JP2011512417A - 血管形成の阻害 - Google Patents

Abstract

血管新生に関連する病態を有する個人における血管形成を阻害するために、機能性ポリペプチドと、リンカーと、ＩｇＧの重鎖分子とを含む融合タンパク、および、該融合タンパクをコードするベクターを提供する。具体的には、哺乳類の眼疾患を治療する目的で、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ＶＥＧＦ拮抗薬をコードするベクターを提供する。
【選択図】図１５

Description

本発明は、血管形成を阻害するか、または病的血管新生、例えば喘息、関節炎、癌、および黄斑変性症を治療するのに有用な組成物および方法に関する。

病的血管新生は、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病網膜症、関節リウマチ、変形性関節症、および喘息のような疾患の主要な要素である。また、腫瘍の増殖と拡散においても重要な役割を果たす。血管新生は、血管新生促進因子と血管新生抑制因子との絶妙なバランスによって調節される。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生に必要であることが知られている。ＶＥＧＦ拮抗薬によるＶＥＧＦ活性の阻害または低下は、ＡＭＤ、関節炎の動物モデル、および各種腫瘍のモデルにおいて血管新生を阻害することが示されている。ＶＥＧＦ活性を阻害または低下させるＶＥＧＦ拮抗薬としては、ＶＥＧＦに対する抗体、可溶性受容体、受容体融合タンパク、ペプチド、および小分子が挙げられるが、これらに限らない。

ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）というタンパクは、ＶＥＧＦに高い親和性で結合することが示されている。Ｆｌｔ−１とＫＤＲの双方とも、その細胞外領域内にＩｇ様ドメインを７個有する。ドメイン２は、ＶＥＧＦの結合に不可欠であることが示されている。それぞれの完全長の可溶性受容体（ドメイン１〜７）およびドメイン１〜３のＩｇＧ Ｆｃへの融合によって、効率的にＶＥＧＦを結合させる。しかし、ＩｇＧ ＦｃのＩｇ様ドメイン２への融合のみでは、ＶＥＧＦを結合させることはできず、Ｉｇ様ドメイン１および２の組み合わせも同様であった（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ， １９９６）。このことから、Ｉｇ様ドメイン１および３は、ドメイン２と共に、効率的なＶＥＧＦの結合に必要であると見られる。

本発明の１つの実施形態によれば、融合タンパクを提供する。この融合タンパクはＸ−Ｙ−Ｚという式を有する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ酸残基のポリペプチドから実質的になる。ＺはＩｇＧの重鎖分子のＣＨ３領域である。

本発明の別の実施形態は、Ｘ−Ｙ−Ｚという式のポリペプチドである。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ残基の空間的分離をもたらすリンカー部分から実質的になる。ＺはＩｇＧの重鎖分子のＣＨ３領域である。

本発明のさらに別の態様はＸ−Ｙ−Ｚという式の融合タンパクである。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ酸残基のポリペプチドから実質的になる。Ｚは抗体分子のＦｃ部分である。

Ｘ−Ｙ−Ｚという式の融合タンパクも提供する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ残基の空間的分離をもたらすリンカー部分から実質的になる。Ｚは抗体分子のＦｃ部分である。

本発明のさらに別の態様は、ポリペプチドＸを多量体化する方法である。ポリペプチドＹを介して、ポリペプチドＸをポリペプチドＺに連結させて、ポリペプチドＸＹＺを形成する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ残基のポリペプチドから実質的になる。Ｚは、ＩｇＧの重鎖分子のＣＨ３領域である。形成されるポリペプチドＸＹＺは、多量体を形成する。

本発明のさらに別の実施形態は、ポリペプチドＸを多量体化する方法を提供する。部分Ｙを介して、ポリペプチドＸをポリペプチドＺに連結させて、ポリマーＸＹＺを形成する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子からなる群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５〜２５アミノ残基の空間的分離をもたらすリンカー部分から実質的になる。ＺはＩｇＧの重鎖分子のＣＨ３領域である。このように形成されるポリペプチドＸＹＺは、多量体を形成する。

本発明の１つの実施形態では、核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２と、リンカーと、多量体化ドメインとを含む融合タンパクをコードする。この融合タンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択される配列を含む。

本発明の別の実施形態では、融合タンパクを提供する。この融合タンパクは、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２と、リンカーと、多量体化ドメインとを含む。この融合タンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択される配列を含む。

本発明の別の実施形態では、インビトロでの方法を提供する。単離した哺乳類細胞に核酸分子を送達する。この核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２と、リンカーと、多量体化ドメインとを含む融合タンパクをコードする。この融合タンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択される配列を含む。この融合タンパクの発現は、プロモーターによって制御する。融合タンパクを発現する細胞を形成する。

本発明のさらに別の実施形態は、融合タンパクを哺乳類に送達する方法である。この融合タンパクを発現する哺乳類細胞を哺乳類に送達する。この細胞は、この融合タンパクを発現および分泌し、それによって、その融合タンパクを哺乳類に供給する。この融合タンパクは、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２と、リンカーと、多量体化ドメインとを含む。この融合タンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択される配列を含む。

本発明の別の態様は、融合タンパクを哺乳類に供給する方法である。ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２と、リンカーと、多量体化ドメインとを含む融合タンパクを哺乳類に送達する。この融合タンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択される配列を含む。この代わりに、前記融合タンパクをコードする核酸構成体を哺乳類に送達することができ、これによって、融合タンパクが哺乳類によって発現される。

本発明の別の態様は、ＶＥＧＦ拮抗薬（本発明の融合タンパクが挙げられるが、これに限らない）によって哺乳類の眼疾患を治療するための改良型の方法である。この改良は、眼疾患を治療するために治療効果のある、減少した量のＶＥＧＦ拮抗薬を提供することを含む。このＶＥＧＦ拮抗薬は、タンパク治療もしくは遺伝子治療、またはこれらの組み合わせによって投与してよい。この減少した量は、哺乳類において、少なくとも６カ月間、例えば、少なくとも９カ月間または少なくとも１年間、維持してよい。

本発明のいくつかの実施形態では、この減少した量は、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜約９５μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜約８５μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌであってよい。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、ＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸を哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、眼疾患を治療するために、このＶＥＧＦ拮抗薬を、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約９５μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約８５μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、ＶＥＧＦ拮抗薬をコードするウイルスベクターを単位投与量当たり約２×１０^６〜約２×１０^１２ｄｒｐという治療効果のある量で哺乳類に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、治療効果のある量は、単位投与量当たり約２×１０^７〜約２×１０^１１ｄｒｐ、約２×１０^８〜約２×１０^１０ｄｒｐである。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、可溶性ＶＥＧＦ受容体または変異体を単位投与量当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約０．５ｍｇ、および約０．１ｍｇ〜約０．２５ｍｇという治療効果のある量で哺乳類に投与することを含む。この可溶性ＶＥＧＦ受容体またはその変異体としては、本発明の融合タンパクが挙げられるが、これに限らない。

いくつかの実施形態では、可溶性ＶＥＧＦ受容体はＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣ（配列番号１もしくは２）、またはＤ２−９ＧＬＹ−ＣＨ３（配列番号２２もしくは２３）である。

いくつかの実施形態では、可溶性ＶＥＧＦ受容体の治療効果のある量は、約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、または約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇである。可溶性ＶＥＧＦ受容体またはその変異体は、反復投与してよい。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、本発明の融合タンパクのＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸を、哺乳類の罹患眼に投与することを含み、眼疾患を治療するために、このＶＥＧＦ拮抗薬を約１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、Ｘ−Ｙ−Ｚという式のＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸を、哺乳類の罹患眼に送達することを含み、このＶＥＧＦ拮抗薬を罹患眼の移行上皮細胞内で、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、Ｘ−Ｙ−Ｚという式のＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸を、硝子体内注射（例えば硝子体中央部への注射）によって、哺乳類の罹患眼に送達することを含み、このＶＥＧＦ拮抗薬を約１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる。

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬は、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜約９５μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜約８５μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる。

１つの実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸はウイルスベクターである。別の実施形態では、このウイルスベクターはＡＡＶ、例えばＡＡＶ２である。

１つの実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬を哺乳類内で、少なくとも６カ月間、例えば、少なくとも９カ月間または１年間、発現させる。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、Ｘ−Ｙ−Ｚという式のＶＥＧＦ拮抗薬を、単位投与量当たり約２×１０^６〜約２×１０^１２ｄｒｐという治療効果のある量で、哺乳類の罹患眼に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、治療効果のある量は、単位投与量当たり約２×１０^７〜約２×１０^１１ｄｒｐ、または約２×１０^８〜約２×１０^１０ｄｒｐである。

いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦ拮抗薬を投与する。第２のＶＥＧＦ拮抗薬は、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ポリペプチド、好ましくは、ＩｇＧのＦｃまたはＣＨ３ドメインに融合したＶＥＧＦ−Ｒ１、より好ましくは、ＦｃまたはＣＨ３に融合したＶＥＧ−Ｒ１のドメイン２であってよい。リンカー、例えば９Ｇｌｙを用いて、ＶＥＧＦ受容体とＩｇＧドメインとを連結してよい。

第２のＶＥＧＦ拮抗薬は、ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブまたはラニビズマブであってよい。

本発明の別の態様は、哺乳類の眼疾患を治療する方法である。この方法は、Ｘ−Ｙ−Ｚという式のＶＥＧＦ拮抗薬を哺乳類の罹患眼に投与することを含み、このＶＥＧＦ拮抗薬は、単位投与量当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇという治療効果のある量である。

いくつかの実施形態では、治療効果のある量は、約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、または約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇである。

本発明の別の態様は、眼に対する遺伝子治療を受けている哺乳類の眼の混濁を軽減する方法である。この方法は、空のカプシドをカプシド全体の９０％以下含む遺伝子治療用ビリオンを哺乳類に（例えば眼に）投与することを含む。

