JP2016513669A - Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合部分を含む融合タンパク質ならびにその使用方法 - Google Patents

Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合部分を含む融合タンパク質ならびにその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ結合部分を含む融合タンパク質ならびに融合タンパク質をコードしている組換えウイルス粒子を提供する。融合タンパク質およびウイルス粒子を含む組成物ならびにそれを使用する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条の下で先行同時係属の２０１３年３月１３日に出願の米国特許仮出願第６１／７８０，９１４号の利益を主張し、本開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる以下の提出物：コンピュータ読み込み可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１５９７９２００９５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、データ記録：２０１４年３月１１日、サイズ：１１３KＢ）の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、ＰＤＧＦ経路およびＶＥＧＦ経路を阻害する融合タンパク質、これらの融合タンパク質の組成物ならびにこれを産生し、使用する方法に関する。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの増殖因子の過剰生産に起因する新たな血管の形成は、腫瘍成長、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）のような疾患の重要な要素である（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。滲出型ＡＭＤは、網膜下の異常な新血管形成を特徴とするＡＭＤ疾患の最も重篤な形態であり、しばしば永続的な視力喪失をもたらす。抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体によるＶＥＧＦの遮断またはＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ活性の阻害は、網膜新血管形成の抑制に有望な臨床前および臨床結果を示した戦略である（非特許文献４および非特許文献５）。しかしながら、最近の臨床データは、内皮細胞と相互作用し血液網膜関門の構築に寄与する周皮細胞が新生血管の内皮細胞に生存シグナルを送り、それ故ＶＥＧＦ離脱抵抗性にするので、一般にＶＥＧＦ阻害だけでは新たな血管組織は消失しないことを示している（非特許文献６および非特許文献７）。さらに、増殖的な網膜膜中に見出される血小板由来増殖因子アイソフォームＢ（ＰＤＧＦ−Ｂ）およびＰＤＧＦ受容体−β（ＰＤＧＦＲβ）は、発達中の脈管構造を安定化するための周皮細胞の動員に重要な役割を有する（非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）。
ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）のＶＥＧＦ結合機能は、第２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）にマッピングされた（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；および非特許文献１４）。高親和性ＶＥＧＦ−結合受容体の天然に存在するオルタナティブスプライス形態である可溶性ＶＥＧＦＲ１（ｓＦｌｔ１）は、囮受容体として主に機能する分泌タンパク質として存在する（非特許文献１５および非特許文献１６）。治療上の使用のために操作された可溶性受容体であるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）の第３のドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に融合したＶＥＧＦＲ１の第２のドメインを有する（非特許文献１７）。これまでに、ＰＤＧＦＲβの細胞外領域がＰＤＧＦ−Ｂ刺激反応に拮抗することが示されている（非特許文献１８および非特許文献１９）。ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃキメラによる研究は、ヒトＰＤＧＦＲβ ＥＣＤ１〜３が高親和性ＰＤＧＦ−Ｂリガンド結合に十分であることを実証した（非特許文献２０および非特許文献２１）。ＰＤＧＦＲβ ＥＣＤ１〜３が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインに融合された場合の、高親和性ＰＤＧＦ−Ｂリガンド結合における前二量体化の効果についても記載されている（非特許文献２２）。
現在の眼治療は、数年にわたり毎月、網膜専門医により硝子体内注射を行う必要がある。したがって、治療剤およびそのような治療剤を眼などの部位に送達する手法を改善する必要性がある。
Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８９年、８４（５）：１４７０〜８頁 Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８９年、１６１（２）：８５１〜９頁 Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、１９９８年、４（３）：３３６〜４０頁 Ａｉｅｌｌｏら、ＰＮＡＳ、１９９５年、９２：１０４５７〜１０４６１頁 Ｗｉｌｌｅｔら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２００４年、１０：１４５〜１４７頁 Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８年、１２５（９）１５９１〜８頁 Ｐａｔｅｌ Ｓ．、Ｒｅｔｉｎａ、２００９年、２９（付録６）：Ｓ４５〜８頁 Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈ Ｖｉs Ｓｃｉ．、１９９４年、３５（１０）：３６４９〜６３頁 Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９７年、１２４：３９４３〜３９５３頁 Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９９年、１２６：３０４７〜３０５５頁 Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９６年、１５：４９１９〜４９２７頁 Ｂａｒｌｅｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２：１０３８２〜１０３８８頁 Ｗｉｅｓｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、１９９７年、９１：６９５〜７０４頁 Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９８年、２７３：３２１６〜３２２２頁 Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９０年、５：５１９〜５２４頁 Ｋｅｎｄａｌｌら、ＰＮＡＳ、１９９３年、９０：１０７０５〜１０７０９頁 Ｈｏｌａｓｈら、２００２年 Ｄｕａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９１年、２６６（１）４１３〜８頁 Ｕｅｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５２（５００７）：８４４〜８頁 Ｈｅｉｄａｒａｎら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１９９５年、９（１）：１４０〜５頁 Ｌｏｋｋｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７年、２７２（５２）：３３０３７〜４４頁 Ｌｅｐｐａｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、３９（９）：２３７０〜５頁
本明細書に提供される本発明は、とりわけ、ＰＤＧＦ経路およびＶＥＧＦ経路を阻害する融合タンパク質、これらの融合タンパク質を含む組成物および融合タンパク質をコードしている核酸を含むウイルス粒子を含む組成物、ならびに眼疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患または癌などの疾患の治療もしくは予防のためにこれらの融合タンパク質およびウイルス粒子を産生し、使用する方法を開示する。
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外部分、（ｂ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分、ならびに（ｃ）多量体化ドメインを含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに結合する、前記融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の順序で配置されている。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦ受容体は、ＰＤＧＦＲβである。本明細書のいくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ４を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号１、２もしくは３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ２を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメインＤ２を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、配列番号４もしくは５のアミノ酸配列、または配列番号４もしくは５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤＧＦ受容体の細胞外部分とＶＥＧＦ受容体の細胞外部分の間のリンカーペプチド、および／またはＶＥＧＦ受容体の細胞外部分と多量体化ドメインの間にペプチドリンカーをさらに含む。さらなる実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ９（配列番号４７）、Ｇｌｕ９（配列番号４８）、Ｓｅｒ９（配列番号４９）、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ（配列番号５０）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５１）、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５２）、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５４）、およびＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、抗体のＦｃ領域である。さらなる実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ３領域、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３もしくは１５のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、多量体の形態である。本明細書の実施形態のいくつかにおいて、融合タンパク質は、二量体の形態である。
一態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養し、該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収することによって産生される、融合タンパク質を提供する。
別の態様において、本発明は、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質を提供し、各融合タンパク質は本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかを含む。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしている核酸を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供する。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程と、該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収する工程とを含む、融合タンパク質を産生する方法を提供する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかの有効量を対象に投与する工程を含む、融合タンパク質を対象に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、黄斑変性または増殖性糖尿病性網膜症を有する。さらなる実施形態において、黄斑変性は、滲出型加齢黄斑変性または萎縮型加齢黄斑変性である。本明細書のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、硝子体内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は癌を有する。いくつかの実施形態において、対象は関節リウマチ、骨関節炎または喘息を有する。いくつかの実施形態において、対象はブドウ膜炎または角膜血管新生を有する。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のＩＴＲを含む。
一態様において、本発明は、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしている核酸を含むｒＡＡＶ粒子も提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、キャプシドの血清型とは異なる血清型のＩＴＲを含む。さらなる実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のＩＴＲである。
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞は（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であり、該ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれがＡＡＶ複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを両端に有する、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチドを含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能を含む、工程と；（ｂ）該宿主細胞によって産生される該ｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む、ｒＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は精製される。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示するｒＡＡＶ粒子のいずれかを対象に投与する工程を含み、ここで該ｒＡＡＶ粒子にコードされた融合タンパク質が該対象中で発現される、対象にウイルスベクターを送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示するｒＡＡＶ粒子のいずれかを対象に投与し、ｒＡＡＶ粒子にコードされる融合タンパク質の有効量が対象中で発現される工程を含む、ウイルスベクターを対象に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、黄斑変性または増殖性糖尿病性網膜症を有する。さらなる実施形態において、黄斑変性は、滲出型加齢黄斑変性または萎縮型加齢黄斑変性である。本明細書のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は癌を有する。いくつかの実施形態において、対象は関節リウマチ、骨関節炎または喘息を有する。いくつかの実施形態において、対象はブドウ膜炎または角膜血管新生を有する。
本明細書は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され記載された変更に加えて、前述の説明から本発明の様々な変更が当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に含まれることになる。本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
短縮したＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体の生成を示す図である。Ａは、ＰＤＧＦＲ−β ＩｇＧ１ Ｆｃ連結二量体化形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−ＦｃならびにＰＤＧＦＲ−β単量体受容体形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）の概略図を示す図である。白い区画は、細胞外ドメインおよびシグナルペプチド（ｓｐ）を含めたＰＤＧＦＲ−β配列を示す。斜線で陰を付けた区画は、９Ｇｌｙリンカーを表し、濃い点描の区画は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のドメインＣＨ２およびＣＨ３を表す。Ｂは、短縮したＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体の生成を示す図である。還元（左パネル）ならびに非還元（右パネル）条件における単量体ｓＰＤＧＦＲ−βおよびＩｇＧ１ Ｆｃ連結二量体化可溶性受容体形態のウェスタンブロットを示す図である。タンパク質は、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体で検出された。 短縮したＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体の容積測定ＰＤＧＦ ＢＢ結合アッセイを示す図である。Ａは、全長サイズのＩｇＧ１ Ｆｃ連結二量体化形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃと比較した単量体ＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）を示す図である。Ｂは、短縮したＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体の容積測定ＰＤＧＦ ＢＢ結合アッセイを示す図である。ＩｇＧ１ Ｆｃ連結二量体化形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃと比較した二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ連結ｓＰＤＧＦＲ−β可溶性受容体形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃを示す図である。容積（μＬ）（ｘ軸）を増加させて、代表的なトランスフェクションからの可溶性受容体を含有する馴化培地（ＣＭ）をヒトＰＤＧＦ ＢＢリガンドと終夜インキュベートし、結合していないリガンドの量（ｙ軸）をＥＬＩＳＡによって測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表示される；すべての受容体は、二元配置分散分析；ボンフェローニ検定によりＰＤＧＦ結合親和性において有意に異なっていた；＊＊＊Ｐ<０．００１。 ＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βおよびＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質であるハイブリッド１〜４、ならびにその親構築物ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−ＦｃおよびｓＦＬＴ０１の概略図である。白い区画は、ＰＤＧＦＲ−β配列を示し、灰色の区画は、その細胞外ドメインおよびシグナルペプチド（ｓｐ）を含めたＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）配列を示す。斜線で陰を付けた区画は、９Ｇｌｙまたは９Ｓｅｒリンカーを表し、濃い点描の区画は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のドメインＣＨ２およびＣＨ３を表す。 還元（左パネル）ならびに非還元（右パネル）条件における全長サイズのＩｇＧ１ Ｆｃ連結二量体化形態であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ（（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃと示す）と比較したＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βおよびＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質であるハイブリッド１〜４のウェスタンブロットを示す図である。タンパク質は、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体および抗Ｆｌｔ−１抗体で検出された。ハイブリッド３および４を含有するサンプルは、個々のトランスフェクションの複製である。 ハイブリッドタンパク質であるハイブリッド１〜４による、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘導およびＶＥＧＦ+ＰＤＧＦ−β誘導増殖の阻害を実証するグラフである。Ａ）ＶＥＧＦだけによるＨＵＶＥＣ増殖アッセイ：ＨＵＶＥＣ増殖に対する、可溶性受容体を含有する馴化培地（ＣＭ）５μｌの阻害効果をＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）だけの存在下で比較した図である。Ｂ）ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）存在下でのＨＵＶＥＣ競合増殖アッセイ：ＨＵＶＥＣ増殖に対する、可溶性受容体を含有するＣＭ５μｌの阻害効果をＶＥＧＦとＰＤＧＦ両方のリガンドの存在下で比較した図である。３つの独立したトランスフェクション（ｎ＝３）からのサンプルを、１回のアッセイで評価した。データは、平均±ＳＤとして表示される。一元配置分散分析；テューキーの検定；陽性対照であるＶＥＧＦ+単独またはＰＤＧＦ ＢＢ+と組み合わせたＶＥＧＦ+、と他のサンプルとの差異に関して＊＊＊ｐ<０．００１。対照＝ＥＧＦＰ ＣＭ；ＶＥＧＦ+＝ＥＧＦＰ ＣＭ+１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ；ＢＢ+のみ＝ＥＧＦＰ ＣＭ+２０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＢＢ；ＶＥＧＦ+ＢＢ+＝ＥＧＦＰ ＣＭ+１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ+２０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＢＢ。 ハイブリッドタンパク質の容積測定結合アッセイを示す図である。Ａは、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃと比較したハイブリッドタンパク質１〜４のＰＤＧＦ ＢＢ容積測定結合アッセイを示す図である。Ｂは、ハイブリッドタンパク質の容積測定結合アッセイを示す図である。ｓＦＬＴ０１と比較したハイブリッドタンパク質１〜４のＶＥＧＦ容積測定結合アッセイを示す図である。代表的なトランスフェクションからの可溶性受容体を含有する馴化培地容積（ｘ軸）を増加させてヒトＰＤＧＦ ＢＢまたはＶＥＧＦリガンドのいずれかと終夜インキュベートし、結合していないリガンドの量（ｙ軸）をＥＬＩＳＡによって３つ組で測定した。 ハイブリッドタンパク質のＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ無細胞競合結合アッセイを示す図である。Ａは、馴化培地容積の増加（ｘ軸）ならびにＰＤＧＦ ＢＢ ＥＬＩＳＡによって測定される結合していないＰＤＧＦリガンドの量（ｙ軸）をハイブリッド３（Ｈｙｂ＃３）、ハイブリッド４（Ｈｙｂ＃４）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃで比較した図である。Ｂは、ハイブリッドタンパク質のＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ無細胞競合結合アッセイを示す図である。馴化培地容積の増加（ｘ軸）ならびにＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡによって測定される結合していないＶＥＧＦリガンドの量（ｙ軸）をハイブリッド３（Ｈｙｂ＃３）、ハイブリッド４（Ｈｙｂ＃４）およびｓＦｌｔＴ０１で比較した図である。 マウス脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）レーザモデルにおけるＡＡＶ２．ハイブリッド４の硝子体内送達のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示すグラフである。ＡＡＶ２．ハイブリッド４（ハイブリッド−４と示される）、ＡＡＶ２．ｓＦＬＴ０２（ｓＦＬＴ０２と示される）、ＡＡＶ２．ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲと示される）で治療した眼（左）における血管新生（ＮＶ）のない熱傷の数を、無治療の反対側の眼（右；未処理）と比較した。両眼からのデータ（治療１回当たりの眼はｎ＝２０）を、ＣＮＶなしの熱傷のパーセンテージとして表示した。ＡＡＶ２．ＰＤＧＦＲの構築に使用されるＰＤＧＦＲ部分は、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃであった。
本発明は、とりわけ、血漿由来増殖因子（ＰＤＧＦ）シグナル伝達経路ならびに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路を阻害する融合タンパク質およびその組成物を提供する。本明細書に記載される本発明の融合タンパク質は、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）の細胞外部分、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外部分、ならびに多量体化ドメインを含み、融合タンパク質は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに結合して、それぞれＰＤＧＦ活性およびＶＥＧＦ活性を阻害する。融合タンパク質を産生する方法、融合タンパク質を送達する方法ならびに眼疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患および／または癌の治療に融合タンパク質を使用する方法も本明細書に提供される。
Ｉ．全般的な技術
本明細書に記載または引用される技術および手順は、通常、当業者に十分理解され、従来の方法を使用して一般的に利用されており、このような使用は、例えば、以下、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、編、１９８８年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編、１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ、編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３〜８年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編、１９９６年）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ、編、１９８７年）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編、１９９１年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２年）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ、編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ、編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１年）に記載される広く利用されている方法である。
ＩＩ．定義
本明細書では「ベクター」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスのことを指す。
本明細書では用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかの任意の長さのヌクレオチド重合形態のことを指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖もしくは複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然に、化学的もしくは生化学的に修飾された非天然のもしくは誘導ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡ中に一般に見ることができる）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。別法として、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミダートなど合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミダート（Ｐ−ＮＨ２）またはホスホルアミダート−リン酸ジエステル混合オリゴマーであることができる。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適当な条件下で鎖をアニールすることによってかまたは適当なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを使用してｄｅ ｎｏｖｏで相補鎖を合成することによってかのいずれかにより化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
