KR20160110523A - 황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

황반 변성을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 상기 방법은 가용성 Flt-1 수용체, 뿐만 아니라 가용성 Flt-1 수용체를 포함하는 융합 단백질의 인간 눈으로의 유전자 전달을 이용한다.

Description

황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND PREVENTING MACULAR DEGENERATION}
본 발명은 일반적으로 인간에서 황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 혈관 내피 성장인자(VEGF) 수용체, Flt-1을 이용하여 황반 변성을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
연령-관련 황반 변성(AMD)은 노인에서 주요한 비가역적 실명의 주요 원인이다. AMD의 초기 임상 제시는 조직파편(드루젠)의 망막하 축적을 수반한다. 진행 중인 환자는 황반 세포의 유의한 변성 및 위축증을 갖는 지도모양 위축(GA), 또는 변성 망막을 구제하기 위한 시도에서 질병 경과의 말단 단계에서 발생하는 맥락막 혈관신생을 갖는 신생혈관 AMD(nAMD)가 발생한다. 황반 망막 색소 상피(RPE) 변성 후에 광수용체 위축증인 경우에 실명이 발생한다.
발병기전은 노화, 환경 및 유전 위험 인자에 따르나, 질병 발생의 원인이 되는 분자 메커니즘은 대부분 공지되어 있지 않은 채로 남아 있다. 가장 현저한 공지된 유전 요인은 면역조절성 보체 인자 H( CFH ) 유전자 내에 존재하는 미스센스 돌연변이이다.
nAMD와 같은 안구 장애와 관련된 병리학적 혈관신생은 혈관 내피 성장인자(VEGF)의 상향조절을 통해 매개된다. 항체, 가용성 수용체 또는 앱타머를 이용한 VEGF의 억제는 이들 질병을 관리하기 위한 유망한 임상적 접근법인 것으로 증명되었다. AMD 관리에서 현저한 개선이 실현되었으나, 현재의 항-VEGF 길항제는 환자 및 치료 의사 둘 모두에게 부담일 수 있는 반복된 유리체내 투여를 필요로 한다.
따라서, 인간에서 황반 변성을 치료하기 위한 덜 부담스럽고 상업적으로 실용적인 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 가용성 Flt-1 수용체가 인간 대상체에서 황반 변성을 치료할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 가용성 수용체가 rAAV-매개 유전자 전달을 이용하여 전달되는 경우 광범위한 용량으로 치료 결과가 관찰된다. 고용량이 용인되었고, 치료적 이익을 발생시켰다. 또한, 본 발명자는 본원에서 2 x 108개의 벡터 유전체(vg), 뿐만 아니라 2 x 1010 vg만큼 적은 단일 용량의 유리체내 전달이 주사 2개월 후에 망막하액 및 망막내액의 유의한 감소를 발생시키는 것을 입증하였다.
따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 VEGF 활성을 조절할 수 있는 혈관 내피 성장인자 수용체-1(VEGFR-1 또는 Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 변성을 치료하는 방법에 관한 것으로, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 부종을 치료하는 방법에 관한 것으로, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달된다.
상기 방법의 구현예에서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1012개; 1 x 108 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 109개; 약 2 x 107 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1011개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1010개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 109개; 2 x 109 내지 약 2 x 1010개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 2 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 또는 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1011개의 rAAV 비리온이 눈으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약 1 x 107개, 약 2 x 107개, 약 6 x 107개, 약 1 x 108개, 약 2 x 108개, 약 6 x 108개, 약 1 x 109개, 약 2 x 109개, 약 6 x 109개, 약 1 x 1010개, 약 2 x 1010개, 약 6 x 1010개, 약 1 x 1011개, 약 2 x 1011개, 약 6 x 1011개, 약 1 x 1012개, 약 2 x 1012개, 약 6 x 1012개, 또는 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 투여된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 변성을 치료하는 방법에 관한 것으로, 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 부종을 치료하는 방법에 관한 것으로, 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달된다.
상기 방법 중 임의의 방법에서, 조성물은 안과적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 추가 구현예에서, rAAV 비리온의 단일 유리체내 주사가 눈으로 제공된다.
추가 구현예에서, 가용성 단백질은,
(a) Flt-1의 적어도 하나의 도메인;
(b) 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 다중화 도메인; 및
(c) (a)를 (b)에 연결시키는 5 내지 25개의 아미노산 잔기 길이의 링커를 포함하며,
가용성 단백질이 발현되는 경우, 가용성 단백질의 다합체가 생성된다.
상기 방법 중 임의의 방법에서, 적어도 하나의 도메인은 Flt-1의 도메인 2를 포함한다.
추가 구현예에서, 다합체는 동종이합체이다.
추가 구현예에서, 다중화 도메인은 IgG의 Fc 영역, 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 다중화 도메인은 IgG의 CH3 도메인, 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
추가 구현예에서, 다중화 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되고, 예를 들어, IgG1 중쇄의 불변 영역으로부터 유래된다.
추가 구현예에서, 링커는,
gly9(SEQ ID NO:1);
glu9(SEQ ID NO:2);
ser9(SEQ ID NO:3);
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4);
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5);
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6); ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7); GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8); 및 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 가용성 단백질은 식 X-Y-Z를 갖고, 상기 식에서 X는 Flt-1의 IgG-유사 도메인 2를 포함하고, Y는 Gly9(SEQ ID NO:1)이고, Z는 IgG Fc 영역 또는 IgG CH3 영역이다.
추가 구현예에서, 다중화 도메인은 인간화된 다중화 도메인이다.
추가 구현예에서, 가용성 단백질은 (a) 도 2a 내지 도 2b에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:11); (b) 도 6에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:15); (c) 도 8에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:17); (d) 도 12에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:21); 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d)와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 (a), (b), (c) 또는 (d)의 활성 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
황반 변성을 치료하기 위한 상기 방법 중 임의의 방법의 구현예에서, 황반 변성은 연령-관련 황반 변성(AMD), 예를 들어, 습성 AMD이다.
상기 방법의 추가 구현예에서, 상기 방법은 안압, 망막 두께, 망막하액, 망막내액 등을 감소시키는 단계를 포함한다.
상기 방법 중 임의의 방법의 추가 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVAAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
상기 방법 중 임의의 방법의 구현예에서, 약 2 x 108 내지 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온, 예를 들어, 약 2 x 108개 이하의 rAAV 비리온, 또는 약 2 x 109개 이하의 rAAV 비리온이 눈으로 전달된다.
본 발명의 상기 및 다른 구현예는 본원의 개시내용에 비추어 당업자가 용이하게 떠올릴 수 있을 것이다.
도 1(SEQ ID NO:10)은 본원에서 "sFLT01 단백질"로 언급되는 Flt-1을 포함하는 융합 단백질에 대한 DNA 서열을 제시한다.
도 2a 내지 도 2b(SEQ ID NO:11)는 sFLT01 단백질에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
도 3(Genbank 등록 번호 NM003376)(SEQ ID NO:12)은 VEGF를 인코딩하는 DNA 서열을 제시한다.
도 4(Genbank 등록 번호 CAC19513)(SEQ ID NO:13)는 VEGF에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
도 5(SEQ ID NO:14)는 Gly9 링커에 의해 VEGF 다중화 도메인, Ex3에 연결된 가용성 Flt-1을 포함하는 추가의 융합 단백질에 대한 DNA 서열을 제시한다.
도 6(SEQ ID NO:15)은 도 5의 DNA 서열(SEQ ID NO:14)에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 제시한다.
도 7(SEQ ID NO:16)은 Gly9에 의해 VEGF 다중화 도메인, Ex3 및 IgG1 CH3 영역으로부터의 서열에 연결된 가용성 Flt-1을 포함하는 추가의 융합 단백질에 대한 DNA 서열을 제시한다.
도 8(SEQ ID NO:17)은 도 7의 DNA 서열(SEQ ID NO:16)에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 제시한다.
도 9a 내지 도 9b(Genbank 등록 번호 NM_002019)(SEQ ID NO:18)는 대표적 Flt-1 수용체 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 제시한다.
도 10a 내지 도 10e(Genbank 등록 번호 P17948)(SEQ ID NO:19)는 대표적 Flt-1 수용체 단백질의 아미노산 서열을 제시한다.
도 11(SEQ ID NO:20)은 Gly9(SEQ ID NO:1)에 의해 IgG1 CH3 영역으로부터의 서열에 연결된 가용성 Flt-1을 포함하는 본원에서 "sFLT02 단백질"로 언급된 Flt-1을 포함하는 융합 단백질에 대한 DNA 서열을 제시한다.
도 12(SEQ ID NO:21)는 sFLT02 단백질에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
도 13(Genbank 등록 번호 Y14737)(SEQ ID NO:22)은 IgG1 람다 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
도 14a 내지 도 14b(SEQ ID NO:23)는 IgG1 람다 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
도 15A 내지 도 15B는 단일 용량의 2 x 108개의 rAAV2-sFLT01으로 처리된 인간 눈(도 15B)에서의 망막하액 및 망막내액에서의 기준선(도 15A)으로부터의 변화(광간섭 단층촬영에 의해 측정됨)를 제시한다.
도 16A 내지 도 16B는 단일 용량의 2 x 1010개의 rAAV2-sFLT01으로 처리된 인간 눈(도 16B)에서의 망막하액 및 망막내액에서의 기준선(도 16A)으로부터의 변화(광간섭 단층촬영에 의해 측정됨)를 제시한다.
본 발명의 실시는 달리 표시하지 않는 한 당 분야의 기술 내의 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)]을 참조하라.
상기이거나 하기이건 간에 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원, 및 등록 번호는 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
1. 정의
본 발명의 기재에서, 하기 용어가 이용될 것이며, 하기 나타낸 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 내용이 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것이 인지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "Flt-1 수용체"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 수용체의 혼합물 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 "연령-관련 황반 변성" 또는 "AMD"는 초기, 중간, 및 진행된 AMD를 포함하며, 건성 AMD, 예를 들어, 지도모양 위축, 및 신생혈관 또는 삼출 AMD로도 공지된 습성 AMD 둘 모두를 포함한다. 이들 질환은 하기에 더욱 충분히 기재된다.
본원에서 사용되는 "황반 부종"은 눈의 황반 영역의 팽창 또는 비후를 야기시킬 수 있는 망막 내의 유체의 축적을 나타낸다. 황반 부종은 망막 내의 혈관이 유체를 누출하는 경우에 발생한다. 병태생리학은 통상적으로 혈관 불안정 및 혈액-망막 장벽의 파괴를 수반한다. 관찰되는 가장 흔한 유형인 낭포 황반 부종(CME)은 이상 중심와주위 망막 모세혈관 투과성이 종속되는 외부 얼기층 내의 유체 축적을 수반한다. 황반은 팽창되는 경우 적절히 기능하지 않는다. 경증 내지 중증의 시력 손실이 있을 수 있으나, 일부 경우에는, 주변 시력은 남아 있다.
용어 "Flt-1 단백질" 및 "VEGF-R1 단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, VEGF에 결합하는 것으로 공지된 수용체 단백질을 나타낸다. 용어 "Flt-1 단백질" 및 "VEGF-R1 단백질" 또는 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공급원에 상관 없이 임의의 Flt-1 단백질로부터 유래되는 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 본원에 추가로 기재되는 것을 포함하는 공지된 VEGF 활성 시험 중 임의의 VEGF 활성 시험으로 측정시 VEGF에 결합할 수 있고 VEGF의 활성을 조절할 수 있는 분자를 나타낸다. 대표적 Flt-1 단백질의 전장 뉴클레오티드 서열 및 해당 아미노산 서열은 각각 도 9a 내지 도 9b(SEQ ID NO:18) 및 10a 내지 도 10e(SEQ ID NO:19)에 제시된다. 그러나, 본원에 정의된 바와 같은 Flt-1 단백질은 상기 여러 수용체가 공지되어 있고, 이들 수용체에서의 변화가 종 사이에서 발생할 것임에 따라 도시된 서열로 제한되지 않는다. 추가의 Flt-1 단백질 서열의 비제한적인 예는 GenBank 등록 번호 AF063657.2; BC039007.1; U01134.1; HD077716.1; X51602.1; EU360600.1; AK300392.1; EU826561.1; EU368830.1; AB385191.1; AK292936.1; AK309901.1; AB209050.1; BC029849.1; BC039007.1; NM_001160031.1; NM_001160030.1; NM_002019.4; NM_001159920.1에서 발견될 수 있다.
신호 서열이 있거나 없는 전장 단백질, 및 이의 단편, 뿐만 아니라 고유 서열에 대한 변형, 예를 들어, 결실, 첨가 및 치환(사실상 보존성 또는 비-보존성 치환)을 갖는 단백질은 이러한 단백질이 필요한 활성을 유지하는 한 본원에서 사용하기 위한 것으로 의도된다. 상기 활성 변이체 및 단편은 본 발명의 상황에서 고려되는 VEGF1 수용체이다. 변형은 부위-특이적 돌연변이유발을 통하는 것과 같이 계획적인 것일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통하는 것과 같이 우발적인 것일 수 있다. 따라서, 모(parent) 서열과 실질적으로 상동성인 활성 단백질, 예를 들어, 해당 리간드의 활성을 조절하는 능력을 보유하는 70...80...85...90...95...98...99% 등의 동일성을 갖는 단백질이 본원에서의 사용에 고려된다.
"고유" 폴리펩티드, 예를 들어, Flt-1 수용체는 천연으로부터 유래된 해당 분자와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 고유 서열은 천연으로부터 분리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "고유" 서열은 특히 특정 분자(예를 들어, 세포외 도메인 서열)의 천연-발생의 트렁케이션되거나 분비된 형태, 폴리펩티드의 천연-발생 변이체 형태(예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 본원에 개시된 고유 분자는 수반하는 도면에 제시된 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 고유 서열이다. 그러나, 수반하는 도면에 개시된 분자 중 일부는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 한편, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치된 다른 메티오닌 잔기가 특정 분자에 대한 시작 아미노산 잔기로 이용될 수 있다. 대안적으로, 이용되는 발현 시스템에 따라, 본원에 기재된 분자는 N-말단 메티오닌이 결여되어 있을 수 있다.
"세포외 도메인"은 세포외 도메인의 전부 또는 단편을 포함하고, 막횡단 도메인의 전부 또는 일부가 결여되고, 세포질 도메인이 또한 결여되어 있을 수 있는 수용체 폴리펩티드의 한 형태를 의미한다. 통상적으로, 본 발명에서 사용되는 경우, 세포외 도메인은 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인 둘 모두가 존재하지 않는다. 보통, 세포외 도메인은 상기 막횡단 및/또는 세포질 도메인의 10% 미만, 이들 도메인의 5% 미만, 상기 도메인의 1% 미만, 또는 0.5% 미만을 포함한다. 본원에 기재된 수용체에 대한 막횡단 도메인은, 예를 들어, 문헌[Kyte et al., J. Mol . Biol. (1982) 157:105-132]의 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 기술을 이용하여 계산되는 것과 같은 표준 친수도 도표를 이용한 소수성 도메인을 확인하기 위한 당 분야에서 일상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명과 함께 사용하기 위한 수용체는 고유 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 수용체의 신호 펩티드의 대략적인 위치는 명세서 및 수반하는 도면에 기재되어 있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드 C-말단 경계의 어느 한 면에서 통상적으로 약 5개 이하의 아미노산까지 다양할 수 있는 것이 인지된다. 신호 펩티드의 C-말단 경계는 문헌[Nielsen et al., Prot . Eng . (1997) 10:1-6 및 von Heinje et al., Nucl . Acids. Res. (1986) 14:4683-4690]에 기재된 것과 같은 당 분야에서 일상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다. 더욱이, 일부 경우에, 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 분해는 전적으로 균일하지 않아, 1개 초과의 분비된 종이 발생하는 것이 또한 인지된다. 신호 펩티드가 본원에서 확인된 바와 같은 신호 펩티드의 C-말단 경계의 어느 한 측면의 약 5개 이하의 아미노산 내에서 분해되는 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 고려된다.
"변이체"는 해당 전장 고유 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 의미한다. 상기 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 고유 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에서 첨가되거나 결실되는 폴리펩티드를 포함한다. 구현예에서, 변이체는 해당 전장 고유 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 88% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 97% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성 및 대안적으로 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10개의 아미노산 길이, 예를 들어, 적어도 약 20개의 아미노산 길이, 예를 들어, 적어도 약 30개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 40개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 50개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 60개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 70개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 80개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 90개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 100개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 150개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 200개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 300개의 아미노산 길이, 또는 그 초과이다. 변이체는 사실상 보존성 또는 비-보존성인 치환을 포함한다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 분자의 필요한 기능이 온전하게 남아 있는 한 약 5 내지 10개 이하의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 또는 심지어 약 15 내지 25개 또는 50개 이하의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 또는 5 내지 50개의 임의의 수의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성 퍼센트를 나타낸다. 2개의 DNA, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 서열이 분자의 규정된 길이에 걸쳐 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80% 내지 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 내지 98%의 서열 동일성, 적어도 약 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 나타내는 경우 서로에 대해 "실질적으로 상동성"이다. 본원에서 사용되는 실질적으로 상동성은 또한 특정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 나타낸다.
