JP6719381B2 - 黄斑変性を処置し、予防するための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般的にヒトにおける黄斑変性を処置し、予防する方法に関する。特に、本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体Ｆｌｔ−１を用いて黄斑変性を処置または予防する方法に関する。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、高齢者における中心性不可逆的失明（central irreversible blindness）の主因である。ＡＭＤの初期臨床症状は、デブリ（ドルーゼン）の網膜下蓄積を伴う。進行を示す患者は、黄斑細胞の著しい変性および萎縮を伴う地図状萎縮（ＧＡ）、または変性網膜を救おうとして疾患経過の末期に起こる脈絡膜血管新生を伴う新生血管ＡＭＤ（ｎＡＭＤ）を発現する。失明は、黄斑網膜色素上皮（ＲＰＥ）の変性の後に光受容体が萎縮した場合に生じる。

病因は、加齢、環境および遺伝的危険因子によって左右されるが、疾患の発症の原因となる分子メカニズムは、大部分不明のままである。最も顕著な公知の遺伝的因子は、免疫調節補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子内に存在するミスセンス突然変異である。

ｎＡＭＤなどの眼の障害に関連する病的血管新生は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の上方制御によって媒介される。抗体、可溶性受容体またはアプタマーを用いたＶＥＧＦの阻害は、これらの疾患を管理するための有望な臨床的アプローチであることが証明された。ＡＭＤの管理の大幅な改善が実現したが、現在の抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、患者と主治医の両方の負担になり得る硝子体内反復投与を必要とする。

したがって、さほど負担にならず、商業的に実現可能であるヒトにおける黄斑変性を処置する方法を開発することが依然として必要とされている。

本発明は、可溶性Ｆｌｔ−１受容体がヒト対象における黄斑変性を処置することができるという発見に基づいている。ｒＡＡＶ媒介遺伝子導入を用いて可溶性受容体を送達すると、広範囲の用量で治療結果が認められる。高用量は、耐容性を示し、治療利益をもたらした。さらに、本発明者らは、本明細書においてほんの２×１０^８ベクターゲノム（ｖｇ）ならびに２×１０^１０ｖｇの単回投与による硝子体内送達によって注射後２カ月目に網膜下および網膜内液の著しい減少がもたらされたことを示した。

したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト対象における黄斑変性を処置する方法であって、ＶＥＧＦ活性を調節することができる血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１またはＦｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を対象の罹患眼に投与することを含み、約１×１０^７〜約１×１０^１３ｒＡＡＶビリオンが眼に送達される、方法を対象とする。

さらなる実施形態では、本発明は、ヒト対象における黄斑浮腫を処置する方法であって、ＶＥＧＦ活性を調節することができるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を対象の罹患眼に投与することを含み、約１×１０^７〜約１×１０^１３ｒＡＡＶビリオンが眼に送達される、方法を対象とする。

上述の方法の実施形態では、約１×１０^７〜約１×１０^１２；１×１０^８〜約１×１０^１２；約１×１０^８〜約１×１０^１１；約１×１０^８〜約１×１０^１０；約１×１０^８〜約１×１０^９；約２×１０^７〜約２×１０^１２；約２×１０^８〜約２×１０^１２；約２×１０^８〜約２×１０^１１；約２×１０^８〜約２×１０^１０；約２×１０^８〜約２×１０^９；２×１０^９〜約２×１０^１０；約１×１０^１０〜約１×１０^１３；約１×１０^１０〜約１×１０^１２；約１×１０^１０〜約１×１０^１１；約２×１０^１０〜約１×１０^１３；２×１０^１０〜約１×１０^１２；約２×１０^１０〜約２×１０^１２；約２×１０^１０〜約１×１０^１１；または約２×１０^１０〜約２×１０^１１ｒＡＡＶビリオンが眼に投与される。いくつかの実施形態では、約１×１０^７、約２×１０^７、約６×１０^７、約１×１０^８、約２×１０^８、約６×１０^８、約１×１０^９、約２×１０^９、約６×１０^９、約１×１０^１０、約２×１０^１０、約６×１０^１０、約１×１０^１１、約２×１０^１１、約６×１０^１１、約１×１０^１２、約２×１０^１２、約６×１０^１２、または約１×１０^１３ｒＡＡＶビリオンが眼に投与される。

付加的実施形態では、本発明は、ヒト対象における黄斑変性を処置する方法であって、ＶＥＧＦ活性を調節することができるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を対象の罹患眼に投与することを含み、約２×１０^１０ｒＡＡＶビリオン未満が眼に送達される、方法を対象とする。