「組換えウイルスベクター」とは、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源でない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターのことを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は、少なくとも１つ、好ましくは２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を両端に有する。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を両端に有する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターのことを指す。そのようなｒＡＡＶベクターが、適切なヘルパーウイルス（または適切なヘルパー機能を発現しているウイルス）に感染しＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞内に存在する場合、ベクターは複製し、感染性ウイルス粒子へとパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターは、より大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなど別のベクターに）に組み込まれると、次にＡＡＶパッケージング機能ならびに適切なヘルパー機能の存在下での複製およびキャプシド形成により「レスキュー」され得る「プロベクター」と称されることがある。ｒＡＡＶは、これらに限定されないが、リポソームと複合体化した、リポソームの中に封入された、最も好ましくはウイルス粒子、特にＡＡＶ内にキャプシド化された、プラスミド、直鎖人工染色体を含む数々の形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングされて「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。
「異種性」とは、比較される、または導入もしくは組み込まれる他の実体の遺伝子型と異なる実体から得られることを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種性ポリヌクレオチドである（発現された場合には、異種性ポリペプチドをコードする可能性がある）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞性配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、ベクターに対して異種性のヌクレオチド配列である。
「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列とは、当業界でよく理解されている用語であり、ウイルスゲノムの終端でそれぞれ逆向きで見出される比較的短い配列のことを指す。
当業界でよく理解されている用語「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列とは、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の終端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、２方向のいずれかで存在することができ、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間の異質性をもたらす。最も外側の１２５ヌクレオチドは、自己相補性があるいくつかのより短い領域も含有し、ＩＴＲのこの部分に鎖内塩基対合を起こすことができる。
「末端分離配列」（terminal resolution sequence）または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡの複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域にある配列である。変異体末端分離配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に不能性である。
ウイルス力価への言及で使用される用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」もしくは「ゲノムコピー」とは、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数のことを指す。特定のベクター標本中にあるゲノム粒子の数は、本明細書の実施例、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１〜１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２〜２７８頁などに記載される手順によって測定することができる。
ウイルス力価への言及で使用される用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」とは、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３頁に記載される感染中心アッセイ、別名複製中心アッセイによって測定される感染性であり、複製能を有する組換えＡＡＶベクター粒子の数のことを指す。
ウイルス力価への言及で使用される用語「形質導入単位（ｔｕ）」とは、本明細書の実施例、または例えばＸｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３〜１２４頁；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０〜５３２頁（ＬＦＵアッセイ）などに記載される機能的アッセイで測定される機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数のことを指す。
ＡＡＶに対する「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（欠損パルボウイルスである）が宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にするウイルスのことを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含めそのようなヘルパーウイルスがいくつか同定されてきた。サブグループＣ（Ａｄ５）の５型アデノウイルスが最も一般に使用されるが、アデノウイルスはいくつかの異なるサブグループを包含する。ヒト、ヒト以外の哺乳動物および鳥起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託施設から利用可能である。ＡＴＣＣなどの受託施設からも利用可能なヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）がある。
「融合タンパク質」とは、共有結合で連結された２つまたはそれ以上の部分を有するタンパク質のことを指し、その部分のそれぞれが異なるタンパク質に由来する。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列を整列させ、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチドもしくは核酸配列のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドのパーセンテージと定義され、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸または核酸配列同一性を決定するための整列化は、当業者の技術的範囲内である様々な方法、例えば一般公開されているコンピュータソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９８７年）、付録３０、７．７．１８節、表７．７．１に記載されるプログラム、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含めたプログラムを使用して達成することができる。好ましい整列化プログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大整列化を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、整列化を測定するのに適当なパラメータを決定することができる。本明細書の目的の場合、所与のアミノ酸配列Ｂにとっての、それとの、もしくはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ｂにとっての、それとの、もしくはそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと代わりに呼ぶことができる）は、以下の通りに算出される：分数Ｘ／Ｙの１００倍であり、Ｘは、配列整列化プログラムによりそのプログラムのＡとＢの整列化において完全な一致として得点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことはいうまでもない。本明細書の目的の場合、所与の核酸配列Ｄにとっての、それとの、もしくはそれに対する所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（所与の核酸配列Ｄにとっての、それとの、もしくはそれに対して特定の％核酸配列同一性を有するまたは含む所与の核酸配列Ｃと代わりに呼ぶことができる）は、以下の通りに算出される：分数Ｗ／Ｚの１００倍であり、Ｗは、配列整列化プログラムによりそのプログラムのＣとＤの整列化において完全な一致として得点されたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄのヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性が、Ｃに対するＤの％核酸配列同一性と等しくならないことはいうまでもない。
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）もしくは細胞は、それが同定、分離および／または自然環境の成分から回収されたことを意味する。
「有効量」とは、臨床結果を含めて有益なまたは所望の効果を生じるのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の観点からは、有効量は、疾患の進行を改善する、安定させるまたは遅延させるのに十分な量である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、それだけには限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどヒト以外の霊長類）、ウサギおよび齧歯類（例えば、マウスおよびラット）がある。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
本明細書では「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。この発明の目的の場合、検出可能かまたは検出不可能かを問わず、有益なまたは所望の臨床結果は、それだけには限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の縮小、病状の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患の拡散（すなわち、転移）の予防、疾患の増悪の遅延もしくは減速、病状の改善もしく緩和、および寛解（部分的かまたは全体かを問わず）を含む。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比べて延命することを意味することもできる。
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す説明は、「Ｘ」の説明を含む。
特に明記しない限り、本明細書では、冠詞の単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の言及を含む。例えば、「ｒＡＡＶ粒子」という句は、１つまたはそれ以上のｒＡＡＶ粒子を含む。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様ならびに実施形態「を含む」、「からなる」ならびに／または「から基本的になる」ことを含むものと理解される。
ＩＩＩ．融合タンパク質および融合タンパク質成分
血漿由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体
血漿由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、多くの生体活性に必要とされ、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、血管形成術後の脈管再狭窄および癌などいくつかの疾患に関係してきた。ＰＤＧＦシグナル伝達経路を調節する血漿由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのタンパク質のメンバーには少なくとも４つ、具体的にはＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄがある。これら４つのＰＤＧＦは、ホモまたはヘテロ二量体化によるジスルフィド連結二量体へと組み立てられる。現在までに異なるＰＤＧＦ二量体アイソフォームが少なくとも５つ記載されており、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤおよびＰＤＧＦ−ＡＢがあり、そのすべてがＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）に結合してＰＤＧＦシグナル伝達経路を活性化する。少なくとも２つのＰＤＧＦＲ、すなわちＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βが同定されている。各ＰＤＧＦＲは、細胞外領域、膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域を有する。ＰＤＧＦＲは二量体化して、ホモ二量体ＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−β／ＰＤＧＦＲ−βおよびヘテロ二量体ＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−βを形成することができる。これらＰＤＧＦＲ二量体の形態のそれぞれは、ＰＤＧＦの異なる二量体アイソフォームを認識する。例えば、ＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−αは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢ、ＢＢおよびＣＣリガンドを認識し、ＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−βは、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＢ、ＣＣおよびＤＤを認識し、ＰＤＧＦＲ−β／ＰＤＧＦＲ−βは、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＤＤを認識する。ＰＤＧＦ−ＡＡおよび−ＢＢ結合部位の欠失突然変異生成はＰＤＧＦＲ−αのアミノ酸１〜３１４にマッピングされ、一方でＰＤＧＦ−ＢＢ結合部位はＰＤＧＦＲ−βのアミノ酸１〜３１５にマッピングされた。ＰＤＧＦへの結合を媒介するこれらＰＤＧＦＲの細胞外領域は、それぞれ長さ約８８〜約１１４アミノ酸に及ぶ５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含有する。参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、Ｌｏｋｋｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２（５２）：３３０３７〜４４頁、Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９８年、２７３（３９）：２５４９５〜５０２頁；およびＭａｈａｄｅｖａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０（４６）：２７５９５〜６００頁を参照のこと。
本発明は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得るＰＤＧＦ受容体の細胞外部分を提供する。したがって一態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを含むがこれに限定されないＰＤＧＦＲの細胞外部分を提供する。本明細書の実施形態のいくつかにおいて、ＰＤＧＦＲはヒトなどの哺乳動物由来である。ＰＤＧＦＲ細胞外領域のＮ末端から始まりＣ末端へと１、２、３、４および５と付番される５つのＩｇ様ドメインがある。本明細書では用語「ＰＤＧＦＲの細胞外部分」とは、ＰＤＧＦＲ細胞外領域の５つのＩｇ様ドメインの１つまたはそれ以上のことを指す。例えば、「ＰＤＧＦＲの細胞外部分」とは、Ｉｇ様ドメインＤ１、Ｉｇ様ドメインＤ２、Ｉｇ様ドメインＤ３、Ｉｇ様ドメインＤ４またはＩｇ様ドメインＤ５などＰＤＧＦＲの細胞外領域に見られる５つのＩｇ様ドメインのいずれか１つまたはそれ以上のことを指す。本明細書では、ＰＤＧＦＲの「Ｉｇ様ドメインＤ１」または「細胞外ドメイン（ＥＣＤ）１」などの用語は、ＰＤＧＦＲの細胞外領域のＮ末端で見られる１番目のＩｇ様ドメインのことを特に指し、ＰＤＧＦＲの「Ｉｇ様ドメインＤ２」または「ＥＣＤ２」とは、ＰＤＧＦＲの細胞外領域のＮ末端から２番目のＩｇ様ドメインのことを特に指す、などである。本明細書の態様のいずれかにおいて、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βからなる群から選択される１つまたはそれ以上のＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインを少なくとも１つ含む。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインを少なくとも１、２、３、４個含むが、多くとも５個である。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインを１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個含む。例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ２を含むことができる。別の例において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ２を含むことができる。さらに別の例において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３、Ｉｇ様ドメインＤ１〜Ｄ４またはＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含むことができる。
各ＰＤＧＦＲの５つのＩｇ様ドメインの任意の組合せを含む細胞外部分が、本明細書で考えられる。したがって一態様において、本発明は、２つのＰＤＧＦＲのうち少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βからなる群から選択される２つのＰＤＧＦＲに由来するＩｇ様ドメインを少なくとも１つ含む。例えば、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲ−αのＩｇ様ドメインの少なくとも１つおよびＰＤＧＦＲ−βのＩｇ様ドメインの少なくとも１つを含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を含むことができる。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、少なくとも２つまたはそれ以上のＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９個含むが、多くとも１０個である。さらなる態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、少なくとも２つまたはそれ以上のＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインを１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３もしくは１〜２個含む。ＰＤＧＦＲの細胞外部分の一部として使用できるＩｇ様ドメインのさらなる説明のために、そのすべてが参照によってその全体として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６８６，５７２号、ＷＯ２００６１１３２７７およびＬｏｋｋｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７年、２７２（５２）：３３０３７〜４４頁を参照のこと。
いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分であることができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号７および８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に提供されるＰＤＧＦＲの任意の細胞外部分のアミノ酸配列バリアントも考えられる。例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分の結合親和性および／または他の生物学的特性は、タンパク質をコードしているアミノ酸配列を改変することによって改善することができる。ＰＤＧＦＲの細胞外部分のアミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードしている核酸配列に適当な変更を導入することによってまたはペプチド合成により変更を導入することによって調製することができる。そのような変更には、例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分のアミノ酸配列における欠失、挿入および／または置換がある。最終的な構造物がＰＤＧＦファミリータンパク質に結合し、ならびに／またはＰＤＧＦ経路の活性化を阻害するなど所望の特徴を保有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組合せにより、ＰＤＧＦＲの細胞外部分の最終的なアミノ酸構造物を作製することができる。したがって、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得るＰＤＧＦＲの細胞外部分のバリアントが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ−α（例えば、ヒトＰＤＧＦＲ−α）のＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４もしくはＤ５のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ−β（例えば、ヒトＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４もしくはＤ５のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号７および８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。
理論に束縛されるものではないが、本明細書においてＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦファミリータンパク質に結合して、ＰＤＧＦＲとの相互作用を遮断することによってＰＤＧＦ経路の活性化を阻害すると考えられる。理論に束縛されるものではないが、本明細書においてＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲに結合して、ＰＤＧＦシグナル伝達経路を優性に阻害し得るとも考えられる。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄからなる群から選択されるＰＤＧＦファミリータンパク質を結合する。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択されるＰＤＧＦファミリータンパク質二量体を結合する。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βからなる群から選択されるＰＤＧＦＲを結合する。
ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、シグナル配列として機能して宿主細胞からＰＤＧＦＲの細胞外部分を分泌させるシグナルペプチドを含んでもよく、または含まなくてもよい。シグナルペプチドは、対象のタンパク質（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分）をコードしている核酸に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、シグナルペプチドを含まない。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体
ＶＥＧＦシグナル伝達経路を調節するＶＥＧＦファミリーのタンパク質には少なくとも５つのメンバーがある：ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰｌＧＦをコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングは、これらのタンパク質の複数のアイソフォームの生成をもたらす。例えば、ＶＥＧＦ−Ａの選択的スプライシングは、アイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６を含めた９つの異なるアイソフォームを産する。ＶＥＧＦファミリーのタンパク質は、膜貫通ＶＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合することによってＶＥＧＦシグナル伝達経路を活性化する。少なくとも３つのＶＥＧＦ受容体が同定されている：ＶＥＧＦＲｌ（別名ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（Ｆｌｔ−１））、ＶＥＧＦＲ２（別名キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ））およびＶＥＧＦＲ３（別名ｆｍｓ様チロシンキナーゼ４（Ｆｌｔ−４））。ＶＥＧＦＲはそれぞれ、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを７つ含む細胞外領域、１つの膜貫通ドメイン区分、膜近傍区分および細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメインを含有する。ＶＥＧＦＲの細胞外領域は、ＶＥＧＦファミリーのタンパク質の異なるメンバーに結合する。例えば、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰｌＧＦを結合し；ＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦ−Ａのすべてのアイソフォーム、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅを結合し；ＶＥＧＦＲ３はＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合する。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達の総説については、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｏｓｋｏｓｋｉ、Ｒら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００７年、６２（３）：１７９〜２１３頁を参照のこと。
本発明は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得るＶＥＧＦ受容体の細胞外部分を提供する。したがって、一態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３を含むがこれに限定されないＶＥＧＦＲの細胞外部分を提供する。本明細書の実施形態のいくつかにおいて、ＶＥＧＦＲはヒトなどの哺乳動物由来である。ＶＥＧＦＲ細胞外領域のＮ末端から始まりＣ末端へと１、２、３、４、５、６および７と付番される７つの細胞外Ｉｇ様ドメインがある。本明細書では用語「ＶＥＧＦＲの細胞外部分」とは、ＶＥＧＦＲ細胞外領域の７つのＩｇ様ドメインの１つまたはそれ以上のことを指す。例えば、「ＶＥＧＦＲの細胞外部分」とは、Ｉｇ様ドメインＤ１、Ｉｇ様ドメインＤ２、Ｉｇ様ドメインＤ３、Ｉｇ様ドメインＤ４、Ｉｇ様ドメインＤ５、Ｉｇ様ドメインＤ６、またはＩｇ様ドメインＤ７などＶＥＧＦＲの細胞外領域に見られる７つのＩｇ様ドメインのいずれか１つもしくはそれ以上のことを指す。本明細書では、ＶＥＧＦＲの「Ｉｇ様ドメインＤ１」または「細胞外ドメイン（ＥＣＤ）１」などの用語の両方は、ＶＥＧＦＲの細胞外領域のＮ末端で見られる１番目のＩｇ様ドメインのことを特に指し、ＶＥＧＦＲの「Ｉｇ様ドメインＤ２」または「ＥＣＤ２」の両方とも、ＶＥＧＦＲの細胞外領域のＮ末端から２番目のＩｇ様ドメインのことを特に指す、などである。本明細書の態様のいずれかにおいて、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを少なくとも１つ含む。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様のドメインを少なくとも１、２、３、４、５、６個含むが、多くとも７個である。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメインを１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個含む。例えば、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２を含むことができる。別の例において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＲ１のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含むことができる。さらに別の例において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２〜Ｄ３またはＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含むことができる。