일반적으로, "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 나타낸다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 동일성 퍼센트는 서열을 정렬시키고, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치 수를 카운팅하고, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 결과에 100을 곱함으로써 2개의 분자 사이의 서열 정보의 직접 비교에 의해 결정될 수 있다. 용이하게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, 펩티드 분석을 위한 문헌[Smith and Waterman Advances in Appl . Math. 2:482-489, 1981]의 국소 상동성 알고리즘을 적합화시킨 ALIGN(Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC)이 분석을 돕기 위해 이용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman) 알고리즘에 또한 의존하는 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8(Genetics Computer Group, Madison, WI로부터 이용 가능함), 예를 들어, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램에서 이용 가능하다. 이들 프로그램은 제조업체에 의해 권장되고, 상기 언급된 Wisconsin Sequence Analysis Package에 기재된 디폴트 파라미터와 함께 용이하게 이용된다. 예를 들어, 참조 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 동일성 퍼센트는 디폴트 스코어링 표 및 6개의 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티와 함께 스미스 및 워터맨의 상동성 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 상황에서 동일성 퍼센트를 확립시키는 또 다른 방법은 존 F. 콜린스(John F. Collins) 및 셰인 S. 스터록(Shane S. Sturrok)에 의해 개발되고, IntelliGenetics, Inc.(Mountain View, CA)에 의해 배급된 애든버러 대학(University of Edinburgh)에 의해 저작권으로 보호된 프로그램의 MPSRCH 패키지를 이용하는 것이다. 이러한 한벌의 패키지로부터, 디폴트 파라미터가 스코어링 표에 대해 사용되는(예를 들어, 12의 갭 오픈 페널티, 1의 갭 신장 페널티, 및 6개의 갭) 스미스-워터맨 알고리즘이 이용될 수 있다. 생성된 데이터로부터, "매치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성 퍼센트를 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음과 같은 디폴트 파라미터를 사용하여 이용될 수 있다: 유전 부호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기재 = 50 서열; 분류 = 높은 스코어(HIGH SCORE); 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 세부사항은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
대안적으로, 상동성은 상동성 영역 사이에서 안정적인 듀플렉스를 형성하는 조건하에서의 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화, 후 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)를 이용한 분해, 및 분해된 단편의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건하에서 서던 하이브리드화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 하이브리드화 조건을 정의하는 것은 당 분야의 기술 내이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기; DNA Cloning, 상기; Nucleic Acid Hybridization, 상기]을 참조하라.
용어 "축퇴성 변이체"는 축퇴성 변이체가 유래되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열에서의 변화를 함유하는 폴리뉴클레오티드로 의도된다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "인코딩"하는 서열은 적절한 조절성 서열의 조절하에 배치되는 경우 전사(DNA의 경우)되고, 폴리펩티드로 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종료 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치될 수 있다.
"벡터"는 적절한 조절 요소와 회합되는 경우 복제될 수 있고, 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소, 예를 들어, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.
"재조합 벡터"는 세포에서 발현될 수 있는 이종성 핵산 서열을 포함하는 벡터를 의미한다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 나타낸다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산에는 적어도 1개, 구현예에서, 2개의 역방위 말단 반복 서열(ITR)이 측접한다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 1개, 구현예에서, 2개의 AAV 역방위 말단 반복 서열(ITR)이 측접된 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 나타낸다. 상기 rAAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되었고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현함), AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재하는 경우 감염성 바이러스 입자로 복제되고 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 염색체 내 또는 또 다른 벡터, 예를 들어, 클로닝 또는 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드 내)로 혼입되는 경우, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "구조"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 언급될 수 있다. rAAV 벡터는 지질과 복합체화되고, 리포솜 내에 캡슐화되고, 바이러스 입자, 특히 AAV 입자 내에 캡시드화된 선형 인공 염색체인 플라스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 형태 중 임의의 형태일 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드로 패키징되어 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성시킬 수 있다.
"재조합 바이러스"는, 예를 들어, 이종성 핵산 작제물의 입자로의 첨가 또는 삽입에 의해 유전학적으로 변경된 바이러스를 의미한다.
용어 "트랜스펙션"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 나타내기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우에 세포는 "트랜스펙션"된 것이다. 다수의 트랜스펙션 기술이 당 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조하라. 상기 기술은 하나 이상의 외인성 분자를 적합한 숙주 세포로 도입시키기 위해 이용될 수 있다.
핵산 서열, 예를 들어, 코딩 서열 및 조절 서열과 관련된 용어 "이종성"은 보통 함께 연결되지 않고/않거나 보통 특정 세포와 관련되지 않은 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종성" 영역은 사실상 다른 분자와 함께 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 핵산 또는 또 다른 핵산 분자에 부착된 핵산의 세그먼트이다. 예를 들어, 핵산 작제물의 이종성 영역은 사실상 코딩 서열과 함께 발견되지 않는 서열이 측접한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 사실상 발견되지 않는 작제물(예를 들어, 고유 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 보통 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종성인 것으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 사용되는 바와 같은 이종성 DNA를 발생시키지 않는다.
"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 나타낸다. 상기 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 임의의 염기 유사체, 비제한적인 예로, 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시하이드록실-메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, -우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하는 서열을 갖는다.
용어 DNA "조절 서열"은 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 서열, 아데닐중합체형성 신호, 전사 종료 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위("IRES"), 인핸서 등을 집합적으로 나타낸다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, 번역될 수 있는 한 이들 조절 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다.
용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 나타내는 이의 보통의 의미로 본원에서 사용되며, 조절 서열은 RNA 중합효소가 결합할 수 있고, 하류 방향(3'-방향)의 코딩 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), "억제성 프로모터"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), 및 "항상성 프로모터"를 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 이들의 일상적인 기능을 수행하도록 형성된 요소의 배열을 나타낸다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있다. 조절 서열은 이들이 코딩 서열의 발현을 유도하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 연속적으로 존재할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재하는 번역되지 않았지만 전사된 서열이 제공될 수 있고, 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 여전히 간주될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용되는 용어 "다중화 도메인"은 특정 Flt-1 수용체가 직접 또는 "링커 도메인"을 통해 연결되는 분자의 부분을 나타내는 것을 의미한다. 다중화 도메인은 2개 이상의 다중화 도메인 및/또는 sFlt-1 수용체 도메인의 상호작용을 촉진하는 폴리펩티드 도메인일 수 있다.
예를 들어, 다중화 도메인은 면역글로불린 서열, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 2개 이상의 다중화 도메인 사이에 분자간 이황화 결합을 형성하는 자유 티올을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 5,731,168호에 기재된 "공동으로의 융기(protuberance-into-cavity)" 도메인일 수 있다. 융기는, 예를 들어, 첫 번째 폴리펩티드의 경계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 작제된다. 융기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이 더 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 두 번째 폴리펩티드의 경계면 상에 임의로 생성된다.
따라서, 양태에서, 다중화 도메인은 단량체 도메인으로부터 이합체, 삼합체 등의 형성을 촉진하거나 가능케 하는 분자의 상기 부분을 제공한다. 양태에서, 다중화 도메인은 면역글로불린 불변 영역 도메인이다.
"면역글로불린"(Ig)은 항원 특이성이 결여된 항체 또는 항체-유사 분자인 단백질, 예를 들어, 당단백질이다. 면역글로불린은 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사합체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄로 연결되는 한편, 이황화 결합의 수는 다양한 면역글로불린 아이소형의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노(N) 말단 가변 도메인(VH) 뒤에 카르복시(C) 말단 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 가변 N-말단 도메인(VL) 및 C-말단 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인(CL)은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 면역글로불린 폴리펩티드 사슬의 도메인 정의에 따르면, 경쇄(L)는 2개의 입체형태적으로 유사한 도메인 VL 및 CL을 갖고; 중쇄는 각각이 하나의 사슬내 이황화 다리를 갖는 4개의 도메인(VH, CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다.
중쇄의 불변(C) 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다양한 부류로 지정될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린이 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 면역글로불린 부류는 서브클래스(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH) 및 그 뒤에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(K) 또는 람다(λ)로 언급되는 2개의 별개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단(불변) 영역을 나타낸다. Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있으나, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 전장 인간 IgG1의 위치 Cys226의 아미노산 잔기, 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 펼쳐져 있을 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3를 포함한다. IgG1의 중쇄 내의 마지막 잔기인 리신이 성숙 단백질의 Fc 내의 말단 잔기로서 제공될 수 있으나, 반드시 그러하지는 않다. 하나의 인간 IgG1 중쇄 Fc 영역은 NCBI 등록 번호 P01857에 규정되어 있다.
인간 IgG1 Fc 영역의 "CH2 도메인"("Cy2" 도메인으로도 언급됨)은 보통 인간 IgG 중쇄 Fc 영역의 Pro111 내지 Lys223을 제외한 전장 IgG의 대략 아미노산 231 내지 대략 아미노산 340에 걸쳐 있다.
"CH3 도메인"은 인간 IgG1 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단의 잔기(즉, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역의 Gly224 내지 Lys330을 제외한 전장 IgG의 대략 아미노산 잔기 341 내지 대략 아미노산 잔기 447)를 포함한다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG 중쇄 Fc 영역의 Glu99 내지 Pro110을 제외한 전장 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230(Burton, Molec . immunol . (1985) 22:161-206)에 펼쳐져 있는 것으로 규정된다. 다른 IgG 아이소형의 힌지 영역은 동일 위치에서 중쇄간 S-S 결합을 형성하도록 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "더 낮은 힌지 영역"은 보통 힌지 영역에 대해 바로 C-말단의 잔기의 스트레치, 즉, 전장 인간 IgG1의 잔기 233 내지 239로 규정된다.
"고유 Fc 영역 서열"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 고유 인간 Fc 영역 서열은 인간 IgGl Fc 영역(비-A 및 A 동종이형); 인간 IgG2 Fc 영역; 인간 IgG3 Fc 영역; 및 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 천연 발생 변이체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 종으로부터의 고유 Fc 영역, 예를 들어, 뮤린 Fc 영역이 또한 널리 공지되어 있다.
"기능성 Fc 영역"은 고유 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 통상적으로 Fc 영역이 결합 도메인(즉, 본원에서 VEGF 리간드)과 조합되는 것을 필요로 하며, 당 분야에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다. Fc 영역은 인간 Fc 영역, 예를 들어, 고유 서열 인간 Fc 영역, 예를 들어, 인간 IgG1(A 및 비-A 동종이형), IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역일 수 있다. 상기 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 PCT 공개 번호 WO01/02440호를 참조하라.
용어 "트랜스진"은 세포로 도입되고, RNA로 전사될 수 있고, 임의로 적절한 조건하에서 변역되고/되거나 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 양태에서, 이는 도입되는 세포에 필요한 특성을 부여하거나, 그렇지 않으면 필요한 치료적 또는 진단적 결과를 발생(예를 들어, 필요한 치료적 또는 진단적 결과를 부여하는 분자로 전사됨)시킨다.
바이러스 역가에 관하여 사용되는 용어 "유전체 입자(gp)", "유전체 당량" 또는 "유전체 카피"는 감염성 또는 기능과 상관 없이 재조합 AAV DNA 유전체를 함유하는 비리온의 수를 나타낸다. 특정 벡터 제조물 내의 유전체 입자의 수는 본원의 실시예, 또는, 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther ., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol . Ther ., 6:272-278]에 기재된 것과 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
바이러스 역가에 관하여 사용되는 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol ., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이 복제 센터 검정으로도 공지된 감염성 센터 검정에 의해 측정되는 감염성 및 복제-적격 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 나타낸다.
바이러스 역가에 관하여 사용되는 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본원의 실시예, 또는, 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp . Neurobiol ., 144:113-124; 또는 Fisher et al. (1996) J. Virol ., 70:520-532]에 기재된 것과 같은 기능 검정(LFU 검정)에서 측정되는 기능성 트랜스진 생성물의 생성을 발생시키는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 나타낸다.
"역방위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 당 분야에서 널리 이해되어 있는 용어이며, 반대 방향으로 존재하는 바이러스 유전체의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 나타낸다.
당 분야에서 널리 이해되어 있는 용어인 "AAV 역방위 말단 반복(ITR)" 서열은 고유 단일-가닥 AAV 유전체의 양 말단에 존재하는 약 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 2개의 택일적 방향 중 어느 하나의 방향으로 존재하여 다양한 AAV 유전체 사이 및 단일 AAV 유전체의 2개의 말단 사이에 이질성을 발생시킬 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 자가-상보성의 여러 더 짧은 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 지정됨)을 함유하여, ITR의 상기 부분 내에서 가닥내 염기쌍 형성이 발생하는 것을 가능케 한다.
"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 동안 AAV rep 단백질에 의해 분해되는 AAV ITR의 D 영역 내의 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의해 분해되기 어렵다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(결손 파르보바이러스임)가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징되는 것을 가능케 하는 바이러스를 나타낸다. 헬퍼 바이러스는 AAV의 복제를 가능케 하는 "헬퍼 기능"을 제공한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 우두를 포함하는 다수의 상기 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함하나, 서브그룹 C의 아데노바이러스 타입 5(Ad5)가 가장 일반적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유류 및 조류 기원의 다수의 아데노바이러스가 공지되어 있으며, 기탁기관, 예를 들어, ATCC로부터 이용 가능하다. 기탁기관, 예를 들어, ATCC로부터 또한 이용 가능한 헤르페스과의 바이러스는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 거짓광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. AAV의 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 기능의 예는 E1A 기능, E1B 기능, E2A 기능, VA 기능 및 E4orf6 기능을 포함한다.
rAAV의 제조물은 감염성 AAV 입자 대 감염성 헬퍼 바이러스 입자의 비가 적어도 약 102:1; 적어도 약 104:1, 적어도 약 106:1; 또는 적어도 약 108:1인 경우에 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 존재하지 않는" 것으로 언급된다. 제조물은 또한 동등한 양의 헬퍼 바이러스 단백질(즉, 상기 기재된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 분해된 형태로 존재하는 경우 헬퍼 바이러스의 상기 수준의 결과로서 존재하는 단백질)이 존재하지 않을 수 있다. 바이러스 및/또는 세포 단백질 오염은 일반적으로 SDS 젤 상에서 쿠마시 염색 밴드의 존재(예를 들어, AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3에 해당하는 밴드가 아닌 밴드의 출현)로 관찰될 수 있다.
용어 "조절하다"는 신호전달 경로의 수준에 영향을 미치는(예를 들어, 상향 조절하거나, 하향 조절하거나, 달리 조절하는) 것을 의미한다. 신호전달의 조절 하의 세포 과정은 특정 유전자의 전사, 정상 세포 기능, 예를 들어, 대사, 증식, 분화, 부착, 아폽토시스 및 생존, 뿐만 아니라 이상 과정, 예를 들어, 형질전환, 분화의 차단 및 전이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적 상 "활성의" 또는 "활성"은 해당 고유 또는 천연 발생 폴리펩티드의 생물학적 활성(억제성 또는 자극성)을 보유하는 Flt-1 수용체 폴리펩티드의 형태를 나타낸다. 활성은 해당 고유 또는 천연 발생 폴리펩티드로 관찰되는 것보다 크거나, 이와 동등하거나, 이보다 작을 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 활성은 황반 변성으로 고통받는 대상체에서 VEGF 신호전달 경로의 수준을 조절하는 것을 포함한다.
뉴클레오티드 서열을 언급하는 경우에 "분리된"은 지정된 분자가 동일 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적 부재 하에 존재하는 것을 의미한다. 따라서, "특정 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자"는 대상 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 다른 핵산 분자를 실질적으로 함유하지 않는 핵산 분자를 나타내나, 상기 분자는 조성물의 기본 특징에 유해하게 영향을 미치지 않는 일부 추가 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐 특정 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 서열의 상대 위치를 기재하기 위한 목적 상, 예를 들어, 특정 뉴클레오티드 서열이 또 다른 서열에 비해 "상류", "하류", "3-프라임(3')" 또는 "5-프라임(5')"에 위치되는 것으로 기재되는 경우, 이는 당 분야에서 통상적인 바와 같은 언급되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥 내의 서열의 위치임이 이해되어야 한다.
용어 "정제된"은 관심 물질이 이러한 관심 물질이 존재하는 샘플의 대부분의 퍼센트를 구성하도록 하는 물질(화합물, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 폴리펩티드 조성물)의 분리를 나타낸다. 통상적으로, 샘플에서, 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 50%, 80% 내지 85%, 90 내지 99%, 예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 구성한다. 관심 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 정제하기 위한 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강을 포함한다.
용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 척추동물, 예를 들어, 포유동물을 나타낸다. 포유동물은 뮤린, 설치류, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 바와 같은 용어 조성물 또는 작용제의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 눈에서 VEGF를 조절하거나, 황반 변성과 관련된 눈에서 신체적 변화의 진행을 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키거나, 이들로부터 나타나는 증상(예를 들어, 드루젠의 축적, 눈에서의 이상 혈관 성장, 눈에서의 이상 유체, 혈액 및 단백질 누출 등)의 진행을 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키는 것과 같은 필요 반응을 제공하는 조성물 또는 작용제의 충분한 양을 나타낸다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 및 전반적 상태, 치료되는 질환의 중증도, 및 특정 관심 거대분자, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다양할 것이다. 임의의 개별적 환자에서의 적절한 "유효" 양은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lim, J. (2012) Age-Related Macular Degeneration, CRC Press, Boca Raton; Kanski et al. (2011) Clinical Ophthalmology: A Systematic Approach, Elsevier Saunders]을 참조하라.
황반 변성 "치료" 또는 황반 변성을 "치료하는" 것은 (1) 질병을 예방하거나, 즉, 질병에 노출될 수 있거나 질병에 걸리기 쉬우나, 질병의 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않는 대상체에서 질병의 발생을 예방하거나, 질병이 덜한 강도로 발생하도록 하거나, (2) 질병을 억제하거나, 즉, 발생을 저지하거나, 진행을 예방하거나 지연시키거나, 질병 상태를 역전시키거나, (3) 질병의 증상을 경감시키거나, 즉, 대상체가 겪는 증상의 수를 감소시키거나, (4) 황반 변성과 관련된 눈에서 신체적 변화의 진행을 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키는 것을 포함한다. 치료는 드루젠의 축적, 눈에서의 이상 혈관 성장, 눈에서의 이상 유체, 혈액 및 단백질 누출 등의 감소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료는, 예를 들어, 눈의 중심 부분 내의 광수용체(막대 및 원뿔)의 손실의 속도 및 양을 모니터하고, 시력 손실의 속도 및 최고 교정 시력(BCVA)을 모니터하고, 망막 아래의 망막 색소 상피층(및 맥락막모세혈관)의 위축증의 속도 및 양을 모니터하고, 망막과 맥락막 사이에 축적되는 드루젠(세포 조직파편)의 양을 모니터하고, 눈에서의 이상 혈관 성장을 모니터하고, 눈에서의 이상 유체, 혈액 및 단백질 누출의 양을 모니터함으로써 검출될 수 있다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대해 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 구성된 군으로부터의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 예시적 방법, 장치, 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 인용된 모든 기술 및 특허 간행물은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 본원에서 본 발명이 종래 발명에 의해 상기 개시에 앞설 자격이 없는 것으로 인정하는 것으로 해석되어선 안된다.