いくつかの実施形態では、空のカプシドは、カプシド全体の８０％以下、７０％以下、６０％以下、または５０％以下である。１つの実施形態では、遺伝子治療用ビリオンは、空のカプシドを実質的に有さない。

１つの実施形態では、ビリオンはＡＡＶビリオン、例えばＡＡＶ２ビリオンである。

いくつかの実施形態では、眼疾患は、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、および糖尿病網膜症からなる群から選択される。

本発明の上記およびその他の実施形態について、以下でさらに詳細に説明するが、これらの実施形態は、血管増殖と炎症とに関連する疾患を治療するための方法と薬剤を当該技術分野に提供する。この薬剤は、天然形態のタンパクよりも向上した安定性とバイオアベイラビリティとをもたらすことができる。

Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃという構成体の９−Ｇｌｙというリンカーの可変領域である。Ｋａｒｐｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ （１９８５）の方法による相対的柔軟性の予測値は、９−Ｇｌｙリンカーを含まないＤ２−Ｆｃという構成体と比べて、柔軟性が平均よりも大きい（＞１）領域として、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃというタンパクのポリグリシン９ｍｅｒ（９−Ｇｌｙ）（ａａ９４〜１０３）というリンカーを示している。いずれの融合タンパクも、□で示されている同一のアミノ酸配列であるｓｐ、すなわちシグナルペプチド（ａａ−２４〜−１）、Ｆｌｔ−１ドメイン２（ａａ１〜９３）、およびＩｇＧｌ−Ｆｃ残基（２４４ａａ）を含む。矢印は、ＳｉｇｎａｌＰ Ｖ２．０というプログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を用いて予測した、シグナルペプチダーゼによる切断部位を表している。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃとの生物活性の比較である。２９３細胞を飢餓培地（Ｍ１９９＋５％ＦＣＳ）中で増殖させ、ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃとの発現カセットを含むプラスミドでトランスフェクションした。７２時間後に馴化培地（ＣＭ）を回収した。ＨＵＶＥＣを９６ウェルプレート（２Ｅ３細胞／ウェル）にて、飢餓培地＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）中に播種し、２４時間後に５０μｌのＣＭ＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた。コントロールのｐＥＧＦＰ（クロンテック。ｐＥＧＦＰは、哺乳類細胞内での蛍光性の向上と発現の上昇のために最適化された、野生型緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のレッドシフト変異体を有する）のプラスミドによるトランスフェクション体に由来するＣＭで、コントロール（＋／−ＶＥＧＦ）をインキュベートした。ポジティブコントロールを５０ｎｇの組み換えタンパクＦｌｔ−１−ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄシステムズ）で処理した。ＨＵＶＥＣの処置後３日目における増殖について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱ_{ｕｅｏｕｓ}試薬（プロメガ）を用いてアッセイした。データは、それぞれ３連でアッセイした２回の実験のＯＤ_４９０の平均値の平均を表している。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃとのウエスタンブロット解析である。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃの双方のタンパクのサイズは、還元ゲルでの泳動に比べて非還元ゲルでの泳動時の方が２倍大きいようである。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃを発現するプラスミドを２９３細胞にトランスフェクションした後、馴化培地から上記のタンパクを充填し、ＳＤＳ−電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ヤギ抗ヒト抗ＩｇＧ１ Ｆｃ抗体とウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体をプローブとして、このブロットを行った。 ９ＧｌｙリンカーとＶＥＧＦ Ｅｘ３を含むｓＦｌｔ−１のハイブリッドタンパクである。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と既に構築済みのタンパクとの構造比較である。３つのすべてのタンパクは、２４ａａのＦｌｔ−１シグナルペプチドと、９３ａａのＦｌｔ−１ドメイン２とからなる、Ｆｌｔ−１ドメイン２の同じアミノ酸配列を含む。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、９ａａの９Ｇｌｙリンカーと、１４ａａのＶＥＧＦ Ｅｘ３と、１２０ａａのヒトＩｇＧ１の重鎖ＦｃのＣＨ３領域とを含む。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３とＤ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃとの生物活性の比較である。タンパクＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３では、ドメイン２が９ＧｌｙリンカーとＶＥＧＦ Ｅｘ３とを通じてＣＨ３領域に連結しているが、このタンパクは、コントロールタンパクのＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃに比べて、ＶＥＧＦ依存性のＨＵＶＥＣの増殖を効率的に阻害もする。５０ｎｇの組み換えＦｌｔ−１−ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄシステムズ）をコントロールとして使用した。 Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃのタンパク活性をＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較したＨＵＶＥＣ増殖アッセイである。 ウエスタンブロットである。（１）Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、（２）Ｄ２−（Ｇ_４Ｓ）_３−Ｆｃ、および（３）−ＥＧＦＰというタンパクを発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の馴化培地（１５μｌのＣＭ）に由来するタンパク（非還元条件および還元条件）をＳＤＳ−電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体とウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体をプローブとして、このブロットを行った。 ９ＧｌｙリンカーまたはＶＥＧＦ Ｅｘ３がある／ないタンパクの組み合わせである。９Ｇｌｙリンカーおよび／またはＶＥＧＦ Ｅｘ３があるか、またはない３つの新規なタンパク（Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３、Ｄ２−ＣＨ３、およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３）の構造比較である。 ９Ｇｌｙ、Ｅｘ３、およびＣＨ３との組み合わせを有するＦｌｔ−１（Ｄ２）構成体によるＨＵＶＥＣ増殖アッセイである。Ｄ２−Ｅｘ３／ＣＨ３、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３、およびＤ２−ＣＨ３というタンパクを含む２９３細胞（５μｌ）に由来する馴化培地をＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較した。 ウエスタンブロットである。（１）Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、（２）Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３（５２／２６ｋＤａ）、および（３）Ｄ２−ＣＨ３（５０／２５ｋＤａ）を発現するプラスミドで２９３細胞をトランスフェクションした。２９３細胞の馴化培地（１５μｌのＣＭ、非還元条件および／または還元条件）に由来するタンパクをＳＤＳ−電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。抗ヒトＶＥＧＦ−Ｒ１ ＨＲＰコンジュゲート（Ｒ＆Ｄシステムズ）をプローブとして、このブロットを行った。 「インビトロでの」ＶＥＧＦ結合アッセイである。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＦｌｔ−１ Ｄ（１〜３）のコントロール可溶性受容体の双方を既知濃度（濃度範囲０．２９〜１５０ｐＭ）含む２９３細胞由来の馴化培地を段階希釈し、１０ｐＭのＶＥＧＦと混合した。続いて、非結合ＶＥＧＦの量をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、他のあらゆる構成体よりも高い親和性でＶＥＧＦに結合する。「ｎ」は、独立した実験（トランスフェクションおよび結合アッセイ）の数を表している。 ＢＩＡｃｏｒｅの計器を用いた表面プラズモン共鳴によって、可溶性Ｆｌｔ−１構成体の結合反応速度を測定した。ｓＦｌｔ−１構成体をセンサーチップ上に固定し、ＶＥＧＦ１６５を０．２〜１５ｎＭの濃度範囲で注入した。ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎというプログラムを用いてセンサーグラムを得て、速度定数ＫａおよびＫｄを割り出し、Ｋｄ／Ｋａ＝ＫＤという比率から解離定数（ＫＤ）を計算した。ＫＤの値が小さいほど、親和性が高いことを意味する。 図１３Ａは、種々のリンカーを有するＦｌｔ−１構成体の発現レベルを示している。図１３Ｂは、種々のリンカーと、ＩｇＧ１のＦｃのＣＨ３部分とを有するＦｌｔ−１構成体の二量体化または多量体化を示している。非還元条件と還元条件との間の差異は、そのタンパクが多量体化されたことを示す。図１３Ｃは、ＶＥＧＦ存在下でのＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおける、馴化培地中に存在する上記Ｆｌｔ−１構成体の阻害生物活性を示している。各構成体は、ＶＥＧＦ不存在下におけるＨＵＶＥＣの増殖レベルに迫る阻害活性を示した。 網膜血管新生（ＮＶ）のマウス酵素誘導網膜症（ＯＩＲ）モデルを用いて、Ｆｌｔ−１構成体の１つをマウスの眼に投与し、血管新生を割り出した。マウスは、過酸素状態に暴露した。処置した眼において血管新生イベントの数を、同じ動物の未処置の眼におけるイベントと比較して割り出した。血管新生イベントが５０％超減少した場合には、その動物を「応答動物」とみなした。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイによって、１つの動物群におけるＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣの発現のレベルと位置を示している。

本発明者の発見は、ドメイン１および３を有さないＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２が、ＶＥＧＦに効率的に結合すると共に、ＶＥＧＦ依存性の内皮細胞の増殖を阻害することができるということである。ドメイン２はリンカーを介して多量体化ドメインに共有結合することができる。リンカーは典型的にはポリペプチド鎖である。この鎖の長さは、６、７、９、１１、１３、１５、またはそれ以上のアミノ酸残基分であってよいが、典型的には５〜２５残基分である。この長さと側鎖組成に応じて、リンカーは、平均柔軟性よりも高い柔軟性を有してよいが、平均柔軟性よりも高い柔軟性を必ずしも有する必要はない。柔軟性は、当該技術分野において既知のアルゴリズムを用いて計算することができる。多量体化ドメインは、サブユニットの会合を促進して、例えば、二量体、三量体、四量体などを形成する多量体タンパク部分である。ＶＥＧＦに効率的に結合し、および／または、ＶＥＧＦ依存性の内皮細胞の増殖を阻害するのに適した組み換えタンパクは、配列番号２、８、２１、２３、および２５からなる群から選択する。