各ＶＥＧＦＲの７つのＩｇ様ドメインの任意の組合せを含む細胞外部分が、本明細書で考えられる。したがって一態様において、本発明は、２つまたはそれ以上のＶＥＧＦＲのうち少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含むＶＥＧＦＲの細胞外部分を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＶＥＧＦＲに由来するＩｇ様ドメインを少なくとも１つ含む。例えば、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインの少なくとも１つおよびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインの少なくとも１つを含むＶＥＧＦＲの細胞外部分を含むことができる。別の例において、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３〜Ｄ４を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分を含むことができる。別の例において、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメインＤ３を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分を含むことができる。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、少なくとも２つまたはそれ以上のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個含むが、多くとも２１個である。さらなる態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、少なくとも２つまたはそれ以上のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３もしくは１〜２個含む。ＶＥＧＦＲの細胞外部分の一部として使用できるＩｇ様ドメインのさらなる説明については、そのすべてが参照によってその全体として組み入れられる、米国特許第７，９２８，０７２号、ＷＯ２００６１１３２７７、Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ、Ｔ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９８年、２７３：３２１６〜３２２２頁、Ｈｏｌａｓｈ、Ｊ．ら、ＰＮＡＳ、２００２年、９９（１７）：１１３９３〜１１３９８頁およびＰｅｃｈａｎ、Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００９年、１６：１０〜１６頁を参照のこと。
いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分であることができる。
本明細書に提供されるＶＥＧＦＲの任意の細胞外部分のアミノ酸配列バリアントも考えられる。例えば、ＶＥＧＦＲの細胞外部分の結合親和性および／または他の生物学的特性は、タンパク質をコードしているアミノ酸配列を改変することによって改善することができる。ＶＥＧＦＲの細胞外部分のアミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードしている核酸配列に適当な変更を導入することによってまたはペプチド合成により変更を導入することによって調製することができる。そのような変更には、例えば、ＶＥＧＦＲの細胞外部分のアミノ酸配列における欠失、挿入および／または置換がある。最終的な構造物がＶＥＧＦファミリータンパク質に結合し、ならびに／またはＶＥＧＦ経路の活性化を阻害するなど所望の特徴を保有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組合せにより、ＶＥＧＦＲの細胞外部分の最終的なアミノ酸構造物を作製することができる。したがって、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得るＶＥＧＦＲの細胞外部分のバリアントが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６もしくはＤ７のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ２）のＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６もしくはＤ７のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ３（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ３）のＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６もしくはＤ７のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、配列番号４および５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。
理論に束縛されるものではないが、本明細書においてＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦファミリータンパク質に結合して、ＶＥＧＦＲとの相互作用を遮断することによってＶＥＧＦ経路の活性化を阻害すると考えられる。理論に束縛されるものではないが、本明細書においてＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲに結合して、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を優性に阻害し得るとも考えられる。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＰｌＧＦからなる群から選択されるＶＥＧＦファミリータンパク質を結合する。いくつかの態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３）を結合する。
ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、シグナル配列として機能して宿主細胞からＶＥＧＦＲの細胞外部分を分泌させるシグナルペプチドを含んでもよく、または含まなくてもよい。シグナルペプチドは、対象のタンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲの細胞外部分）をコードしている核酸に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、シグナルペプチドを含まない。
多量体化ドメイン
本発明は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得る多量体化ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域）を提供する。多量体化ドメインは、サブユニットの会合を促進して、例えば二量体、三量体、四量体などを形成する多量体タンパク質の部分である。本明細書では用語「多量体化ドメイン」は、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメインなどを指すために使用することができる。多量体化ドメインを含む融合タンパク質は、多量体化ドメインを含む他の融合タンパク質と相互作用して、融合タンパク質多量体（例えば、融合タンパク質二量体）を産生することができる。例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、本明細書に開示する通りＰＤＧＦＲの細胞外部分またはＶＥＧＦＲの細胞外部分に融合させることができる二量体化ドメインである。ＰＤＧＦＲの細胞外部分およびＩｇＧ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む別の融合タンパク質と二量体化して、少なくともＰＤＧＦに多特異性を持つ融合タンパク質二量体を産生することができる。多量体化ドメインは、別のポリペプチドと多量体を形成する任意のポリペプチドであることができる。使用できる多量体化ドメインは、当業界で公知である。米国特許第７，９２８，０７２号およびＷＯ２００６／１１３２７７を参照のこと。例えば、ＣＨ３ドメイン単独もしくはＣＨ２とＣＨ３ドメインの両方などＩｇＧ１またはＩｇＧ２ラムダ重鎖のＦｃ領域を、多量体化ドメインとして使用することができる。ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥなど免疫グロブリンアイソタイプ由来の他のＦｃ領域も多量体化ドメインとして使用することができる。本明細書では用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。一実施形態において、多量体化ドメインは、抗体のＦｃ領域である。さらなる実施形態において、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域およびＩｇＥ Ｆｃ領域からなる群から選択される。別のさらなる実施形態において、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域およびＩｇＧ４ Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＣＨ３領域を含む。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンをコードしているアミノ酸配列は、当業界で周知である。例えば、ＩｇＧ１ラムダ重鎖アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＡ７５０３２の下に見ることができる。免疫グロブリンのＦｃ領域は、酵素パパインによる切断によってまたは他の手段によって得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ＶＥＧＦ−Ａの多量体化ドメインなどＶＥＧＦの多量体化ドメインも使用することができる。ＶＥＧＦ−Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ００３３７６で示される核酸にコードされる。例えば、ＶＥＧＦ−Ａの多量体化ドメインは、ＶＥＧＦ−Ａエクソン３にコードされており、ＰＤＧＦＲの細胞外部分および／またはＶＥＧＦＲの細胞外部分など本明細書に開示する融合タンパク質成分のいずれかに連結することができる。
いくつかの実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列バリアントが、本明細書に提供される。例えば、多量体化ドメインの生物学的特性（例えば、多量体化特性）を改善することが望ましいことがある。多量体化ドメインのアミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードしている核酸配列に適当な変更を導入することによってまたはペプチド合成により変更を導入することによって調製することができる。そのような変更には、例えば、多量体化ドメインのアミノ酸配列における欠失、挿入および／または置換がある。最終的な構造物が多量体タンパク質の形成など所望の特徴を保有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組合せにより、多量体化の最終的なアミノ酸構造物を作製することができる。したがって、本明細書に開示する任意の融合タンパク質の成分になり得る多量体化ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域）のバリアントが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ３領域のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。多量体化ドメインのバリアントは、当業界で周知である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号第２０１２／０２５１５３１号を参照のこと。
リンカー
融合タンパク質の成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分または多量体化ドメイン）は、ペプチドリンカーなどの連結部分によって連結することができる。好ましくは、リンカーは融合タンパク質成分の柔軟性を高め、融合タンパク質中の各機能成分の構造に著しく干渉しない。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、２〜１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個のアミノ酸を含むが、多くとも１００個である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、長さ５〜７５、５〜５０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０または５〜９個のアミノ酸である。典型的なリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４６）など少なくとも２つのアミノ酸残基を有する直鎖ペプチドを含む。適切な直鎖ペプチドは、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニンならびにアラニルおよび／またはセリニルおよび／またはプロリニルおよび／またはグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ９（配列番号４７）、Ｇｌｕ９（配列番号４８）、Ｓｅｒ９（配列番号４９）、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ（配列番号５０）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５１）、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５２）、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５４）、およびＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
リンカー部分は、ポリエチレングリコールなど他のポリマーから作製することもできる。そのようなリンカーは、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１００または１０〜５０個のエチレングリコールモノマー単位を有することができる。適切なポリマーは、適当な範囲のアミノ酸残基が占有するサイズと同程度のサイズであるべきである。典型的なサイズのポリマーは、約１０〜２５Åの間隔を生じることになる。
リンカー部分は、非直鎖様式で複数の融合タンパク質成分を連結する分枝「腕」を有するタンパク質多価リンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、多価リンカーは、約３〜４０個のアミノ酸残基を有し、そのすべてまたはいくつかは、融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分または多量体化ドメイン）とコンジュゲーションするための結合部位を提供する。αアミノ基およびαカルボン酸は、結合部位として機能することができる。典型的な多価リンカーには、それだけには限定されないが、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリシステイン、ポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸がある。場合により、不活性側鎖、例えば、グリシン、アラニンおよびバリンを持つアミノ酸残基をアミノ酸配列に含めることができる。リンカーは、融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）に一度結合すると投与（例えば、眼投与）に適する化学リンカーなど、非ペプチド化学物質であることもできる。化学リンカーは二官能基リンカーであることができ、それぞれは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）と反応する。別法として、化学リンカーは適切に間隔を置いて配置された多数の反応基を有する分枝状リンカーであることができ、それぞれは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）の官能基と反応することができる。融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）は、反応性官能基を介して結合され、立体障害が反応性官能基（例えば、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒドおよびチオール）のいくつかとペプチドとの共有結合の形成に実質的に干渉しないように、間隔を置いて配置される。リンカー部分の例には、それだけには限定されないが、Ｔａｒｎ、Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６年、１９６：１７〜３２頁に開示されたものがある。
リンカー部分を使用して、本明細書に開示する融合タンパク質の成分のいずれかを連結することができる。例えば、ペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ９（配列番号４７））を使用して、ＰＤＧＦＲの細胞外部分のＣ末端をＶＥＧＦＲの細胞外部分のＮ末端に連結することができ、さらにそれを使用してＶＥＧＲの細胞外部分のＣ末端を多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域）のＮ末端に連結することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＤＧＦＲの細胞外部分と多量体化ドメインの間に使用される。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＶＥＧＦＲの細胞外部分と多量体化ドメインの間に使用される。いくつかの実施形態において、リンカーはＰＤＧＦＲの細胞外部分とＶＥＧＦＲの細胞外部分の間に使用される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＤＧＦＲの細胞外部分とＶＥＧＦＲの細胞外領域の間のリンカーおよびＶＥＧＦＲの細胞外領域と多量体化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域）の間のリンカーを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーを含むが、多くとも４つのリンカーである。例えば、融合タンパク質は、（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分、（ｂ）ＶＥＧＦＲの細胞外部分、（ｃ）多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域）、ならびに少なくとも１つのリンカーをＮ末端からＣ末端へと：（１）リンカー、ａ、リンカー、ｂ、リンカー、ｃ、リンカー；（２）ａ、リンカー、ｂ、リンカー、ｃ、リンカー；（３）リンカー、ａ、リンカー、ｂ、リンカー、ｃ；（４）ａ、リンカー、ｂ、リンカー、ｃ；（５）ａ、リンカー、ｂ、ｃ；および（６）ａ、ｂ、リンカー、ｃからなる群から選択される順序で含むことができる。別の例において、融合タンパク質は、（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分、（ｂ）多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域）、および少なくとも１つのリンカーをＮ末端からＣ末端へと：（１）リンカー、ａ、リンカー、ｂ、リンカー；（２）リンカー、ａ、リンカー、ｂ；（３）ａ、ｂ、リンカー；（４）ａ、リンカー、ｂ；（５）リンカー、ｂ、リンカー、ａ、リンカー；（６）リンカー、ｂ、リンカー、ａ；（７）ｂ、ａ、リンカー；および（８）ｂ、リンカー、ａからなる群から選択される順序で含むことができる。
融合タンパク質
少なくとも２つの異なる結合パートナー（例えば、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ）に対する結合特異性を有する融合タンパク質が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤＧＦファミリー（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄ）のタンパク質に対する第１の結合特異性およびＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰ１ＧＦ）に対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤＧＦファミリーのタンパク質二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣまたはＰＤＧＦ−ＤＤ）に対する第１の結合特異性およびＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰ１ＧＦ）に対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、哺乳動物（例えば、ヒト）のＰＤＧＦに対する第１の結合特異性および哺乳動物（例えば、ヒト）のＶＥＧＦに対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるＰＤＧＦＲのいずれかと同じＰＤＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βのいずれか１つと同じＰＤＧＦ経路の成分に結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β／ＰＤＧＦＲ−βまたはＰＤＧＦＲ−α／ＰＤＧＦＲ−β二量体のいずれか１つと同じＰＤＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるＰＤＧＦＲのいずれかのＰＤＧＦＲの細胞外部分の少なくとも１つを含む。例えば、融合タンパク質は、少なくとも１つのＰＤＧＦＲ−αの細胞外部分および少なくとも１つのＰＤＧＦＲ−βの細胞外部分を含むことができる。別の例において、融合タンパク質は、Ｉｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３およびＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５などＰＤＧＦＲ−βの細胞外部分を２つ含むことができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号７および８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲのいずれかと同じＶＥＧＦ経路の成分に結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３のいずれか１つと同じＶＥＧＦ経路の成分に結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲのいずれかのＶＥＧＦＲの細胞外部分の少なくとも１つを含む。例えば、融合タンパク質は、少なくとも１つのＶＥＧＦＲ１の細胞外部分および少なくとも１つのＶＥＧＦＲ２の細胞外部分を含むことができる。別の例において、融合タンパク質は、Ｉｇ様ドメインＤ２およびＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３などＶＥＧＦＲ１の細胞外部分を２つ含むことができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号４および５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分を含む。ＰＤＧＦＲの細胞外部分およびＶＥＧＦＲの細胞外部分を含む本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかは、多量体化ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および多量体化ドメインを含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦならびにＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ活性の阻害）。ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および多量体化ドメインを含む本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかは、さらにリンカーを含むことができる。リンカーは、本明細書に開示する任意のリンカーであることができる。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｇｌｙ９（配列番号４７）、Ｇｌｕ９（配列番号４８）、Ｓｅｒ９（配列番号４９）、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ（配列番号５０）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５１）、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５２）、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５４）、およびＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、哺乳動物（例えば、ヒト）のＰＤＧＦＲの細胞外部分を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、哺乳動物（例えば、ヒト）のＶＥＧＦＲの細胞外部分を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトＰＤＧＦＲ（例えば、ヒトＰＤＧＦＲ−β）の細胞外部分およびヒトＶＥＧＦＲ（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）の細胞外部分を含む。
一態様において、本発明は：ａ）配列番号１、２、３、７または８のアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分；ｂ）配列番号４または５のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分；およびｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含む多量体化ドメインを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分；ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分；ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含む多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は：ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分；ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分；ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含む多量体化ドメインを含む。
ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および多量体化ドメインを特定の順序で含む融合タンパク質が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へとａ、ｂ、ｃの順序で配列されている（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分、（ｂ）ＶＥＧＦＲの細胞外部分、および（ｃ）Ｆｃ領域を含む。実施形態のいくつかにおいて、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ４を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメインＤ２を含む。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲの細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、融合タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は配列番号１４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
少なくとも２つもしくはそれ以上のＰＤＧＦＲの細胞外部分、２つもしくはそれ以上のＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または２つもしくはそれ以上の多量体化ドメインを含む融合タンパク質も考えられる。例えば、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へとａ、ａ、ｂ、ｃの順序でまたはａ、ｂ、ｂ、ｃの順序で配置されている（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分、（ｂ）ＶＥＧＦＲの細胞外部分、および（ｃ）Ｆｃ領域を含むことができる。各組合せが本明細書に明白に述べられているかのように、少なくとも１つのＰＤＧＦＲの細胞外部分、少なくとも１つのＶＥＧＦＲの細胞外部分および少なくとも１つの多量体化ドメインの任意の組合せが本明細書に提供される。