항상 엄격하게 언급되는 것은 아니지만, 모든 숫자상의 지정은 용어 "약"이 선행하는 것이 이해되어야 한다. 항상 엄격하게 언급되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시이며, 이의 동등물이 당 분야에 공지되어 있음이 또한 이해되어야 한다.
2. 본 발명을 수행하는 방식
본 발명을 상세히 기재하기 전, 본 발명은 특정 제형 또는 공정 파라미터에 제한되지 않고, 이는 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 본 발명의 특정 구현예를 기재하기 위한 것으로, 이로 제한하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
본 발명은 본원에 기재된 예로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하는 것이 인지되어야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 이용될 수 있으며, 본 발명은 당업자의 기술 내에 본원에 제공된 임의의 적용 및 모든 적용 및 모든 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 중심은 VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질(본원에서, "가용성 Flt-1 단백질" 또는 "가용성 Flt-1 수용체"로도 언급됨)을 인코딩하는 작제물을 이용한 인간 눈으로의 유전자 전달이 해당 신호전달 경로를 조절하고, 황반 변성의 증상을 유의하게 감소시키는 작용을 한다는 발견이다. 양태에서, 본 발명은 비-인간 영장류에서 효능이 있는 것으로 이전에 보고된 용량보다 적은 용량을 투여하는 것을 수반한다. 예를 들어, 문헌[Lukason et al., Molecular Ther . (2011) 19:260-265]을 참조하라. 따라서, 가용성 Flt-1 단백질의 투여는 인간에서 황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 유용한 기술을 제공한다. 본원에 기재된 방법은 단독으로 이용될 수 있거나, 전통적인 요법(예를 들어, PDGF 길항제, PDGF-R 길항제, 보체 경로 억제제)과 함께 이용될 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 가용성 단백질은 직접 또는 링커를 통해 다중화 도메인에 연결된, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역에 연결된 적어도 하나의 Flt-1 도메인 또는 이의 활성 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 가용성 단백질은 직접 또는 링커를 통해 다중화 도메인에 연결된 도메인 2 또는 이의 일부 및/또는 신장부를 포함한다. 링커는 5 내지 25개의 아미노산 잔기 길이의 서열을 포함할 수 있다. 대표적 다중화 도메인은 IgG Fc 영역 또는 이의 일부, 및 IgG CH3 영역 또는 이의 일부를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
수용체는 면역글로불린 영역의 상류 또는 하류에 존재할 수 있다. 통상적으로, 융합 단백질은 생체 내에서 발현되는 경우 다합체 형태로 생성된다. 다합체는 이합체, 삼합체 등일 수 있다.
본 발명의 추가의 이해를 위해, 황반 변성, Flt-1 수용체, 수용체-면역글로불린 융합체, 뿐만 아니라 본 발명과 함께 이용하기 위한 다양한 유전자 전달 방법에 관한 더욱 상세한 논의가 하기에 제공된다.
황반 변성
상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 VEGF 활성을 억제함으로써 황반 변성을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 경감시키고/시키거나, 황반 변성의 진행을 예방하거나 지연시키기 위해 Flt-1 수용체를 이용한다. 특정 구현예에서, 황반 변성이 발생할 위험이 있는 개체에 질병을 지연시키거나 예방하기에 효과적인 양이 투여된다.
황반 변성의 적어도 3개 형태가 확인되었다. (1) 중추 지도모양 위축으로도 공지된 AMD의 위축성 비삼출성-건성 형태가 황반 변성을 가진 환자의 약 85 내지 90%에서 발생한다. AMD의 건성 형태는 통상적으로 망막 아래의 망막 색소 상피층(및 추측상 맥락막모세혈관)의 위축증으로부터 발생하며, 눈의 중심 부분 내의 광수용체(막대 및 원뿔)의 손실을 통해 시력 손실을 야기시킨다. 망막과 맥락막 사이에 축적되는 세포 조직파편(드루젠으로 언급됨)이 추가로 존재할 수 있다. (2) 신생혈관 또는 삼출성 AMD로도 공지된 AMD의 습성 형태는 AMD의 더욱 증증 형태이다. AMD의 습성 형태는 통상적으로 눈에서의 이상 혈관 성장을 특징으로 하며, 결함이 있는 혈관이 유체 및 혈액을 누출한다. 이는 맥락막모세혈관으로부터 브루크막을 통해 망막하 공간으로의 이상 혈관 성장으로 인해 시력 손실을 야기시킬 수 있고, 궁극적으로는 황반 아래의 혈액 및 단백질 누출을 발생시킬 수 있다. 이들 혈관으로부터의 출혈, 누출, 및 반흔형성은 치료되지 않고 놔두는 경우 결국 광수용체에 대한 비가역적 손상, 황반에서의 반흔 형성 및 비교적 신속한 시력 손실을 야기시킨다. (3) 색소 상피 박리 관련(PED) ARMD는 환자의 5% 미만에서 발생하며, 망막 박리를 발생시킨다.
Flt-1 분자 및 융합체
본 발명은 VEGF 활성을 조절함으로써 황반 변성을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 경감시키고/시키거나, 황반 변성의 진행을 예방하거나 지연시키기 위해 Flt-1 수용체의 가용성 형태를 이용한다. 양태에서, Flt-1 수용체-면역글로불린 융합체가 본 발명에서 사용된다. 본원에 추가로 기재된 것을 포함하는 공지된 다양한 검정 및 동물 모델 중 임의의 검정 및 동물 모델에서 측정시 VEGF에 결합하고 리간드 활성을 조절하는 능력을 보유한 고유 분자, 뿐만 아니라 이의 활성 단편 및 유사체가 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다. 예를 들어, VEGF 결합 검정은 공지되어 있으며, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Pechan et al., Gene Ther (2009) 16:10-16)] 및 미국 특허 번호 7,928,072호에 기재되어 있다.
대표적 전장 인간 Flt-1 수용체를 인코딩하는 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 도 9a 내지 도 9b(SEQ ID NO:18) 및 도 10a 내지 도 10e(SEQ ID NO:19)에 제시된다. Flt-1 수용체 단백질은 7개의 Ig-유사 도메인을 포함하는 도 10a 내지 도 10e의 위치 27 내지 758에서 발견되는 세포외 부분을 갖는다. 도 10a 내지 도 10e의 아미노산 1 내지 26은 신호 서열이다. 7개의 Ig-유사 도메인은 각각 도 10a 내지 도 10e의 잔기 번호 32 내지 123, 151 내지 214, 230 내지 327, 335 내지 421, 428 내지 553, 556 내지 654, 및 661 내지 747에 위치된다. 이러한 Flt-1 단백질은 Genbank 등록 번호 NM_002019(도 9a 내지 도 9b, SEQ ID NO:18)에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩된다.
구현예에서, 본 발명에서 사용되는 Flt-1 분자는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2를 포함한다. 분자가 VEGF 활성을 조절하는 능력을 보유하는 한 Flt-1 분자의 임의의 부분이 이용될 수 있으나, 일부 구현예에서, Flt-1 분자는 도메인 1 및 3의 전부 또는 일부가 결여되어 있을 수 있다. Flt-1 도메인 2는 도 10a 내지 도 10e의 위치 151 내지 214에서 발견된다. 그러나, 본 발명의 융합체의 Flt-1 성분은, 예를 들어, Flt-1의 도메인 1과 2, 도메인 2와 3 사이 등에서 발견되는 아미노산의 임의의 서열, 예를 들어, 도 10a 내지 도 10e의 위치 124 내지 229 사이에서 발견되는 아미노산 서열에 해당하는 아미노산의 임의의 서열, 예를 들어, 도 10a 내지 도 10e의 위치124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 136...140...145...150, 151, 152, 153, 154, 155...160...165...170 중 어느 하나에서 시작하는 아미노산 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229까지의 아미노산 서열 등을 포함할 수 있다. 구현예에서, 본원에 기재된 융합체의 Flt-1 성분은 도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226을 포함한다. Flt-1 성분은 필요한 활성이 유지되는 한 도메인 1 및 3의 일부를 포함하거나, 심지어 도메인 2의 결실을 포함하는 Flt-1 단백질의 세포외 영역에 존재하는 다른 도메인 중 임의의 도메인의 일부를 또한 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 도메인 1 및 3은 이들의 전체가 존재하지 않는다.
또한, 본 발명의 가용성 단백질은 추가 폴리펩티드/모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 단백질은 VEGFR2의 전부 또는 일부, 예를 들어, VEGFR2의 다양한 도메인 중 임의의 도메인, 비제한적인 예로, VEGFR2의 도메인 1, 2 및/또는 3, 뿐만 아니라 이들 도메인 중 하나 이상 또는 일부가 결실된 작제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, VEGFR2 융합체 및 VEGFR2로부터의 도메인과 Flt-1 도메인의 하이브리드 융합체의 설명에 대해, 문헌[Holash et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA (2002) 99:11393-11398] 및 미국 특허 번호 7,378,095호를 참조하라.
본 발명의 특정 융합체는 도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226에 해당하는 도 2a 내지 도 2b, 도 6, 도 8 및 도 12의 위치 24 내지 118에 제시된 서열을 갖는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2, 또는 VEGF를 조절하는 능력을 보유한 서열의 부분 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 또한 태반 성장인자에 결합한다.
신호 서열이 또한 제공될 수 있고, 가용성 단백질(예를 들어, Flt-1 Ig-유사 도메인 2 서열)의 N-말단에 연결될 수 있다. 신호 서열은 고유 신호 서열의 전부 또는 일부, 예를 들어, 도 10a 내지 도 10e의 위치 1 내지 26에서 발견되는 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 도 2a 내지 도 2b(SEQ ID NO:11), 도 6(SEQ ID NO:15), 도 8(SEQ ID NO:17) 및 도 12(SEQ ID NO:21)에 제시된 융합체에서, 23개의 아미노산의 신호 서열(도 2a 내지 도 2b, 도 6, 도 8 및 도 12의 아미노산 1 내지 23)이 제공된다. 이러한 서열은 Flt-1 단백질의 고유 신호 서열에 상동성이다. 대안적으로, 이종성 신호 서열이 제공될 수 있다. 다수의 상기 서열이 당 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 사용될 것이다. 신호 펩티드의 비제한적인 예는 분비된 단백질, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 소 프로알부민, 인간 프로인슐린, 인간 인터페론-γ, 인간 α-섬유소원, 인간 IgG 중쇄, 래트 아밀라제, 뮤린 α-태아단백질, 닭 리소자임 및 제아 마이스(Zea mays) 제어 단백질 22.1, 뇌 유래 신경영양 인자, 인슐린 성장 인자 1 및 β-글루코로니다제에 존재하는 신호 펩티드를 포함한다.
상기 설명한 바와 같이, 융합체의 Flt-1 부분은 직접 또는 링커 모이어티를 통해 다중화 도메인에 연결된다. 다중화 도메인은 면역글로불린 서열, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 2개 이상의 다중화 도메인 사이에 분자간 이황화 결합을 형성하는 자유 티올을 포함하는 폴리펩티드, 또는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 5,731,168호에 기재된 "공동으로의 융기" 도메인일 수 있다. 다중화 도메인은 단량체 도메인으로부터 이합체, 삼합체 등의 형성을 촉진하거나 이를 가능케 하는 분자의 부분을 제공한다.
다중화 도메인은 단량체 융합 단백질의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 다합체에 대해 적절한 속도로 비-변성 폴리아크릴아미드 젤 상을 이동하도록 할 것이다. 당화는 젤 내의 단백질의 이동에 영향을 미칠 수 있다. 특정 서열이 본원에서 제시되나, 변이체, 예를 들어, 대립유전자 변이체가 또한 이용될 수 있다. 통상적으로, 상기 변이체는 개시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 가질 것이다.
다중화는, 예를 들어, 환원 및 비-환원 젤을 이용하여 검정될 수 있다. 다중화는 또한 단백질의 이의 리간드/수용체에 대한 증가된 결합 친화성의 검출에 의해 검정될 수 있다. BiaCore™ 표면 플라즈몬 공명 검정이 이와 관련하여 이용될 수 있다. 이들 검정은 센서 칩 표면에 가까운 수성층에서의 굴절 지수에서의 변화를 측정함으로써 질량에서의 변화를 검출한다. 다중화를 검출하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다.
양태에서, 다중화 도메인은 면역글로불린 분자, 비제한적인 예로, 중쇄로부터의 영역, 면역글로불린 불변 영역 도메인, Fc 영역 등으로부터 유래된다. IgG1 또는 IgG2 람다 중쇄의 Fc 부분의 서열, 예를 들어, CH3 단독, 예를 들어, 도 14a 내지 도 14b의 아미노산 371 내지 477, 또는 CH3의 일부 또는 신장부, 또는 CH2 및 CH3 도메인 둘 모두, 예를 들어, 도 14a 내지 도 14b의 아미노산 247 내지 477, 또는 이들의 일부 또는 신장부가 이용될 수 있다.
면역글로불린 분자의 일부를 획득하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 면역글로불린 분자의 Fc 부분은 효소 파파인을 이용한 전체 항체 분자의 분해에 의해 획득될 수 있다. 이들 부분을 획득하기 위해 다른 수단이 또한 이용될 수 있다. IgG1 람다 중쇄 단백질 서열에 대해, Genbank 등록 번호 Y14737 및 DNA 및 아미노산 서열을 각각 제시하는 도 13(SEQ ID NO:22) 및 도 14a 내지 도 14b(SEQ ID NO:23)를 참조하라. 다른 Fc 영역, 예를 들어, 다른 IgG 유형 및 IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체로부터의 다른 Fc 영역이 이용될 수 있다. VEGF의 다중화 영역이 또한 이용될 수 있다. VEGF를 인코딩하는 DNA 서열이 Genbank 등록 번호 NM003376 및 도 3(SEQ ID NO:12)에 제시된다. VEGF의 아미노산 서열은 Genbank 등록 번호 CAC19513 및 도 4(SEQ ID NO:13)에 제시된다. VEGF 엑손 3(VEGF Ex3)에 의해 인코딩된 VEGF의 다중화 영역은 VEGF 단백질의 대략 아미노산 잔기 75 내지 88이며(도 4), 이는 아미노산 서열 Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQ ID NO:7)을 포함한다.
많은 다양한 링커 모이어티가 이용될 수 있고, 기능적으로 동등할 수 있으나, 양태에서, 9개의 글리신 잔기의 링커가 본 발명에서 이용된다. 다른 링커는, 예를 들어, 5 내지 100개의 아미노산 잔기, 5 내지 75개의 아미노산 잔기, 5 내지 50개의 아미노산 잔기, 5 내지 25개의 아미노산 잔기, 5 내지 20개의 아미노산 잔기, 5 내지 15개의 아미노산 잔기, 5 내지 10개의 아미노산 잔기, 또는 5 내지 9개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 유용한 링커의 예는 하기를 포함한다:
gly9(SEQ ID NO:1);
glu9(SEQ ID NO:2);
ser9(SEQ ID NO:3);
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4);
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5);
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6); ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7); GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8); 및 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9).
이용될 수 있는 다른 폴리펩티드 링커는 5, 7, 또는 30개의 잔기를 포함하는 다양한 길이의 폴리글리신을 포함한다. 또한, Flt-1의 다른 부분, 예를 들어, Flt-1의 도메인 3 또는 이의 일부 또는 신장부, 예를 들어, 도 10a 내지 도 10e의 아미노산 235 내지 336이 링커로서 이용될 수 있다.
링커 모이어티는 또한 다른 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조될 수 있다. 상기 링커는 10 내지 1000, 10 내지 500, 10 내지 250, 10 내지 100, 또는 10 내지 50의 에틸렌 글리콜 단량체 단위를 가질 수 있다. 적합한 중합체는 아미노산 잔기의 적절한 범위에 의해 점유된 크기와 유사한 크기의 중합체여야 한다. 통상적인 크기 조정된 중합체는 약 10 내지 25 옹스트롬의 간격을 제공할 것이다.
본 발명에서 사용되는 융합 단백질의 예시적 형태는 도 2a 내지 도 2b(SEQ ID NO:11), 도 6(SEQ ID NO:15), 도 8(SEQ ID NO:17) 및 도 12(SEQ ID NO:21)에 제시되어 있으며, 이들 각각은 도 1(SEQ ID NO:10), 도 5(SEQ ID NO:14), 도 7(SEQ ID NO:16) 및 도 11(SEQ ID NO:20)에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 상기 서열은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 번호 7,928,072호에 기재되어 있다.
본원에서 "sFLT01 단백질"로 언급되는 도 2a 내지 도 2b에 제시된 융합체(SEQ ID NO:11)는 N-말단에서 C-말단의 순서로 도 2a 내지 도 2b의 위치 1 내지 23에서 발견되는 신호 서열; 도 2a 내지 도 2b의 위치 24 내지 118(도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226에 해당함)에서 발견되는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2 + 이러한 도메인의 신장부; 도 2a 내지 도 2b의 위치 119 내지 127에서 발견되는 9개의 글리신의 서열; 및 도 2a 내지 도 2b의 위치 128 내지 358의 IgG1-Fc CH2/CH3 잔기를 포함한다.
도 6에 제시된 융합체(SEQ ID NO:15)는 N-말단에서 C-말단의 순서로 도 6의 위치 1 내지 23에서 발견되는 신호 서열; 도 6의 위치 24 내지 118(도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226에 해당함)에서 발견되는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2 + 이러한 도메인의 신장부; 도 6의 위치 119 내지 127에서 발견되는 9개의 글리신의 서열; 및 도 6의 위치 128 내지 141의 VEGF 다중화 도메인을 포함한다.
도 8(SEQ ID NO:17)은 N-말단에서 C-말단의 순서로 도 8의 위치 1 내지 23에서 발견되는 신호 서열; 도 8의 위치 24 내지 118(도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226에 해당함)에서 발견되는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2 + 이러한 도메인의 신장부; 도 8의 위치 119 내지 127에서 발견되는 9개 글리신의 서열; 도 8의 위치 128 내지 141의 VEGF 다중화 도메인; 및 도 8의 위치 142 내지 247의 IgG CH2/CH3 영역으로부터의 서열을 포함한다.