さらに、多量体化ドメインおよびリンカーを様々な他のタンパクまたはタンパク部分と共に用いて、多量体化を誘導できることを本発明者は見出した。このようなタンパクは、多量体化した時のみにリガンドまたは受容体に結合するものであっても、多量体化した時に結合親和性が向上するものであってもよい。多量体化に適したタンパクとしては、細胞外受容体（その一部を含む）、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子が挙げられる。好適なタンパクとしては、チロシンキナーゼ受容体およびセリンスレオニンキナーゼ受容体が挙げられる。細胞外受容体の具体例としては、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク共役受容体、ＦＧＦ受容体、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体などが挙げられる。抗体可変領域の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＳｃＦｖが挙げられる。サイトカインの例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦα、およびＴＮＦ−βが挙げられる。ケモカインの例としては、ＢＣＡ−１／ＢＬＣ、ＢＲＡＫ、ケモカインＣＣ−２、ＣＴＡＣＫ、ＣＸＣＬ−１６、ＥＬＣ、ＥＮＡ、ＥＮＡ−７０、ＥＮＡ−７４、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エクソダス−２、フラクタルカイン、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ、ＧＲＯα（ＭＧＳＡ）、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、Ｉ−３０９、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＬＡＧ−１、ＬＤ７８−β、ＬＥＣ／ＮＣＣ−４、ＬＬ−３７、リンホタクチン、ＭＣＰ、ＭＣＡＦ（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ、ＭＤＣ、ＭＤＣ−２、ＭＤＣ−４、ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、ＭＩＰ−３／ＭＰＩＦ−１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４（ＰＡＲＣ）、ＭＩＰ−５、ＮＡＰ−２、ＰＡＲＣ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−２、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、ＴＡＲＣ、およびＴＥＣＫが挙げられる。増殖因子の例としては、ヒトアンフィレギュリン、ヒト血管新生タンパク、ヒトＡＣＥ、ヒトアンギオゲニン、ヒトアンギオポイエチン、ヒトアンギオスタチン、ヒトベータセルリン、ヒトＢＭＰ、ヒトＢＭＰ−１３／ＣＤＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−１４／ＣＤＭＰ−１、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−７、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトコロニー刺激因子、ヒトｆｌｔ３−リガンド、ヒトＧＣＳＦ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ、ヒト結合組織増殖因子、ヒトクリプト−１、ヒトクリプティック、ヒトＥＣＧＦ、ヒトＥＧＦ、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ、ヒトエリトロポイエチン、ヒトフェチュイン、ヒトＦＧＦ、ヒトＦＧＦ−１、ヒトＦＧＦ−１０、ヒトＦＧＦ−１６、ヒトＦＧＦ−１７、ヒトＦＧＦ−１８、ヒトＦＧＦ−１９、ヒトＦＧＦ−２、ヒトＦＧＦ−２０、ヒトＦＧＦ−３、ヒトＦＧＦ−４、ヒトＦＧＦ−５、ヒトＦＧＦ−６、ヒトＦＧＦ−７／ＫＧＦ、ヒトＦＧＦ−８、ヒトＦＧＦ−９、ヒトＦＧＦ−酸性、ヒトＦＧＦ−塩基性、ヒトＧＤＦ−１１、ヒトＧＤＦ−１５、ヒト成長ホルモン放出因子、ヒトＨＢ−ＥＧＦ、ヒトヘレグリン、ヒトＨＧＦ、ヒトＩＧＦ、ヒトＩＧＦ−Ｉ、ヒトＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインヒビン、ヒトＫＧＦ、ヒトＬＣＧＦ、ヒトＬＩＦ、種々のヒト増殖因子、ヒトＭＳＰ、ヒトミオスタチン、ヒトミオスタチンプロペプチド、ヒト神経成長因子、ヒトオンコスタチンＭ、ヒトＰＤ−ＥＣＧＦ、ヒトＰＤＧＦ、ヒトＰＤＧＦ（ＡＡホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ（ＡＢホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ（ＢＢホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ（ＣＣホモダイマー）、ヒトＰＩＧＦ、ヒトＰＩＧＦ、ヒトＰＩＧＦ−１、ヒトＰＩＧＦ−２、ヒトＳＣＦ、ヒトＳＭＤＦ、ヒト幹細胞増殖因子、ヒトＳＣＧＦ−α、ヒトＳＣＧＦ−β、ヒトトロンボポイエチン、ヒトトランスホーミング増殖因子、ヒトＴＧＦ−α、ヒトＴＧＦ−β、およびヒトＶＥＧＦが挙げられる。

Ｆｌｔ−１受容体タンパクは、７個のＩｇ様ドメインを含む細胞外部分を有する。これらは、ジェンバンク受託番号Ｐ１７９４８の残基番号３２〜１２３、１５１〜２１４、２３０〜３２７、３３５〜４２１、４２８〜５５３、５５６〜６５４、６６１〜７４７に位置する（配列番号１５も参照されたい）。残基番号１〜２６はシグナル配列を含む。Ｆｌｔ−１のタンパクは、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００２０１９（配列番号１４）で示されているＤＮＡ配列によってコードされる。

多量体化ドメインは、当該技術分野で既知であるように用いることができる。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２λの重鎖のＦｃ部分の配列、例えば、ＣＨ３のみ（ａａ３７１〜４７７）、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方（ａａ２４７〜４７７）を用いることができる。Ｉｇ分子のＦｃ部分は、パパイン酵素によって抗体分子全体を切断することで得られるものである。他の方法を用いて、これらの部分を得ることもできる。ＩｇＧ１λの重鎖のタンパク配列については、ジェンバンク受託番号Ｙ１４７３７および配列番号１０を参照されたい。他のＦｃ領域、例えば、他のＩｇＧタイプのＦｃ領域、ならびに、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥという抗体のＦｃ領域を用いることができる。また、ＶＥＧＦの多量体化領域も用いることができる。ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００３３７６および配列番号１１に示されている。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、ジェンバンク受託番号ＣＡＣ１９５１３および配列番号１２に示されている。ＶＥＧＦエクソン３（ＶＥＧＦ Ｅｘ３）によってコードされる、ＶＥＧＦの多量体化領域（配列番号１３）は、ＶＥＧＦタンパク（配列番号１２）のアミノ酸残基７５〜８８周辺にある。多量体化ドメインは、単量体融合タンパクの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を非変性ポリアクリルアミドゲル上に、マルチマーに適した速度で移動させる。糖鎖付加は、ゲル中におけるタンパクの移動に影響を及ぼすことができる。本明細書には特定の配列が示されているが、対立遺伝子多型のような変異体も用いることができる。典型的には、このような変異体は、開示されている配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有することになる。

多量体化は、例えば、本明細書に示されているように、還元および非還元ゲルを用いてアッセイすることができる。また、多量体化は、リガンド／受容体に対するタンパクの結合親和性の向上を検出することによってアッセイすることもできる。これに関しては、ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）による表面プラズモン共鳴アッセイを用いることができる。これらのアッセイは、センサーチップ表面に近い水層の屈折率の変化を測定することによって、質量の変化を検出する。当該技術分野において既知のいずれの方法を用いても、多量体化を検出することができる。

本発明によるリンカー部分は、例えば、５〜１００アミノ酸残基、５〜７５アミノ酸残基、５〜５０アミノ酸残基、５〜２５アミノ酸残基、５〜２０アミノ酸残基、５〜１５アミノ酸残基、５〜１０アミノ酸残基、５〜９アミノ酸残基からなることができる。有用なリンカーの例としては、ｇｌｙ_９（配列番号２７）、ｇｌｕ_９（配列番号２８）、ｓｅｒ_９（配列番号２９）、ｇｌｙ_５ｃｙｓｐｒｏ_２ｃｙｓ（配列番号３０）、（ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_３（配列番号３１）、ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号３２）、ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号１３）、ＧｌｙＡｓｐＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｒｇＡｓｎＧｌｎＬｙｓ（配列番号２６）、およびＧｌｙ_９ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号３４）が挙げられる。用いることができる他のポリペプチドリンカーとしては、５、７、または３０残基といった様々な長さのポリグリシンが挙げられる。加えて、Ｆｌｔ−１の他の部分、例えば、Ｆｌｔ−１のドメイン３をリンカーとして用いることができる。配列番号１５を参照されたい。また、リンカー部分は、ポリエチレングリコールのような他のポリマーから作製することができる。このようなリンカーは、１０〜１０００個、１０〜５００個、１０〜２５０個、１０〜１００個、または１０〜５０個のエチレングリコールモノマー単位を有することができる。好適なポリマーは、適切な範囲のアミノ酸残基によって占められる大きさに近い大きさのものでなければならない。典型的な大きさのポリマーは、約１０〜２５オングストロームの空間をもたらすことになる。

本発明による融合タンパクは、当該技術分野において既知の手段によって作製することができる。このようなタンパクは、合成によって、または作製する部分をつなげることによって作製することができるが、組み換えによる製法を用いることもできる。融合遺伝子配列は、標準的な組み換えＤＮＡツールを用いて作製することができる。この融合遺伝子配列を複製するために、融合遺伝子配列をベクター、例えばウイルスベクターまたはプラスミドベクターに挿入することができる。最終的な受容細胞において機能するプロモーター配列を、融合遺伝子配列の上流に導入することができる。用いるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターであることができる。各タイプの例は、当該技術分野において周知である。ベクターは、当該技術分野において既知のいずれかの手段によって、宿主細胞または哺乳類に導入することができる。用いることができる好適なベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびプラスミドが挙げられる。ベクターがウイルスベクターであり、そのベクターがパッケージングされている場合、ビリオンを用いて細胞を感染させることができる。裸のＤＮＡを用いる場合には、特定の宿主細胞に適したトランスフェクション手順または形質転換手段を用いることができる。融合遺伝子の送達のために、ポリマー、リポソーム、またはナノ粒子を用いた裸のＤＮＡの調製物を用いることができる。本発明による組み換え構成体で形質転換またはトランスフェクションできる細胞は、当業者にとって利便的であるいずれのものであってもよい。用いてよい代表的な細胞型としては、細菌、酵母、昆虫、および哺乳類細胞が挙げられる。哺乳類細胞の中では、利便的である多くの組織型細胞を選択してよい。用いてよい代表的な細胞は、線維芽細胞、肝実質細胞、内皮細胞、幹細胞、造血細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、およびケラチノサイトである。これらの細胞は、インビトロでタンパクを産生するために用いることができるか、または、コードされたタンパクをインビボで産生させるために、ヒトを含む哺乳類に送達することができる。この送達手段は、核酸を哺乳類に送達するもの、ウイルスベクターを哺乳類に送達するもの、および融合タンパクを哺乳類に送達するものに代わるものである。