ＰＤＧＦＲの細胞外部分および多量体化ドメインを含む融合タンパク質も考えられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へとａおよびｂの順序で配置されている（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分および（ｂ）Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へとｂおよびａの順序で配置されている（ａ）ＰＤＧＦＲの細胞外部分および（ｂ）Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ２を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ４を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ−β）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む。各組合せが本明細書に明白に述べられているかのように、少なくとも１つのＰＤＧＦＲの細胞外部分と少なくとも１つの多量体化ドメインの任意の組合せが本明細書に提供される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
本発明に記載される融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメインの修飾形態を含むことができる。例えば、融合タンパク質成分は、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化およびリン酸化を含めた翻訳後修飾を有することができる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントが、本明細書に提供される。例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／もしくは多量体化ドメインの結合親和性ならびに／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメインをコードしているヌクレオチド配列に適当な変更を導入することによってもしくはペプチド合成により導入することによって調製することができる。そのような変更には、例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／もしくは多量体化ドメインのアミノ酸配列における残基の欠失、挿入、ならびに／または置換がある。最終的な構造物が所望の特徴（例えば、ＰＤＧＦに対する結合、ＶＥＧＦに対する結合、ＰＤＧＦ経路の活性化の阻害、多量体形成、および／またはＶＥＧＦ経路の活性化の阻害）を保有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組合せにより、最終的な構造物を作製することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に開示する任意のＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質バリアントは、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質バリアントは、配列番号９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
本明細書に開示するアミノ酸残基置換は、保存的置換も含む。保存的置換は、「保存的置換」の見出しで以下の表１に示される。そのような置換が生物活性に変化をもたらす場合、表１において「典型的置換」と呼ばれる、またはアミノ酸の種類を参照して以下にさらに記載される多くの変化が次いで導入され、産物がスクリーニングされ得る。表１に示すまたはアミノ酸種類を参照して以下に記載されるアミノ酸置換は、本明細書に提供される融合タンパク質またはタンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分、多量体化ドメインなど）のいずれかに導入することができる。
Figure 2016513669
タンパク質もしくはポリペプチドの生物学的特性における実質的な変更は、（ａ）例え
ばシートもしくはヘリカル構造である置換部位におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する効果が著しく異なる置換を選択することによって成し遂げられる。アミノ酸は、共通の側鎖特性により分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（７）大きい疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ。
非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーを別の種類と交換することを伴う。
突然変異生成に好ましい位置にある、融合タンパク質の特定の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４４：１０８１〜１０８５頁のＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓによって記載されるように「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。ここでは、残基または標的残基のグループが、同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなど荷電残基）、中性または負荷電を持つアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、アミノ酸と標的結合相手との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能感受性を実証するアミノ酸の位置は、置換の部位でまたはそれに対して、さらなるもしくは他のバリアントを導入することによって洗練される。したがって、アミノ酸配列の変形を導入する部位が予め定められているとしても、突然変異の性質自体は必ずしも予め定められていない。例えば、所与の部位での突然変異の動作を分析するには、標的コドンもしくは領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異生成を行い、発現した融合ポリペプチドバリアントを所望の活性についてスクリーニングする。
融合タンパク質またはタンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分、多量体化ドメインなど）の適当な構造を維持するのに必要とされない任意のシステイン残基を通常セリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐこともできる。反対に、システイン結合を融合タンパク質またはタンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分、多量体化ドメインなど）に追加して、その安定性を改善することができる。
さらなる実施形態において、本発明のタンパク質またはペプチドは、天然に存在しないもしくは修飾されたアミノ酸を１つまたはそれ以上含むことができる。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上に掲載した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基のことを指し、その残基はポリペプチド鎖内で隣接するアミノ酸残基を共有結合することが可能である。非天然のアミノ酸には、それだけには限定されないが、ホモリジン、ホモアルギニン、ホモ−セリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、ａｌｌｏ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンがある。修飾アミノ酸には、可逆的もしくは不可逆的に化学的にブロックされた、またはＮ末端アミノ基もしくは側鎖基において修飾された天然および非天然のアミノ酸があり、例えば、Ｎ−メチル化ＤならびにＬアミノ酸、別の官能基に化学修飾された側鎖官能基がある。例えば、修飾アミノ酸には、メチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アスパラギン酸の修飾アミノ酸であるアスパラギン酸−（β−メチルエステル）；グリシンの修飾アミノ酸であるＮ−エチルグリシン；またはアラニンカルボキサミドおよびアラニンの修飾アミノ酸がある。さらなる非天然および修飾アミノ酸、ならびにタンパク質およびペプチドにそれらを組み込む方法は、当業界で公知である（例えばＳａｎｄｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１〜９１頁；ＸｉｅおよびＳｃｈｕｌｔｚ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５４８〜５５４頁；ＨｏｄｇｓｏｎおよびＳａｎｄｅｒｓｏｎ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３３：４２２〜４３０頁を参照のこと）。
アミノ酸配列挿入は、長さ１〜１００残基またはそれ以上の残基のアミノ−（「Ｎ」）および／もしくはカルボキシ−（「Ｃ」）末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ融合タンパク質または細胞障害性ポリペプチドに融合した融合タンパク質がある。融合タンパク質分子の他の挿入バリアントには、融合タンパク質のＮまたはＣ末端への、タンパク質多量体形成を可能にするポリペプチドの融合がある。
本発明は、本明細書においてシグナル配列とも称されるシグナルペプチドを提供し、そのシグナルペプチドは本明細書に提供される任意の融合タンパク質の成分であることができる。例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および多量体化ドメインを含む融合タンパク質は、異種性ペプチド、好ましくは、成熟した融合タンパク質のＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のペプチドをさらに含むことができる。好ましく選択された異種性シグナル配列とは、真核性宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然の哺乳動物シグナル配列を認識せず、処理しない原核性宿主細胞の場合、真核性（すなわち、哺乳動物の）シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは耐熱性毒素ＩＩ遺伝子のリーダー配列からなる群から選択される原核性シグナル配列によって置き換えられる。酵母分泌の場合、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイヴェロマイシス−因子リーダーを含める）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルで置換できる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスウイルスｇＤシグナルを利用可能である。シグナルペプチドは、宿主細胞から産生されたかのように融合タンパク質から完全に切断することができ、または部分的に切断することができる。宿主細胞から融合タンパク質の混合集団を産生することができ、融合タンパク質は、完全に切断されたシグナル配列（例えば、シグナル配列がない）、部分的に切断されたシグナル配列（例えば、シグナル配列の部分）および／または切断されていないシグナル配列（例えば、完全なシグナル配列）を含む。例えば、Ｎ末端でシグナルペプチドをさらに含む融合タンパク質を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基のいずれか１つによってＮ末端で切断することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の融合タンパク質は、細胞からのタンパク質分泌のためのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の融合タンパク質は、細胞からのタンパク質分泌のためのシグナルペプチドを含まない。
本発明は、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質であって、各融合タンパク質は本明細書に開示する任意の融合タンパク質を含む、前記二量体融合タンパク質を提供する。一実施形態において、二量体融合タンパク質は、同一の融合タンパク質を２つ含む。別の実施形態において、二量体融合タンパク質は、異なる融合タンパク質を２つ含む。本明細書に開示する融合タンパク質は、２つまたはそれ以上の融合タンパク質の多量体を形成することができる。多量体（例えば、二量体、三量体、四量体など）は、同一の融合タンパク質から形成する（例えば、ホモ多量体）または異種性融合タンパク質から形成する（例えば、ヘテロ多量体）ことができる。別の実施形態において、多量体融合タンパク質は、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。別の実施形態において、多量体融合タンパク質は、配列番号９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードしている核酸を含む宿主細胞からタンパク質融合多量体として回収される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はグリコシル化される。例えば、融合タンパク質は、宿主細胞からの放出後にＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメインでグリコシル化されてもよい。
本発明の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も本明細書に提供される。医薬組成物は、例えば全身性または局所性投与を含めた本明細書に記載される様々な投与の方法に適していることができる。医薬組成物は、点眼薬、注射可能な溶液の形態、または吸入（口または鼻のいずれかによる）もしくは経口投与に適した形態であることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物は、ヒトへの投与に適している。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物は、硝子体内注射または眼への局所適用に適している。そのような薬学的に許容できる担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱油などのような石油、動物、植物、または合成起源の液体を含む水および油など滅菌した液体であり得る。食塩水および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびにグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液用の液状担体として利用することができる。医薬組成物は、例えば防腐剤、緩衝剤、等張化剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、増粘剤などの追加成分をさらに含むことができる。本明細書に記載される医薬組成物は、単回単位剤形または複数回剤形に包装することができる。組成物は通常、無菌の実質的に等張の溶液として処方される。組成物は、眼房水および眼組織と親和性がある浸透価を有するように処方することもできる。そのような浸透価は通常、水１キログラムにつき約２００〜約４００ミリオスモル（「ｍＯｓｍ／ｋｇ」）になるが、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／ｋｇになる。網膜は、約２８３ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透価を有すると考えられている。
ＩＶ．核酸、ベクター、および宿主細胞
核酸
ＰＤＧＦＲの細胞外部分およびＶＥＧＦＲの細胞外部分、および多量体化ドメインなど本明細書に開示する融合タンパク質成分のいずれかをコードしている単離された核酸が、本明細書に提供される。哺乳動物のＰＤＧＦＲをコードしている核酸は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−β両方の受容体型について記載されている。典型的な核酸配列は、それだけには限定されないが、Ｙａｒｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２３：２２６〜２３２頁；Ｍａｔｓｕｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４３：８００〜８０３頁；米国特許出願番号第０７／３０９，３３２号の継続出願であり現在は放棄されている米国特許出願番号第０７／７７１，８２９号、米国特許第５，６８６，５７２号およびＷＯ２００６／１１３２７７に見ることができる。ヒトＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βをコードしているｍＲＮＡは、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ_００６２０６．４およびＮＭ_００２６０９．３に見ることができる。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分をコードする。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲの細胞外部分をコードしている単離された核酸は、配列番号１６および１７からなる群から選択される。ＶＥＧＦＲの細胞外部分をコードしている単離された核酸も、本明細書に提供される。哺乳動物のＶＥＧＦＲをコードしている核酸は、すべての受容体型について記載されている。典型的な核酸配列は、それだけには限定されないが、米国特許第７，９２８，０７２号およびＷＯ２００６／１１３２７７に見ることができる。ヒトＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２をコードしているｍＲＮＡは、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ_００１１５９９２０．１およびＮＭ_００２２５３．２に見ることができる。ヒトＶＥＧＦＲ３をコードしているｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ_００２０２０．７およびＮＭ_１８２９２５．４に見ることができる。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号４および５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号４および５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲの細胞外部分をコードする。多量体化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域）をコードしている単離された核酸も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含む多量体化ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む多量体化ドメインをコードする。
本明細書に開示する融合タンパク質をコードしている単離された核酸も提供される。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードしている単離された核酸は、配列番号２１〜２４からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードしている単離された核酸は、配列番号１８〜２０からなる群から選択される核酸配列を含む。
融合タンパク質または融合タンパク質の成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分または多量体化ドメイン）をコードしている単離された核酸配列は、リンカーをコードしている核酸配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸は、Ｇｌｙ９（配列番号４７）、Ｇｌｕ９（配列番号４８）、Ｓｅｒ９（配列番号４９）、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ（配列番号５０）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５１）、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５２）、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５４）、およびＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５５）からなる群から選択されるリンカーをコードする。
単離された核酸は、シグナル配列として機能して宿主細胞から融合タンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードしている配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、シグナルペプチドをコードしている配列を含まない。
融合タンパク質もしくは融合タンパク質の成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分または多量体化ドメイン）をコードしている単離された核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは他の任意の形態などのＲＮＡ形態、もしくはクローニングによって得られるもしくは合成的に産生されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むがこれに限定されないＤＮＡ形態、またはその任意の組合せであることができる。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖、またはその任意の組合せであることができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、コード鎖、別名センス鎖であることができ、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であることができる。単離された核酸は、当業者に公知の様々なクローニング方法を使用して生物学的供給源から得ることができる。単離された核酸は、公知の方法による直接化学合成によって調製することもできる。融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分または多量体化ドメイン）をコードしている核酸は、天然源からの単離または以前に調製されたバリアントもしくは融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分の非バリアント版のオリゴヌクレオチド媒介突然変異生成、部位特異的変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、およびカセット式変異生成による調製を含むがこれに限定されない当業界で公知の様々な方法によって調製することができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２年）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３年）を参照のこと。
ベクター
本発明は、細胞に融合タンパク質または融合タンパク質成分をコードしている１つもしくはそれ以上の核酸配列を導入して、前記タンパク質を発現させる核酸送達媒体の使用を考える。核酸送達媒体の例には、リポソーム、天然高分子および合成高分子を含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに様々な真核性および原核性宿主における発現について記載されている当業者に一般に使用される他の組換え媒体がある。いくつかの実施形態において、核酸送達媒体は、プラスミドなどの発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来通りの機能を確立するための任意のエレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサー、選択マーカーおよび複製起点を含むことができる。プロモーターは、構成的な、誘導可能なまたは抑制可能なプロモーターであることができる。典型的なプロモーターには、それだけには限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／チキンβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１年、１０８（２）：１９３〜９頁）ならびに伸長因子１−αプロモーター（ＥＦｌ−αプロモーター）（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０年、９１（２）：２１７〜２３頁およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６年、３（９）：８０２〜１０頁）がある。細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞）に核酸を送達することができるいくつかの発現ベクターが当業界で公知であり、本明細書においてそれを使用して、細胞中で融合タンパク質または融合タンパク質成分を産生することができる。例えば、融合タンパク質をコードしている核酸を含むように操作したｐＢＲ３２２（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、５３：１５４頁）などのプラスミドで形質転換した場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して融合タンパク質を産生することができる。発現された融合タンパク質または融合タンパク質成分は、当業界で公知の従来技術にしたがっておよび本明細書に記載の通り細胞から捕集し、精製することができる。
宿主細胞
本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）をコードしている核酸は、当業界で公知の任意の手段によって標的細胞に与えることができる。いくつかの実施形態において、対象のタンパク質（例えば、融合タンパク質）をコードしている核酸はウイルスベクター中にあり、ベクターはパッケージングされ、次いでビリオンを使用して細胞を感染させることができる。いくつかの実施形態において、対象のタンパク質（例えば、融合タンパク質）をコードしている核酸は、プラスミドなどの発現ベクター中にある。特定の細胞に適しているトランスフェクションまたは形質転換手順を使用して、標的細胞に対象のタンパク質（例えば、融合タンパク質）をコードしている核酸を導入することができる。ポリマー、リポソームまたはナノスフェアを利用している製剤を使用して、対象のタンパク質（例えば、融合タンパク質）をコードしている核酸を送達することができる。本発明による組換え構築物で形質転換またはトランスフェクトすることができる細胞は、当業者に都合の良い任意の細胞であってよい。使用できる典型的な細胞型には、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞がある。使用できる典型的な哺乳動物細胞には、それだけには限定されないが、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、幹細胞、造血細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞およびケラチン生成細胞がある。使用することができるさらに典型的な哺乳動物細胞株には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２０細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞およびＭＤＣＫ細胞がある。これらの細胞を使用して、対象のタンパク質を産生し、捕集することができる。いくつかの実施形態において、形質転換またはトランスフェクトした細胞を、細胞または哺乳動物宿主に与えることができる。細胞もしくは哺乳動物宿主に送達するのに適した細胞には、任意の器官、腫瘍または細胞株由来の任意の哺乳動物細胞型がある。例えば、ヒト、マウス、ヤギ、羊、ウシ、イヌ、ネコおよびブタ細胞を使用することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
用語「宿主細胞」は、本発明のベクターのレシピエントであった細胞、またはそれになることができる細胞およびその後代を含む。天然の、偶然のまたは計画的な突然変異により、後代は、（形態においてまたは全ＤＮＡ相補部のゲノムにおいて）元の親細胞と必ずしも完全に同一ではない。宿主細胞は、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
Ｖ．融合タンパク質および融合タンパク質成分を産生する方法
本明細書に開示する本発明の融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）を産生する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、本明細書に開示する融合タンパク質のいずれかをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程と、該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収する工程とを含む、本明細書に開示する任意の融合タンパク質を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードしている核酸は、配列番号１８〜２４からなる群から選択される。
（１）宿主細胞の培養
本発明の融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）を産生するのに使用される細胞は、当業界で公知の、選択した宿主細胞の培養に適した培地中で培養される。適切な培地の例には、Ｈａｍ’ｓ ＦｌＯ（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、およびルリア培地（ＬＢ）がある。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれかを細胞の培地として使用することができる。所与の培地は通常、必要に応じてホルモンおよび／もしくは他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子など）、ＤＨＦＲ、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源で補充される。他の任意の必要な補助剤も、当業者に公知である適切な濃度で含まれてよい。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかになる。大腸菌増殖の場合、例えば、選択温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５〜約９の任意のｐＨであることができる。大腸菌の場合、ｐＨは好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。誘導可能なプロモーターが発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。例えば、ＰｈｏＡプロモーターを使用して転写を制御する場合、形質転換された宿主細胞をリン酸制限培地中で培養して誘導することができる。当業界で公知のように、利用されるベクター構築物にしたがって、他の様々な誘導物質を使用することができる。