도 12(SEQ ID NO:21)는 N-말단에서 C-말단의 순서로 도 12의 위치 1 내지 23에서 발견되는 신호 서열; 도 12의 위치 24 내지 118(도 10a 내지 도 10e의 아미노산 132 내지 226에 해당함)에서 발견되는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2 + 이러한 도메인의 신장부; 도 12의 위치 119 내지 127에서 발견되는 9개 글리신의 서열; 및 도 12의 위치 128 내지 233에서 발견되는 IgG CH2/CH3 잔기를 포함하는 본원에서 "sFLT02"로 언급되는 융합체를 제시한다.
특정 서열이 본원에서 논의되나, 변이체, 예를 들어, 대립유전자 변이체가 또한 이용될 수 있다. 통상적으로, 상기 변이체는 개시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 가질 것이며, 다중화 및 VEFG에 결합하는 능력을 포함하는 본원에 기재된 기능을 보유할 것이다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 Flt-1 수용체 및 이의 융합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자생물학의 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 방법을 이용하여, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터의 cDNA 및 유전체 라이브러리를 스크리닝하거나, 유전자를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써 획득될 수 있다. 관심 유전자는 또한 공지된 서열을 기초로 하여 클로닝되는 것이 아니라 합성적으로 생성될 수 있다. 상기 분자는 특정 서열에 대한 적절한 코돈을 갖도록 설계될 수 있다. 이후, 완전한 서열이 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리되고, 완전한 코딩 서열로 어셈블리된다. 예를 들어, 문헌[Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; 및 Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311]을 참조하라.
따라서, 특정 뉴클레오티드 서열이 필요한 서열을 갖는 벡터로부터 획득될 수 있거나, 적절한 경우 당 분야에 공지된 다양한 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, 상기]을 참조하라. 필요한 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 획득하는 한 방법은 통상적인 자동화 폴리뉴클레오티드 합성기에서 생성된 중첩 합성 올리고뉴클레오티드의 상보적 세트를 어닐링시킨 후, 적절한 DNA 리가제를 이용한 라이게이션 및 PCR을 통한 라이게이션된 뉴클레오티드 서열의 증폭에 의한 것이다. 예를 들어, 문헌[Jayaraman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1991) 88:4084-4088]을 참조하라. 또한, 올리고뉴클레오티드-특이적 합성(Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), 미리 존재하는 뉴클레오티드 영역의 올리고뉴클레오티드 특이적 돌연변이유발(Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 및 Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536), 및 T4 DNA 중합효소를 이용한 갭이 존재하는 올리고뉴클레오티드의 효소적 방식의 채워 넣기(enzymatic filling-in)(Queen et al., Proc. Natl. Acad . Sci . USA (1989) 86:10029-10033)이 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 분자를 제공하기 위해 이용될 수 있다.
획득된 후, 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 직접 또는 링커 모이어티를 통해 다중화 도메인에 연결될 수 있다. 작제물은 하기에 추가로 기재되는 바와 같이 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 대상체에 전달될 수 있다.
유전자 전달 기술
sFlt-1 작제물, 예를 들어, 상기 기재된 sFlt-1 작제물은 여러 유전자-전달 기술 중 임의의 기술을 이용하여 당해 대상체로 전달될 수 있다. 유전자 전달을 위한 여러 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 재조합 벡터는 하기에 기재되는 바와 같이 약학적 조성물로 제형화되고, 생체 내 또는 생체 외 형질도입 기술을 이용하여 대상체로 도입된다. 생체 외 형질도입되는 경우, 필요한 수용자 세포가 대상체로부터 분리되고, 재조합 벡터로 형질도입되고, 대상체로 재도입될 것이다. 대안적으로, 동계 또는 이종 세포가 이용될 수 있으며, 이들 세포는 대상체에서 부적절한 면역 반응을 발생시키지 않을 것이다.
형질도입된 세포의 대상체로의 전달 및 도입을 위한 적합한 방법이 기재되어 왔다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, 적절한 배지 중에서 재조합 벡터와 대상체의 세포를 조합시키고, 통상적인 기술, 예를 들어, 서던 블롯 및/또는 PCR을 이용하거나 선택 가능한 마커를 이용함으로써 관심 DNA를 갖는 세포에 대해 스크리닝함으로써 시험관 내에서 형질도입될 수 있다.
다수의 바이러스 기반 시스템이 생체 내 또는 생체 외에서 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 벡터로 삽입될 수 있고, 레트로바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 이후, 재조합 바이러스는 생체 내 또는 생체 외에서 분리되고, 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 기재되어 왔다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740호; 문헌[Miller and Rosman, BioTechniques (1989) 7:980-990; Miller, A.D., Human Gene Therapy (1990) 1:5-14; Scarpa et al., Virology (1991) 180:849-852; Burns et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1993) 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin, Cur. Opin . Genet. Develop. (1993) 3:102-109]를 참조하라. 복제-결여 뮤린 레트로바이러스 벡터가 널리 이용되는 유전자 전달 벡터이다. 뮤린 백혈병 레트로바이러스는 단백질 코어(gag)에 의해 싸여져 있고, 숙주 범위를 결정하는 당단백질 외피(env)에 의해 둘러싸인 핵 코어 단백질 및 중합효소(pol) 효소와 복합체화된 단일 가닥 RNA를 포함한다. 레트로바이러스의 유전체 구조는 5' 및 3' 장 말단 반복(LTR)에서 에워싸인 gag, pol, 및 env 유전자를 포함한다. 레트로바이러스 벡터 시스템은 5' 및 3' LTR 및 패키징 신호를 함유하는 최소 벡터가 벡터 패키징 및 표적 세포로의 감염 및 통합을 가능케 하기에 충분하다는 사실을 이용하나, 단, 바이러스 구조 단백질은 패키징 세포주에서 트랜스로 공급되어야 한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터의 기본적인 장점은 대부분의 세포 유형에서의 효과적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA로의 정확한 단일 카피 벡터 통합 및 레트로바이러스 유전체의 조작의 용이성을 포함한다.
다수의 아데노바이러스 벡터가 또한 기재되어 왔다. 숙주 유전체로 통합되는 레트로바이러스와 달리, 아데노바이러스는 염색체 외적으로 존속하며, 따라서 삽입 돌연변이유발과 관련된 위험을 최소화시킨다(Haj-Ahmad and Graham, J. Virol . (1986) 57:267-274; Bett et al., J. Virol . (1993) 67:5911-5921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5:717-729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68:933-940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1:51-58; Berkner, K.L. BioTechniques (1988) 6:616-629; 및 Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4:461-476). 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 하기에 더욱 상세히 기재된다.
또한, 다양한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. AAV 벡터는 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 작제될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,173,414호 및 5,139,941호; 국개 공개 번호 WO 92/01070호(1992년 1월 23일에 공개됨) 및 WO 93/03769호(1993년 3월 4일에 공개됨); 문헌[Lebkowski et al., Molec . Cell. Biol . (1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol . and Immunol . (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; 및 Zhou et al., J. Exp . Med . (1994) 179:1867-1875]을 참조하라. AAV 벡터 시스템은 또한 하기에 추가로 상세히 기재된다.
관심 핵산 분자를 전달하기 위해 이용될 추가의 바이러스 벡터는 우두 바이러스 및 조류 폭스바이러스를 포함하는 폭스과 바이러스로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 유전자를 발현하는 우두 바이러스 재조합체가 하기와 같이 작제될 수 있다. 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA가 먼저 우두 프로모터에 인접하고, 우두 DNA 서열, 예를 들어, 티미딘 키나제(TK)를 인코딩하는 서열에 측접하도록 적절한 벡터로 삽입된다. 이후, 이러한 벡터는 우두로 동시에 감염되는 세포를 트랜스펙션시키기 위해 이용된다. 상동성 재조합이 바이러스 유전체에 우두 프로모터 + 단백질을 인코딩하는 유전자를 삽입하는 작용을 한다. 발생된 TK-재조합체는 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 세포를 배양하고, 이에 대해 내성인 바이러스 플라크를 채집함으로써 선택될 수 있다.
대안적으로, 조류폭스바이러스, 예를 들어, 파울폭스 및 카나리폭스 바이러스가 또한 유전자를 전달하기 위해 이용될 수 있다. 조류폭스 벡터의 이용은 인간 및 다른 포유류 종에서 특히 필요한데, 이는 조류폭스 속의 일원이 민감한 조류 종에서만 생산적으로 복제할 수 있고, 따라서 포유류 세포에서는 감염성이 없기 때문이다. 재조합 조류폭스바이러스를 생성시키기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 우두 바이러스의 생성과 관련하여 상기 기재된 바와 같은 유전적 재조합을 이용한다. 예를 들어, WO 91/12882호; WO 89/03429호; 및 WO 92/03545호를 참조하라.
분자 컨쥬게이트 벡터, 예를 들어, 문헌[Michael et al., J. Biol . Chem . (1993) 268:6866-6869 및 Wagner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1992) 89:6099-6103]에 기재된 아데노바이러스 키메라 벡터가 또한 유전자 전달에 이용될 수 있다.
알파바이러스 속의 일원, 비제한적인 예로, 신드비스 및 셈리키 산림 바이러스로부터 유래된 벡터가 또한 융합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 바이러스 벡터로 사용될 것이다. 본 발명의 방법의 실시에 유용한 신버스(Sinbus)-바이러스 유래 벡터의 설명에 대해, 문헌[Dubensky et al., J. Virol . (1996) 70:508-519]; 및 국제 공개 번호 WO 95/07995호 및 WO 96/17072호를 참조하라.
대안적으로, Flt-1 작제물은 바이러스 벡터의 사용 없이, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 모두 포함되는 미국 특허 번호 6,413,942호; 6,214,804호; 5,580,859호; 5,589,466호; 5,763,270호; 및 5,693,622호에 기재된 바와 같은 플라스미드-기반 핵산 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 플라스미드는 생체 내에서 단백질 생성물의 발현을 유도하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 관심 유전자를 포함할 것이다. 상기 조절 요소는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
아데노바이러스 유전자 전달 시스템
본 발명의 한 구현예에서, Flt-1 수용체, 예를 들어, 상기 기재된 융합체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아데노바이러스-기반 발현 벡터로 삽입된다. 아데노바이러스 유전체는 각각의 가닥의 5' 말단에 공유적으로 결합된 55-kDa 말단 단백질을 갖는 약 36,000개 염기쌍의 선형 이중-가닥 DNA 분자이다. 아데노바이러스("Ad") DNA는 혈청형에 따라 정확한 길이를 갖는 약 100개 염기쌍의 동일한 역방위 말단 반복("ITR")을 함유한다. 바이러스 복제 기점은 유전체 말단에 정확히 ITR 내에 위치된다. DNA 합성은 2단계로 발생한다. 첫째로, 복제는 딸(daughter) 듀플렉스 분자 및 모(parental) 치환 가닥을 발생시키는 가닥 치환에 의해 진행된다. 치환된 가닥은 단일-가닥이며, 복제 개시 및 딸 듀플렉스 분자의 발생을 가능케 하는 "팬핸들(panhandle)" 중간체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 복제는 유전체의 양 말단으로부터 동시에 진행될 수 있으며, 이는 팬핸들 구조를 형성시키는 필요조건을 회피한다.
생산적 감염 주기 동안, 바이러스 유전자는 바이러스 DNA 복제까지의 기간인 초기 단계, 및 바이러스 DNA 복제의 개시와 동시에 발생하는 후기 단계의 두단계로 발현된다. 초기 단계 동안, 영역 E1, E2, E3 및 E4에 의해 인코딩된 초기 유전자 생성물만이 발현되며, 이는 세포를 바이러스 구조 단백질의 합성을 위해 준비시키는 다수의 기능을 수행한다. 후기 단계 동안, 초기 유전자 생성물에 더하여 후기 바이러스 유전자 생성물이 발현되고, 숙주 세포 DNA 및 단백질 합성이 차단된다. 이후, 세포는 바이러스 DNA 및 바이러스 구조 단백질의 생성에만 전념하게 된다.
아데노바이러스의 E1 영역은 표적 세포의 감염 후에 발현되는 첫 번째 영역이다. 이러한 영역은 2개의 전사 단위, E1A 및 E1B 유전자로 구성된다. E1A 유전자 생성물의 주요 기능은 정지 세포가 세포 주기로 진입하고 세포 DNA 합성을 다시 시작하도록 유도시키고, E1B 유전자 및 다른 초기 영역(E2, E3, E4)을 전사적으로 활성화시키는 것이다. E1A 유전자 단독을 이용한 일차 세포의 트랜스펙션은 무제한의 증식(무한증식)을 유도할 수 있으나, 완전한 형질전환을 발생시키지 않는다. 그러나, 대부분의 경우에서의 E1A의 발현은 프로그램화된 세포 사멸(아폽토시스), 및 단지 때때로 무한증식을 유도한다. E1B 유전자의 공동발현은 아폽토시스의 유도를 방지하고, 완전한 형태적 형질전환을 발생시키는데 요구된다. 확립된 무한증식 세포주에서, E1A의 고수준 발현은 E1B의 부재하에서 완전한 형질전환을 야기시킬 수 있다.
E1B-인코딩된 단백질은 바이러스 복제를 가능케 하도록 세포 기능을 유도하는데 있어서 E1A를 돕는다. 핵 내에 본질적으로 국소화되는 복합체를 형성하는 E1B 55 kD 및 E4 33 kD 단백질은 숙주 단백질의 합성을 억제하고, 바이러스 유전자의 발현을 촉진하는 기능을 한다. 이들의 주요 영향은 부수적으로 감염의 후기 단계의 개시와 함께 핵으로부터 세포질로의 바이러스 mRNA의 선택적 수송을 확립하는 것이다. E1B 21 kD 단백질은 생산적 감염 주기의 정확한 시간적 조절에 중요하며, 이에 의해 바이러스 생활 주기가 완료되기 전에 숙주 세포의 조기 사멸을 방지한다.
아데노바이러스-기반 벡터는 높은 수준으로 유전자 생성물 펩티드를 발현한다. 아데노바이러스 벡터는 낮은 역가의 바이러스를 이용함에도 높은 감염성 효율을 갖는다. 또한, 상기 바이러스는 세포 비함유 비리온으로서 충분히 감염성이어서, 생산자 세포주의 주입이 필요하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 생체 내에서 이종성 유전자의 장기간 발현을 달성한다. 아데노바이러스는 중증의 인간 병리와 관련되지 않으며, 상기 바이러스는 매우 다양한 세포를 감염시킬 수 있고, 넓은 숙주-범위를 가지며, 상기 바이러스는 비교적 용이하게 대량으로 생성될 수 있으며, 상기 바이러스는 바이러스 유전체의 초기-영역 1("E1")의 결실에 의해 복제 결여성이 될 수 있다. 따라서, 적어도 E1 영역이 결실되고 관심 유전자에 의해 대체된 인간 아데노바이러스로부터 유래된 벡터가 전임상 및 임상 단계에서 유전자 요법 실험에 광범위하게 사용되어 왔다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 40개가 넘는 아데노바이러스의 혈청형 계통 중 임의의 혈청형 계통, 예를 들어, 혈청형 2, 5, 12, 40 및 41을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 아데노바이러스 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래된다. 본원에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 복제-결여성이며, 적합한 프로모터, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스에 관하여 하기에 논의되는 프로모터 중 임의의 프로모터의 조절 하에 관심 유전자를 함유한다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,048,551호에는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터의 조절 하에 Ad.RSVIL-10 및 Ad.RSVIL-1ra로 각각 언급되는 항염증성 사이토카인 IL-10에 대한 인간 유전자를 포함하는 복제-결여성 아데노바이러스 벡터, 뿐만 아니라 항염증성 사이토카인 IL-1ra에 대한 유전자를 포함하는 벡터가 기재되어 있다.
아데노바이러스 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래되고, 다양한 프로모터 시스템을 갖는 다른 재조합 아데노바이러스가 당업자에 의해 이용될 수 있다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,306,652호에는 E2A 과발현에 의한 세포 사멸을 방지하기 위한 hr 돌연변이 및 ts400으로 언급되는 ts125 돌연변이를 함유하는 E2A 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터, 뿐만 아니라 유도성 프로모터의 조절 하에서 hr 돌연변이만을 함유하는 E2A 서열을 갖는 벡터, 및 유도성 프로모터의 조절 하에서 hr 돌연변이 및 ts125 돌연변이(ts400)를 함유하는 E2A 서열을 갖는 벡터가 기재되어 있다.
또한, 미국 특허 번호 6,306,652호에 기재된 바와 같은 "최소" 아데노바이러스 벡터가 본 발명과 함께 사용될 것이다. 상기 벡터는 유전체의 바이러스 입자로의 캡시드화에 필요한 바이러스 유전체의 적어도 일부(캡시드화 신호), 뿐만 아니라 적어도 기능성 부분의 적어도 하나의 카피 또는 ITR의 유도체를 보유한다. 최소 아데노바이러스 벡터의 패키징은 헬퍼 바이러스, 또는 대안적으로 미국 특허 번호 6,306,652호에 기재된 바와 같은 패키징-결여성 복제 헬퍼 시스템과의 공동감염에 의해 달성될 수 있다.
관심 유전자의 전달을 위한 다른 유용한 아데노바이러스-기반 벡터는 바이러스 유전체의 광범위한 대부분이 제거된 "거트리스(gutless)"(헬퍼-의존성) 아데노바이러스를 포함한다(Wu et al., Anesthes . (2001) 94:1119-1132). 상기 "거트리스" 아데노바이러스 벡터는 본질적으로 바이러스 단백질을 생성하지 않으며, 따라서 바이러스 유도 유전자 요법이 단일 투여 후에 1년 이상 동안 성공적으로 발생하는 것을 가능케 하고(Parks, R.J., Clin . Genet. (2000) 58:1-11; Tsai et al., Curr . Opin. Mol . Ther . (2000) 2:515-523), 면역 시스템에 의한 간섭을 배제한다. 또한, 바이러스 유전체의 제거는 전신적으로 투여된 약물에 의한 발현 조절을 제공하는 조절 서열의 삽입을 위한 공간을 발생시키며(Burcin et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA (1999) 96:355-360), 바이러스 유도 단백질 발현의 안전성 및 조절 둘 모두를 제공한다. 이들 및 다른 재조합 아데노바이러스가 본 발명의 방법과 함께 사용될 것이다.