さらなる実施形態では、本発明は、ヒト対象における黄斑浮腫を処置する方法であって、ＶＥＧＦ活性を調節することができるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を対象の罹患眼に投与することを含み、約２×１０^１０ｒＡＡＶビリオン未満が眼に送達される、方法を対象とする。

上述の方法のいずれにおいても、組成物は、眼科学的に許容される媒体をさらに含み得る。

上述の方法の付加的実施形態では、ｒＡＡＶビリオンの単回硝子体内注射が眼に投与される。

さらなる実施形態では、可溶性タンパク質は、
（ａ）Ｆｌｔ−１の少なくとも１つのドメイン；
（ｂ）免疫グロブリン重鎖に由来する多量体化ドメイン；
および
（ｃ）（ａ）を（ｂ）に連結する長さが５〜２５アミノ酸残基のリンカー
を含み、可溶性タンパク質が発現される場合、可溶性タンパク質の多量体が生成する。

上述の方法のいずれにおいても、少なくとも１つのドメインは、Ｆｌｔ−１のドメイン２を含む。

さらなる実施形態では、多量体は、ホモ二量体である。

付加的実施形態では、多量体化ドメインは、ＩｇＧのＦｃ領域、またはその活性断片を含む。

上述の方法の特定の実施形態では、多量体化ドメインは、ＩｇＧのＣＨ３ドメイン、またはその活性断片を含む。さらなる実施形態では、多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１重鎖の定常領域に由来するなど、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。

付加的実施形態では、リンカーは、以下からなる群から選択される：
ｇｌｙ_９（配列番号１）；
ｇｌｕ_９（配列番号２）；
ｓｅｒ_９（配列番号３）；
ｇｌｙ_５ｃｙｓｐｒｏ_２ｃｙｓ（配列番号４）；
（ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_３（配列番号５）；
ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号６）；
ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号７）；
ＧｌｙＡｓｐＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｒｇＡｓｎＧｌｎＬｙｓ（配列番号８）および
Ｇｌｙ_９ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号９）。

他の実施形態では、可溶性タンパク質は、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘは、Ｆｌｔ−１のＩｇＧ様ドメイン２を含み、Ｙは、Ｇｌｙ_９（配列番号１）であり、Ｚは、ＩｇＧ Ｆｃ領域またはＩｇＧ ＣＨ３領域である。

付加的実施形態では、多量体化ドメインは、ヒト化されている。

さらなる実施形態では、可溶性タンパク質は、（ａ）図２Ａ〜２Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１１）；（ｂ）図６に示すアミノ酸配列（配列番号１５）；（ｃ）図８に示すアミノ酸配列（配列番号１７）；（ｄ）図１２に示すアミノ酸配列（配列番号２１）；および（ｅ）それと少なくとも９０％の配列同一性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の活性型変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

黄斑変性を処置する上述の方法のいずれかの実施形態では、黄斑変性は、例えば、滲出型ＡＭＤなどの、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。

上述の方法のさらなる実施形態では、本方法は、眼圧、網膜厚、網膜下液、網膜内液などを減少させることを含む。

上述の方法のいずれかの付加的実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。

上述の方法のいずれかの実施形態では、例えば、最大約２×１０^８ｒＡＡＶビリオン、または最大約２×１０^９ｒＡＡＶビリオンなどの、約２×１０^８から２×１０^１０未満までのｒＡＡＶビリオンが眼に送達される。

