の下で可視化した。
12%分離ゲルを1つ、30%単量体溶液[29.2%(w/v)アクリルアミド、0.8%(w/v)ビスアクリルアミド]940μL、Tris(pH8.8)920μL、10%(w/v)SDS、20μL、dH2O、940μL、10%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)23.5μL及びN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)3.8μLの2.5mLから調製した。全ての成分を混合し、2つのキャスティングガラス板の間にピペットで入れた。ゲルの上に100%ブタノール0.1mLを乗せ、およそ15分にわたって重合させた。次いで、ブタノールを廃棄し、蒸留水(dH2O)ですすいだ。スタッキングゲル溶液[30%単量体溶液415μL、0.5MのTris−Cl(pH6.8)588.8μL、10%(w/v)SDS、36.2μL、dH2O、1.46mL、10%(w/v)APS、16.7μL及びTEMED、3.5μL]を分離ゲルの上部に乗せた。コームをスタッキングゲルに挿入し、約30分にわたって重合させた。リザーバ槽に電気泳動緩衝液[25mMのTris、250mMのグリシン、0.1%のSDS、pH8.3]を満たした。再現性を実証するためにアッセイを2連で行った。試料を等体積の2×試料緩衝液[0.5MのTris(pH6.8)、100%グリセロール、10%(w/v)SDS、0.5%(w/v)ブロモフェノールブルー、10%(v/v)β−メルカプトエタノール]と混合し、100℃で10分間の加熱の前後に短く遠心した。試料緩衝液が流れきるまで電気泳動装置を16mAの一定電流に設定した。次いで、ゲルを染色溶液[0.025%(w/v)クーマシー(Coomassi)(登録商標)ブリリアントブルー(brilliant blue)R−250、40%(v/v)メタノール、7%(v/v)酢酸]中、30分にわたって染色し、その後、脱染溶液[40%(v/v)メタノール、7%(v/v)酢酸]中でバックグラウンド染色が透明になるまで脱染した。マジックマーク(MagicMark)(商標)XPウエスタンプロテインスタンダード(XP Western Protein Standard)(Invitrogen、USA)に応じて試料サイズを測定した。
タンパク質試料を伴うSDS−PAGEを、前染色を伴わずに電気的転写に供した。電気泳動された試料を含有するポリアクリルアミドゲルを以下のステップでサンドイッチ位に配置した;まず、3mmのクロマトグラフィー紙(Whatman、USA)の3つの層、次いでニトロセルロースメンブレン(GE Healthcare、USA)、その後にポリアクリルアミドゲル、及び最終的にさらに3つのクロマトグラフィー紙の層。全ての層をTowbin転写緩衝液[25mMのTris、190mMのグリシン、20%(v/v)メタノール、pH8.0](Towbinら、1979年)に予め浸漬した後、トランス−ブロットSDセミドライ電気泳動転写セル(Trans−blot SD semi−dry electrophoretic transfer cell)(BioRad、USA)上に配置した。試料を15Vの一定電圧で15分にわたってメンブレンにブロットした。メンブレンを1:1000に希釈したsFLT−1に対する一次抗体(Abcam、USA)7mLにおいてインキュベートし、そしてRTで1時間インキュベートしてsFLT−1タンパク質を検出した。メンブレンを1×TBST(1×TBST50ml中2.5gのミルク)10mLで洗浄し、このプロセスを3回繰り返した。次いで、メンブレンを、HRPとコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体(Abcam、USA)7mLと1時間インキュベートした。再度メンブレンに1×TBST10mLを広げ、これを3回繰り返した。その後、ブロットをECLミックス(ECL mix)(GE Healthcare、USA)5mLと一緒にインキュベートし、すぐに10〜30分にわたって化学発光にさらした。
sFLT−1の抗血管新生活性をさらに理解するために、Liangら(2007年)に従って創傷治癒アッセイを行った。このアッセイは、sFLT−1を用いて処理したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において試み、処理を伴わないHUVEC及び0.5mg/mLを用いて処理したHUVECと比較した。ベバシズマブは、VEGF−Aを阻害するモノクローナル抗体である。このアッセイは、FLT−1遺伝子の抑制を踏まえた細胞遊走を可視化するために行った。in vitroスクラッチアッセイは、in vivoにおける細胞の遊走をある程度まで模倣するものである。
WJ−MSCの安定なトランスフェクション
WJ−MSCに対するブラストサイジンの濃度の影響を1日目〜5日目に分析した。WJ−MSCを10μg/mLのブラストサイジンで処理した場合に、細胞死が起こったことが示される、WJ−MSCの円形化及び浮遊が引き起こされ、最小の生存細胞が観察された。WJ−MSCの成長を完全に阻害するブラストサイジンの最低濃度は10μg/mLであることが見いだされた。この濃度を、陽性にトランスフェクトされたWJ−MSCの選択に使用し、4μg/mLのブラストサイジン濃度を、DNA構築物を用いてトランスフェクトした後のWJ−MSCを維持するために使用した。
トランスフェクトされたWJ−MSCを、sFLT−1 mRNA転写物の存在について分析した。抽出した全RNAを、表1に列挙されているプライマーを使用したRT−PCRに供した。RT−PCR分析により、トランスフェクトされたWJ−MSCにおいてプラスミドが転写的に活性であることが明らかになった。増幅結果が転写物に関連するものであり、プラスミドDNAに由来するものではないことを確実にするために、抽出したRNA試料を、RT部分を伴わないPCR増幅で処理した。試料から特異的なバンドは検出されず、これにより、増幅結果がプラスミドDNAに由来するものではないことが示された。RT−PCR分析により、トランスフェクトされたWJ−MSCにおいてプラスミドが転写的に活性であることが明らかになった(図1)。