아데노 -관련 바이러스 유전자 전달 시스템
아데노-관련 바이러스(AAV)는 유전자 요법을 위해 유전자를 전달하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. AAV 유전체는 약 4681개의 뉴클레오티드를 함유하는 선형의 단일-가닥 DNA 분자이다. AAV 유전체는 각각의 말단에 일반적으로 역방위 말단 반복(ITR)이 측접된 내부 비반복 유전체를 포함한다. ITR은 약 145개의 염기쌍(bp) 길이이다. ITR은 DNA 복제 기점, 및 바이러스 유전체에 대한 패키징 신호를 제공하는 것을 포함하는 다수의 기능을 갖는다. 유전체의 내부 비반복 부분은 AAV 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자로 공지된 2개의 큰 열린해독틀을 포함한다. rep 및 cap 유전자는 바이러스가 복제되고 비리온으로 패키징되는 것을 가능케 하는 바이러스 단백질을 코딩한다. 특히, 적어도 4개의 바이러스 단백질과는 이들의 겉보기 분자량에 따라 언급되는 AAV rep 영역, Rep 78, Rep 68, Rep 52, 및 Rep 40으로부터 발현된다. AAV cap 영역은 적어도 3개의 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 인코딩한다.
AAV는 AAV 유전체의 내부 비반복 부분(즉, rep 및 cap 유전자)를 결실시키고, ITR 사이의 이종성 유전자(본 발명의 경우, Flt-1 수용체 또는 융합체를 인코딩하는 유전자)를 삽입함으로써 관심 유전자를 전달하도록 공학 처리되었다. 이종성 유전자는 통상적으로 적절한 조건하에서 환자의 표적 세포에서의 유전자 발현을 유도할 수 있는 이종성 프로모터(항시성, 세포-특이성, 또는 유도성)에 기능적으로 연결된다. 종료 신호, 예를 들어, 아데닐중합체형성 부위가 또한 포함될 수 있다.
AAV는 헬퍼 의존성 바이러스이며, 즉, 이는 AAV 비리온을 형성시키기 위해 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두)와의 공동감염을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스와의 공동감염의 부재하에서, AAV는 바이러스 유전체가 숙주 세포 염색체로 삽입되나, 감염성 비리온은 생성되지 않는 잠복 상태를 확립시킨다. 이후, 헬퍼 바이러스에 의한 감염은 통합된 유전체를 "구조"하여, 이를 복제시키고, 이의 유전체를 감염성 AAV 비리온으로 패키징시킨다. AAV는 다양한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수 있는 반면, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종이어야 한다. 따라서, 예를 들어, 인간 AAV는 개과 아데노바이러스와 공동감염된 개과 세포에서 복제될 것이다.
관심 유전자를 포함하는 재조합 AAV 비리온은 하기에 더욱 충분히 기재되는 다양한 당 분야에서 인정된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. rAAV 비리온을 생성시키는데 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 야생형 AAV 및 헬퍼 바이러스가 이용될 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,139,941호 참조). 대안적으로, 널리 공지된 헬퍼 바이러스 중 하나에 의한 감염과 조합된 헬퍼 기능 유전자를 함유하는 플라스미드가 복제 기능원으로 이용될 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,622,856호 및 미국 특허 번호 5,139,941호 참조). 유사하게, 보조 기능 유전자를 함유하는 플라스미드가 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 야생형 AAV에 의한 감염과 조합하여 이용될 수 있다. rAAV 벡터와 조합하여 사용되는 경우 이들 세 접근법은 rAAV 비리온을 생성시키기에 각각 충분하다. 당 분야에 널리 공지된 다른 접근법이 또한 rAAV 비리온을 생성시키기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, rAAV 비리온을 생성시키기 위해 삼중 트랜스펙션 방법(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,001,650호에 상세히 기재됨)이 이용되는데, 이는 이러한 방법이 감염성 헬퍼 바이러스의 사용을 필요로 하지 않아, rAAV 비리온이 임의의 검출 가능한 헬퍼 바이러스가 존재함이 없이 생성되는 것을 가능케 하기 때문이다. 이는 AAV 헬퍼 기능 벡터, 보조 기능 벡터, 및 rAAV 발현 벡터의 rAAV 비리온 생성을 위한 3개의 벡터의 사용에 의해 달성된다. 그러나, 당업자는 이들 벡터에 의해 인코딩된 핵산 서열이 다양한 조합으로 2개 이상의 벡터에 제공될 수 있음을 인지할 것이다.
본원에서 설명한 바와 같이, AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 작용하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 인코딩한다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 건출 가능한 wt AAV 비리온(즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성시키지 않고 효과적인 AAV 벡터 생성을 지지할 수 있다. 상기 벡터의 예인 pHLP19가 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,001,650호에 기재되어 있다. AAV 헬퍼 기능 벡터의 rep 및 cap 유전자는 상기 설명한 바와 같이 공지된 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, AAV 헬퍼 기능 벡터는 AAV-2로부터 유래된 rep 유전자 및 AAV 6으로부터 유래된 cap 유전자를 가질 수 있고; 당업자는 다른 rep 및 cap 유전자 조합이 가능함을 인지할 것이며, 규정되는 특징은 rAAV 비리온 생성을 지지하는 능력이다.
보조 기능 벡터는 AAV가 복제를 위해 의존하는 비 AAV-유래 바이러스 및/또는 세포 기능(즉, "보조 기능")에 대한 뉴클레오티드 서열을 인코딩한다. 보조 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 어셈블리와 관련된 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스 기반 보조 기능은 널리 공지된 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 타입-1이 아님), 및 우두 바이러스 중 임의의 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 보조 기능 플라스미드 pLadeno5가 사용된다(pLadeno5에 관한 세부사항은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,004,797호에 기재되어 있음). 이러한 플라스미드는 AAV 벡터 생성을 위한 아데노바이러스 보조 기능의 완전한 세트를 제공하나, 복제 적격 아데노바이러스를 형성시키는데 필요한 성분이 결여되어 있다.
AAV의 추가 이해를 위해, 재조합 AAV 발현 벡터 및 AAV 헬퍼 및 보조 기능에 관한 더욱 상세한 논의가 하기에 제공된다.
재조합 AAV 발현 벡터
재조합 AAV(rAAV) 발현 벡터는 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 성분으로서 전사 개시 영역을 포함하는 조절 요소, 관심 폴리뉴클레오티드 및 전사 종료 영역을 적어도 제공하는 공지된 기술을 이용하여 작제된다. 조절 요소는 관심 세포, 예를 들어, 포유류 세포에서 기능성이 되도록 선택된다. 작동 가능하게 연결된 성분을 함유하는 생성된 작제물은 기능성 AAV ITR 서열과 결합된다(5' 및 3').
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 2 서열에 대해 문헌[Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)]을 참조하라. 본 발명의 벡터에서 사용되는 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없으며, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 또한, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 게다가, AAV 발현 벡터 내의 선택된 뉴클레오티드 서열에 측접된 5' 및 3' ITR은 이들이 의도된 기능을 하는 한, 즉, 숙주 세포 유전체 또는 벡터로부터 관심 서열의 절제 및 구조를 가능케 하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포 내에 존재하는 경우 수용자 세포 유전체로의 DNA 분자의 통합을 가능케 하는 한 반드시 동일하거나 동일 AAV 혈청형 또는 분리물로부터 유래될 필요는 없다.
AAV 벡터에서 사용하기 위한 적합한 폴리뉴클레오티드 분자는 약 5 킬로베이스(kb) 크기 미만일 것이다. 선택된 폴리뉴클레오티드 서열은 대상체의 생체 내에서 이의 전사 또는 발현을 유도하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 상기 조절 요소는 선택된 유전자와 보통 회합된 조절 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 조절 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 조절 서열은 일반적으로 포유류 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 예로는 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터, GFAP 프로모터, SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 비바이러스 유전자, 예를 들어, 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열이 또한 본원에서 사용될 것이다. 상기 프로모터 서열은, 예를 들어, Stratagene(San Diego, CA)으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
AAV ITR에 의해 결합된 관심 폴리뉴클레오티드 분자를 갖는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 주요 AAV 열린해독틀("ORF")이 절제된 AAV 유전체로 직접 삽입함으로써 작제될 수 있다. 복제 및 패키징 기능을 가능케 하는 ITR의 충분한 부분이 남아 있는 한 AAV 유전체의 다른 부분이 또한 결실될 수 있다. 상기 작제물은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,173,414호 및 5,139,941호; 국제 공개 번호 WO 92/01070호(1992년 1월 23일에 공개됨) 및 WO 93/03769호(1993년 3월 4일에 공개됨); 문헌[Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol . and Immunol. 158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al. (1994) J. Exp . Med . 179:1867-1875]을 참조하라.
대안적으로, AAV ITR은 바이러스 유전체 또는 이를 함유하는 AAV 벡터로부터 절제될 수 있고, 문헌[Sambrook et al., 상기]에 기재된 것과 같은 표준 라이게이션 기술을 이용하여 또 다른 벡터 내에 존재하는 선택된 핵산 작제물의 5' 및 3'에 융합될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 ㎍/㎖ BSA, 10 mM 내지 50 mM NaCl, 및 0℃에서의 40 μM ATP, 0.01 내지 0.02(Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("점착 종단" 라이게이션을 위함) 또는 14℃에서의 1 mM ATP, 0.3 내지 0.6(Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("둔단" 라이게이션을 위함)에서 달성될 수 있다. 분자간 "점착 존단" 라이게이션은 보통 30 내지 100 ㎍/㎖ 전체 DNA 농도(5 내지 100 nM 전체 최종 농도)로 수행된다. ITR을 함유하는 AAV 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,139,941호에 기재되어 있다. 특히, 등록 번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226으로 미국 미생물 보존 센터("ATCC")에서 이용 가능한 여러 AAV 벡터가 상기 특허에 기재되어 있다.
본 발명의 목적 상, AAV 발현 벡터로부터 rAAV 비리온을 생성시키기에 적합한 숙주 세포는 이종성 DNA 분자의 수용자일 수 있거나, 수용자로 사용되어 왔거나, 수용체로 사용될 수 있고, 예를 들어, 현탁액 배지, 생물반응기 등에서 성장될 수 있는, 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함한다. 상기 용어는 트랜스펙션된 기원 세포의 프로제니를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 나타낸다. 안정적 인간 세포주 293(예를 들어, 등록 번호 ATCC CRL1573으로 미국 미생물 보존 센터를 통해 용이하게 이용 가능함)로부터의 세포가 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 타입 5 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주(Graham et al. (1977) J. Gen. Virol . 36:59)이며, 이는 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다(Aiello et al. (1979) Virology 94:460). 293 세포주는 용이하게 트랜스펙션되고, rAAV 비리온을 생성시키는 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
AAV 헬퍼 기능
상기 기재된 AAV 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 AAV ITR이 측접된 뉴클레오티드 서열을 복제하고 캡시드화시켜 rAAV 비리온을 생성하도록 AAV 헬퍼 기능을 제공할 수 있도록 되어야 한다. AAV 헬퍼 기능은 일반적으로 생산적 AAV 복제에 대해 이후에 트랜스로 작용하는 AAV 유전자 생성물을 제공하도록 발현될 수 있는 AAV 유래 코딩 서열이다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터로부터 분실된 필요한 AAV 기능을 보충하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV ORF, 즉, rep 및 cap 코딩 영역 중 하나 또는 둘 모두, 또는 이들의 기능적 동족체를 포함한다.
"AAV rep 코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 인코딩하는 AAV 유전체의 당 분야에 인지된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은 AAV의 DNA 복제 기점의 인지, 결합 및 니킹(nicking), DNA 헬리카제 활성 및 AAV(또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사의 조절을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다. Rep 발현 생성물은 집합적으로 AAV 유전체를 복제시키는데 필요하다. AAV rep 코딩 영역의 설명에 대해, 예를 들어, 문헌[Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol . and Immunol . 158:97-129; 및 Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801]을 참조하라. AAV rep 코딩 영역의 적합한 동족체는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로도 공지된 인간 헤르페스바이러스 6(HHV-6) rep 유전자를 포함한다(Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
"AAV cap 코딩 영역"은 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3, 또는 이들의 기능적 동족체를 인코딩하는 AAV 유전체의 당 분야에 인지된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 집합적으로 바이러스 유전체를 패키징시키는데 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV cap 코딩 영역의 설명에 대해, 예를 들어, 문헌[Muzyczka, N. and Kotin, R.M. (상기)]을 참조하라.
AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 트랜스펙션 전, 또는 트랜스펙션과 동시에 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 숙주 세포로 도입된다. 따라서, AAV 헬퍼 작제물은 생산적 AAV 감염에 필요한 분실된 AAV 기능을 보충하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적 발현을 제공하기 위해 이용된다. AAV 헬퍼 작제물은 AAV ITR이 결여되어 있으며, 자신이 복제되거나 패키징될 수 없다.
이들 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태로 존재할 수 있다. 다수의 AAV 헬퍼 작제물, 예를 들어, Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 모두를 인코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Samulski et al. (1989) J. Virol . 63:3822-3828; 및 McCarty et al. (1991) J. Virol . 65:2936-2945]을 참조하라. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,139,941호를 참조하라.
AAV 보조 기능
숙주 세포(또는 패키징 세포)는 또한 rAAV 비리온을 생성시키기 위해 비AAV 유래 기능, 또는 "보조 기능"을 제공할 수 있게 되어야 한다. 보조 기능은 AAV가 이의 복제를 위해 의존하는 비AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능이다. 따라서, 보조 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리와 관련된 것을 포함하는 AAV 복제에 필요한 비AAV 단백질 및 RNA를 적어도 포함한다. 바이러스 기반 보조 기능은 공지된 헬퍼 바이러스 중 임의의 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있다.
특히, 보조 기능은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포로 도입된 후, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 통상적으로, 보조 기능은 관련되지 않은 헬퍼 바이러스를 이용한 숙주 세포의 감염에 의해 제공된다. 아데노바이러스; 헤르페스바이러스, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 및 2; 및 우두 바이러스를 포함하는 다수의 적합한 헬퍼 바이러스가 공지되어 있다. 다양한 공지된 작용제 중 임의의 작용제를 이용한 세포 동기화에 의해 제공되는 것을 포함하는 비바이러스 보조 기능이 또한 본원에서 사용될 것이다. 예를 들어, 문헌[Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117]을 참조하라.
대안적으로, 보조 기능은 상기 정의된 바와 같은 보조 기능 벡터를 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,004,797호 및 국제 공개 번호 WO 01/83797호를 참조하라. 보조 기능을 제공하는 핵산 서열은 천연원, 예를 들어, 아데노바이러스 입자의 유전체로부터 획득될 수 있거나, 당 분야에 공지된 재조합 또는 합성 방법을 이용하여 작제될 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이, 보조 헬퍼 기능에 대해 아데노바이러스 유전자의 전체 보충이 필요하지 않음이 입증되었다. 특히, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이체가 AAV 복제에 허용이 되는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Ito et al., (1970) J. Gen. Virol . 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317]. 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이체는 AAV 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 E2B 및 E3 영역이 아마 보조 기능을 제공하는데 있어서 관련되지 않은 것을 나타낸다. 문헌[Carter et al., (1983) Virology 126:505]. 그러나, E1 영역이 결여되어 있거나, 결실된 E4 영역을 갖는 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지할 수 없다. 따라서, AAV 복제를 위해 E1A 및 E4 영역이 직접적 또는 간접적으로 필요할 수 있다. 문헌[Laughlin et al., (1982) J. Virol . 41:868; Janik et al., (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505]. 다른 특성규명된 Ad 돌연변이체는 다음을 포함한다: E1B(Laughlin et al. (1982), 상기; Janik et al. (1981), 상기; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A(Handa et al., (1975) J. Gen.Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol . 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol . 35:665; Jay et al., (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol . Chem . 256:567); E2B(Carter, Adeno -Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3(Carter et al. (1983), 상기); 및 E4(Carter et al.(1983), 상기; Carter (1995)). E1B 코딩 영역 내에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스에 의해 제공된 보조 기능의 연구는 상반되는 결과를 발생시켰으나, 문헌[Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210]에서는 E1B55k가 AAV 비리온 생성에 필요하나, E1B19k는 그렇지 않은 것으로 보고되어 있다. 또한, 국제 공개 WO 97/17458호 및 문헌[Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945]에는 다양한 Ad 유전자를 인코딩하는 보조 기능 벡터가 기재되어 있다. 보조 기능 벡터는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 온전한 E1B55k 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 국제 공개 번호 WO 01/83797호에 기재되어 있다.
헬퍼 바이러스를 이용한 숙주 세포의 감염, 또는 보조 기능 벡터를 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션의 결과로서, AAV 헬퍼 작제물을 전이활성화시켜 AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 생성시키는 보조 기능이 발현된다. Rep 발현 생성물은 AAV 발현 벡터로부터 재조합 DNA(관심 DNA를 포함함)를 절제한다. Rep 단백질은 또한 AAV 유전체를 이중화시키는 작용을 한다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드로 어셈블리되고, 재조합 AAV 유전체가 캡시드로 패키징된다. 따라서, 생산적 AAV 복제가 발생하고, DNA가 rAAV 비리온으로 패키징된다. "재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV 비리온"은 양 말단에 AAV ITR이 측접되는 관심 이종성 뉴클레오티드 서열을 캡시드화시키는 AAV 단백질 껍질을 포함하는 감염성의 복제 결여성 바이러스로 본원에서 정의된다.