タンパクまたは核酸の組成物は、緩衝液、水性もしくは親油性担体、殺菌済みまたは非殺菌のビヒクル、発熱性または非発熱性のビヒクルのような担体中に存在することができる。非発熱性のビヒクルは、注射製剤として有用である。製剤は、液体または固形、例えば、凍結乾燥したものであることができる。また、製剤は、エーロゾルとして投与することもできる。組成物は、１つ以上の融合タンパクもしくは１つ以上の核酸、または、融合タンパクと核酸の両方を含んでもよい。組成物中の融合タンパクおよび／または核酸は均質であってよく、その場合には、ホモマルチマータンパクが形成されることになり、あるいは、融合タンパクおよび／または核酸は、組成物中において不均質であってよく、その場合には、ヘテロマルチマータンパクが形成されることになる。ヘテロマルチマーの場合には、典型的に、Ｘ部分は融合タンパク間で異なることになるが、Ｚ部分は融合タンパク間で同一になる。

融合タンパクは、当該技術分野において既知のいずれかの手段によって、細胞または哺乳類宿主に供給することができる。タンパクは、細胞または宿主に送達することができる。核酸は、細胞または宿主に投与することができる。形質転換またはトランスフェクションした細胞は、細胞または宿主に投与することができる。後者の場合には、移植拒絶反応を軽減するために、同一の遺伝的背景の細胞が望ましい。

哺乳類の宿主動物への送達に適した細胞としては、いずれかの器官、腫瘍、または細胞系に由来するいずれかの哺乳類細胞型が挙げられる。例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、およびブタの細胞を用いることができる。用いるのに適した細胞のタイプとしては、線維芽細胞、肝実質細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、および幹細胞が挙げられるが、これらに限らない。

融合タンパクまたは融合タンパクをコードする核酸の送達手段としては、融合タンパクを発現する細胞の送達、融合タンパクの送達、および融合タンパクをコードする核酸の送達が挙げられる。融合タンパク、細胞、または核酸は、例えば、注射、カテーテル法、または内視鏡によって、所望の器官または腫瘍に直接送達することができる。また、これらは、静脈内、気管支内、腫瘍内、髄腔内、筋肉内、眼内、局所、皮下、経皮、または経口送達することができる。効果的に治療できる患者としては、滲出型加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、関節リウマチ、変形性関節症、ブドウ膜炎、喘息、および癌を患う患者が挙げられる。この治療は、疾患の症状および／もしくはマーカー、ならびに／または、疾患の重症度を改善することになる。

分泌タンパクをコードする遺伝子治療用ウイルスベクター（例えばＡＡＶ２）は、（例えばヒト以外の霊長類において、）硝子体前部または硝子体中央部に送達すると、眼の移行上皮細胞を形質導入する。形質導入した細胞から産生される分泌タンパクは、前眼房で利用可能である。したがって、硝子体内へのウイルス遺伝子の送達によって、眼の最前部の疾患を治療することができる。このような眼の最前部の疾患の例としては、眼乾燥症候群、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、角膜血管新生、角膜移植片拒絶反応が挙げられるが、これらに限らない。分泌タンパクの例としては、ｓＦＬＴ１、ＩＬ−１０、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８ｂｐ、可溶性ＰＤＬ１−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇ、可溶性ＩＬ−１７Ｒ、および可溶性ＩＬ２３Ｒが挙げられるが、これらに限らない。

核酸は、いずれかの望ましいベクター内で、哺乳類、特にヒトに送達することができる。このベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプラスミドベクターを含むウイルスまたは非ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスの代表的な型としては、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。核酸は、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、およびポリマーとの複合体を含め、十分に効率的な送達レベルをもたらすいずれかの望ましい形態で投与することができる。

タンパク治療と核酸治療の組み合わせを用いることができる。例えば、本発明による融合タンパクを患者に投与することができる。好反応が観察される場合には、長期効果のために、融合タンパクをコードする核酸分子を投与することができる。あるいは、タンパクと核酸を同時に、またはほぼ同時に投与することができる。別の代替法では、リガンドに対する抗体または融合タンパクを投与してから、または投与と同時に、受容体に対する抗体または融合タンパクを投与することができる。別の選択肢では、一方が抗体をコードし、もう一方が融合タンパクをコードする核酸の組み合わせを用いる。本発明のＦｌｔ−１構成体（タンパク形態、または核酸形態のいずれか）と組み合わせて用いることができるいくつかの抗体は、ベバシズマブおよびラニビズマブであり、いずれもＶＥＧＦに向けられる。ベバシズマブは癌を、ラニビズマブは黄斑変性症を治療するのに特に有用である。

本発明の実践時には、別段の指示がない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を採用し、これらの技術は、当該技術分野の範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．， １９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉ ＆ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ． Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， ｅｄｓ．， １９８７）、ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９１）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ ｅｄｓ． （１９８８））、およびＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））のような文献で十分に説明されている。

本明細書で使用する場合、本発明による「減少した量」のＶＥＧＦ拮抗薬とは、そのＶＥＧＦ拮抗薬の（哺乳類内における）局所濃度を指す。局所濃度は、同じ適応症における市販の「基準ＶＥＧＦ拮抗薬」の局所濃度よりも低いときに、減少した量とみなされる。例えば、「減少した量」は、基準ＶＥＧＦ拮抗薬の局所濃度の９０％、７５％、５０％、２５％、１０％、または５％であってよい。例として、ラニビズマブ（ルセンティス）は、ＡＭＤを治療するための抗ＶＥＧＦ抗体の形態をした市販のＶＥＧＦ拮抗薬である。本発明に従って、ＶＥＧＦ拮抗薬を用いてＡＭＤを治療する場合、そのＶＥＧＦ拮抗薬の減少した量は、抗体を眼に投与した後におけるラニビズマブの局所濃度よりも低い局所濃度として定義する。眼内におけるラニビズマブの局所濃度は、１回投与後において約１００μｇ／ｍｌと推定される。したがって、本発明に従ってＡＭＤを治療するために用いるＶＥＧＦ拮抗薬は、減少した量で、すなわち１００μｇ／ｍｌ未満、例えば、９５μｇ／ｍｌ以下、８５μｇ／ｍｌ以下、７５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、２５μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、または５μｇ／ｍｌ以下の局所濃度で供給する。本発明のＶＥＧＦ拮抗薬がタンパクであるときには、タンパク治療または遺伝子治療のいずれかによって供給してもよい。

本明細書で使用する場合、「基準ＶＥＧＦ拮抗薬」とは、市販のＶＥＧＦ拮抗薬を指す。基準ＶＥＧＦ拮抗薬は、ＶＥＧＦのシグナル伝達を拮抗するものであれば、いずれの形態のものであってもよい。例えば、基準ＶＥＧＦ拮抗薬は、融合タンパク、またはＶＥＧＦ抗体のようなその他のタイプの分子であってよい。

ウイルスベクター粒子（パッケージングしたゲノム）を含むウイルスビリオン（例えば遺伝子治療用ビリオン）のストックまたは調製物は、そのストックに存在するビリオンの少なくとも約５０％〜９９％またはそれ以上が、パッケージングしたゲノム（すなわちＡＡＶベクター粒子）を持つビリオンである場合、空のカプシドを「実質的に有さない」。好ましくは、このベクター粒子は、ストックに存在するビリオンの少なくとも約７５％〜８５％、より好ましくは約９０％を占め、さらに好ましくは、ストックに存在するビリオンの少なくとも約９５重量％、もしくはさらには９９重量％以上、またはこれらの範囲の間のいずれかの整数分の割合を占める。つまり、得られるストックの約４０％〜約１％以下、好ましくは約２５％〜約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、さらに好ましくは約５％〜約１％以下が空のカプシドを含む場合、ストックは空のカプシドを実質的に有さない。空のカプシドを実質的に有さないウイルスビリオンは、例えば米国特許第７，２６１，５４４号に記載されているように調製してよく、この特許は参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。空のカプシドは、当該技術分野において既知の方法、例えばＰｒｏｇｅｎ Ｃａｐｓｉｄ Ｅｌｉｓａによって測定してよい。

遺伝子送達ビヒクルは、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができるいずれかの分子である。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む）、リポタンパク、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、細菌、ウイルス（バキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスなど）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、
真菌ベクター、ならびに、当該技術分野において一般的に用いられるその他の組み換え用ビヒクルであって、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における発現に関して説明がなされており、遺伝子治療および単なるタンパク発現のために用いることができるビヒクルである。

遺伝子送達、遺伝子移入などは、本明細書で使用する場合には、導入のために用いられる方法を問わず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と称する場合もある）の導入を指す用語である。このような方法としては、ベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または、タンパク質に基づくかもしくは脂質に基づく種々の他の遺伝子送達複合体によるもの）のような種々の周知の技術、ならびに、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促す技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために用いられる他の種々の技術）が挙げられる。導入したポリヌクレオチドは、宿主細胞中に安定的または一時的に保持させてよい。安定保持には典型的に、導入したポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製起点を含むこと、あるいは、染色体外レプリコン（例えばプラスミド）、または、核もしくはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコンに組み込まれることのいずれかが必要になる。当該分野において既知であると共に、本明細書に記載されているように、多くのベクターが、哺乳類細胞への遺伝子の移入を媒介できることで知られている。