（２）融合タンパク質または融合タンパク質成分の精製
組換え技術を使用する場合、本明細書に記載される融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）は、細胞膜周辺腔内で細胞内に産生される、または培地中に直接分泌され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１の工程として、タンパク質回収は、通常浸透圧ショック、超音波処理または溶解などの手段により細胞を破壊する工程を一般に含む。一旦細胞が破壊されたら、宿主細胞または溶解した断片のいずれかに由来する粒状の細片は、例えば遠心分離もしくは限外濾過によって除去される。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現システムからの上清は通常、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濾過され、濃縮される。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述の工程のいずれかで含めることができ、偶然の汚染菌の増殖を予防するために抗生物質を含めることができる。
そのような細胞から調製される融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）の組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。いくつかの実施形態において、プロテインＡまたはプロテインＧが、アフィニティークロマトグラフィーに使用する親和性リガンドとして使用される。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、融合タンパク質中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプによって決まる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３頁（１９８３））。いくつかの実施形態において、プロテインＡを親和性リガンドとして使用して、本明細書に記載される融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）を単離し、精製する。いくつかの実施形態において、プロテインＧを親和性リガンドとして使用して、本明細書に記載される融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）を単離し、精製する。親和性リガンドが結合している基材はほとんどの場合アガロースであるが、他の基材が利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなど機械的に安定な基材により、アガロースで達成できるより速い流速および短い処理時間が可能になる。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、二酸化ケイ素、ヘパリン、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、または陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、ならびに等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安沈殿などタンパク質精製のための他の技術も、回収予定の融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）に応じて利用可能である。いくつかの実施形態において、回収される融合タンパク質は、実質的に純粋である。さらなる実施形態において、回収される融合タンパク質は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純度のいずれかである。任意の予備精製工程（単数）または工程（複数）の後に、対象の融合タンパク質または融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）および汚染物質を含む混合物は、ｐＨ約２．５〜４．５で溶出緩衝液を使用する低ｐＨ疎水的相互作用クロマトグラフィーに供することができ、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で実施できる。
一般に、研究、試験、および臨床応用に使用する融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分（例えば、ＰＤＧＦＲの細胞外部分、ＶＥＧＦＲの細胞外部分および／または多量体化ドメイン）を調製する様々な方法は、当業界で確立されており、上記の方法と一致しており、ならびに／または当業者によって対象とする特定の融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分に対して適切であると考えられている。
（３）融合タンパク質または融合タンパク質成分の生物活性
タンパク質は、免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；二酸化ケイ素もしくはＤＥＡＥなど陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えば、セファデックスＧ−７５を使用するゲル濾過；疎水性親和性樹脂、基材に固定された適切な結合パートナーを使用するリガンド親和性、遠心分離、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ、ウェスタンブロットアッセイ、アミノ酸および核酸配列決定ならびに生物活性など一般に公知の方法を使用して精製し、同定することができる。
本明細書に開示する融合タンパク質または融合タンパク質成分は、標的結合パートナー（例えば、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦファミリータンパク質）に対する親和性、競合的結合（例えば、ＰＤＧＦＲまたはＶＥＧＦＲに対する標的結合パートナーの遮断）、阻害活性（例えば、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ経路活性化の阻害）、細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、および血管形成（例えば、脈絡膜血管新生）の阻害を含むがこれに限定されない生物活性を特徴付けまたは評価することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する融合タンパク質または融合タンパク質成分は、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで生物活性を評価することができる。本明細書に記載されるアッセイのいずれかにおいて、アッセイは、４℃、２０〜２８℃（例えば、２５℃）、または３７℃の温度で実施される。
本明細書に開示する融合タンパク質もしくは融合タンパク質成分は、ＰＤＧＦファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄ）、ＰＤＧＦファミリータンパク質の二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣまたはＰＤＧＦ−ＤＤ）またはＶＥＧＦファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰｌＧＦ）などの結合パートナーに対する親和性について評価することができる。結合親和性を評価する多くの方法が、当業界で公知であり、それを使用して、結合パートナーに対する融合タンパク質または融合タンパク質成分の結合親和性を同定することができる。結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）値または最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値として表示することができる。結合親和性（例えば、Ｋｄ値）を決定する技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびＢＩＡｃｏｒｅなど当業界で周知である。そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＮＹ（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（２００９）；Ａｌｔｓｃｈｕｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３１：６２９８頁（１９９２）；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって開示されているＢＩＡｃｏｒｅ法を参照のこと。例えば、結合パートナーに対する融合タンパク質の結合親和性は、ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する融合タンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイされる。この典型的なアッセイにおいて、分泌された融合タンパク質を段階希釈して、最終濃度２０ｐＭでヒトＰＤＧＦ ＢＢリガンドと混合し、オービタルシェーカー台上で、室温で終夜インキュベートした。インキュベーション後に、結合していないＰＤＧＦ−ＢＢの量を、ヒトＰＤＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ ＤｕｏＳｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＤＹ２２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定する。結合親和性の統計的有意性を、Ｐｒｉｓｍ ５．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析し、二元配置分散分析検定を使用して算出し、続いてボンフェローニ補正する。さらなる例において、ＶＥＧＦファミリータンパク質に対する融合タンパク質の結合が、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイされる。典型的なアッセイにおいて、分泌された融合タンパク質を段階希釈して、最終濃度２０ｐＭでヒトＶＥＧＦと混合し、オービタルシェーカー台上で、室温で終夜インキュベートする。次いで結合していないＶＥＧＦの量を、ヒトＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定する。
本明細書の実施形態のいずれかにおいて、融合タンパク質は、活性の阻害（例えば、ＰＤＧＦ活性および／またはＶＥＧＦ活性の阻害）について≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）のＥＣ５０を有する。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、融合タンパク質は、結合パートナー（例えば、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦ）に対して約１．０ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭまたは３ｐＭのいずれかより低い、それを含む、これらの数の間の任意の値を含むＫｄを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質バリアントは、本明細書に記載される野生型融合タンパク質の結合と比較してより高い親和性で結合パートナーに結合する。いくつかの態様において、融合タンパク質バリアントは、配列番号９〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質による結合パートナーの結合と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００倍の少なくともいずれか、それを含む、これらの数の間の任意の値を含む、より高倍の親和性で結合パートナーに結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する融合タンパク質は、細胞増殖の減少など、抗増殖性活性について評価することができる。融合タンパク質の抗増殖特性を評価するための多くの方法が、当業界で公知である。１つの典型的なアッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して、本明細書に記載される融合タンパク質によるＶＥＧＦ依存的および／またはＰＤＧＦ依存的細胞増殖の阻害を実証することができる。このアッセイにおいて、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦの存在下で融合タンパク質がＨＵＶＥＣに加えられ、細胞増殖が測定される。例えば、ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ−Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｉｎｃ）を、５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２，０００個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、終夜静置する。インキュベーション後に、培地を、等容（５μｌ）の捕集した細胞培養、および最終濃度１０ｎｇ／ｍｌの組換えｈＶＥＧＦ−１６５リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９３−ＶＥ）を単独で含有する、または１ウェル当たり１００μｌの最終容量中に最終濃度２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２０−ＢＢ）と組み合わせて含有する、５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換する。細胞を、５％ＣＯ２下に３７℃で３〜４日間インキュベートする。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８０）を２０μｌ／ウェルで添加し、４時間後に４９０ｎｍで吸光度を取得して、融合タンパク質による細胞増殖の阻害を決定する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の抗血管新生特性は、当業界で周知の技術を使用して測定される。典型的なアッセイにおいて、滲出型加齢黄斑変性の動物モデルを使用して、融合タンパク質による眼内の血管新生阻害をアッセイする。このアッセイにおいて、正常な成体マウスの眼は、試験０日目に左目（ＯＳ）への融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶ粒子の単回硝子体内注射により治療され、一方で右目（ＯＤ）は治療に対して未処理のままにする。試験２８日目に、レーザを使用して両眼にＣＮＶを誘導する（例えば、眼１つ当たり３カ所の熱傷が作られる。出力２００ｍＷ、スポット５０μｍ、１００ｍｓ）。試験４２日目に、マウスをＦＩＴＣ−デキストランで灌流し、安楽死させる。眼を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、その後に脈絡膜フラットマウント（choroidal flatmounts）を調製して、血管新生の範囲を調べる。治療した（ＯＳ）眼におけるＣＮＶのない熱傷の数を反対側（ＯＤ）の眼と比較して、融合タンパク質の有効性を決定する。実施例５を参照のこと。
ＶＩ．ウイルス粒子およびウイルス粒子を産生する方法
本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている核酸を含むウイルス粒子も本明細書に提供される。ウイルスベクターを使用して、融合タンパク質または融合タンパク質成分をコードしている核酸を送達し、それにより特定の標的組織（例えば、患部組織）内の標的細胞中でタンパク質を発現させることができる。多くの種のウイルスが公知であり、その多くが標的細胞に核酸を送達する目的で調べられた。細胞に送達するために、外来の核酸を、アデノウイルス、部分欠失アデノウイルス、全欠失アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルスなどのようなベクターに挿入することができる。いくつかの実施形態において、細胞は個体であり、ウイルスは静脈内、筋肉内、門脈内または他の投与経路によって送達される。最も一般的に使用されるウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレンチウイルスを含めたレトロウイルスから得られるものがある。典型的なウイルスベクターについては、どちらも参照によってその全体として本明細書に組み入れられる米国特許第７，９２８，０７２号およびＷＯ２００６／１１３２７７を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、１つもしくは２つのＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸および１つまたは２つのＩＴＲを両端に有する本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている配列を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子内にキャプシド化されている。ＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。いくつかの実施形態において、核酸は、転写の方向に作動的に連結された成分、すなわち転写開始および終了配列を含めた制御配列、ならびに対象のタンパク質コード配列（例えば、融合タンパク質をコードしている核酸）を含む。これらの成分は、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列を５’および３’末端に有する。「機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングの目的通りＩＴＲ配列が機能することを意味する。そのすべてが参照によってその全体として本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００年、９７（７）３４２８〜３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３年、７７（１２）：７０３４〜４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９年、１６：１０〜１６頁を参照のこと。本発明のいくつかの態様を実行する場合、組換えベクターは、キャプシド形成およびｒＡＡＶによる感染のための物理的な構造に必須のＡＡＶの配列の少なくともすべてを含む。本発明のベクターに使用するＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を持つ必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４年、５：７９３〜８０１頁に記載の通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって改変されてもよくまたはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかから得られてもよい。４０個以上のＡＡＶの血清型が現在公知であり、新たな血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２年、９９（１８）：１１８５４〜６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００（１０）：６０８１〜６頁、およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３年、７７（１２）：６７９９〜８１０頁を参照のこと。任意のＡＡＶ血清型の使用は、本発明の範囲内と考えられる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、それだけには限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２を含むＡＡＶ血清型から得られるベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１２〜１５からなる群から選択される融合タンパク質をコードしている核酸は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを両端に有する。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号２１〜２４からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２のキャプシドタンパク質を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４年、７８（１２）：６３８１頁）。
異なるＡＡＶ血清型を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、患部組織）内の特定の細胞型を標的する。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合した血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができ、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲを含むことができる。別の例において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができる。さらに別の例において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ１とＡＡＶ２両方に由来するキャプシドタンパク質を含むことができ、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含むことができる。各組合せが本明細書に明白に述べられているかのように、ｒＡＡＶ粒子の産生に対するＡＡＶ血清型の任意の組合せが本明細書に提供される。
いくつかの態様において、本発明は組換え自己相補ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補ゲノムを持つＡＡＶウイルス粒子および自己相補ＡＡＶゲノムの使用方法は、そのそれぞれが参照によってその全体として本明細書に組み入れられる、米国特許第６、５９６、５３５号；第７，１２５，７１７号；第７，７６５，５８３号；第７，７８５，８８８号；第７，７９０，１５４号；第７，８４６，７２９号；第８，０９３，０５４号；および第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１頁に記載されている。自己相補ゲノムを含むｒＡＡＶは、部分的に相補している配列（例えば、導入遺伝子の相補しているコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を速やかに形成することになる。いくつかの実施形態において、本発明はＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供し、ｒＡＡＶゲノムは、第１の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、融合タンパク質コード鎖）および第２の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、融合タンパク質非コードまたはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種性ポリヌクレオチド配列は、そのほとんどまたは全長に沿って第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の異種性ポリヌクレオチド配列および第２の異種性ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対形成を促進する配列；例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連結される。ヘアピン構造は、当業界で公知であり、例えばｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、第１の異種性ポリヌクレオチド配列および第２の異種性ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴ
ＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号４１）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分離配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製する際に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲでウイルスゲノムを切断しなくなり、したがって、５’から３’の順序で以下を含む組換えウイルスゲノムは、ウイルスキャプシド中にパッケージングされることになる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種性ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種性ポリヌクレオチドに対して逆方向の第２の異種性ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶ ＩＴＲ。いくつかの実施形態において、本発明は、機能性ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む組換えウイルスゲノム、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチド配列、Ｄ領域の欠失を含み、機能的な末端分離配列を欠いている突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、第１のポリヌクレオチド配列の融合タンパク質をコードしている配列に対する相補配列を含む第２のポリヌクレオチド配列および機能性ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。
ｒＡＡＶ粒子は、当業界で公知の方法を使用して産生することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号、第６，９９５，００６号を参照のこと。本発明を実行する際に、ｒＡＡＶ粒子を産生するための宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物および酵母がある。宿主細胞は、宿主細胞中でＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が安定して維持されるパッケージング細胞またはＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されるプロデューサー細胞であることもできる。典型的なパッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞から得られる。ＡＡＶベクターは、当業界で公知の標準的な技術を使用して精製され、処方される。
いくつかの態様において、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であり、該ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれがＡＡＶ複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを両端に有する、本明細書に開示する任意の融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能を含む、工程と；（ｂ）該宿主細胞によって産生される該ｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む、本明細書に開示する任意のｒＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号１２〜１５からなる群から選択される融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８ＲおよびＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記キャプシド形成タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２キャプシドタンパク質などからなる群から選択される。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９キャプシドならびにＡＡＶ２ ＩＴＲ、変異体ＡＡＶ２ ＩＴＲおよび融合タンパク質をコードしている導入遺伝子を含む組換え自己相補ゲノムを含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は精製される。本明細書では用語「精製された」は、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するまたはそれが最初に調製される場所に存在する可能性もある少なくともいくつかの他の成分が全くないｒＡＡＶ粒子の標本を含む。したがって、単離されたｒＡＡＶ粒子は、例えば、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物から濃縮するための精製技術を使用して調製することができる。濃縮は、例えば溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合によって、もしくは感染力によってなど様々な方法で測定することができ、またはヘルパーウイルス、培地成分などを含めた産生培養汚染物質もしくは過程中の汚染物質を含む汚染物質など、供給源混合物中に存在する第２の潜在的干渉物質に関して測定することができる。