재조합 AAV 복제 후, rAAV 비리온은 다양한 통상적인 정제 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, CsCl 구배 등을 이용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 복수의 컬럼 정제 단계, 예를 들어, 음이온 교환 컬럼, 친화성 컬럼 및/또는 양이온 교환 컬럼 상에서의 정제가 이용될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 02/12455호를 참조하라. 추가로, 보조 기능을 발현시키기 위해 감염이 이용되는 경우, 공지된 방법을 이용하여 나머지 헬퍼 바이러스는 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는, 예를 들어, 20분 이상 동안 약 60℃의 온도로 가열함으로써 비활성화될 수 있다. 이러한 처리는 헬퍼 바이러스만 효과적으로 비활성화시키는데, 이는 AAV가 극도로 열 안정성인 반면, 헬퍼 아데노바이러스는 열 불안정성이기 때문이다.
관심 뉴클레오티드 서열을 함유하는 생성된 rAAV 비리온은 이후 하기 기재되는 기술을 이용하여 유전자 전달에 이용될 수 있다.
rAAV 입자
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 ITR이 측접된 트랜스진을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 핵산은 AAV 입자 내에 캡시드화된다. AAV 입자는 또한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 관심 단백질 코딩 서열(들)(예를 들어, 치료 트랜스진), 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 성분, 전사 개시 및 종료 서열을 포함하는 조절 서열을 포함하며, 이에 의해 발현 카세트를 형성한다. 발현 카세트는 5' 및 3' 말단에 적어도 하나의 기능성 AAV ITR 서열이 측접된다. "기능성 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징에 대해 의도된 바와 같이 기능하는 것을 의미한다. 모든 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol ., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther ., 2009, 16:10-16]을 참조하라. 본 발명의 일부 양태의 실시를 위해, 재조합 벡터는 적어도 캡시드화 및 rAAV에 의한 감염을 위한 물리적 구조에 필수적인 AAV의 서열 모두를 포함한다. 본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없고(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음), 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, AAV ITR은 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. AAV의 40개 초과의 혈청형이 현재 공지되어 있으며, 새로운 혈청형 및 현존하는 혈청형의 변이체가 지속적으로 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; 및 Bossis et al., J. Virol ., 2003, 77(12):6799-810]을 참조하라. 임의의 AAV 혈청형의 용도가 본 발명의 범위 내로 간주된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh10, AAV11, AAV12 등의 ITR을 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 등의 캡시드 단백질을 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(Gao, et al. J. Virol. 2004, 78(12):6381).
특정 표적 세포의 형질도입을 최적화시키거나, 특정 표적 조직(예를 들어, 병에 걸린 조직) 내에 특정 세포 유형을 표적화하기 위해 다양한 AAV 혈청형이 이용된다. rAAV 입자는 동일 혈청형 또는 혼합된 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각각의 조합이 명백히 본원에 언급된 것처럼 본원에 제공된다.
자가-상보성 AAV 바이러스 유전체
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자가-상보성 유전체를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자가-상보성 유전체를 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자가-상보성 AAV 유전체의 사용 방법은 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,596,535호; 7,125,717호; 7,765,583호; 7,785,888호; 7,790,154호; 7,846,729호; 8,093,054호; 및 8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있다. 자가-상보성 유전체를 포함하는 rAAV는 이의 부분적 상보성 서열(예를 들어, 트랜스진의 상보성 코딩 및 비-코딩 가닥)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 신속히 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공하며, rAAV 유전체는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료 트랜스진 코딩 가닥) 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료 트랜스진의 비코딩 또는 안티센스 가닥)을 포함하고, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 이의 길이 대부분 또는 전부를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 가닥내 염기쌍형성을 촉진하는 서열, 예를 들어, 헤어핀 DNA 구조에 의해 연결된다. 헤어핀 구조는 당 분야, 예를 들어, siRNA 분자에서 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과로서, AAV 바이러스 유전체 복제시, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 유전체를 분해하지 않을 것이고, 그 자체로 5'에서 3' 순서로 AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이된 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드와 역방향의 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 및 제3 AAV ITR을 포함하는 재조합 바이러스 유전체가 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다.
rAAV 벡터의 생성
트랜스펙션, 안정적 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드 및 배큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 포함하는 rAAV 벡터의 생성을 위한 다수의 방법이 당 분야에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자의 생성을 위한 rAAV 생성 배양은 1) 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예를 들어, HeLa, A549, 또는 293 세포, 또는 곤충-유래 세포주, 예를 들어, 배큘로바이러스 생성 시스템의 경우 SF-9; 2) 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예를 들어, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페르 바이러스, 배큘로바이러스에 의해 제공된 적합한 헬퍼 바이러스 기능, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 생성물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예를 들어, 치료 트랜스진); 및 5) rAAV 생성을 지지하는 적합한 배지 및 배지 성분을 모두 필요로 한다. 당 분야에 공지된 적합한 배지는 rAAV 벡터의 생성에 이용될 수 있다. 이들 배지는 Hyclone Laboratories 및 JRH에 의해 생산되는 배지, 예를 들어, 변형 이글 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 맞춤 제형, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,566,118호에 기재된 맞춤 제형, 및 미국 특허 번호 6,723,551호에 기재된 Sf-900 II SFM 배지를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 특허 문헌 각각은 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에서 사용하기 위한 맞춤 배지 제형과 관련하여 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 0.5% 내지 20%(v/v 또는 w/v)의 수준으로 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질이 보충될 수 있다. 대안적으로, 당 분야에 공지된 바와 같이, rAAV 벡터는 동물-유래 생성물을 갖지 않는 배지로도 언급될 수 있는 혈청 비함유 조건으로 생성될 수 있다. 당업자는 생성 배양물 내의 rAAV의 역가를 증가시키기 위해 rAAV 벡터의 생성을 지지하도록 설계된 상업적 또는 맞춤 배지에 글루코스, 비타민, 아미노산, 및/또는 성장인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 하나 이상의 세포 배양 성분이 또한 보충될 수 있음을 인지할 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 길이의 시간 동안 다양한 온도 범위에 걸친 조건 등) 하에서 성장될 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 회전병, 중공 섬유 필터, 미세담체, 및 패킹된 베드(packed-bed) 또는 유체화된-베드 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flask), 교반 탱크 생물반응기, 및 일회용 시스템, 예를 들어, 웨이브 백(Wave bag) 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있는 현탁-적합화 숙주 세포, 예를 들어, HeLa, 293, 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해 또는 생성 배양물로부터 소모된 배지의 수거에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수거될 수 있으나, 단, 상기 세포는 미국 특허 번호 6,566,118호에 더욱 충분히 기재된 바와 같이 온전한 세포로부터 배지로 rAAV 입자의 방출을 야기시키는 당 분야에 공지된 조건 하에서 배양되어야 한다. 세포를 용해시키는 적합한 방법은 또한 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 다수의 동결/해동 주기, 음파처리, 미세유체화, 및 화학제품, 예를 들어, 세제 및/또는 프로테아제를 이용한 처리를 포함한다.
rAAV 벡터의 정제
수거시, 본 발명의 rAAV 생성 배양물은 (1) 숙주 세포 단백질; (2) 숙주 세포 DNA; (3) 플라스미드 DNA; (4) 헬퍼 바이러스; (5) 헬퍼 바이러스 단백질; (6) 헬퍼 바이러스 DNA; 및 (7) 예를 들어, 혈청 단백질, 아미노산, 트랜스페린 및 다른 저분자량 단백질을 포함하는 배지 성분 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 또한, rAAV 생성 배양물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12 등으로 구성된 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형을 갖는 rAAV 입자를 추가로 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, rAAV 생성 배양물 수거물은 숙주 세포 조직파편을 제거하기 위해 정화된다. 일부 구현예에서, 생성 배양물 수거물은, 예를 들어, 등급 DOHC 밀리포어 밀리스택+ HC 포드 필터(Millipore Millistak+ HC Pod Filter), 등급 A1HC 밀리포어 밀리스택+ HC 포드 필터, 및 0.2 ㎛ 필터 옵티캡 XL1O 밀리포어 익스프레스 SHC 하이드로필릭 멤브레인(Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane) 필터를 포함하는 일련의 뎁스 필터(depth filter)를 통한 여과에 의해 정화된다. 정화는 또한 당 분야에 공지된 다양한 다른 표준 기술, 예를 들어, 원심분리 또는 당 분야에 공지된 0.2 ㎛ 또는 그 초과의 포어 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양물 수거물은 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해하기 위해 Benzonase®로 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어, 30분 내지 수시간의 기간 동안 주위 온도 내지 37℃의 온도에서 1 내지 2.5 단위/㎖의 최종 농도의 Benzonase®을 포함하는 당 분야에 공지된 표준 조건하에서 수행된다.
rAAV 입자는 원심분리, 유통(flow-through) 음이온 교환 여과, rAAV 입자의 농축을 위한 접선 유동 여과(TFF), 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획, 헬퍼 바이러스의 열 비활성화, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환, 나노여과, 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획의 정제 단계 중 하나 이상을 이용하여 분리되거나 정제될 수 있다. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 다양한 순서로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기에 기재되는 순서의 모든 단계를 포함한다. rAAV 입자를 정제하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,989,264호 및 8,137,948호 및 WO 2010/148143호에서 발견된다.
조성물 및 전달
생성된 후, sFlt-1 수용체, 또는 이를 인코딩하는 벡터(또는 비리온), 예를 들어, 상기 기재된 융합체는 황반 변성을 치료하기 위해 눈으로의 직접 전달에 적합한 조성물로 제형화될 것이다. 유전자 요법이 필요한 경우, 조성물은 치료적 유효량의 관심 Flt-1, 예를 들어, 해당 신호 경로에 결합하여 이의 효과를 매개하거나, 당해 질병 상태의 증상을 감소시키거나 개선시키기에 충분한 양, 또는 필요한 이점을 부여하기에 충분한 양의 관심 Flt-1을 생성시키기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. 적절한 용량은 또한 다른 요인 중에서 치료되는 대상체의 상태, 연령, 치료되는 질환의 중증도, 투여 방식에 좌우될 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, "치료적 유효량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것이다. 예를 들어, rAAV 비리온의 생체 내 주사를 위해, 치료적 유효 용량은 대략적으로 약 106 내지 1015의 재조합 바이러스의 벡터 유전체(vg), 예를 들어, 108 내지 1014 vg, 예를 들어, 108 내지 1012 vg, 예를 들어, 108 내지 1010 vg, 108 내지 109 vg, 또는 이들 사이의 임의의 정수, 예를 들어, .5 x 108 vg ... 1 x 108 vg ... 1.5 x 108 vg ... 2 x 108 vg ... 5 x 108 vg ... 1 x 109 vg ... 2 x 109 vg ... 3 x 109 vg ... 5 x 109 vg ... 6 x 109 vg ... 1 x 1010 vg ... 2 x 1010 vg ... 5 x 1010 vg ... 1 x 1011 vg ... 5 x 1011 vg ... 1 x 1012 vg ... 5 x 1012 vg 등일 것이다.
양태에서, 조성물은 또한 안과적으로 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 조성물은 용액, 젤, 연고, 현탁액, 사용 전에 비히클로 재구성되는 건조 분말, 또는 다른 적합하고 잘-용인되는 안과 전달 시스템으로 제형화될 수 있다. 상기 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 눈으로의 직접 전달에 적합한 임의의 약학적 작용제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물 중 임의의 TWEEN 화합물, 및 액체, 예를 들어, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 광산 염, 예를 들어, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기 산의 염, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 그 안에 포함할 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 상기 비히클에 제공될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제의 충분한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
투여는 치료 과정 전체에 걸쳐 단일 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 실시될 수 있다. 투여의 가장 효과적인 수단을 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 벡터, 요법의 조성물, 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 다양할 것이다. 단일 및 다수 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
다수의 용량이 투여되는 경우, 투여되는 첫 번째 제형은 이후의 제형과 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 첫 번째 투여는 AAV 비리온의 형태일 수 있고, 두 번째 투여는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드 DNA, AAV 비리온, 서브유닛 백신 조성물 등의 형태일 수 있다. 또한, 이후의 전달 또한 두 번째 전달 방식과 동일하거나 상이할 수 있다.
하나 초과의 트랜스진이 전달된 재조합 벡터에 의해 발현될 수 있음이 이해되어야 한다. 대안적으로, 하나 이상의 상이한 트랜스진을 각각 발현하는 별개의 벡터가 또한 본원에 기재된 바와 같이 대상체로 전달될 수 있다. 따라서, 다수의 트랜스진이 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 전달된 벡터가 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합되는 것으로 또한 의도된다. 예를 들어, 황반 변성을 치료하기 위한 다른 화합물이 제공될 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 눈으로의 sFlt-1 수용체 작제물의 전달(유전자 요법을 통하거나 단백질 요법을 통하건 간에)을 위해, 투여는 통상적으로 국소적일 것이다. 이는 투여될 필요가 있는 물질(단백질 또는 DNA)의 양을 제한하고, 전신 부작용을 제한하는 장점을 갖는다. 유전자총(gene gun)에 의한 각막 상의 국소 투여; 결막하 주사, 전방내 주사, 각막으로의 점안약을 통함, 측두 가장자리(temporal limbus)를 통한 전방으로의 주사, 기질내 주사, 전기 펄스와 조합된 각막 적용, 각막내 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사(예를 들어, 전방, 중간 또는 후방 유리체 주사), 및 안구내 주사를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 많은 가능한 전달 방식이 이용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체 외 트랜스펙션되거나 형질도입될 수 있고, 안구내 이식에 의해 전달될 수 있다. 문헌[Auricchio, Mol . Ther. (2002) 6:490-494; Bennett, Nature Med . (1996) 2:649-654, 1996; Borras, Experimental Eye Research (2003) 76:643-652; Chaum, Survey of Ophthalmology (2002) 47:449-469; Campochiaro, Expert Opinions in Biological Therapy (2002) 2:537-544; Lai, Gene Therapy (2002) 9:804 813; Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research (2003) 22:277-293]을 참조하라.
따라서, 안과 제형은 안구 약물 투여에 적합한 임의의 형태, 예를 들어, 국소 투여에 적합한 투여 형태, 점안약으로서 투여를 위한 용액 또는 현탁액, 세안약, 또는 주사, 연고, 젤, 리포솜 분산액, 콜로이드 미세입자 현탁액 등, 또는 안구 삽입물, 예를 들어, 임의로 생물분해 가능한 조절 방출 중합체 매트릭스로 투여된다. 안구 삽입물은 결막, 공막, 평면부, 안구앞부분, 또는 안구뒤부분 내에 이식된다. 이식물은 안구 표면으로의 제형의 조절 방출, 통상적으로 연장된 기간에 걸친 지속된 방출을 제공한다. 또한, 구현예에서, 제형은 미국 식품의약안전청에 의해 천연 발생이고/이거나 GRAS("일반적으로 안전한 것으로 간주되는")인 성분으로 전적으로 구성된다.
단백질 및 핵산 치료의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 융합 단백질은 환자에게 투여될 수 있다. 유리한 반응이 관찰되는 경우, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 장기간 효과를 위해 투여될 수 있다. 대안적으로, 단백질 및 핵산은 동시에 또는 대략적으로 동시에 투여될 수 있다.
투여 처리는 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄일 수 있다. 또한, 대상체는 적절한 경우 다수 용량으로 투여될 수 있다. 당업자는 적절한 수의 용량을 용이하게 결정할 수 있다.
양태에서, 본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에서 이용된다.
발명의 키트
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 키트는 정제된 sFlt-1 수용체, 이를 포함하는 융합체, 이를 인코딩하는 재조합 벡터, 또는 이를 인코딩하는 AAV 비리온/rAAV 벡터를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 구현예에서, 키트는 안과적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 키트는 또한 안구 전달에 적합한 전달 장치를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에 대한 키트의 사용 및 이의 내용물에 관한 적합한 세트의 설명서, 일반적으로 서면으로 된 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의의 편리한 적절한 패키징 내에 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산, 단백질, 벡터, 또는 비리온이 건조 제형(예를 들어, 동결 건조된 분말 또는 건조 분말)으로 제공되는 경우, 탄력성의 마개를 갖는 바이알이 이용될 수 있어, 벡터는 탄력성 마개를 통해 유체를 주입함으로써 재현탁될 수 있다. 비-탄력성의 제거 가능한 클로저(closure)(예를 들어, 밀봉된 유리) 또는 탄력성 마개를 갖는 앰풀이 액체 제형에 대해 이용될 수 있다. 특정 장치(예를 들어, 주사기)와 함께 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다.
설명서는 일반적으로 의도된 사용 방법에 대한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브-유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 설명서는 통상적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면으로 된 설명서(예를 들어, 키트 내에 포함된 종이 시트)이나, 기계-판독 가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크로 수행되는 설명서)가 또한 고려된다.
2. 실험
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예의 예이다. 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
이용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 물론 허용되어야 한다.
재료 및 방법
가용성 벡터 작제 .
도 1(SEQ ID NO:10) 및 2a 내지 도 2b(SEQ ID NO:11)는 "sFLT01"로 언급된 융합 단백질의 DNA 및 단백질 서열을 제시한다. 이러한 작제물은 N-말단에서 C-말단의 순서로 도 2a 내지 도 2b의 위치 1 내지 23에서 발견되는 신호 서열; 도 2a 내지 도 2b의 위치 24 내지 118에서 발견되는 Flt-1 Ig-유사 도메인 2 + 상기 도메인의 신장부; 도 2a 내지 도 2b의 위치 119 내지 127에서 발견되는 9개의 글리신의 서열; 및 도 2a 내지 도 2b의 위치 128 내지 358의 IgG1-Fc CH2/CH3 잔기를 포함한다.
DNA는 하이브리드 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 및 소 성장 호르몬 아데닐중합체형성 신호 서열(BGH 폴리 A)을 함유하는 플라스미드 pCBA(2)-int-BGH로 클로닝되었다. 문헌[Xu et al., Hum. Gene. Ther. (2001) 12:563-573].
전체 sFLT01 발현 카세트가 이후 AAV2 역방위 말단 반복부(ITR)를 함유하는 프리바이러스성 플라스미드 벡터 pAAVSP70으로 클로닝되었다. 문헌[Ziegler et al, Mol. Ther . (2004) 9:231-240]. ITR이 측접한 영역을 포함하는 플라스미드 sp70.BR/sFLT01 내의 생성된 AAV 유전체의 전체 크기는 4.6 kb였다.