外因性ポリヌクレオチドは、宿主への送達のために、静脈内投与、筋肉内投与、門脈内投与、またはその他の経路による投与を介して、アデノウイルス、部分欠失したアデノウイルス、完全欠失したアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、裸のプラスミド、プラスミド／リポソーム複合体などのようなベクターに挿入する。本発明の方法および組成物で用いることができる発現ベクターとしては、例えばウイルスベクターが挙げられる。インビボとエクスビボの双方において、最も頻繁に用いられる遺伝子治療の投与法の１つは、遺伝子の送達のためにウイルスベクターを使用することである。多くの種のウイルスが知られており、多くは、遺伝子治療目的で研究されてきている。最も広く使用されているウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するものが挙げられる。

アデノウイルスは、エンベロープがなく、約３６ｋｂのゲノムを持つ核ＤＮＡウイルスであり、古典的遺伝学と分子生物学における研究（Ｈｕｒｗｉｔｚ， Ｍ．Ｓ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６、Ｈｉｔｔ， Ｍ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｔ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９９）を通じて詳しい特徴が明らかにされてきた。そのウイルス遺伝子は、２つの時間的部類のウイルスタンパクの産生との関連で、初期転写ユニット（Ｅ１〜Ｅ４と表される）と後期転写ユニット（Ｌ１〜Ｌ５と表される）に分類される。これらのイベントを区別するのは、ウイルスＤＮＡの複製である。ヒトアデノウイルスは、赤血球の血球凝集、発癌性、ＤＮＡとタンパクのアミノ酸の組成と相同性、および抗原的関連性を含む特性に基づいて、多数の血清型に分類される（約４７種類あり、適宜番号が付されると共に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦという６つのグループに分類される）。

組み換えアデノウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に対する向性、潜在的病原性が最小限であること、ベクターストックの調製のために高力価で複製する能力、および大きな挿入物を運ぶ潜在力を含め、遺伝子送達ビヒクルとして使用するためのいくつかの利点を有する（Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｋ．Ｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：３９−６６， １９９２、Ｊｏｌｌｙ， Ｄ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４ １９９４）。偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）、および部分欠失したアデノウイルス（「ＤｅＡｄ」という）のように、アデノウイルスの様々な遺伝子配列が欠失したアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの特徴のうち、受容細胞への核酸の送達に適したビヒクルにアデノウイルスをならしめる望ましい特徴を利用するように設計されてきている。

特に、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルス」またはミニアデノウイルスベクターとしても知られている偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる最小限のシス作用ヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスゲノム由来のアデノウイルスベクターであり、１つ以上の導入遺伝子を含むことができる（偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）およびＰＡＶの製造方法について取り扱っている米国特許第５，８８２，８７７号を参照されたい。この特許は参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＰＡＶは、アデノウイルスの特徴のうち、遺伝子送達に適したビヒクルにアデノウイルスをならしめる望ましい特徴を利用するように設計されてきている。アデノウイルスベクターは一般に、ウイルスの増殖のために必須ではない領域の欠失によって、最大で８ｋｂの大きさの挿入物を保持できるが、最大運搬能は、ＰＡＶを含め、ウイルスコーディング配列の大半が欠失した部分を含むアデノウイルスベクターの使用により達成することができる。Ｇｒｅｇｏｒｙらの米国特許第５，８８２，８７７号、Ｋｏｃｈａｎｅｋ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５７３１−５７３６， １９９６、Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１３５６５−１３５７０， １９９６、Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：８９４４−８９６０， １９９６、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：１１−２２， １９９６、米国特許第５，６７０，４８８号、１９９６年１０月２４日に公開された国際公開第９６／３３２８０号、１９９６年１２月１９日に公開された国際公開第９６／４０９５５号、１９９７年７月１９日に公開された国際公開第９７／２５４４６号、１９９５年１１月９日に公開された国際公開第９５／２９９９３号、１９９７年１月３日に公開された国際公開第９７／００３２６号、Ｍｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０：２７０９−２７１６， １９９８を参照されたい。最大で約３６ｋｂの外来核酸を収容することができるこのようなＰＡＶは、ベクターに対する宿主免疫応答の可能性、または複製能を持つウイルスの産生が軽減される一方で、ベクターの運搬能が最適化されるので、有用である。ＰＡＶベクターは、複製起点を含む５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ならびに、ＰＡＶゲノムのパッケージングに必要なシス作用ヌクレオチド配列を含み、適切な調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどと共に、１つ以上の導入遺伝子を収容することができる。

他に、部分欠失したアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスの初期遺伝子の大半がベクターから欠失され、条件的プロモーターの制御下でプロデューサー細胞の染色体内に配置される部分欠失したアデノウイルス（「ＤｅＡｄ」という）ベクターを提供する。プロデューサー細胞内に配置される欠失可能なアデノウイルス遺伝子としては、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４（ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７のみをプロデューサー細胞内に配置する必要がある）、ｐＩＸ、およびｐＩＶａ２を挙げてよい。Ｅ３もベクターから欠失してよいが、ベクター産生に必要ではないので、プロデューサー細胞から削除することができる。通常、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子はベクター内に存在するが、ＭＬＰは、条件的プロモーターに置き換えてもよい。

ＤｅＡｄベクターおよびプロデューサー細胞株での使用に適した条件的プロモーターとしては、細胞毒性または細胞増殖抑制性アデノウイルス遺伝子が細胞に有害なレベルで発現されないように、非誘導状態における基底発現量が低い、ならびに、ベクターの複製と組み立てを支えるのに十分な量のウイルスタンパクが産生されるように、誘導状態における発現レベルが高いといった特徴を有するものが挙げられる。ＤｅＡｄベクターおよびプロデューサー細胞株での使用に適した好ましい条件的プロモーターとしては、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンを基材とする二量体化遺伝子制御系、エクジソン遺伝子制御系、ならびに、テトラサイクリン遺伝子制御系が挙げられる。Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ １０：１４９９−５０７に記載されているＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）の技術（テキサス州ウッドランズのバレンティス社）も本発明において有用である場合があり、この文献の開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。部分欠失したアデノウイルス発現系については、国際公開第９９／５７２９６号にさらに記載されており、この特許の開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ゲノムのサイズが４．６ｋｂである一本鎖のヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐタンパク（Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶの複製、レスキュー、転写、および組み込みをコードするｃａｐ遺伝子という２つの主要な遺伝子を含む一方で、このｃａｐタンパクはＡＡＶウイルス粒子を形成する。ＡＡＶの名前は、ＡＡＶの増殖感染を可能にするのに、すなわち、宿主細胞におけるＡＡＶ自体の複製を可能とするのに必須の遺伝子産物を供給するために、アデノウイルスまたは他のヘルパーウイルス（例えばヘルペスウイルス）に依存することに由来する。ヘルパーウイルスがないと、ＡＡＶは、宿主細胞のヘルパーウイルス、通常、アデノウイルスへの重複感染によりレスキューされるまで、プロウイルスとして宿主細胞の染色体に組み込まれる（Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｏｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：９７−１２７， １９９２）。

遺伝子移入ベクターとしてのＡＡＶの利点は、そのいくつかの独特の生態特徴に起因する。ＡＡＶゲノムの両末端は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）として知られるヌクレオチド配列であり、この配列は、ウイルスの複製、レスキュー、パッケージング、および組込みに必要なシス作用ヌクレオチド配列を含む。トランスのｒｅｐタンパクによって媒介されるＩＴＲの組み込み機能により、ＡＡＶゲノムは、ヘルパーウイルスの不在下で、感染後に、細胞染色体に組み込まれることが可能となる。このウイルスのこの独特な特性は、目的の遺伝子を含む組み換えＡＡＶの細胞ゲノムへの組み込みを可能とするので、遺伝子移入におけるＡＡＶの使用と関連性がある。したがって、遺伝子移入の多くの目的にとって理想的である安定した形質転換は、ｒＡＡＶベクターの使用によって実現してよい。さらに、ＡＡＶの組み込み部位は十分に確立されており、ヒトの１９番染色体にあることが突き止められている（Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：２２１１−２２１５， １９９０）。このように組み込み部位を予測可能であることにより、宿主遺伝子を活性化もしくは不活化するか、またはコーディング配列を遮断する場合のある細胞ゲノムへのランダムな挿入イベント（このようなイベントにより、ＡＡＶの組み込みのベクターの使用が制限される）の危険性が減少し、ｒＡＡＶベクターの設計時にこの遺伝子を除去すると、ｒＡＡＶベクターで観察されてきたように組み込みパターンが変化する場合がある（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８：２７５−２８４， １９９７）。

遺伝子移入のためにＡＡＶを使用することには、他の利点がある。ＡＡＶの宿主域は広い。さらに、レトロウイルスと異なり、ＡＡＶは静止細胞と分裂細胞の両方に感染することができる。加えて、ＡＡＶはヒト疾患に関連付けられておらず、レトロウイルス由来の遺伝子移入ベクターにより引き起こされてきた多くの問題を未然に防ぐ。

組み換えｒＡＡＶベクターの産生への標準的アプローチでは、一連の細胞内イベント、すなわち、ＡＡＶのＩＴＲ配列に隣接する目的導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターゲノムで宿主細胞をトランスフェクションすることと、トランスで必要とされるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐタンパクの遺伝子をコードするプラスミドによって宿主細胞をトランスフェクションすることと、トランスフェクションした細胞をヘルパーウイルスに感染させて、トランスで必要とされる非ＡＡＶヘルパー機能を供給することとの調整が必要とされてきた（Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｏｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９， １９９２）。アデノウイルス（または他のヘルパーウイルス）タンパクは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子の転写を活性化し、続いて、ｒｅｐタンパクがＡＡＶのｃａｐ遺伝子の転写を活性化する。次いで、ｃａｐタンパクは、ＩＴＲ配列を利用して、ｒＡＡＶゲノムをｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングする。したがって、パッケージング効率は、部分的には、十分な量の構造タンパクのアベイラビリティによって、および、ｒＡＡＶベクターゲノムにおいて必要とされるあらゆるシス作用パッケージ配列のアクセシビリティによって決まる。