FLT−1を発現するWJ−MSCのin vivoにおける追跡を補助するために、ヌクレオフェクション法を使用して細胞にpMAX−GFPをトランスフェクトした。得られた陽性クローンはわずかであったが(低トランスフェクション効率及び選択圧力の欠如に一部起因する)、WJ−MSCの小さな集団が継代5まで緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現し続けた。
WJ−MSCに対するブラストサイジン処理の2週間後に、細胞溶解物を採取し、SDS−PAGEによって分離した。その後、SDS−PAGEタンパク質試料のニトロセルロースメンブレンへの電気的転写を行い、一次抗体及び二次抗体を用いてプローブした。FLT−1タンパク質の発現をウエスタンブロット分析によって確認した。pBLAST−hsFLT−1をトランスフェクトした細胞におけるおよそ165kDaの分子量種がsFLT−1に対する一次抗体及びHRPとコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体と反応した(図2)。FLT−1タンパク質は継代3において高度に発現し、継代8ではタンパク質レベルは低下した。継代8まで、各継代に1週間かかった。
sFLT−1を用いて処理したHUVEC細胞についての創傷の中心に向かう細胞の遊走は、0.5mg/mLのベバシズマブを用いて処理したHUVECと比較して速かった。結論として、sFLT−1を用いて処理したHUVECについて、0.5mg/mLのベバシズマブと比較して、部分的な阻害が実現された。
Claims (26)
- 血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)遺伝子を保有する組換えベクターを有し、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)ポリペプチドを発現する、遺伝子操作された間葉系幹細胞(MSC)であって、ヒトの体において血管新生を阻害する、幹細胞。
- VEGFR遺伝子がVEGFR1である、請求項1に記載の幹細胞。
- 前記VEGFRポリペプチドが可溶型のVEGFRである、請求項1に記載の幹細胞。
- VEGFRポリペプチドがヒトFLT−1タンパク質である、請求項1に記載の幹細胞。
- 組換えベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項1に記載の幹細胞。
- プラスミドベクターがpBLAST−hsFLT−1である、請求項5に記載の幹細胞。
- 間葉系幹細胞が臍帯から単離されている、請求項1に記載の幹細胞。
- カチオン性脂質トランスフェクションによってプラスミドベクターがトランスフェクトされている、請求項6に記載の幹細胞。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する、請求項1に記載の幹細胞。
- 配列番号1と50〜100%の配列相同性を有するタンパク質を発現する、請求項9に記載の幹細胞。
- 黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成で構成される群から選択される疾患又は障害を有する患者において血管新生を阻害する、請求項1に記載の幹細胞。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の幹細胞遺伝子操作された間葉系幹細胞を産生するための方法であって、
i.間葉系幹細胞に血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA構築物をトランスフェクトするステップと、
ii.ステップ(i)の前記遺伝子の間葉系幹細胞における発現について選択するステップと、
iii.ステップ(ii)において選択された幹細胞を培養するステップと
を含む、方法。 - ステップ(i)において使用されるトランスフェクション方法がカチオン性脂質トランスフェクションである、請求項12に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を90〜95%の密集度まで培養する、請求項12に記載の方法。
- DNAとトランスフェクション試薬の比が1:2である、請求項13に記載の方法。
- 新しい血管の制御されない成長に関連する疾患又は障害を有する患者において血管新生を阻害するための、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)を発現する遺伝子操作された間葉系幹細胞(MSC)の使用。
- 疾患又は障害が、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成で構成される群から選択される、請求項16に記載の使用。
- VEGFRがVEGFR−1である、請求項16に記載の使用。
- 幹細胞を薬学的有効量で投与する、請求項16に記載の使用。
- 可溶性血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)を発現することが可能な遺伝子操作された間葉系幹細胞(MSC)と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 発現されるVEGFRがヒトFLT−1である、請求項20に記載の組成物。
- 間葉系幹細胞が臍帯から単離されている、請求項20に記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体が生理食塩水溶液である、請求項20に記載の組成物。
- 容器及びその容器に含有される組成物を含むキットであって、組成物が、請求項1に記載の遺伝子操作された幹細胞を含む、キット。
- 組成物が血管新生を阻害するのに使用できるものであることを示す添付文書をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 組成物が、黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症を治療するのに使用される、請求項24に記載のキット。
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