재조합 벡터 AAV2-sFLT01은 헬퍼 플라스미드 p5rep-Δ-CMVcap 및 pHelper(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용한 293 세포의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었고, ÅKTA FPLC 시스템(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)에서의 이오딕사놀 단계 구배 및 HiTrap 헤파린 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 프로토콜에 따라 정제되었다. 문헌[Vincent et al, J. Virol . (1997) 71:1897-1905; Zolotukhin et al., Methods (2002) 28:158-167].
바이러스 역가는 BGH 폴리 A 서열에 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 TaqMan PCR 검정(ABI Prism 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 결정되었다.
유리체내 주사.
실시예 1을 위해, 암컷 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 2.1 내지 2.8 ㎏이 케타민 및 디아제팜으로 진정되었다. 용량 투여 전, 눈은 포비돈-아이오딘 국소 방부제로 세척되었고, 멸균 염수로 헹궈졌다. 산동제(1% 트로피카미드) 및 국소 마취제(프로파라카인)가 각각의 주사되는 눈으로 주입되었다. 시술 동안 눈꺼풀을 개방된 채로 유지시키기 위해 개검기가 삽입되었고, 안구가 수축되었다. 투여 주사기의 27 게이지 바늘이 공막 및 평면부를 통해 가장자리에 대해 약 4 mm 후방에 삽입되었다. 바늘이 주변 망막에 인접한 전유리체, 중간-유리체 또는 황반에 인접한 후유리체의 3개의 위치 중 하나로 수정체 후방으로 유도되었다. AAV 벡터는 50 ㎕ 또는 100 ㎕의 전체 부피로 주사되었다.
맥락막 혈관신생( CNV )의 유도.
CNV는 시험 물품의 투여 후에 트랜스진이 충분한 시간 동안 피크 발현에 도달하도록 영장류에서 유도되었다. 532 ㎚ 파장을 갖는 다이오드 레이저(Iridex Corp., Mountain View, CA) 및 슬릿 램프 어댑터가 CNV를 유도하기 위해 브루크막을 파열시키기 위해 이용되었다. 9개의 화상이 100 내지 200 밀리초 동안 500 내지 700 mW에서 75 마이크론의 스폿 크기로 수행되는 동일 유형 레이저를 이용하여 3 x 3 격자 패턴으로 황반 영역에 위치되었다.
CNV 평가.
원숭이에서의 CNV 병변으로부터의 누출이 플루오레세인 혈관조영술에 의한 레이저 유도 2, 3 및 4주 후에 평가되었다. 진정된 동물에 플루오레세인 염료(10% 플루오레세인 소듐, 약 0.1 ㎖/㎏)가 주사되었고, 안저가 염료 주사 후 여러 시점에 이미지화되어 동맥 및 정맥 단계가 모니터되었다. 검안경 이미지가 수집되었고, 각각의 화상 부위에서 누출 CNV의 존재에 대해 분석되었다.
실시예 1
비-인간 영장류에서의 AAV2 - sFLT01의 효능
유리체내 투여된 AAV2-sFLT01의 효능을 결정하기 위해 비-인간 영장류(NHP)에서 2개의 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구(연구 A)에서, 시노몰구스 원숭이에 2 x 108 또는 2 x 109 vg의 AAV2-sFLT01을 유리체내 처리하였다. 대측 대조군 눈을 트랜스진을 코딩하지 않는 AAV2 벡터(AAV2-Null)의 동일 용량으로 처리하였다. 레이저 CNV 유도가 벡터 투여 6주 후에 발생하였다. CNV의 정도는 플루오레세인 혈관조영술 3주에서 최대인 것으로 밝혀졌고, 따라서 이때가 처리 효능을 평가하기 위해 이용된 시점이었다. 누출 병변의 수를 AAV2-sFLT01 처리된 눈과 대측 대조군 눈 사이에서 비교하였다(표 1). sFLT01 처리 그룹 중 어느 것도 AAV2-Null 대조군 눈에 비해 누출 CNV 병변에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내지 않았다.
두 번째 연구(연구 B)에서, 2 x 1010 vg의 AAV2-sFLT01 또는 AAV2-Null을 유리체내 전달한 반면, 대측 눈은 치료에 대해 나이브인 채로 유지시켰다. 둘 모두의 눈에서의 레이저 CNV 유도가 벡터 투여 22주 후에 발생하였다. AAV2-sFLT01 처리된 눈의 6개 모두는 나이브 대측 대조군 눈에 비해 CNV 누출의 양에서의 유의한 감소를 나타내었고, AAV2-sFLT01 처리된 화상의 7%만이 누출 CNV를 나타낸 반면, 대조군 눈에서의 화상의 56%가 누출 CNV였다. 이러한 차이는 피셔 정확 검정(Fisher's exact test)에 의해 결정시 통계적으로 유의하였다(p < 0.0001). AAV2-Null 대조군 벡터로 처리된 눈은 미처리 대조군 눈에 비해 CNV에서 감소를 나타내지 않았다.
[표 1] 2개의 NHP 효능 연구로부터의 결과.
Figure pct00001
요컨대, VEGF에 대한 가용성 수용체를 인코딩하는 AAV2 유전자 요법 벡터의 유리체내 투여는 비-인간 영장류 눈에서 트랜스진 생성물의 용량 의존적 발현과 함께 망막 세포의 형질도입을 발생시켰다. 발현은 먼저 투여 3주 후만큼 초기에 측정하였고, 측정된 마지막 시점(23주)까지 비교적 안정적인 것으로 밝혀졌다.
8마리의 동물 중 7마리에 대해 NHP 모델에서 효능이 관찰되었고, 이들의 sFLT01 발현 수준은 방수에서 100 ng/㎖를 초과하였고, 이는 상기 모델에서 혈관신생에서의 변화를 발생시키기 위해 달성되어야 하는 sFLT01의 역치값이 존재할 수 있음을 암시한다. 벡터 투여 22주 후에 레이저 처리된, 2 x 1010 vg로 처리된 6마리의 동물 모두가 대조군 눈에 비해 감소된 CNV를 가졌다.
실시예 2
인간에서의 AAV2 - sFLT01의 효능
AAV2-sFLT01의 단일 유리체내 주사의 안전성, 용인성 및 효능을 평가하기 위해 인간에서 용량 상승 연구를 수행하였다. AAV2-sFLT01을 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. 본 연구에서 이용된 환자는 말단-단계 신생혈관 AMD 환자였다. 연구를 적합화시키기 위한 기준은 하기를 포함하였다:
● 환자의 병력 및 CNV의 문서화된 진단에 의해 확인되는 바와 같은 AMD에 종속적인 맥락막 혈관신생(CNV).
● 연구 눈에서 20/100 또는 그 보다 나쁜 거리 최고 교정 시력(distance BCVA).
● 타안은 20/400 또는 그 보다 나은 거리 BCVA를 가져야 한다.
● 연구 눈, 즉, AAV2-sFLT01이 투여된 눈은 가장 나쁜 CVA(타안에 비함)를 가졌다.
● 연구의 용량-상승 부분 동안 연구 눈에서의 황반하 원반형 반흔형성. 환자는 연구의 두 번째 부분(최대 내성 용량(MTD) 단계) 동안 연구 눈에서 황반 반흔형성을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 또한, 연구의 두 번째 부분에서 등록된 환자는 스크리닝 전 및 환자의 가장 최근의 항-VEGF 요법의 치료 후 12개월 이내에 항-VEGF 요법에 대한 반응성을 나타내야 한다.
● 망막내액 또는 망막하액의 확실한 존재.
● 충분한 안구 검사 및 시험을 가능케 하는 동공의 적절한 확장.
배제 기준은 하기와 같았다:
● AMD가 아닌 임의의 이유로 인한 연구 눈에서의 CNV.
● 시력을 변경시킬 수 있거나, 연구 시험을 방해할 수 있는 스크리닝 동안의 연구 눈에서의 질환의 병력.
● 활성의 비조절성 녹내장.
● 등록 3개월 이내에 연구 눈에서 임의의 안구내 수술을 받았거나, 치료 1년 이내에 연구 눈에서 안구내 수술(백내장 수술을 포함함)이 공지되어 있거나 안구내 수술에 대한 후보자일 수 있음.
● 연구 눈에서의 급성 또는 만성 감염.
● 연구 눈에서의 염증의 병력 또는 어느 한 눈에서의 진행 중인 염증.
● 유리체내 주사에 대한 임의의 금기.
● 60일 이내에 연구 눈에서 광선 역학 요법, 또는 스크리닝 전 14일 이내에 레이저 광응고를 받음.
● 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin™), 또는 페가프타닙(pegaptanib) 소듐(Macugen®)을 현재 이용하거나, 스크리닝 전 1개월 이내에 이용하였음.
● 아플리버셉트(Aflibercept)(Eylea®)를 현재 이용하거나, 스크리닝 전 4개월 이내에 이용하였음.
● 임의의 눈주위(연구 눈), 유리체내(연구 눈), 또는 전신(경구 또는 정맥내) 스테로이드를 현재 이용하거나, 스크리닝 전 3개월 이내에 이용하였음.
● 눈 내 또는 안면 상의 임의의 활성 헤르펠스 감염, 특히 활성 병변.
● 연구 순응 및 추적조사를 방해할 임의의 유의한 불충분하게 제어되는 질병.
● 망막 또는 시신경에 독성인 것으로 공지된 임의의 약물의 현재 또는 이전 사용.
● 임의의 안구 또는 전신 유전자 전달 생성물을 이용한 이전 치료.
● 스크리닝 전 120일 이내에 임의의 연구 생성물을 투여받음.
연구의 첫 번째 부분에서, 4개의 별개의 그룹의 환자에게 하기와 같은 100 ㎕의 고정된 부피의 상이한 용량의 AAV2-sFLT01을 투여하였다. (1) 그룹 1에는 한 눈에 2 x 108 vg의 단일 유리체내 주사를 투여하였고; (2) 그룹 2에는 한 눈에 2 x 109 vg의 단일 유리체내 주사를 투여하였고; (3) 그룹 3에는 한 눈에 6 x 109 vg의 단일 유리체내 주사를 투여하였고; (4) 그룹 4에는 한 눈에 2 x 1010 vg의 단일 유리체내 주사를 투여하였다.
이들 용량은 안전하고 잘 용인되는 것으로 결정되었다. 특히, 용량-제한 독성(DLT)이 관찰되지 않았고, MTD에 도달하지 않았다.
AAV2-sFLT01의 효능을 결정하기 위해, 망막하액 및 망막내액의 양에서의 기준선으로부터의 변화를 광간섭 단층촬영(OCT)에 의해 측정하였다. 또한, 전방 탭을 통한 방수 내의 sFLT01 단백질 수준과 같이 BCVA를 측정하였다.
놀랍게도, 2 x 108 vg의 단일 유리체내 주사가 투여된 환자는 OCT에 의해 측정시 망막하액 및 망막내액의 유의한 감소를 감소를 나타내었다. 도 15A 및 도 15B를 참조하라.
연구의 두 번째 부분에서, 첫 번째 연구에서 이용된 가장 높은 용량(2 x 1010 vg)의 단일 유리체내 주사가 다양한 환자에게 제공되었다. 이러한 용량은 또한 주사 2개월 후 OCT에 의해 측정시 망막하액 및 망막내액의 유의한 감소를 발생시켰다. 도 16A 및 도 16B를 참조하라.
표 2는 예상 반응자 및 비-반응자의 수를 제시한다. 예상 반응자는 이들의 기준선 특징을 기초로 하여 항-VEGF 치료에 대한 반응을 나타내는 것이 예상된 환자로 특성 규명되었다. 이후, 예상 반응자는 다음과 같이 특성 규명되었다: 완전한 반응자: 확실한 반응, 건성 망막, 및 추가 치료 필요 없이 정상 망막 해부학의 복귀를 나타낸 환자. 부분적 반응자: 유체의 일부 감소를 나타낸 환자. 비 반응자: 효과가 관찰되지 않음.
[표 2]
생물학적 활성
Figure pct00002
표 2에 제시된 바와 같이, 11명의 예상 반응자 중 6명이 치료에 대해 적어도 부분적 반응을 나타내었다.
따라서, 황반 변성을 치료하기 위한 방법, 뿐만 아니라 sFlt-1 수용체 및 이의 융합체를 포함하는 조성물이 기재된다. 본 발명의 구현예는 다소 상세히 기재되었으나, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 명백한 변화가 이루어질 수 있음이 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION SCARIA, Abraham <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND PREVENTING MACULAR DEGENERATION <130> 0800-0066.40 <150> US 61/936,797 <151> 2014-02-06 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 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aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360 ggtggaggtg gaggtggagg tcctaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag 1077 <210> 11 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for the sFLT01 protein <400> 11 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser 20 25 30 Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile 35 40 45 Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe 50 55 60 Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser 65 70 75 80 Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 110 Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 115 120 125 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 12 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA sequence encoding VEGF <400> 12 ctgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg 60 cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc 120 ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc 180 tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg 240 agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag 300 aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg 360 ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc 420 cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc 480 cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc 540 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 600 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 660 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 720 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 780 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 840 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 900 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 960 aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 1020 aagtcctgga gcgttccctg tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa 1080 gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag 1140 cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt gacaagccga ggcggtga 1188 <210> 13 <211> 395 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> amino acid sequence for VEGF <400> 13 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Tyr His Leu 1 5 10 15 Leu Pro Gly Arg Arg Arg Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Gly Gln 20 25 30 Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe 50 55 60 Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Arg Leu Gly 100 105 110 Ala Arg Lys Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp 115 120 125 Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Leu Ala Arg Ala Ser Gly 130 135 140 Arg Gly Gly Arg Val Ala Arg Arg Gly Ala Glu Glu Ser Gly Pro Pro 145 150 155 160 His Ser Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg 165 170 175 Ala Ser Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu 180 185 190 Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro 195 200 205 Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met 210 215 220 Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp 225 230 235 240 Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser 245 250 255 Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu 260 265 270 Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg 275 280 285 Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln 290 295 300 His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu 305 310 315 320 Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys 325 330 335 Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu 340 345 350 Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser 355 360 365 Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn 370 375 380 Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 385 390 395 <210> 14 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for an additional fusion protein including a soluble Flt-1 linked by a Gly9 linker to the VEGF multimerization domain, Ex3 <400> 14 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360 ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420 aattag 426 <210> 15 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence encoded by the DNA sequence of Figure 5 <400> 15 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser 20 25 30 Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile 35 40 45 Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe 50 55 60 Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser 65 70 75 80 Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 110 Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn 130 135 140 <210> 16 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for an additional fusion protein including a soluble Flt-1 linked by Gly9 to the VEGF multimerization domain, Ex3 and a sequence from the IgG1 CH3 region <400> 16 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360 ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420 aatcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 480 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 540 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 600 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 660 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 720 ctctccctgt ctccgggtaa atag 744 <210> 17 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence encoded by the DNA sequence of Figure 7 <400> 17 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser 20 25 30 Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile 35 40 45 Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe 50 55 60 Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser 65 70 75 80 Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 110 Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Gln Pro Arg 130 135 140 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 145 150 155 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 165 170 175 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 210 215 220 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 18 <211> 7120 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA sequence encoding for a representative Flt-1 receptor protein <400> 18 atcgaggtcc gcgggaggct cggagcgcgc caggcggaca ctcctctcgg ctcctccccg 60 gcagcggcgg cggctcggag cgggctccgg ggctcgggtg cagcggccag cgggcgcctg 120 gcggcgagga ttacccgggg aagtggttgt ctcctggctg gagccgcgag acgggcgctc 180 agggcgcggg gccggcggcg gcgaacgaga ggacggactc tggcggccgg gtcgttggcc 240 gcggggagcg cgggcaccgg gcgagcaggc cgcgtcgcgc tcaccatggt cagctactgg 300 gacaccgggg tcctgctgtg cgcgctgctc agctgtctgc ttctcacagg atctagttca 360 ggttcaaaat taaaagatcc tgaactgagt ttaaaaggca cccagcacat catgcaagca 420 ggccagacac tgcatctcca atgcaggggg gaagcagccc ataaatggtc tttgcctgaa 480 atggtgagta aggaaagcga aaggctgagc ataactaaat ctgcctgtgg aagaaatggc 540 aaacaattct gcagtacttt aaccttgaac acagctcaag caaaccacac tggcttctac 600 agctgcaaat atctagctgt acctacttca aagaagaagg aaacagaatc tgcaatctat 660 atatttatta gtgatacagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 720 atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 780 actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 840 tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 900 acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 960 accaatacaa tcatagatgt ccaaataagc acaccacgcc cagtcaaatt acttagaggc 1020 catactcttg tcctcaattg tactgctacc actcccttga acacgagagt tcaaatgacc 1080 tggagttacc ctgatgaaaa aaataagaga gcttccgtaa ggcgacgaat tgaccaaagc 1140 aattcccatg ccaacatatt ctacagtgtt cttactattg acaaaatgca gaacaaagac 1200 aaaggacttt atacttgtcg tgtaaggagt ggaccatcat tcaaatctgt taacacctca 1260 gtgcatatat atgataaagc attcatcact gtgaaacatc gaaaacagca ggtgcttgaa 1320 accgtagctg gcaagcggtc ttaccggctc tctatgaaag tgaaggcatt tccctcgccg 1380 gaagttgtat ggttaaaaga tgggttacct gcgactgaga aatctgctcg ctatttgact 1440 cgtggctact cgttaattat caaggacgta actgaagagg atgcagggaa ttatacaatc 1500 ttgctgagca taaaacagtc aaatgtgttt aaaaacctca ctgccactct aattgtcaat 1560 gtgaaacccc agatttacga aaaggccgtg tcatcgtttc cagacccggc tctctaccca 1620 ctgggcagca gacaaatcct gacttgtacc gcatatggta tccctcaacc tacaatcaag 1680 tggttctggc acccctgtaa ccataatcat tccgaagcaa ggtgtgactt ttgttccaat 1740 aatgaagagt cctttatcct ggatgctgac agcaacatgg gaaacagaat tgagagcatc 1800 actcagcgca tggcaataat agaaggaaag aataagatgg ctagcacctt ggttgtggct 1860 gactctagaa tttctggaat ctacatttgc atagcttcca ataaagttgg gactgtggga 1920 agaaacataa gcttttatat cacagatgtg ccaaatgggt ttcatgttaa cttggaaaaa 1980 atgccgacgg aaggagagga cctgaaactg tcttgcacag ttaacaagtt cttatacaga 2040 gacgttactt ggattttact gcggacagtt aataacagaa caatgcacta cagtattagc 2100 aagcaaaaaa tggccatcac taaggagcac tccatcactc ttaatcttac catcatgaat 2160 gtttccctgc aagattcagg cacctatgcc tgcagagcca ggaatgtata cacaggggaa 2220 gaaatcctcc agaagaaaga aattacaatc agagatcagg aagcaccata cctcctgcga 2280 aacctcagtg atcacacagt ggccatcagc agttccacca ctttagactg tcatgctaat 2340 ggtgtccccg agcctcagat cacttggttt aaaaacaacc acaaaataca acaagagcct 2400 ggaattattt taggaccagg aagcagcacg ctgtttattg aaagagtcac agaagaggat 2460 gaaggtgtct atcactgcaa agccaccaac cagaagggct ctgtggaaag ttcagcatac 2520 ctcactgttc aaggaacctc ggacaagtct aatctggagc tgatcactct aacatgcacc 2580 tgtgtggctg cgactctctt ctggctccta ttaaccctct ttatccgaaa aatgaaaagg 2640 tcttcttctg aaataaagac tgactaccta tcaattataa tggacccaga tgaagttcct 2700 ttggatgagc agtgtgagcg gctcccttat gatgccagca agtgggagtt tgcccgggag 2760 agacttaaac tgggcaaatc acttggaaga ggggcttttg gaaaagtggt tcaagcatca 2820 gcatttggca ttaagaaatc acctacgtgc cggactgtgg ctgtgaaaat gctgaaagag 2880 ggggccacgg ccagcgagta caaagctctg atgactgagc taaaaatctt gacccacatt 2940 ggccaccatc tgaacgtggt taacctgctg ggagcctgca ccaagcaagg agggcctctg 3000 atggtgattg ttgaatactg caaatatgga aatctctcca actacctcaa gagcaaacgt 3060 gacttatttt ttctcaacaa ggatgcagca ctacacatgg agcctaagaa agaaaaaatg 3120 gagccaggcc tggaacaagg caagaaacca agactagata gcgtcaccag cagcgaaagc 3180 tttgcgagct ccggctttca ggaagataaa agtctgagtg atgttgagga agaggaggat 3240 tctgacggtt tctacaagga gcccatcact atggaagatc tgatttctta cagttttcaa 3300 gtggccagag gcatggagtt cctgtcttcc agaaagtgca ttcatcggga cctggcagcg 3360 agaaacattc ttttatctga gaacaacgtg gtgaagattt gtgattttgg ccttgcccgg 3420 gatatttata agaaccccga ttatgtgaga aaaggagata ctcgacttcc tctgaaatgg 3480 atggctcctg aatctatctt tgacaaaatc tacagcacca agagcgacgt gtggtcttac 3540 ggagtattgc tgtgggaaat cttctcctta ggtgggtctc catacccagg agtacaaatg 3600 gatgaggact tttgcagtcg cctgagggaa ggcatgagga tgagagctcc tgagtactct 3660 actcctgaaa tctatcagat catgctggac tgctggcaca gagacccaaa agaaaggcca 3720 agatttgcag aacttgtgga aaaactaggt gatttgcttc aagcaaatgt acaacaggat 3780 ggtaaagact acatcccaat caatgccata ctgacaggaa atagtgggtt tacatactca 3840 actcctgcct tctctgagga cttcttcaag gaaagtattt cagctccgaa gtttaattca 3900 ggaagctctg atgatgtcag atacgtaaat gctttcaagt tcatgagcct ggaaagaatc 3960 aaaacctttg aagaactttt accgaatgcc acctccatgt ttgatgacta ccagggcgac 4020 agcagcactc tgttggcctc