レトロウイルスベクターは遺伝子送達のための一般的ツールである（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ （１９９２） ３５７：４５５−４６０）。再配列していない単一コピー遺伝子を、広範な齧歯類、霊長類、およびヒトの体細胞中に送達するレトロウイルスベクターの能力によって、細胞への遺伝子の移入に十分に適したレトロウイルスベクターが作製される。

レトロウイルスは、ウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、ゲノムＲＮＡはＤＮＡ中間体に逆転写され、この中間体は、感染した細胞の染色体ＤＮＡ中に非常に効率的に組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ中間体をプロウイルスと言う。プロウイルスの転写、および感染性ウイルスへの組み立ては、適切なヘルパーウイルスの存在下で、または、混入ヘルパーウイルスの同時産生を伴わずにカプシド形成を可能とする適切な配列を含む細胞株で行われる。カプシド形成のための配列を、適切なベクターとのコトランスフェクションによりもたらす場合には、ヘルパーウイルスは組み換えレトロウイルスの産生に必要ではない。

レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接する３つの遺伝子、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを有する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、カプシド、およびヌクレオカプシド）タンパクをコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープの糖タンパクをコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役割を果たす。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のすべてのシス作用配列を含む。レンチウイルスは、（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、および／またはＳＩＶ中に、）ｖｉｔ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、およびｖｐｘを含む追加の遺伝子を有する。５’ＬＴＲに隣接しているのは、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子中へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド形成に必要な配列（Ｐｓｉ部位）である。カプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列が、ウイルスゲノムから欠損している場合には、ゲノムＲＮＡのカプシド形成を阻害するシス欠損がもたらされる。しかし、得られた突然変異体は依然として、すべてのビリオンタンパクの合成を導くことができる。

レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節または構造的機能を有する他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。より高い複雑性により、レンチウイルスは、潜伏感染の過程で見られるように、その生活環を調節できる。典型的なレンチウイルスは、ＡＩＤＳの原因菌であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。インビボでは、ＨＩＶは、リンパ球およびマクロファージのように、めったに分裂しない最終分化細胞に感染することができる。インビトロでは、ＨＩＶは、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）の初代培養物、ならびに、アフィジコリンまたはガンマ照射による処理によって細胞周期を停止させたＨｅＬａ−Ｃｄ４またはＴリンパ球細胞に感染することができる。細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を通じたＨＩＶプレインテグレーション複合体の核内への能動輸送に依存している。これは、複合体中の部分的に重複している多数の分子決定因子と、標的細胞の核内輸送機構との相互作用によって生じる。同定されている決定因子としては、ｇａｇマトリックス（ＭＡ）タンパク中の機能性核内保留シグナル（ＮＬＳ）、核親和性のビリオン随伴タンパク、ｖｐｒ、およびｇａｇＭＡタンパク中のＣ−末端ホスホチロシン残基が挙げられる。遺伝子治療でのレトロウイルスの使用については、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号、および米国特許第５，９９４，１３６号に記載されており、これらの特許の開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡを細胞に送達する他の方法では、送達用のウイルスを使用しない。例えば、カチオン性両親媒性化合物を用いて、本発明の核酸を送達することができる。生物活性分子の細胞内送達を促すように設計された化合物は、非極性環境と極性環境の両方（例えば、形質膜、組織液、細胞内区画、および生物活性分子自体の中または上）と相互作用しなければならないので、このような化合物は、典型的に極性ドメインと非極性ドメインの両方を含むように設計される。このようなドメインを両方とも有する化合物は、両親媒性物質と称してよく、（インビトロでの用途か、インビボでの用途かを問わず、）上記のような細胞内送達を促すのに用いられるものとして開示されてきた多くの脂質および合成脂質は、この定義を満たしている。このような両親媒性物質のうち特に重要な部類の１つがカチオン性両親媒性物質である。一般に、カチオン性両親媒性物質は、生理的ｐＨまたはその周辺で正電荷を持つことができる極性基を有し、この特性は、当該技術分野において、例えば、ＤＮＡのような負電荷を持つポリヌクレオチドを含む多くの種類の生物活性（治療用）分子と両親媒性物質との相互作用の程度を定義する際に重要であると理解されている。

遺伝子送達のためにカチオン性両親媒性化合物を含む組成物を使用することについては例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第５，２７９，８３３号、米国特許第５，６５０，０９６号、米国特許第５，７４７，４７１号、米国特許第５，７６７，０９９号、米国特許第５，９１０，４８７号、米国特許第５，７１９，１３１号、米国特許第５，８４０，７１０号、米国特許第５，７８３，５６５号、米国特許第５，９２５，６２８号、米国特許第５，９１２，２３９号、米国特許第５，９４２，６３４号、米国特許第５，９４８，９２５号、米国特許第６，０２２，８７４号、米国特許第５，９９４，３１７号、米国特許第５，８６１，３９７号、米国特許第５，９５２，９１６号、米国特許第５，９４８，７６７号、米国特許第５，９３９，４０１号、および米国特許第５，９３５，９３６号に記載されており、これらの開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

加えて、本発明の核酸は、「裸のＤＮＡ」を用いて送達することができる。トランスフェクション促進タンパク、ウイルス粒子、リポソーム製剤、荷電脂質、およびリン酸カルシウム沈殿剤との結合なしに、プロモーターに機能可能に結合される所望のポリペプチドまたはペプチドをコードする非感染性の非組み込み型ＤＮＡ配列を送達する方法が、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，９６３，６２２号、米国特許第５，９１０，４８８号に記載されており、これらの開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

ウイルス成分と非ウイルス成分とを兼ね備える遺伝子移入系も報告されている（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１５４８、Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１１５４２、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６０９９、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２３００、Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８８５０、Ｋｕｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：１４３７、およびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：１８５）。大半のケースでは、アデノウイルスを遺伝子送達系に組み入れて、そのエンドソーム特性を利用してきた。報告されている、ウイルス成分と非ウイルス成分との組み合わせは一般に、アデノウイルスと遺伝子送達複合体との共有結合、または、非結合アデノウイルスとカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体とのコインターナリゼーションのいずれかを伴う。

ＤＮＡおよびタンパクを眼に送達するためには、典型的には局所投与を行う。局所投与は、投与する必要のあるＤＮＡの量を制限すると共に、全身性副作用を制限するという利点を有する。多くの考え得る送達形態を用いることができ、その形態としては、遺伝子銃による角膜への局所投与、結膜下注射、前房内注射、点眼による角膜への投与、側頭の角膜輪部を介した前眼房への注射、基質内注射、電気パルスと組み合わせた角膜投与、角膜内注射、網膜下注射、硝子体内注射（例えば、硝子体前部、中央部、または後部注射）、および眼内注射が挙げられるが、これらに限らない。あるいは、細胞をエクスビボでトランスフェクションまたは形質導入し、眼内移植によって送達することができる。Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６： ４９０−４９４， ２００２、Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： ６４９−６５４， １９９６、Ｂｏｒｒａｓ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７６： ６４３−６５２， ２００３、Ｃｈａｕｍ， Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ４７： ４４９−４６９， ２００２、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２： ５３７−５４４ （２００２）、Ｌａｉ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ８０４−８１３， ２００２、Ｐｌｅｙｅｒ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２： ２７７−２９３， ２００３を参照されたい。

提案した種々の治療剤および投与の効果は、特定の疾患用の好適な動物モデルで試験することができる。例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３５： １０１−１１１， １９９４に記載されているように、マウスの酵素誘導網膜症モデルで、未熟児網膜症を試験することができる。ヒト誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、加齢性黄斑変性症のような疾患で生じるので、マウスのレーザー誘導脈絡膜血管新生をモデルとして用いることができる（Ｔｏｂｅ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５３： １６４１−１６４６， １９９８）。他のＣＮＶモデルは、霊長類、ラット、ミニブタ、およびウサギで開発されてきている。加齢性黄斑変性症のマウスモデルは、遺伝子欠損マウスで開発されてきている。単球化学誘導タンパク−１、またはＣ−Ｃケモカイン受容体−２のいずれかを欠損したマウスは、加齢性黄斑変性症の特徴を持つようになる（Ａｍｂａｔｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ９： １３９０−１３９７， ２００３）。

疾患の予防または治療においては、本発明のＶＥＧＦ拮抗薬（タンパクまたは遺伝子治療）の適切な用量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重篤度およびクール、ＶＥＧＦ拮抗薬の投与が予防目的か治療目的か、治療歴、患者の病歴、およびＶＥＧＦ拮抗薬に対する反応、ならびに、担当医の判断によって決まることになる。ＶＥＧＦ拮抗薬は、一度にまたは一連の治療を通じて、適切に患者に投与する。併用療法のレジメンでは、本発明の組成物は、治療効果のある量または治療上相乗作用のある量で投与する。本明細書で使用する場合、治療効果のある量は、ＶＥＧＦ拮抗薬と１種類以上の他の治療剤との併用、または本発明の組成物の投与によって、標的の疾患または状態が軽減または抑制される量である。治療上相乗作用のある量は、特定の疾患に関係する状態または症状を相乗的にまたは有意に軽減または除去するのに必要なＶＥＧＦ拮抗薬と１種類以上の他の治療剤の量である。

疾患のタイプおよび重篤度に応じて、もたらされる局所濃度が、約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜約９５μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜約８５μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌであるように、ＶＥＧＦ拮抗薬を投与してよい。遺伝子治療によってウイルスビリオンを通じてＶＥＧＦ拮抗薬を送達する場合には、その投与量は、単位投与量当たり約２×１０^６〜約２×１０^１２、約２×１０^７〜約２×１０^１１ｄｒｐ、または約２×１０^８〜約２×１０^１０ｄｒｐであってよい。タンパク治療によってＶＥＧＦ拮抗薬を投与する場合には、その投与量は、単位投与量当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約３ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２．５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１．５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約０．５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約０．２５ｍｇ、約０．２５ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、または約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇであってよい。