本発明の融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も本明細書に提供される。医薬組成物は、例えば全身性または局所性投与を含めた本明細書に記載される様々な投与の方法に適していることができる。本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの医薬組成物は、例えば、静脈注射によって、カテーテルによって、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと、または定位注射、Ｃｈｅｎら、１９９４年、ＰＮＡＳ、９１：３０５４〜３０５７頁によって全身的に導入することができる。医薬組成物は、点眼薬、注射可能な溶液の形態、または吸入もしくは経口投与に適した形態であることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｒＡＡＶおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物は、ヒトへの投与に適している。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｒＡＡＶおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物は、硝子体内注射または眼への局所適用に適している。そのような薬学的に許容できる担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱油などのような石油、動物、植物、または合成起源の液体を含む水および油など滅菌した液体であり得る。食塩水および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびにグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液用の液状担体として利用することができる。医薬組成物は、例えば防腐剤、緩衝剤、等張化剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、増粘剤など追加成分をさらに含むことができる。本明細書に記載される医薬組成物は、単回単位剤形または複数回剤形に包装することができる。組成物は通常、無菌の実質的に等張の溶液として処方される。組成物は、眼房水および眼組織と親和性がある浸透価を有するように処方することもできる。そのような浸透価は通常、約２００〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇになるが、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／ｋｇになる。発現ベクターまたはウイルスベクターを貯蔵および／もしくは送達するのに有用な眼科用液剤は、例えば、ＷＯ０３０７７７９６Ａ２に開示されている。
ＶＩＩ．融合タンパク質およびウイルス粒子を使用する治療の方法
本発明の方法は、本明細書に開示する任意の融合タンパク質を使用する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＤＧＦタンパク質またはＶＥＧＦタンパク質を結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＤＧＦＲタンパク質およびＶＥＧＦＲタンパク質を結合する。本明細書に記載される融合タンパク質は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を有することができる：（ａ）ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−ＤなどＰＤＧＦファミリーの１つもしくはそれ以上のタンパク質を結合する；（ｂ）ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰＩＧＦなどＶＥＧＦファミリーの１つもしくはそれ以上のタンパク質を結合する；（ｃ）ＰＤＧＦ受容体へのＰＤＧＦファミリータンパク質の結合を遮断する；（ｄ）ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦファミリータンパク質の結合を遮断する；（ｅ）ＰＤＧＦシグナル伝達経路および／またはＶＥＧＦシグナル伝達経路の活性化を阻害する；（ｆ）眼疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは癌などの疾患を治療および／または予防する。融合タンパク質の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる。
本発明は、個体に本明細書に記載される任意の融合タンパク質の有効量を投与することにより疾患（眼疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患または癌など）を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患を治療する方法は、個体に融合タンパク質を含む組成物の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、疾患を治療する方法は、個体に融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの有効量を投与する工程を含む。個体に本明細書に記載される任意の融合タンパク質の有効量を投与することにより疾患（眼疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患または癌など）の１つもしくはそれ以上の状況もしくは症状を治療または予防する方法も提供される。いくつかの実施形態において、疾患の１つもしくはそれ以上の状況もしくは症状を治療または予防する方法は、個体に融合タンパク質を含む組成物の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、疾患の１つもしくはそれ以上の状況もしくは症状を治療または予防する方法は、個体に融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの有効量を投与する工程を含む。
本明細書に記載される方法を使用して、炎症性疾患、眼疾患、自己免疫疾患または癌を含むがこれに限定されない様々な疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、治療される疾患には、関節リウマチ、炎症性関節炎、骨関節炎、癌、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（滲出型ＡＭＤまたは萎縮型ＡＭＤなど）、血管新生によって特徴づけられる眼疾患（脈絡膜血管新生など）、ブドウ膜炎（前ブドウ膜炎または後ブドウ膜炎など）、網膜色素変性症および糖尿病性網膜症があるが、これに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、自己免疫疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスである。関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の炎症をもたらす慢性自己免疫疾患である。ＲＡは主に滑膜関節に影響を及ぼすが、周囲の組織および器官に影響を及ぼすことがある。ＲＡの病理は、軟骨の破壊および関節の強直（癒合）をもたらし得る炎症過程を含む。ＲＡの他の病理学的徴候は、脈管炎（血管の炎症）を含み、ほぼすべての器官系に影響を及ぼす可能性があり、多発神経障害、皮膚潰瘍および内臓梗塞を含むさらなる合併症を引き起こし得る。胸膜と肺の徴候には、胸膜炎、間質性線維症、カプラン症候群、胸膜と肺の小結節、間質性肺炎、リウマチ様肺疾患および動脈炎がある。他の徴候には、伸側面など様々な関節周囲構造、ならびに肋膜および髄膜における炎症性リウマチ結節の発症がある。骨格筋の衰弱および萎縮が良く見られる。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、炎症性疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、炎症性疾患は、炎症性関節炎、骨関節炎、乾癬、慢性炎症、過敏性腸疾患、肺の炎症または喘息である。炎症性関節炎とは、例えば、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、混合型結合組織病、乾癬性関節炎、反応性関節炎、硬皮症、シェーグレン症候群、スティル病および全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患に起因し得る関節の炎症のことを指す。炎症性関節炎は、特定の型の細菌（反応性関節炎など）にまたは関節における結晶構造の析出物（痛風および偽性痛風など）に起因することもあり得る。炎症性関節炎の特徴的な症状は、１つまたはそれ以上の関節の痛みおよび腫脹であり、その関節は他の関節より暖かくなり得る。長時間にわたる無活動後（例えば、朝または長時間の着席の後）の関節のこわばりは、非常に一般的な症状である。炎症性関節炎の患者は、通常複数の関節病訴を有する。骨関節炎、別名変形性関節症または変形性関節疾患は、関節軟骨および軟骨下骨を含めた関節の分解を含む一群の機械的異常である。症状には、関節痛、圧痛、こわばり、固定および時々滲出（すなわち、関節内液体の存在の増加）があり得る。例えば、遺伝的、発育的、代謝的、肥満関連、および機械的な様々な原因により、過程が開始され、軟骨が喪失し得る。軟骨由来分解産物が滑液スペースに放出されると、関節を覆っている細胞は、それらを除去しようとする。新生骨副産物または「棘」が生ずることがある。しばしば、骨が軟骨によって十分に保護されなくなる場合、骨は露出し、損傷を受ける可能性がある。これらの骨変化は、関節の炎症と合わせて痛みを引き起こす。痛みに伴って運動が低下する結果、局所筋肉は萎縮する可能性があり、靭帯はより弛緩していく可能性がある。
持続的で無秩序な血管形成が、癌など多数の病状において起こる。癌において、細胞は分裂し、制御されずに増殖して、悪性腫瘍を形成し、その腫瘍は血管新生し、身体の近くの部分に浸潤する。癌は、リンパ系または血流を経由して身体のより離れた部分に拡散（転移）することもできる。癌の原因は、環境性（化学物質、放射線への曝露によるまたは生活様式による）、遺伝性、または感染性であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、癌を治療することができる。いくつかの実施形態において、癌は、前立腺ガン、乳癌、肺癌、食道ガン、大腸癌、直腸ガン、肝癌、尿路癌（例えば、膀胱癌）、腎癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、膵癌、胃癌、甲状腺ガン、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパもしくは骨髄系の造血性癌、頭頸部癌、上咽頭癌（ＮＰＣ）、グリア芽細胞腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腺癌、線維肉腫もしくは横紋筋肉腫など間葉性起源の癌、軟部組織肉腫および癌、絨毛膜癌腫、肝芽腫、カポジ肉腫またはウィルムス腫瘍である。
血管形成と関連する他の疾患は、本明細書に開示する方法および組成物で治療することができる。これらの疾患には、アテローム性動脈硬化症、水晶体後繊維増殖、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、ネフローゼ症候群、妊娠高血圧腎症、腹水症、心膜滲出液（心膜炎と関連付けられるなど）および胸水がある。
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、眼疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、眼疾患は、滲出型ＡＭＤまたは萎縮型ＡＭＤなどのＡＭＤ、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症および局所炎症過程に関連する他の眼病である。いくつかの実施形態において、眼疾患は、脈絡膜血管新生など血管新生によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、眼疾患は角膜移植の結果である。いくつかの実施形態において、本発明は、眼ドルーゼンの形成、眼もしくは眼組織の炎症および失明を含むがこれに限定されない眼疾患の１つもしくはそれ以上の状況もしくは症状を治療または予防する方法を提供する。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ブドウ膜炎、すなわち、強膜の下にある眼の中間層であるブドウ膜の炎症を検出ならびに／または治療することができる。ブドウ膜炎は、米国における失明のおよそ１０％〜２０％の原因であると推定される。ブドウ膜は、前部から後部に、虹彩、毛様体および脈絡膜と伝統的に３つの部位に分けられる。ブドウ膜の主要な機能は、栄養およびガス交換、光吸収ならびに毛様体突起による眼房水の分泌である。ブドウ膜炎は、毒素、感染および／または自己免疫不全への曝露と一般に関連している。しかしながら、多くの場合、原因は不明である。ブドウ膜炎は、片眼または両眼に影響を及ぼし得る。症状は急速に発症することがあり、かすみ目、視野内の灰色点の浮遊、眼痛、眼の赤みおよび光過敏を含むことがある。ブドウ膜炎の最も一般的な型は、前ブドウ膜炎または虹彩の炎症を伴う虹彩炎である。扁平部炎とは、眼の中間、すなわち、虹彩と脈絡膜の間のブドウ膜の炎症のことを指す。後部ブドウ膜炎は、眼の後部、すなわち、脈絡膜に影響を及ぼす。後部ブドウ膜炎に関連する炎症は、網膜（網膜炎）または眼の後部の血管（脈管炎）にも影響を及ぼし得る。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、網膜色素変性症（ＲＰ）を治療することができる。ＲＰは、光受容器（杆体および錐体）または網膜の網膜色素上皮の異常に起因する遺伝性の眼病である。疾患は、進行性視力低下およびしばしば失明に至ることがある。ＲＰの症状には、夜間または弱光における視力低下、側（周辺）視力の消失および、進行例では、中心視力の消失がある。ＲＰの診断は、視野試験および網膜電図検査法による光受容細胞機能の進行性消失の証拠を利用する。少なくとも３５個の遺伝子座が、「無症候性網膜色素変性症」（すなわち、別の疾患またはより広い症候群の一部の結果ではないＲＰ）を引き起こすことが公知である。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、糖尿病性網膜症を治療することができる。糖尿病性網膜症とは、糖尿病の合併症に起因する網膜の障害のことを指す。特に、血管壁が高血糖によって損なわれ、血液網膜柵の形成が変化し、網膜血管がより透過性になる。損傷を受けた血管は、体液および脂質を黄斑に漏出し、黄斑を膨張させ（すなわち、黄斑浮腫）、視界を曇らせる。疾患が進行するにつれて、血管は増殖期に入り、網膜に沿っておよび眼を満たす硝子体液中で増殖する。これらの血管は、出血し、視界を曇らせ、例えば、網膜を破壊し、網膜剥離を引き起こし、または血管新生緑内障を引き起こすことがある。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療することができる。ＡＭＤは、黄斑と呼ばれる網膜の部位にある光受容細胞への損傷の結果として起こる中心視力の進行性消失によって特徴づけられる。ＡＭＤは、２つの病態：滲出型および萎縮型に大まかに分類され、萎縮型が全症例の８０〜９０％までを構成する。萎縮型ＡＭＤは、ブルック膜と眼の網膜色素上皮の間に堆積する細胞外物質の小さい黄色または白色の集積物である黄斑ドルーゼの形成によって特徴づけられる。深刻な視力喪失のおよそ９０％を占める滲出型ＡＭＤは、血管新生と関連しており、血管は、網膜の下の脈絡膜から増殖し、これらの新たな血管の漏出を伴う。いずれの形態のＡＭＤにおいても血液および液体の集積が網膜剥離を引き起こし、続いて光受容器が急速に変性し、失明することがある。ＡＭＤの滲出型は、萎縮型が先行し、それから生じることが一般に認められている。
融合タンパク質の有効量を対象に送達する方法が、本明細書に提供される。融合タンパク質を、組成物で対象に送達することができる。融合タンパク質を、融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶによって対象に送達することもできる。融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶを含む組成物が本明細書で考えられる。
本明細書に記載される組成物は、静脈内（例えば、注入ポンプによる）、腹膜内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、膀胱内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、くも膜下腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入性（例えば、噴霧器の霧として）、粘膜（鼻粘膜を介してなど）、皮下、経皮、胃腸内、関節内、大槽内、心室内、頭蓋内、尿道内、肝内、および腫瘍内を含むがこれに限定されない任意の経路によって個体に投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は静脈内（ＩＶ）または動脈内など血管内に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は動脈に直接投与される。いくつかの実施形態において、組成物は全身的に投与される（例えば静脈注射による）。いくつかの実施形態において、組成物は局所的に投与される（例えば動脈内または眼内注射による）。
いくつかの実施形態において、組成物は眼または眼組織に直接投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば点眼薬で眼に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は眼（眼内注射）にまたは眼関連組織に注射によって投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射または後方強膜近傍送達により投与することができる。これらの方法は、当業界で公知である。例えば、網膜薬物送達のための典型的な眼周囲経路の説明は、Ｒａｇｈａｖａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２００４年、１（１）：９９〜１１４頁を参照のこと。組成物は、例えば、硝子体、眼房水、強膜、結膜、強膜と結膜の間の部位、網膜脈絡膜組織、黄斑、または個体の眼の中もしくはすぐ近くの他の部位に投与することができる。組成物は、移植片として個体に投与することもできる。好ましい移植片は、生体適合性がありおよび／または生物分解可能な、ある期間にわたって化合物を徐々に放出する徐放性製剤である。薬物送達のための眼移植片は、当業技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，５０１，８５６号、第５，４７６，５１１号および第６，３３１，３１３号を参照のこと。組成物は、それだけには限定されないが、米国特許第４，４５４，１５１号および米国特許出願公開第２００３／０１８１５３１号および第２００４／００５８３１３号に記載されるイオン泳動法を含めたイオン導入法を使用して個体に投与することもできる。
組成物の最適な有効量は、経験的に決定することができ、疾患の型および重症度、投与経路、疾患の増悪および健康、個体の質量ならびに身体部位によって左右されると予想される。そのような決定は、当業者の技術的範囲内である。例えば、眼内的に投与される場合、本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの量は、１用量当たり約１０４〜約１０１４ｄｒｐｓのＤＮＡｓｅ粒子抵抗性（ｄｒｐｓ）力価として個体に投与することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの量は、１用量当たり約１０５〜約１０１３、約１０６〜約１０１２、約１０７〜約１０１１、約１０８〜約１０１０、約１０９〜約１０１０、約１０１０〜約１０１１、または約１０１１〜約１０１２ｄｒｐで個体に投与することができる。
融合タンパク質を含む組成物は、日用量を単回で投与されてよく、または全日用量は１日に２、３または４回に分けた用量で投与されてもよい。融合タンパク質を含む組成物は、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、９カ月毎に１回または毎年１回投与することもできる。融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶを含む組成物は、より低い頻度、例えば、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回、７カ月毎に１回、８カ月毎に１回、９カ月毎に１回、１０カ月毎に１回、１１カ月毎に１回または毎年１回で投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶを含む組成物の単回用量は、１年に１回投与される。組成物は、ある期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出する移植片でなど徐放性製剤で投与されてもよく、徐放製剤は１カ月に１回、２〜６カ月毎に１回、毎年１回、さらには１回の投与などより低い頻度で組成物を投与することを可能にする。徐放性手段（ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、微小球などのような）は、眼内、硝子体内、網膜下、眼周囲、結膜下もしくはテノン嚢など眼または眼関連組織の様々な位置での注射または外科的移植によって投与されてもよい。
本発明の組成物（例えば、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶ）は、単独でまたは１つもしくはそれ以上の追加の治療剤と併用して使用することもできる。例えば、本発明の組成物は、単独で、または加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜剥離もしくは損傷を受けた網膜組織に対して薬効を有することが公知の他の治療剤と併用して投与することができる。典型的な治療剤には、補体インヒビター、抗血管新生剤、抗ＶＥＧＦ剤（マキュジェン（ペガプタニブナトリウム）、アイリーア（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ）、およびルセンティス（登録商標）もしくはアバスチン（登録商標）などの抗ＶＥＧＦ抗体を含むがこれに限定されない）、および抗ＰＤＧＦ剤（Ｆｏｖｉｓｔａ（商標）など）がある。本発明の組成物は、黄斑変性が進行期へ進行する危険性を低下させるのに有益であると示されている栄養剤、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、酸化亜鉛および銅と併用して投与することができる。他の有用な補助因子には、殺菌剤、抗生物質、抗ウイルスおよび抗真菌薬ならびに鎮痛薬および麻酔薬を含めた症状緩和補助因子がある。いくつかの実施形態において、併用は同時投与として提供され、融合タンパク質もしくは融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶおよび少なくとも１つの治療剤は、同じ組成物中で一緒に投与されるまたは異なる組成物で同時に投与される。いくつかの実施形態において、併用は個別投与として提供され、融合タンパク質もしくは融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶの投与は、少なくとも１つの治療剤の投与の前に、同時に、および／または後に行うことができる。連続投与間の間隔は、少なくとも分、時または日（または、別法として、より短い）であり得る。
本明細書に記載される組成物は、光線力学療法など他のＡＭＤ治療と併用して使用することもできる。光線力学療法はビスダイン（ベルテポルフィン）の静脈内投与を伴い、その後に特定の波長の光が異常な血管に加えられる。光はビスダインを活性化し、血管を除去する。別法として、本明細書に記載される組成物は、レーザ療法と併用して使用することができ、レーザ療法は、高エネルギーレーザ光を使用して黄斑の下の異常な血管を破壊することを伴う。
ＶＩＩＩ．製品およびキット
本明細書に記載される組成物（例えば、融合タンパク質またはｒＡＡＶ粒子）を適切な包装で含むキットまたは製品も提供される。本明細書に記載される組成物（眼病用組成物など）に適した包装は当業界で公知であり、例えば、バイアル（密封されたバイアルなど）、容器、アンプル、瓶、ジャー、軟包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋）、などを含む。これらの製品は、さらに無菌化および／または封入されてもよい。
本発明は、本明細書に記載される組成物を含むキットも提供し、本明細書に記載される使用など、組成物を使用する方法に関する説明書をさらに含むことができる。本明細書に記載されるキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、注射器および本明細書に記載される任意の方法を実施するための説明書を含む添付文書を含めて商業上ならびに使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載される融合タンパク質および／または本明細書に記載される融合タンパク質をコードしているｒＡＡＶ、眼内注射に適した薬学的に許容できる担体、ならびに１つもしくはそれ以上の：緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、注射器および眼内注射を実施するための説明書を含む添付文書を含む。
実施例１：ｓＰＤＧＦＲ−β／Ｆｃ融合タンパク質の産生。
ＰＤＧＦ−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）細胞外ドメインは、タンパク質のＮ末端からＣ末端へと１〜５と付番された５つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有する。完全長ＰＤＧＦＲ−β細胞外ドメインを使用して、いくつかの短縮した可溶性ＰＤＧＦＲ−β（ＰＤＧＦＲ−β）単量体および二量体タンパク質を生成した（図１Ａ）。