tcccatgctg aagcgcttca cctggactga cagcaaaccc 4080 aaggcctcgc tcaagattga cttgagagta accagtaaaa gtaaggagtc ggggctgtct 4140 gatgtcagca ggcccagttt ctgccattcc agctgtgggc acgtcagcga aggcaagcgc 4200 aggttcacct acgaccacgc tgagctggaa aggaaaatcg cgtgctgctc cccgccccca 4260 gactacaact cggtggtcct gtactccacc ccacccatct agagtttgac acgaagcctt 4320 atttctagaa gcacatgtgt atttataccc ccaggaaact agcttttgcc agtattatgc 4380 atatataagt ttacaccttt atctttccat gggagccagc tgctttttgt gattttttta 4440 atagtgcttt tttttttttg actaacaaga atgtaactcc agatagagaa atagtgacaa 4500 gtgaagaaca ctactgctaa atcctcatgt tactcagtgt tagagaaatc cttcctaaac 4560 ccaatgactt ccctgctcca acccccgcca cctcagggca cgcaggacca gtttgattga 4620 ggagctgcac tgatcaccca atgcatcacg taccccactg ggccagccct gcagcccaaa 4680 acccagggca acaagcccgt tagccccagg gatcactggc tggcctgagc aacatctcgg 4740 gagtcctcta gcaggcctaa gacatgtgag gaggaaaagg aaaaaaagca aaaagcaagg 4800 gagaaaagag aaaccgggag aaggcatgag aaagaatttg agacgcacca tgtgggcacg 4860 gagggggacg gggctcagca atgccatttc agtggcttcc cagctctgac ccttctacat 4920 ttgagggccc agccaggagc agatggacag cgatgagggg acattttctg gattctggga 4980 ggcaagaaaa ggacaaatat cttttttgga actaaagcaa attttagaac tttacctatg 5040 gaagtggttc tatgtccatt ctcattcgtg gcatgttttg atttgtagca ctgagggtgg 5100 cactcaactc tgagcccata cttttggctc ctctagtaag atgcactgaa aacttagcca 5160 gagttaggtt gtctccaggc catgatggcc ttacactgaa aatgtcacat tctattttgg 5220 gtattaatat atagtccaga cacttaactc aatttcttgg tattattctg ttttgcacag 5280 ttagttgtga aagaaagctg agaagaatga aaatgcagtc ctgaggagag gagttttctc 5340 catatcaaaa cgagggctga tggaggaaaa aggtcaataa ggtcaaggga aaaccccgtc 5400 tctataccaa ccaaaccaat tcaccaacac agttgggacc caaaacacag gaagtcagtc 5460 acgtttcctt ttcatttaat ggggattcca ctatctcaca ctaatctgaa aggatgtgga 5520 agagcattag ctggcgcata ttaagcactt taagctcctt gagtaaaaag gtggtatgta 5580 atttatgcaa ggtatttctc cagttgggac tcaggatatt agttaatgag ccatcactag 5640 aagaaaagcc cattttcaac tgctttgaaa cttgcctggg gtctgagcat gatgggaata 5700 gggagacagg gtaggaaagg gcgcctactc ttcagggtct aaagatcaag tgggccttgg 5760 atcgctaagc tggctctgtt tgatgctatt tatgcaagtt agggtctatg tatttatgat 5820 gtctgcacct tctgcagcca gtcagaagct ggagaggcaa cagtggattg ctgcttcttg 5880 gggagaagag tatgcttcct tttatccatg taatttaact gtagaacctg agctctaagt 5940 aaccgaagaa tgtatgcctc tgttcttatg tgccacatcc ttgtttaaag gctctctgta 6000 tgaagagatg ggaccgtcat cagcacattc cctagtgagc ctactggctc ctggcagcgg 6060 cttttgtgga agactcacta gccagaagag aggagtggga cagtcctcta ccaagatcta 6120 aatccaaaca aaagcaggct agagccagaa gagaggacaa atctttgttc ttcctcttct 6180 ttacatacgc aaaccacctg tgacagctgg caattttata aatcaggtaa ctggaaggag 6240 gttaaacaca gaaaaaagaa gacctcagtc aattctctac tttttttttt ttttccaaat 6300 cagataatag cccagcaaat agtgataaca aataaaacct tagctattca tgtcttgatt 6360 tcaataatta attcttaatc attaagagac cataataaat actccttttc aagagaaaag 6420 caaaaccatt agaattgtta ctcagctcct tcaaactcag gtttgtagca tacatgagtc 6480 catccatcag tcaaagaatg gttccatctg gagtcttaat gtagaaagaa aaatggagac 6540 ttgtaataat gagctagtta caaagtgctt gttcattaaa atagcactga aaattgaaac 6600 atgaattaac tgataatatt ccaatcattt gccatttatg acaaaaatgg ttggcactaa 6660 caaagaacga gcacttcctt tcagagtttc tgagataatg tacgtggaac agtctgggtg 6720 gaatggggct gaaaccatgt gcaagtctgt gtcttgtcag tccaagaagt gacaccgaga 6780 tgttaatttt agggacccgt gccttgtttc ctagcccaca agaatgcaaa catcaaacag 6840 atactcgcta gcctcattta aattgattaa aggaggagtg catctttggc cgacagtggt 6900 gtaactgtat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgggtgt atgtgtgttt 6960 tgtgcataac tatttaagga aactggaatt ttaaagttac ttttatacaa accaagaata 7020 tatgctacag atataagaca gacatggttt ggtcctatat ttctagtcat gatgaatgta 7080 ttttgtatac catcttcata taataaactt ccaaaacaca 7120 <210> 19 <211> 1338 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> amino acid sequence of a representative Flt-1 receptor protein <400> 19 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365 Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400 Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415 Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480 Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile 500 505 510 Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg 515 520 525 Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val 530 535 540 Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560 Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 590 Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys 595 600 605 Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640 Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg 645 650 655 Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val 660 665 670 Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro 675 680 685 Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu 690 695 700 Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg 705 710 715 720 Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln 725 730 735 Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser 740 745 750 Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala 755 760 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile Arg Lys Met Lys 770 775 780 Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile 1025 1030 1035 Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr 1040 1045 1050 Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1055 1060 1065 Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp 1070 1075 1080 Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser 1085 1090 1095 Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu 1100 1105 1110 Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu 1115 1120 1125 Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu 1130 1135 1140 Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu 1145 1150 1155 Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala 1175 1180 1185 Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe 1190 1195 1200 Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys 1205 1210 1215 Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro 1220 1225 1230 Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser 1250 1255 1260 Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys 1265 1270 1275 Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys 1280 1285 1290 His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr 1295 1300 1305 Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro 1310 1315 1320 Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1325 1330 1335 <210> 20 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for a fusion protein including Flt-1, termed "sFLT02 protein" herein which includes a soluble Flt-1 linked by Gly9 to the a sequence from the IgG1 CH3 region <400> 20 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360 ggtggaggtg gaggtggagg tcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag 702 <210> 21 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for the sFLT02 protein <400> 21 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser 20 25 30 Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile 35 40 45 Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe 50 55 60 Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser 65 70 75 80 Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 110 Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 22 <211> 1434 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of the IgG1 lambda heavy chain <400> 22 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gttgtatatg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgcgag agagggtcgg 360 tgggtacgat atactacggt gactactatc ggatactact ttgactactg gggccaggga 420 accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 480 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 720 gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 780 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1320 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ccccgggtaa atga 1434 <210> 23 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> amino acid sequence of the IgG1 lambda heavy chain <400> 23 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Arg Trp Val Arg Tyr Thr Thr Val Thr 115 120 125 Thr Ile Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215 220 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475

Claims (60)

  1. VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 황반 변성을 치료하는 방법으로서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액을 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 부종을 치료하는 방법으로서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 방법이 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액을 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1012개; 1 x 108 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 109개; 약 2 x 107 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1011개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1010개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 109개; 2 x 109 내지 약 2 x 1010개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 2 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 또는 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1011개의 rAAV 비리온이 눈으로 투여되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 107개, 약 2 x 107개, 약 6 x 107개, 약 1 x 108개, 약 2 x 108개, 약 6 x 108개, 약 1 x 109개, 약 2 x 109개, 약 6 x 109개, 약 1 x 1010개, 약 2 x 1010개, 약 6 x 1010개, 약 1 x 1011개, 약 2 x 1011개, 약 6 x 1011개, 약 1 x 1012개, 약 2 x 1012개, 약 6 x 1012개, 또는 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 투여되는 방법.
  7. VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 황반 변성을 치료하는 방법으로서, 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법이 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액을 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
  9. VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함하는 조성물을 인간 대상체의 병에 걸린 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 황반 부종을 치료하는 방법으로서, 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법이 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액을 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 108 내지 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 108개 이하의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 방법.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 109개 이하의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 안과학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온의 단일한 유리체내 주사가 눈에 제공되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이,
    (a) Flt-1의 적어도 하나의 도메인;
    (b) 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 다중화 도메인; 및
    (c) (a)를 (b)에 연결시키는 5 내지 25개의 아미노산 잔기 길이의 링커를 포함하며,
    가용성 단백질이 발현되는 경우, 가용성 단백질의 다합체가 생성되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 도메인이 Flt-1의 도메인 2를 포함하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 다합체가 동종이합체인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG의 Fc 영역, 또는 이의 활성 단편을 포함하는 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG의 CH3 도메인, 또는 이의 활성 단편을 포함하는 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG1 중쇄의 불변 영역으로부터 유래되는 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가,
    gly9(SEQ ID NO:1);
    glu9(SEQ ID NO:2);
    ser9(SEQ ID NO:3);
    gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4);
    (gly4ser)3(SEQ ID NO:5);
    SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6); ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7); GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8); 및 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이 식 X-Y-Z를 갖고, 상기 식에서 X가 Flt-1의 IgG-유사 도메인 2를 포함하고, Y가 Gly9이고, Z가 IgG Fc 영역 또는 IgG CH3 영역인 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 인간화된 다중화 도메인인 방법.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이 (a) 도 2a 내지 도 2b에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:11); (b) 도 6에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:15); (c) 도 8에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:17); (d) 도 12에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:21); 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d)와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 (a), (b), (c) 또는 (d)의 활성 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  27. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제8항, 및 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 황반 변성이 연령-관련 황반 변성(AMD)인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 황반 변성이 습성 AMD인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, rAAV 비리온이 AAV2로부터 유래되는 방법.
  31. 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온을 눈으로 전달함으로써 인간 대상체에서 황반 변성을 치료하기 위한 조성물의 제조에서의, VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액이 감소되는 용도.
  33. 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온을 눈으로 전달함으로써 인간 대상체에서 황반 부종을 치료하기 위한 조성물의 제조에서의, VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액이 감소되는 용도.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1012개; 1 x 108 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010개; 약 1 x 108 내지 약 1 x 109개; 약 2 x 107 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1011개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 1010개; 약 2 x 108 내지 약 2 x 109개; 2 x 109 내지 약 2 x 1010개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1013개; 2 x 1010 내지 약 1 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1012개; 약 2 x 1010 내지 약 1 x 1011개; 또는 약 2 x 1010 내지 약 2 x 1011개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 용도.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 107개, 약 2 x 107개, 약 6 x 107개, 약 1 x 108개, 약 2 x 108개, 약 6 x 108개, 약 1 x 109개, 약 2 x 109개, 약 6 x 109개, 약 1 x 1010개, 약 2 x 1010개, 약 6 x 1010개, 약 1 x 1011개, 약 2 x 1011개, 약 6 x 1011개, 약 1 x 1012개, 약 2 x 1012개, 약 6 x 1012개, 또는 약 1 x 1013개의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 용도.
  37. 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온을 눈으로 전달함으로써 인간 대상체에서 황반 변성을 치료하기 위한 조성물의 제조에서의, VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온의 용도.
  38. 제37항에 있어서, 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액이 감소되는 용도.
  39. 약 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온을 눈으로 전달함으로써 인간 대상체에서 황반 부종을 치료하기 위한 조성물의 제조에서의, VEGF 활성을 조절할 수 있는 VEGFR-1(Flt-1)의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온의 용도.
  40. 제39항에 있어서, 안압, 망막 두께, 망막하액, 또는 망막내액이 감소되는 용도.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 108 내지 2 x 1010개 미만의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 용도.
  42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 108개 이하의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 용도.
  43. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 109개 이하의 rAAV 비리온이 눈으로 전달되는 용도.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 안과적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 용도.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온의 단일 유리체내 주사가 눈으로 제공되는 용도.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이,
    (a) Flt-1의 적어도 하나의 도메인;
    (b) 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 다중화 도메인; 및
    (c) (a)를 (b)에 연결시키는 5 내지 25개의 아미노산 잔기 길이의 링커를 포함하며,
    가용성 단백질이 발현되는 경우, 가용성 단백질의 다합체가 생성되는, 용도.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 도메인이 Flt-1의 도메인 2를 포함하는 용도.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 다합체가 동종이합체인 용도.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG의 Fc 영역, 또는 이의 활성 단편을 포함하는 용도.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG의 CH3 도메인, 또는 이의 활성 단편을 포함하는 용도.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 용도.
  52. 제51항에 있어서, 다중화 도메인이 IgG1 중쇄의 불변 영역으로부터 유래되는 용도.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가,
    gly9(SEQ ID NO:1);
    glu9(SEQ ID NO:2);
    ser9(SEQ ID NO:3);
    gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4);
    (gly4ser)3(SEQ ID NO:5);
    SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6); ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7); GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8); 및 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)로 구성된 군으로부터 선택되는 용도.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이 식 X-Y-Z를 갖고, 상기 식에서 X가 Flt-1의 IgG-유사 도메인 2를 포함하고, Y가 Gly9이고, Z가 IgG Fc 영역 또는 IgG CH3 영역인 용도.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 다중화 도메인이 인간화된 다중화 도메인인 용도.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이 (a) 도 2a 내지 도 2b에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:11); (b) 도 6에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:15); (c) 도 8에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:17); (d) 도 12에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:21); 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d)와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 (a), (b), (c) 또는 (d)의 활성 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 용도.
  57. 제31항, 제32항, 제35항 내지 제38항, 및 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 황반 변성이 연령-관련 황반 변성(AMD)인 용도.
  58. 제57항에 있어서, 황반 변성이 습성 AMD인 용도.
  59. 제31항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는 용도.
  60. 제59항에 있어서, rAAV 비리온이 AAV2로부터 유래되는 용도.
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