本発明のＶＥＧＦ拮抗薬は、単回投与しても反復投与してもよい。数日間またはそれ以上の期間にわたって反復投与するためには、状態に応じて、疾患の症状が所望どおり抑制されるようになるまで、治療を維持する。本発明の療法の経過は、従来の技術およびアッセイによってモニタリングする。

動物または患者が、ＶＥＧＦ拮抗薬に対する免疫応答を示した場合には、必要に応じて、例えば入手可能な免疫抑制剤を用いることによって、その免疫応答（炎症、および／または、混濁もしくは抗体）を軽減しようと試みてよい。本発明のいくつかの実施形態に従って遺伝子治療を用いる場合には、空のウイルスカプシドの数を減らすと、免疫応答を軽減する助けとなる。いくつかの実施形態によれば、ウイルスベクターに対する免疫応答の軽減は、ＶＥＧＦ拮抗薬（例えばＤ２９ＧＬＹＦＣ）の発現を増やす助けとなるので、ＶＥＧＦ拮抗薬の治療効能が増大する。

本発明を実施するための現時点での好ましい態様を含め、具体例と関連付けて本発明を説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定められている本発明の趣旨および範囲内である上記の系および技術の多くの変形形態および変更形態が存在することは当業者には明らかであろう。本明細書に開示されている参照文献は全て、参照することにより明示的に組み込まれる。

実施例１
ポリグリシン９ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）リンカーを含む第１の構成体Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃと、９Ｇｌｙリンカー以外は同じ配列を有する第２の構成体Ｄ２−Ｆｃという２つの構成体を生成した（図１）。

配列解析プログラムＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．５．１（コネチカット州ニューヘブンのＩＢＩ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｂｏｘを用いて、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃというタンパクのアミノ酸配列を解析した。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ中のポリグリシン９ｍｅｒリンカーは、Ｋａｒｐｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ （１９８５） Ｎａｔｕｒｗｉｓｓ， ７２： ２１２−２１３の柔軟性予測法によって、平均柔軟性よりも高い柔軟性を有する領域として同定された。このような領域は、Ｄ２−Ｆｃの配列では検出されなかった（図１）。

実施例２
柔軟なポリグリシン９ｍｅｒリンカーによってＩｇＧ１のＦｃ領域に連結されたＦｌｔ−１ Ｆｌｔ−１の単離Ｉｇ様ドメイン２（Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ）を試験した。融合タンパクのＤ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、ＶＥＧＦに効率的に結合できると共に、ＶＥＧＦ依存性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害することができる（図２参照）。対照的に、Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２が、ＩｇＧ１の重鎖（Ｆｃ）に直接結合して、Ｄ２−Ｆｃを形成しているときには、最小限のＶＥＧＦの結合しか観察されなかった（図２参照）。ＩｇＧ１のＦｃを介した二量体化と、柔軟なリンカーの挿入はいずれも、Ｆｌｔ−１のドメイン２へのＶＥＧＦの結合を促進するようである。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃの双方に二量体形態が存在することをウエスタンブロット解析によって確認した（図３参照）。

実施例３
ＡＡＶベクター（０．０００５ｍＬの体積中１×１０^８〜１×１０^９個の粒子）の硝子体内注射を、新生児（Ｐ０）または生後１日（Ｐ１）のＣ５７ＢＬ／６マウスに施す。Ｐ７の仔と、この仔らを養育中の雌親を５日間過酸素状態に暴露することによって、網膜血管新生（ＮＶ）をＣ５７ＢＬ／６マウスで誘発させる。これらの仔をＰ１２で通常の大気に戻し、Ｐ１７（ＮＶピーク時）で安楽死させる（Ｓｍｉｔｈ ＬＥＨ， Ｗｅｓｌｏｗｓｋｉ Ｅ， ＭｃＬｅｌｌａｎ Ａ， Ｋｏｓｔｙｋ ＳＫ， Ｄ’Ａｍａｔｏ Ｒ， Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ． Ｏｘｙｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． １９９４；３５：ｌ０ｌ−ｌ１１）。眼全体をパラフィンで包埋し、５ミクロン間隔で連続的に横断面を作製する。１００ミクロン毎に切断した断面内の内境界膜の内側の内皮細胞核の数を計数することによって、ＮＶの程度を割り出す。

抗血管形成剤をコードするＡＡＶベクターで処理した動物のコホートを、無関連な導入遺伝子をコードするベクター、または導入遺伝子をコードしないベクターで処理したコホートと比較する。処理した各眼内の内皮細胞核の平均数を、動物の未処理の各僚眼と比較する。

実施例４
Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３の生成
Ｆｌｔ−１のドメイン２は、ＶＥＧＦ_１６５の結合に不可欠であることが示されている。しかし、Ｆｌｔ−１のドメイン２単独ではＶＥＧＦ Ａに結合できないことが示された（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６．）。ＶＥＧＦ Ａは、二量体として存在するときに、酸性残基（成熟タンパクのアミノ酸６３〜６７）を通じてＦｌｔ−１に結合し、受容体のリガンド誘導性の二量体化の考え得るメカニズムを可能にする（Ｋｅｙｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。

したがって、Ｆｌｔ−１のドメイン２のＶＥＧＦ Ａへの結合を回復する方策として、Ｆｌｔ−１のドメイン２の二量体化を利用した。ＩｇＧの重鎖の断片との融合をタンパクの二量体化に用いることができる（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。この実施例では、ＶＥＧＦ Ａ（配列番号１２）のアミノ酸７５〜８８（すなわち、ＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮ、配列番号１３）が、ハイブリッドタンパクのｓＦｌｔ−１の生物活性を上昇させることを示す。

まず、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、Ｄ２−Ｆｃ、およびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３という３つのハイブリッドタンパクを作製した（図４）。３つのハイブリッドタンパクはすべて、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃと同じ、Ｆｌｔ−１のドメインＤ２を含む。ＶＥＧＦへの結合は、ポリグリシン９ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）リンカーを含まないＤ２−Ｆｃでは観察されなかった。第３のタンパク、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、ポリグリシン９ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）リンカーと、ＶＥＧＦの多量体化ドメイン（ａａ ＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮ、配列番号１３、ＶＥＧＦ Ｅｘ３）を含むが、ヒトＩｇＧ１の重鎖ＦｃのＣＨ３領域（配列番号１０のａａ３７１〜４７７）も含む。

タンパクＤ２−Ｆｃは、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおいて効率的な阻害活性を示さず（図５）、ＶＥＧＦ_１６５に効率的に結合しないことが暗に示された。しかし、９ＧｌｙリンカーとＶＥＧＦ_１６５の二量体化領域（Ｅｘ３）の両方を介してＣＨ３領域に融合した、Ｆｌｔ−１のドメイン２を含む第３のハイブリッドタンパクＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおいて阻害活性を示した（図５）。これは、このハイブリッドタンパクがＶＥＧＦ_１６５に効率的に結合することを暗に示している。

実施例５
Ｆｌｔ−１ Ｄ２構成体内でのリンカー（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３の利用
タンパクの特徴の向上のために、いくつかのポリグリシンリンカーの利用についてすでに報告がなされている（Ｍｏｕｚ ｅｔ ａｌ．， １９９６、Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。次の構成体用に、我々は、別の型のリンカーである１５ｍｅｒ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）を用いた。Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃタンパクを生成した。このタンパクは、Ｆｌｔ−１ドメイン２、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカー、およびヒトＩｇＧ１の重鎖のＦｃ領域を含む。

Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−ＦｃをＨＵＶＥＣ増殖アッセイでさらに特徴付けた。ＨＵＶＥＣ増殖の阻害性によって測定した場合の、Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃの生物活性は、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３の生物活性と同様であった（図６）。

ウエスタンブロットを用いて、Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃの構成体をさらに特徴付け、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃと比較した（図９）。いずれの構成体も、主に二量体形態で存在し、還元サンプルの分離後にモノマー形態を検出した。

実施例６
９ＧｌｙまたはＶＥＧＦ Ｅｘ３のＦｌｔ−１（Ｄ２）構成体における役割
９ＧｌｙリンカーまたはＶＥＧＦ二量体化配列Ｅｘ３の、可溶性受容体ＶＥＧＦの結合に対する役割を調べる目的で、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３、Ｄ２−ＣＨ３、およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３という３種類の別の構成体を生成した（図８）。３つの構成体をすべて生成し、上記の構成体と同様に、ＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。これらのＶＥＧＦ遮断活性をＨＵＶＥＣ増殖アッセイで評価した（図９）。

ＩｇＧ１のＣＨ３領域を含むタンパクのＨＵＶＥＣ増殖アッセイでは、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３（Ｅｘ３なし）、およびタンパクＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３（９Ｇｌｙリンカーなし）が、親タンパクＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較して、同様のＶＥＧＦ遮断効力を有していたことが示されている。しかし、タンパクＤ２−ＣＨ３は、これらすべての中で最も弱いＶＥＧＦ阻害剤であるようであった（図９）。

トランスフェクションした２９３細胞由来の馴化培地のＦｌｔ−１のＥＬＩＳＡデータは、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３、およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３、ならびにＤ２−ＣＨ３においては、同様のＦｌｔ−１レベル（７０〜９０ｎｇ／ｍｌ）を示し、最も活性が低い形態のＤ２−ＣＨ３においては、やや高いレベル（約１５０ｎｇ／ｍｌ）を示している。構成体Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３およびＤ２−ＣＨ３のウエスタンブロット（図１０）は、非還元条件での二量体形態の存在を示している。

実施例７
すべての構成体の中でＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃがＶＥＧＦとの結合性が最も高い
ＶＥＧＦ結合アッセイによって、無細胞系における本発明の可溶性ＶＥＧＦ受容体の相対的なＶＥＧＦ結合親和性を比較できるようになる。

簡潔に言えば、既知濃度の可溶性受容体（０．２９〜１５０ｐＭの濃度範囲）を含む馴化培地を段階希釈し、１０ｐＭのＶＥＧＦと混合した。続いて、非結合ＶＥＧＦの量をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、０．００１〜約０．２ｐＭの受容体濃度において、他のどの構成体よりも高い親和性でＶＥＧＦと結合する。Ｄ２−ＣＨ３は、ＶＥＧＦに対する結合親和性が最も低い（図１１）。