完全長ＰＤＧＦＲ−β（ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）（配列番号７））の細胞外ドメインのＮ末端、または最初の４つのＥＣＤを含有するＰＤＧＦＲ−β（ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）（配列番号８））の細胞外ドメインのＮ末端にＰＤＧＦＲ−βシグナルペプチド（ＳＰ）を含有する２つのＰＤＧＦＲ−β単量体構築物を作製した。９個のグリシン残基からなるペプチドリンカー（９Ｇｌｙ）を介してヒト免疫グロブリンＧ１重鎖断片（ＩｇＧ１ Ｆｃ）のＮ末端にＰＤＧＦＲ−β細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の５つすべて、最初の３つ、または最初の２つのドメインを融合することによって３つのＰＤＧＦＲ−β二量体構築物を産生し、それぞれＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ（配列番号９）、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃ（配列番号１０）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃ（配列番号１１）と命名した。単量体構築物と同様に、すべての二量体構築物は、融合させた全長または短縮したＰＤＧＦＲ−β細胞外ドメインのＮ末端にＳＰを含有した。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃの構築のために、プラスミドｐＣＭＶ６−ＸＬ５−ＰＤＧＦＲＢ（カタログ番号ＳＣ３０９９７９；Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を鋳型とし、鋳型に制限部位ＳｐｅＩ（ＰＤＧＦＲＢＰＲ６ＳｐｅＩ Ｆ：５’−ＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧ（配列番号２５））およびＡｇｅＩ（ＰＤＧＦＲＢＰＲ７ＡｇｅＩ Ｒ：５’−ＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧ（配列番号２６））を導入するプライマーと一緒に使用した。ＰＣＲ産物の増幅は、以下のサイクリングパラメータで達成した：５０℃で２分間を１サイクル、９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクル。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯプラスミドに挿入し、ＰＣＲ産物挿入物の配列を塩基配列決定によって確認した後に、プラスミドｐＣＭＶ／Ｋ−Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃのＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位にサブクローニングして（ｐＣＭＶ／Ｋ−Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃの説明についてはＰｅｃｈａｎ Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）、１６：１０〜１６頁を参照のこと）、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃのオープンリーディングフレーム（配列番号２０）を持つプラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ−Ｓ−（Ｄ１〜Ｄ２）−９Ｇｌｙ−Ｆｃを生成した。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃの構築のために、プラスミドｐＣＭＶ６−ＸＬ５−ＰＤＧＦＲＢ（カタログ番号ＳＣ３０９９７９；Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を鋳型とし、鋳型に制限部位ＡｃｃＩ（ＰＤＧＦＲＢ−ＰＲ１−ａｃｃ Ｆ：５’−ＣＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣ（配列番号２７））およびＡｇｅＩ（Ｄ５−ＰＲ９−ＡｇｅＩ−Ｒｅｖ Ｒ：５’−ＡＣＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号２８））を導入するプライマーと一緒に使用した。ＰＣＲ産物の増幅は、以下のサイクリングパラメータで達成した：５０℃で２分間を１サイクル、９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクル。次いでＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯプラスミドに挿入し、ｐＴＯＰＯ−ＰＤＧＦＲＢ（Ｄ３〜Ｄ５）内のＰＣＲ産物挿入物の配列を塩基配列決定によって確認した。プラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ−Ｓ−（Ｄ１〜Ｄ２）−９Ｇｌｙ−Ｆｃの６２２塩基対（ｂｐ）ＳｐｅＩ−ＡｃｃＩ断片を、プラスミドｐＴＯＰＯ−ＰＤＧＦＲＢ（Ｄ３〜５）のＳｐｅＩおよびＡｃｃＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴＯＰＯ−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）を生成した。次いでプラスミドｐＴＯＰＯ−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）の１，５９６ｂｐ ＳｐｅＩ−ＡｇｅＩ断片を、プラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ−Ｓ−（Ｄ１〜Ｄ２）−９Ｇｌｙ−ＦｃのＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位に挿入して、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃのオープンリーディングフレーム（配列番号１８）を持つプラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ−（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇｌｙ−Ｆｃを生成した。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃの構築のために、プラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜５）９Ｇ−Ｆｃを鋳型とし、鋳型に制限部位ＳｐｅＩ（ＰＤＧＦ０２ Ｆ：５’−ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧＧＴ（配列番号２９））およびＡｇｅＩ（ＰＤＧＦ０３ Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧ（配列番号３０））を導入するプライマーと一緒に使用した。ＰＣＲ産物の増幅は、以下のサイクリングパラメータで達成した：９５℃で１分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル。ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜５）９Ｇ−ＦｃのＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位に挿入して、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜３）９Ｇ−Ｆｃのオープンリーディングフレーム（配列番号１９）を完成させた。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）の構築のために、プラスミドｐＣＭＶ−ｓＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇ−Ｆｃの５３０７ｂｐ ＡｇｅＩ−ＥａｇＩ断片を、オリゴヌクレオチドＤ５−ＳＶ４０ Ｆ：ＣＣＧＧＴＴＡＧＧＧＡ（配列番号３１）およびＤ５−ＳＶ４０ Ｂ−２：ＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＡ（配列番号３２）からなるアニールされたオリゴヌクレオチド断片にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターならびにＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）のオープンリーディングフレーム（配列番号１６）を持つプラスミドｐＣＭＶＰＤＧＦＲＢ（Ｄ１〜Ｄ５）を生成した。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）を構築するために、プラスミドｐＣＭＶ−ｓＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇ−Ｆｃの４９２４ｂｐ ＢｂｖＣＩ−ＥａｇＩ断片を、オリゴヌクレオチドＤ４−ＳＶ４０ Ｆ：ＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＧＣ（配列番号３３）およびＤ４−ＳＶ４０ Ｂ：ＧＧＣＣＧＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣ（配列番号３４）からなるアニールされたオリゴヌクレオチド断片にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターならびにＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）のオープンリーディングフレーム（配列番号１７）を持つプラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲＢ（Ｄ１〜Ｄ４）を生成した。
ＳＰ領域を除く成熟タンパク質の予測分子量は、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）で５６．２ｋＤａおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）で４３．６ｋＤａであった。ＳＰ領域を除く単量体としての成熟タンパク質の予測分子量は、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃで８２．７ｋＤａ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃで４６．７ｋＤａおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃで５８．２ｋＤａであった。これらのタンパク質構築物をコードしているプラスミドを使用して、２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に細胞からの培地を採取し、粗馴化培地（ＣＭ）を使用して、分泌されたＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃタンパク質を分析した。それぞれの構築物でトランスフェクトした細胞によるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃおよびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃタンパク質ホモ二量体の産生を、ウェスタンブロット分析によって確認した。簡潔には、細胞培養培地から精製した分泌タンパク質を、還元または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルにロードした。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）構築物でトランスフェクトした細胞の細胞培養培地から精製したＥＧＦＰもゲルにロードし、対照として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質を分離した後に、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜をビオチン化ヤギ抗ヒトＰＤＧＦＲ−β抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で標識し、化学発光試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）で現像した後に画像化した。還元および非還元条件下でＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃならびにＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃタンパク質の移動度は変化したが、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）単量体タンパク質の移動度が変化しないままだったことは、ＰＤＧＦＲ−β／Ｆｃ融合タンパク質がホモ二量体を形成したことを示している（図１Ｂ）。
ＰＤＧＦ ＢＢリガンドとＰＤＧＦＲ−β単量体および二量体タンパク質との相対的結合親和性を、無細胞容積測定ＰＤＧＦ結合アッセイシステムを使用して決定した（図２）。ＰＤＧＦＲ−β単量体および二量体タンパク質を産生するために、２９３細胞を、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃ、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−ＦｃまたはＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃタンパク質をコードしているプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクション７２時間後に細胞培養培地を捕集した。分泌されたＰＤＧＦＲ−β単量体および二量体のタンパク質の存在をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって確認し、その後結合親和性を分析した。分泌されたタンパク質を段階希釈して、ヒトＰＤＧＦ ＢＢリガンド（最終濃度２０ｐＭ）と混合し、オービタルシェーカー台上で、室温で終夜インキュベートした。次いで結合していないＰＤＧＦ ＢＢの量を、ヒトＰＤＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ ＤｕｏＳｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＤＹ２２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。結合親和性の統計的有意性を、Ｐｒｉｓｍ ５．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析し、二元配置分散分析検定を使用して算出し、続いてボンフェローニ補正した。結合親和性分析は、単量体ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）タンパク質が、５つすべてのＥＣＤを含有する単量体ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）タンパク質よりも著しく高い親和性でＰＤＧＦに結合したことを示した（＊＊＊Ｐ<０．００１）（図２Ａ）。しかし、ＰＤＧＦ結合の陽性対照として機能する二量体完全長ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃタンパク質は、単量体ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）およびＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）の両方より著しく良好なＰＤＧＦ結合剤であった（＊＊＊Ｐ<０．００１）（図２Ａ）。生成された３つの二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ結合ＰＤＧＦＲ−β構築物の中で、最初の３つのＥＣＤを持つ構築物、すなわちＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃは、全長サイズのＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃタンパク質より著しく良好なＰＤＧＦ結合剤であった（＊＊＊Ｐ<０．００１）、一方で最初の２つのＥＣＤを持つ構築物、すなわちＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃは、ＰＤＧＦ結合親和性を全く示さなかった（図２Ｂ）。
実施例２：ハイブリッドＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βおよびＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ−１タンパク質の生成。
Ｆｌｔ−１受容体（ＶＥＧＦＲ−１）細胞外ドメインは、タンパク質のＮ末端からＣ末端へと１〜７と付番された７つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有する。ＰＤＧＦ ＢＢとＶＥＧＦリガンド両方を遮断するために、ＰＤＧＦＲ−βおよびＶＥＧＦＲ１のＥＣＤを含む融合タンパク質を生成し、ハイブリッドタンパク質と命名した（図３）。
ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖断片（ＩｇＧ１ Ｆｃ）に連結したヒトＶＥＧＦＲ１のＥＣＤ２からなる以前に生成したＶＥＧＦ結合タンパク質、すなわちｓＦＬＴ０１を使用して、ＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βまたはＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物を生成した。ｓＦＬＴ０１タンパク質の説明については、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰｅｃｈａｎ Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）、１６：１０〜１６頁を参照のこと。９個のセリン残基からなるペプチドリンカー（９Ｓｅｒ）を介してＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤ１〜５のＮ末端にＶＥＧＦＲ１シグナルペプチド（ＳＰ）およびＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ２を含有するｓＦＬＴ０１の断片を連結することによってＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド１（配列番号１２）を構築し、それを９個のグリシン残基からなるペプチドリンカー（９Ｇｌｙ）を介してＩｇＧ１ Ｆｃにさらに連結した。９Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ２のＮ末端にＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤ１〜５およびＰＤＧＦＲ−β ＳＰを連結することによってＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッド２（配列番号１３）を構築し、それを、９Ｇｌｙペプチドリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃにさらに連結した。ＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤ１〜５の代わりにＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤ１〜３を使用したことを除いて、ＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド３（配列番号１４）およびＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッド４（配列番号１５）をそれぞれハイブリッド１および２と同様に構成した。ＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド１の構築のために、９セリン（９Ｓｅｒ）リンカーを含むＶＥＧＦＲ１ドメインＤ２に融合されたＶＥＧＦＲ１シグナルペプチドをコードしている３７２ｂｐ ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ断片Ｋｏｚａｋ−ＳＰ−Ｄ２−９Ｓｅｒ（配列番号３５）を、プラスミドｐＴＯＰＯ−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）のＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴＯＰＯ−（Ｄ２−９Ｓｅｒ）−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）を生成した。プラスミドｐＴＯＰＯ−（Ｄ２−９Ｓｅｒ）−ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）のＳｐｅＩ−ＡｇｅＩ断片を、プラスミドｐＣＭＶ−ＰＤＧＦＲ−（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇｌｙ−ＦｃのＳｐｅＩ−ＡｇｅＩ部位に挿入して、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド１のオープンリーディングフレーム（配列番号２１）を持つｐＣＭＶ−Ｆ（Ｄ２−９Ｓ）−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド１を形成した。ＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッド２の構築のために、合成ＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含有する６７８ｂｐ ＢｓｔＢＩ−ＢｍｇＸＩ断片（配列番号３６）を、プラスミドｐＣＭＶ−ｓＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｇ−Ｆｃの５６２６ｂｐ ＢｓｔＢＩ−ＢｍｇＸＩ断片とライゲーションして、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ−１ハイブリッド２のオープンリーディングフレーム（配列番号２２）を持つｐＣＭＶ−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｓ−Ｆ（Ｄ２）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド２を形成した。ＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド３の構築のために、合成ＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含有する４５２ｂｐ ＢｍｇＢＩ−ＰｓｈＡＩ断片（配列番号３７）を、プラスミドｐＣＭＶ−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｓ−Ｆ（Ｄ２）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド２の５３３４ｂｐ ＢｍｇＢＩ−ＰｓｈＡＩ断片とライゲーションして、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＶＥＧＦＲ１／ＰＤＧＦＲ−βハイブリッド３のオープンリーディングフレーム（配列番号２３）を持つｐＣＭＶ−Ｆ（Ｄ２−９Ｓ）−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ３）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド３を形成した。ＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッド４の構築のために、合成ＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含有する７５８ｂｐ ＢｍｇＢＩ−ＰｓｈＡＩ断片（配列番号３８）を、プラスミドｐＣＭＶ−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ５）−９Ｓ−Ｆ（Ｄ２）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド２の５０２１ｂｐ ＢｍｇＢＩ−ＰｓｈＡＩ断片とライゲーションして、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列の制御下にＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッド４のオープンリーディングフレーム（配列番号２４）を持つｐＣＭＶ−Ｐ（Ｄ１〜Ｄ３）−９Ｓ−Ｆ（Ｄ２）−９Ｇ−ＦｃまたはｐＣＭＶハイブリッド４を形成した。
それぞれの構築物でトランスフェクトした細胞によるハイブリッド１、ハイブリッド２、ハイブリッド３およびハイブリッド４タンパク質ホモ二量体の産生を、ウェスタンブロット分析によって確認した。簡潔には、細胞培養培地からの分泌タンパク質を、還元または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルにロードした。ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃタンパク質もゲルにロードし、対照として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質を分離した後に、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜をビオチン化ヤギ抗ヒトＰＤＧＦＲ−β抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で標識し、化学発光試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）で現像した後に画像化した。還元条件と比較した非還元条件下でのハイブリッド１、２、３および４のタンパク質移動度により、ハイブリッドタンパク質が二量体化したことを確認した（図４）。ＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤを５つすべて含有するＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃならびにハイブリッド１および２が、還元条件下でＰＤＧＦＲ陽性バンドを２本示したことは、第５のＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤの部位におけるこれらタンパク質のタンパク質分解的切断の可能性を示唆している（図４、左パネル）。最初の３つのＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤしか含有しないハイブリッド３および４が切断されないように見えることは、それらがハイブリッド１および２に見られるタンパク質分解的切断部位を含有しないことを示している（図４、左パネル）。
実施例３：ＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦＲ−β誘導増殖を阻害する能力についてハイブリッドＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１タンパク質を試験した。ハイブリッドタンパク質の産生のために、２９３細胞を、ハイブリッド１、ハイブリッド２、ハイブリッド３またはハイブリッド４をコードしている構築物でトランスフェクトし、分泌されたハイブリッドタンパク質を含有する細胞培養培地をトランスフェクションの７２時間後に捕集した。捕集した細胞培養を、ＶＥＧＦリガンドの存在下でＨＵＶＥＣに加えた。ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ−Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｉｎｃ）を、５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２，０００個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、終夜静置した。インキュベーション後に、培地を、等容（５μＬ）の３つの独立した受容体もしくは対照トランスフェクションから生成された捕集した細胞培養を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬの組換えｈＶＥＧＦ−１６５リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９３−ＶＥ）単独と一緒に含有する、または１ウェル当たり１００μｌの最終容量中に最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２０−ＢＢ）と組み合わせて含有する、５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。陰性対照は、１ウェル当たり１００μｌの最終容量に、ＥＧＦＰ構築物でトランスフェクトした細胞から捕集した等容（５μｌ）の細胞培養からなった。陽性対照は、１ウェル当たり１００μｌの最終容量のＶＥＧＦリガンドまたはＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ ＢＢリガンドの存在下における、ＥＧＦＰ構築物でトランスフェクトした細胞からの等容（５μｌ）の捕集した細胞培養を含んだ。細胞を、５％ＣＯ２下に３７℃で３〜４日間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８０）を２０μｌ／ウェルで添加し、４時間後に４９０ｎｍで吸光度を取得した。ＶＥＧＦ依存的ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおいて、ハイブリッド２、ハイブリッド３およびハイブリッド４は、ＨＵＶＥＣ増殖を著しく遮断し、ハイブリッド２ならびに４はｓＦＬＴ０１と同程度の効力を有した（図５Ａ）。ハイブリッド２、３および４と比較して、ハイブリッド１は、ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ増殖を遮断せず、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤを欠くＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃタンパク質と同程度のレベルの抗増殖性活性を有した（図５Ａ）。他のＥＣＤが存在しない場合、二量体化はＶＥＧＦＲ１ Ｄ２媒介ＶＥＧＦ結合に対する制限因子なので、ハイブリッド１中の二量体化ＩｇＧ１−Ｆｃ配列のタンパク質分解的切除により、ＶＥＧＦ結合能力はおそらく除かれた（Ｐｅｃｈａｎ Ｐ．らＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）、１６：１０〜１６頁）。しかしながら、ハイブリッド２において、タンパク質分解的切断は、分子をＰＤＧＦＲ−β ＥＣＤとまだＶＥＧＦを結合可能なｓＦＬＴ０１含有単位とに分離した（図５Ａ）。捕集したハイブリッドＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１タンパク質も、ＨＵＶＥＣ競合増殖アッセイにおいて試験した。このアッセイにおいて、捕集した細胞培養を、上記のＶＥＧＦリガンドとＰＤＧＦ ＢＢリガンド両方の存在下でＨＵＶＥＣに加えた。ハイブリッド２およびハイブリッド４が、ＨＵＶＥＣ増殖を著しく遮断し、ハイブリッド２ならびに４がｓＦＬＴ０１と同程度の効力を有したという点で、このアッセイの結果はこれまでのアッセイと類似した（図５Ｂ）。両方のリガンドの存在下で、ハイブリッド１もＨＵＶＥＣ増殖を遮断しなかった。この前のアッセイに対し、ハイブリッド３は、両方のリガンドの存在下で弱い抗増殖性効力を有し、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤを欠くＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃタンパク質の活性と同等だった（図５Ｂ）。両方のＨＵＶＥＣ増殖アッセイに対する統計的有意性を、Ｐｒｉｓｍ ５．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析し、一元配置分散分析検定を使用して算出し、続いてテューキー検定した。
実施例４：ＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質の結合親和性。
ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ ＢＢリガンドとＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１ハイブリッドタンパク質との相対的結合親和性を、無細胞容積測定ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ結合アッセイシステムを使用して決定した（図６）。ハイブリッドＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１タンパク質の産生のために、２９３細胞をハイブリッド１、ハイブリッド２、ハイブリッド３またはハイブリッド４をコードしているプラスミドでトランスフェクトした。結合対照として使用するために、細胞を、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−ＦｃまたはｓＦＬＴ０１タンパク質をコードしているプラスミドでもトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に細胞培養培地を捕集し、分泌タンパク質の存在をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって確認し、その後結合親和性を分析した。分泌されたタンパク質を段階希釈して、ヒトＶＥＧＦＲ１リガンド（最終濃度２０ｐＭ）またはヒトヒトＰＤＧＦ ＢＢリガンド（最終濃度８０ｐＭ）と混合し、オービタルシェーカー台上で、室温で終夜インキュベートした。次いで結合していないＰＤＧＦ ＢＢの量を、ヒトＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＰＤＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＰＤＧＦ-ＢＢ ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ＶＥＧＦ結合アッセイにおける４つすべてのハイブリッドの比較は、ハイブリッド１が最も弱いＶＥＧＦ結合剤であることを示した（図６Ａ）。１つのアッセイにおいて別々の３つのトランスフェクションから捕集した馴化培地中のハイブリッド３、ハイブリッド４およびｓＦＬＴ０１のＶＥＧＦ結合比較は、ハイブリッド４が、ｓＦＬＴ０１と同程度にＶＥＧＦを結合し、ハイブリッド３より強いＶＥＧＦ結合剤であることを示した（図６Ａ）。ＰＤＧＦ結合アッセイにおける４つすべてのハイブリッドの比較は、ハイブリッド１が最も弱いＰＤＧＦ結合剤であることも実証し、一方でハイブリッド４は、４つすべてのハイブリッドの中で最良の結合を実証した（図６Ｂ）。