実施例８
ゲノム成分ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣは、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲと、ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣの発現カセットとからなる。ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣの発現を促すために、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターを使用し、このプロモーターは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、および、一部がβアクチン転写産物に属する、エクソン１の９４ｂｐの断片からなる。ハイブリッドニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンのイントロンもＣＢＡプロモーターの一部であり、多くの潜在性転写因子結合部位を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムからポリアデニル化領域を得る。

試験物質ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣをポリプロピレンバイアルに入ったストック凍結液として、ＡＡＶ２ビヒクルコントロール、０．０１４％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ロット番号ＮＢＲ１５０４５−１０８）を含むリン酸緩衝生理食塩水を、予め調合した水溶液として調製した。試験物質とビヒクル物質の溶液を調製して、所望の投与量体積での意図どおりの投与量を実現するのに適切な濃度の投与溶液を生成した。

カニクイサルの眼に硝子体内投与したところ、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣ（５０μｌの投与量体積中２×１０^８、２×１０^９、および２×１０^１０）によって、房水および硝子体液中で測定した場合に、ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣが用量依存的に発現し、それらのレベルが、ＡＡＶベクターの投与から少なくとも１年間維持されたことが明らかになった。

我々は、ヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）でレーザー−ＣＮＶ実験を実施し、ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣが、このＨＮＰモデルにおいて脈絡膜血管新生を阻害するのに非常に有効であることが示された。この実験の１セットでは、硝子体の前部／中央部に注射した２×１０^８および２×１０^９のベクター粒子によって、用量依存的な発現を得られたが、この実験セットでは効能は観察されなかった。２×１０^１０のｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣを硝子体中央部に注射（硝子体中央部への注射）したところ、注射した眼でｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣが発現し（例えば、移行上皮細胞および網膜神経節細胞がｍＲＮＡの発現を示した）、１１１ｎｇ／ｍｌ、２７７ｎｇ／ｍｌ、８８５ｎｇ／ｍｌ、９６７ｎｇ／ｍｌ、１，０５７ｎｇ／ｍｌ、および１，５８４ｎｇ／ｍｌという治療効果のある濃度が房水中で測定された。硝子体液中でのレベルは、房水中のレベルよりも約３倍高かった。これらの濃度は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害するのに有効であった。図１５は、２×１０^１０のｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣを投与された別のグループの動物における発現場所を示している。

高投与量のグループでは、軽度から中程度の硝子体の混濁が観察され、混濁は、大半の動物において時間の経過と共に消散した。導入遺伝子に対するＴ細胞応答は検出されなかったが、一部の動物では、ＡＡＶに対するＴ細胞応答が観察された。コントロールのＡＡＶ２ビリオンを投与された動物も高投与量で混濁を示したことから、この混濁の原因は、導入遺伝子のｓＦｌｔではなく、ウイルスカプシドであることがうかがえる。硝子体の混濁をスコアリングし、Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔらが開発した系（１９８５， Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ９２： ４６７）と比較した。小柱網および虹彩角膜角中のリンパ球もしくは形質細胞、硝子体中の炎症細胞、または、網膜における血管周囲のリンパ球からなる炎症性変化が、一部の動物（ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣ、またはコントロールビリオンのいずれかを投与された動物）で硝子体の混濁と共に観察された。組織の破壊または再構築は観察されなかった。最も持続性の高い炎症を示した動物は、導入遺伝子の発現が最も低かった。

別の動物グループでは、房水または血清において既存のＡＡＶ力価を有した動物はいなかった。血清、房水、および硝子体液のｓＦＬＴ０１タンパクの有無、ならびに、ｓＦＬＴ０１およびベクターＡＡＶ２に対する抗体について評価した。ビヒクルコントロールグループ内の一部の動物を含め、何匹かの動物で、このアッセイを用いたこの調査の全期間にわたって、間欠的かつ一貫性のない陽性反応が観察された。血清ではｓＦＬＴ０１に対する抗体は見出されなかった。血清中でＡＡＶ２に対する力価を有していた動物で、用量依存性および時間依存性の増加が見られた。房水での力価が最も高い動物は、発現量が最も少なく、房水での力価が最も低い動物は、発現量が最も低く、房水での力価が最も高い動物は、発現量が最も高かった。

一部の動物の追加的な臨床症状、質的な食物消費、身体検査結果）、体重、眼科検査結果、蛍光眼底血管造影写真、網膜電図、眼圧測定値の変化について評価した。殺処分後、その動物の全身剖検を行い、組織を回収、保存した。コントロールおよび高投与量のサルから採った組織を処理して、顕微鏡で調べた。網膜の電気的活動に対する影響は観察されなかった。

一部の動物に対して、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ１Ｄ２９ＧＬＹＦＣ（２×１０^８、２×１０^９、および２×１０^１０の投与量）の後、ルセンティスを１１週間投与したところ、副作用は観察されなかった。

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Ｎｉｅｌｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， １０， １
Ｑｉｕ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １１１７３−１１１７６

Claims (46)

1. 哺乳類の眼疾患を治療する方法であって、該哺乳類の罹患眼に、ＶＥＧＦ拮抗薬をコードするウイルスベクターを約２×１０^８〜約２×１０^１０ｄｒｐという治療効果のある量で投与することを含む方法。
2. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ２である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ−Ｒ１（ＦＬＴ−１）を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇＧ様ドメイン２（ＦＬＴ−１Ｄ２）を含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記ＩｇＧの重鎖分子が、該重鎖のＦｃ部分を含む、請求項４に記載の方法。
8. 前記ＩｇＧの重鎖分子が、該重鎖のＣＨ３部分を含む、請求項４に記載の方法。
9. 前記ＶＥＧＦ受容体が、アミノ酸リンカーを通じて、前記ＩｇＧの重鎖分子に融合している、請求項４に記載の方法。
10. 前記アミノ酸リンカーが９Ｇｌｙリンカーである、請求項９に記載の方法。
11. 前記融合ポリペプチドが、ＦＬＴ−１Ｄ２−９ＧＬＹ−ＦＣ、またはＦＬＴ−１Ｄ２−９ＧＬＹ−ＣＨ３である、請求項４に記載の方法。
12. 前記罹患眼に前記ＶＥＧＦを硝子体内注射によって投与する、請求項１に記載の方法。
13. 前記罹患眼に前記ＶＥＧＦ拮抗薬を硝子体中央部への注射によって投与する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記罹患眼の移行上皮細胞中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を発現させる、請求項１に記載の方法。
15. 前記罹患眼の中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を少なくとも６カ月間発現させる、請求項１に記載の方法。
16. 前記罹患眼の中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を少なくとも１年間発現させる、請求項１５に記載の方法。
17. 前記眼疾患が、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、および糖尿病網膜症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
18. 第２のＶＥＧＦ拮抗薬を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記第２のＶＥＧＦ拮抗薬が、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記タンパクがＶＥＧＦ抗体である、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブまたはラニビズマブである、請求項２０に記載の方法。
22. 哺乳類の眼疾患を治療する方法であって、該哺乳類の疾患する眼に、ＶＥＧＦ拮抗薬をコードする核酸を投与することを含み、該眼疾患を治療するために、該ＶＥＧＦ拮抗薬を、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，５００ｎｇ／ｍｌという治療効果のある量で発現させる方法。
23. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ２である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ−Ｒ１（ＦＬＴ−１）を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇＧ様ドメイン２（ＦＬＴ−１Ｄ２）を含む、請求項２５に記載の方法。
28. 前記ＩｇＧの重鎖分子が、該重鎖のＦｃ部分を含む、請求項２５に記載の方法。
29. 前記ＩｇＧの重鎖分子が、該重鎖のＣＨ３部分を含む、請求項２５に記載の方法。
30. 前記ＶＥＧＦ受容体が、アミノ酸リンカーを通じて、前記ＩｇＧの重鎖分子に融合している、請求項２５の方法。
31. 前記アミノ酸リンカーが９Ｇｌｙリンカーである、請求項３０の方法。
32. 前記融合ポリペプチドが、ＦＬＴ−１Ｄ２−９ＧＬＹ−ＦＣ、またはＦＬＴ−１Ｄ２−９ＧＬＹ−ＣＨ３である、請求項２５の方法。
33. 前記罹患眼に前記ＶＥＧＦを硝子体内注射によって投与する、請求項２２に記載の方法。
34. 前記罹患眼に前記ＶＥＧＦ拮抗薬を硝子体中央部への注射によって投与する、請求項３３に記載の方法。
35. 前記罹患眼の移行上皮細胞中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を発現させる、請求項２２に記載の方法。
36. 前記罹患眼の中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を少なくとも６カ月間発現させる、請求項２２に記載の方法。
37. 前記罹患眼の中で、前記ＶＥＧＦ拮抗薬を少なくとも１年間発現させる、請求項３６に記載の方法。
38. 前記眼疾患が、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、および糖尿病網膜症からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
39. 第２のＶＥＧＦ拮抗薬を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
40. 前記第２のＶＥＧＦ拮抗薬が、ＩｇＧの重鎖分子に融合したＶＥＧＦ受容体を含む融合ポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
41. 前記タンパクがＶＥＧＦ抗体である、請求項３９に記載の方法。
42. 前記ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブまたはラニビズマブである、請求項４１に記載の方法。
43. 眼のためのＡＡＶ遺伝子治療を受けている哺乳類の眼の混濁を軽減する方法であって、空のカプシドをカプシド全体の９０％以下含む遺伝子治療用ＡＡＶビリオンを該哺乳類に投与することを含む方法。
44. 前記遺伝子治療用ＡＡＶビリオンが、空のカプシドをカプシド全体の８０％以下、７０％以下、６０％以下、または５０％以下含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記遺伝子治療用ＡＡＶビリオンが空のカプシドを実質的に有さない、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、請求項４３の方法。

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