ハイブリッド３、ハイブリッド４、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−ＦｃまたはｓＦＬＴ０１タンパク質をコードしている構築物でトランスフェクトした２９３細胞から捕集された馴化培地を使用して、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ無細胞競合結合アッセイを行った。トランスフェクション７２時間後に細胞培養培地を捕集し、分泌タンパク質の存在をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって確認し、その後結合親和性を分析した。分泌されたタンパク質を段階希釈して、ヒトＰＤＧＦ ＢＢリガンド（最終濃度２０ｐＭ）とヒトＶＥＧＦＲ１リガンド（最終濃度２０ｐＭ）の両方と混合し、オービタルシェーカー台上で、室温で終夜インキュベートした。その後結合していないＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦリガンドの量を、ヒトＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＰＤＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ（ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ＰＤＧＦ ＢＢ結合対照（ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃ）およびＶＥＧＦ結合対照（ｓＦＬＴ０１）に対するハイブリッド３およびハイブリッド４の比較は、ハイブリッド３およびハイブリッド４の両方がＰＤＧＦ ＢＢ（図７Ａ）およびＶＥＧＦ（図７Ｂ）リガンドに結合することを示し、ハイブリッド４は両方のリガンドに対するより高い結合親和性を実証した。ハイブリッド３、ハイブリッド４、ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−ＦｃまたはＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃを発現している細胞の細胞培養培地を使用するＰＤＧＦ結合比較は、ハイブリッド４が最良のＰＤＧＦ結合剤であるＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃと同程度の親和性を有し（図７Ａ）、一方でＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃがハイブリッド１〜４のすべて（図６Ｂ）またはＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃ（図２Ｂ）より著しく弱いＰＤＧＦ結合剤であることを実証した。
実施例５：マウスにおけるハイブリッドＰＤＧＦＲ−β／ＶＥＧＦＲ１タンパク質によるレーザ誘導ＣＮＶの阻害。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、その非病原性の性質、最小の毒性および免疫原性、非分裂細胞を形質導入する能力ならびに治療用タンパク質を終生発現する潜在性のため、眼内遺伝子送達にとって魅力的な道具である（Ａｌｉら、１９９６年；Ａｌｉら、１９９７年；Ａｌｉら、１９９８年；Ｌａｉら、２００５年）。
ハイブリッド４のアデノ随伴ウイルス媒介送達のために、ＣＭＶプロモーターを、チキンβ−アクチンプロモーターＣＭＶイントロン／エンハンサーによって置き換え、プロモーターおよびハイブリッド４をコードしている断片を含む発現カセットを、プロウイルス性プラスミドベクターｐＡＡＶＳＰ７０のＲｓｒＩＩおよびＭｌｕＩ部位に挿入した。Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、２００４年；９：２３１〜２４０頁を参照のこと。プラスミドｓｐ７０．ＢＲ／ハイブリッド４内に得られたＡＡＶゲノムの全長サイズは、４．６ｋｂであった。ヘルパープラスミドｐ５ｒｅｐ−Ｄ−ＣＭＶｃａｐおよびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して２９３細胞を３重トランスフェクションすることによって組換えベクターＡＡＶ２．Ｈｙｂｒｉｄ４を産生し、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でイオジキサノールステップ勾配およびＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して製造業者の手順にしたがって精製した。Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９７年；７１：１８９７〜１９０５頁を参照のこと。ＡＡＶ２．Ｈｙｂｒｉｄ４ウイルス標本は、１ｍＬ当たり２．２Ｅ１２ ｄｒｐｓ（ＤＮａｓｅ耐性粒子）の力価を有した。ウイルス力価を、リアルタイムＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。ＡＡＶ２．ｓＦＬＴ０２を、ＶＥＧＦＲ１ Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３タンパク質（配列番号３９）をコードしている核酸（配列番号４０）を使用して米国特許第７，９２８，０７２号に以前に記載の通り構築した。ＡＡＶ２．Ｈｙｂｒｉｄ４、ＡＡＶ２．ｓＦＬＴ０２またはＡＡＶ２．ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲ＝ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃ）を、硝子体内送達によりマウス脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）レーザモデルに投与して、ＣＮＶの阻害におけるハイブリッド４のｉｎ ｖｉｖｏ効力を評価した。簡潔に言えば、正常な成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼を、試験開始時に左目（ＯＳ）へのＡＡＶ２．Ｈｙｂｒｉｄ４、ＡＡＶ２．ｓＦＬＴ０２またはＡＡＶ２．ＰＤＧＦＲの１Ｅ９ ｄｒｐｓの単回硝子体内注射により治療し、一方で右目（ＯＤ）を治療に対して未処理のままにした。試験２８日目に、レーザを使用して両眼にＣＮＶを誘導した（眼１つ当たり３カ所の熱傷が作られる。出力２００ｍＷ、スポット５０μｍ、１００ｍｓ）。試験４２日目に、マウスを５ｍｇ／ｍＬの分子量２．０×１０６のＦＩＴＣ−デキストランで灌流し、安楽死させた。眼を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、その後に脈絡膜フラットマウントを調製して、血管新生の範囲を調べた。治療した（ＯＳ）眼におけるＣＮＶのない熱傷の数を反対側（ＯＤ）の眼と比較した。ｉｎ ｖｉｖｏ有効性の分析は、網膜血管新生の阻害においてＡＡＶ２．Ｈｙｂｒｉｄ４の単回硝子体内注射が、ＡＡＶ２．ｓＦＬＴ０２より効果的であることを実証した（図８）。さらに、ＡＡＶ２．ＰＤＧＦＲは、マウスレーザ誘導ＣＮＶモデルにおいて、網膜血管新生を阻害しなかった（図８）。
配列
ＰＤＧＦＲ細胞外領域Ｄ１〜Ｄ３のアミノ酸配列
ＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹ（配列番号１）
ＰＤＧＦＲ細胞外領域Ｄ１〜Ｄ４のアミノ酸配列
ＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥ（配列番号２）
ＰＤＧＦＲ細胞外領域Ｄ１〜Ｄ５のアミノ酸配列
ＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫ（配列番号３）
ＶＥＧＦＲ１細胞外領域Ｄ２のアミノ酸配列
ＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴ（配列番号４）
ＶＥＧＦＲ１細胞外領域Ｄ１−Ｄ３のアミノ酸配列
ＰＥＬＳＬＫＧＴＱＨＩＭＱＡＧＱＴＬＨＬＱＣＲＧＥＡＡＨＫＷＳＬＰＥＭＶＳＫＥＳＥＲＬＳＩＴＫＳＡＣＧＲＮＧＫＱＦＣＳＴＬＴＬＮＴＡＱＡＮＨＴＧＦＹＳＣＫＹＬＡＶＰＴＳＫＫＫＥＴＥＳＡＩＹＩＦＩＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＱＩＳＴＰＲＰＶＫＬＬＲＧＨＴＬＶＬＮＣＴＡＴＴＰＬＮＴＲＶＱＭＴＷＳＹＰＤＥＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲＩＤＱＳＮＳＨＡＮＩＦＹＳＶＬＴＩＤＫＭＱＮＫＤＫＧＬＹＴＣＲＶＲＳＧＰＳＦＫＳＶＮＴＳＶＨＩＹＤＫ（配列番号５）
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列
ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６）
分泌ペプチド（下線）を持つＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）のアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫ（配列番号７）
分泌ペプチド（下線）を持つＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）のアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥ（配列番号８）
分泌ペプチド（下線）を持つＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃのアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）
分泌ペプチド（下線）を持つＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ３）９Ｇ−Ｆｃのアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）
分泌ペプチド（下線）を持つＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ２）９Ｇ−Ｆｃのアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１）
ハイブリッド１のアミノ酸配列
ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＳＳＳＳＳＳＳＳＳＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１２）
ハイブリッド２のアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＳＳＳＳＳＳＳＳＳＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３）
ハイブリッド３のアミノ酸配列
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ハイブリッド４のアミノ酸配列
ＭＲＬＰＧＡＭＰＡＬＡＬＫＧＥＬＬＬＬＳＬＬＬＬＬＥＰＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＳＳＳＳＳＳＳＳＳＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１５）
ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）のオープンリーディングフレーム
ＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＣＡＣＧＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＧＣＧＣＡＡＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＴＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＡＡＧＴＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＡ（配列番号１６）
ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ４）のオープンリーディングフレーム
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ＰＤＧＦＲ（Ｄ１〜Ｄ５）９Ｇ−Ｆｃのオープンリーディングフレーム
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ハイブリッド１のオープンリーディングフレーム
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ハイブリッド３のオープンリーディングフレーム
ＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＣＡＣＧＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧ（配列番号２３）
ハイブリッド４のオープンリーディングフレーム
ＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＣＡＣＧＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧ（配列番号２４）
ＰＤＧＦＲＢＰＲ６ＳｐｅＩ Ｆの核酸プライマー
ＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧ（配列番号２５）
ＰＤＧＦＲＢＰＲ７ＡｇｅＩ Ｒの核酸プライマー
ＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧ（配列番号２６）
ＰＤＧＦＲＢ−ＰＲ１−Ａｃｃ Ｆの核酸プライマー
ＣＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣ（配列番号２７）
Ｄ５−ＰＲ９−ＡｇｅＩ−Ｒｅｖ Ｒの核酸プライマー
ＡＣＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号２８）
ＰＤＧＦ０２ Ｆの核酸プライマー
ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧＧＴ（配列番号２９）
ＰＤＧＦ０３ Ｒの核酸プライマー
ＣＣＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧ（配列番号３０）
Ｄ５−ＳＶ４０ Ｆの核酸プライマー
ＣＣＧＧＴＴＡＧＧＧＡ（配列番号３１）
Ｄ５−ＳＶ４０ Ｂ−２の核酸プライマー
ＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＡ（配列番号３２）
Ｄ４−ＳＶ４０ Ｆの核酸プライマー
ＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＧＣ（配列番号３３）
Ｄ４−ＳＶ４０ Ｂの核酸プライマー
ＧＧＣＣＧＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣ（配列番号３４）
Ｋｏｚａｋ−ＳＰ−Ｄ２−９Ｓｅｒの合成核酸断片
ＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴ（配列番号３５）
Ｄ２−２２２０−２９０８の合成核酸断片
ＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ（配列番号３６）
Ｄ３−Ｆｃの合成核酸断片
ＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ（配列番号３７）
Ｄ３−Ｆ（Ｄ２）の合成核酸断片
ＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ（配列番号３８）
ｓＦＬＴ０２（Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３）のアミノ酸配列
ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）
ｓＦＬＴ０２（Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３）のオープンリーディングフレーム
ＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧ（配列番号４０）
突然変異ＩＴＲの核酸配列
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ（配列番号４１）
分泌ペプチドのないハイブリッド１のアミノ酸配列
ＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＳＳＳＳＳＳＳＳＳＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２）
分泌ペプチドのないハイブリッド２のアミノ酸配列
ＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＶＲＬＬＧＥＶＧＴＬＱＦＡＥＬＨＲＳＲＴＬＱＶＶＦＥＡＹＰＰＰＴＶＬＷＦＫＤＮＲＴＬＧＤＳＳＡＧＥＩＡＬＳＴＲＮＶＳＥＴＲＹＶＳＥＬＴＬＶＲＶＫＶＡＥＡＧＨＹＴＭＲＡＦＨＥＤＡＥＶＱＬＳＦＱＬＱＩＮＶＰＶＲＶＬＥＬＳＥＳＨＰＤＳＧＥＱＴＶＲＣＲＧＲＧＭＰＱＰＮＩＩＷＳＡＣＲＤＬＫＲＣＰＲＥＬＰＰＴＬＬＧＮＳＳＥＥＥＳＱＬＥＴＮＶＴＹＷＥＥＥＱＥＦＥＶＶＳＴＬＲＬＱＨＶＤＲＰＬＳＶＲＣＴＬＲＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＳＳＳＳＳＳＳＳＳＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３）
分泌ペプチドのないハイブリッド３のアミノ酸配列
ＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＳＳＳＳＳＳＳＳＳＱＩＳＱＧＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４４）
分泌ペプチドのないハイブリッド４のアミノ酸配列分
ＬＶＶＴＰＰＧＰＥＬＶＬＮＶＳＳＴＦＶＬＴＣＳＧＳＡＰＶＶＷＥＲＭＳＱＥＰＰＱＥＭＡＫＡＱＤＧＴＦＳＳＶＬＴＬＴＮＬＴＧＬＤＴＧＥＹＦＣＴＨＮＤＳＲＧＬＥＴＤＥＲＫＲＬＹＩＦＶＰＤＰＴＶＧＦＬＰＮＤＡＥＥＬＦＩＦＬＴＥＩＴＥＩＴＩＰＣＲＶＴＤＰＱＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨＱＲＧＦＦＧＩＦＥＤＲＳＹＩＣＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮＶＳＶＮＡＶＱＴＶＶＲＱＧＥＮＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹＨＩＲＳＩＬＨＩＰＳＡＥＬＥＤＳＧＴＹＴＣＮＶＴＥＳＶＮＤＨＱＤＥＫＡＩＮＩＴＶＶＥＳＧＹＳＳＳＳＳＳＳＳＳＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４５）

Claims (52)

  1. （ａ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外部分、（ｂ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分、および（ｃ）多量体化ドメインを含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに結合し、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の順序で配置されている、前記融合タンパク質。
  2. ＰＤＧＦ受容体はＰＤＧＦＲβである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ４を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  5. ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、ＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  6. ＰＤＧＦＲの細胞外部分は、配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号１、２もしくは３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  7. ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ２を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  8. ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメインＤ２を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様領域Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  10. ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  11. ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、配列番号４もしくは５のアミノ酸配列、または配列番号４もしくは５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  12. 融合タンパク質は、ＰＤＧＦ受容体の細胞外部分とＶＥＧＦ受容体の細胞外部分の間のリンカーペプチド、および／またはＶＥＧＦ受容体の細胞外部分と多量体化ドメインの間のペプチドリンカーをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  13. ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ９（配列番号４７）、Ｇｌｕ９（配列番号４８）、Ｓｅｒ９（配列番号４９）、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ（配列番号５０）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５１）、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５２）、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−
    Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５４）、およびＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 多量体化ドメインは、抗体のＦｃ領域である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  15. Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ３領域、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. Ｆｃ領域は、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  17. 融合タンパク質は、配列番号１３、１５、４３もしくは４５のアミノ酸配列、または配列番号１３、１５、４３もしくは４５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  18. 融合タンパク質は、多量体の形態である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  19. 融合タンパク質は、二量体の形態である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしている核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養し、該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収することによって産生される、融合タンパク質。
  21. ２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質であって、各融合タンパク質が請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、前記二量体融合タンパク質。
  22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
  23. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしている核酸。
  24. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  25. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしている核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程と、該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収する工程とを含む、融合タンパク質を産生する方法。
  26. 宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を対象に投与する工程を含む、融合タンパク質を対象に送達する方法。
  28. 対象は、黄斑変性または増殖性糖尿病性網膜症を有する、請求項２７に記載の方法。
  29. 黄斑変性は、滲出型加齢黄斑変性または萎縮型加齢黄斑変性である、請求項２８に記載の方法。
  30. 融合タンパク質は、硝子体内注射によって対象に投与される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 対象は、癌を有する、請求項２７に記載の方法。
  32. 対象は、関節リウマチ、骨関節炎または喘息を有する、請求項２７に記載の方法。
  33. 対象は、ブドウ膜炎または角膜血管新生を有する、請求項２７に記載の方法。
  34. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むベクター。
  35. ウイルスベクターである、請求項３４に記載のベクター。
  36. ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）である、請求項３５に記載のベクター。
  37. ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のＩＴＲを含む、請求項３６に記載のベクター。
  38. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしている核酸を含むｒＡＡＶ粒子。
  39. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のキャプシドタンパク質を含む、請求項３８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  40. 核酸は、キャプシドの血清型とは異なる血清型のＩＴＲを含む、請求項３９に記載のｒＡＡＶ粒子。
  41. ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ１０のＩＴＲである、請求項４０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  42. （ａ）ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞は（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であり、該ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれがＡＡＶ複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを両端に有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしているヌクレオチドを含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能を含む、工程と；
    （ｂ）該宿主細胞によって産生される該ｒＡＡＶ粒子を回収する工程と
    を含む、ｒＡＡＶ粒子を産生する方法。
  43. ｒＡＡＶ粒子は精製される、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を対象に投与する工程を含み、ここで該ｒＡＡＶ粒子にコードされた融合タンパク質が該対象中で発現される、対象にウイルスベクターを送達する方法。
  45. 対象は、黄斑変性または増殖性糖尿病性網膜症を有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 黄斑変性は、滲出型加齢黄斑変性または萎縮型加齢黄斑変性である、請求項４５に記載の方法。
  47. ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内注射によって対象に投与される、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 対象は、癌を有する、請求項４４に記載の方法。
  49. 対象は、関節リウマチ、骨関節炎または喘息を有する、請求項４４に記載の方法。
  50. 対象は、ブドウ膜炎または角膜血管新生を有する、請求項４４に記載の方法。
  51. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項２２に記載の組成物を含む、製品またはキット。
  52. 請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む、製品またはキット。
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