対象発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示を考慮して、容易に当業者の心に浮かぶであろう。

本明細書で「ｓＦＬＴ０１タンパク質」と呼ぶ、Ｆｌｔ−１を含む融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す図である。 ｓＦＬＴ０１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。 ｓＦＬＴ０１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。 ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００３３７６）（配列番号１２）を示す図である。 ＶＥＧＦのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ１９５１３）（配列番号１３）を示す図である。 ＶＥＧＦ多量体化ドメインＥｘ３にＧｌｙ_９リンカーにより連結された可溶性Ｆｌｔ−１を含む付加的融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１４）を示す図である。 図５のＤＮＡ配列（配列番号１４）によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。 ＶＥＧＦ多量体化ドメインＥｘ３にＧｌｙ_９により連結された可溶性Ｆｌｔ−１およびＩｇＧ１ ＣＨ３領域の配列を含む付加的融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１６）を示す図である。 図７のＤＮＡ配列（配列番号１６）によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１７）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１９）（配列番号１８）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１９）（配列番号１８）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１７９４８）（配列番号１９）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１７９４８）（配列番号１９）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１７９４８）（配列番号１９）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１７９４８）（配列番号１９）を示す図である。 代表的なＦｌｔ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１７９４８）（配列番号１９）を示す図である。 ＩｇＧ１ ＣＨ３領域の配列にＧｌｙ_９（配列番号１）により連結された可溶性Ｆｌｔ−１を含む本明細書で「ｓＦＬＴ０２タンパク質」と呼ぶ、Ｆｌｔ−１を含む融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号２０）を示す図である。 ｓＦＬＴ０２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す図である。 ＩｇＧ１ラムダ重鎖のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｙ１４７３７）（配列番号２２）を示す図である。 ＩｇＧ１ラムダ重鎖のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す図である。 ＩｇＧ１ラムダ重鎖のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す図である。 図１５Ａは、２×１０^８ｒＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の単回投与により処置した（図１５Ｂ）ヒト眼における網膜下および網膜内液のベースライン（図１５Ａ）からの変化（光干渉断層撮影により測定された）を示す図である。図１５Ｂは、２×１０^８ｒＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の単回投与により処置した（図１５Ｂ）ヒト眼における網膜下および網膜内液のベースライン（図１５Ａ）からの変化（光干渉断層撮影により測定された）を示す図である。 図１６Ａは、２×１０^１０ｒＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の単回投与により処置した（図１６Ｂ）ヒト眼における網膜下および網膜内液のベースライン（図１６Ａ）からの変化（光干渉断層撮影により測定された）を示す図である。図１６Ｂは、２×１０^１０ｒＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の単回投与により処置した（図１６Ｂ）ヒト眼における網膜下および網膜内液のベースライン（図１６Ａ）からの変化（光干渉断層撮影により測定された）を示す図である。

本発明の実施には、特に示さない限り、当技術分野の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来方法を用いるものとする。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ． ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、現行版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ． Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；連続出版物Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ． Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ． ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ． Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ． Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ． ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ． Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３〜８）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ． Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ． Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ． ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ． Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ． ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ． Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ． ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）を参照のこと。

本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許および特許出願、ならびに受託番号は、上文または下文を問わず、それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。

１． 定義
本発明を記述するに際して、以下の用語を用いるものとし、以下に示すように定義するものとする。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示すと判断されない限り、複数の指示対象を含むことを注意しなければならない。したがって、例えば、「ａｎ Ｆｌｔ−１ 受容体」への言及は、２つまたはそれ以上のそのような受容体の混合物などを含む。

本明細書で用いているように、「加齢黄斑変性」または「ＡＭＤ」は、初期、中期および進行ＡＭＤを含み、地図状萎縮などの非滲出型ＡＭＤと新生血管または滲出性ＡＭＤとしても公知の滲出型ＡＭＤとの両方を含む。これらの状態は、下文でより十分に述べる。

本明細書で用いているように、「黄斑浮腫」は、眼の黄斑部の腫脹または肥厚を引き起こし得る網膜内の液の蓄積を意味する。黄斑浮腫は、網膜における血管が液体を漏出させる場合に発現する。病態生理は、一般的に血管の不安定性および血液網膜関門の破綻を伴う。観察される最も一般的な種類である、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）は、異常な網膜傍中心窩毛細血管の透過性に二次的な外網状層における液の蓄積を伴う。黄斑は、腫脹した場合、適切に機能しない。視力喪失は、軽度から重度であるが、場合によって、周辺視は残る。

「Ｆｌｔ−１タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ｒ１タンパク質」という用語は、本明細書で同義で用い、ＶＥＧＦに結合することが公知である受容体タンパク質を意味する。「Ｆｌｔ−１タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ｒ１タンパク質」または前述のものをコードするヌクレオチド配列という用語は、起源に関係なく、任意のＦｌｔ−１タンパク質に由来する、それぞれタンパク質またはヌクレオチド配列を意味する。この用語は、本明細書で用いているように、本明細書でさらに述べるものを含む、公知のＶＥＧＦ活性試験のいずれかで測定される、ＶＥＧＦに結合またはその活性を調節することができる分子を意味する。代表的なＦｌｔ−１タンパク質の全長ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列をそれぞれ図９Ａ〜９Ｂ（配列番号１８）および１０Ａ〜１０Ｅ（配列番号１９）に示す。しかし、本明細書で定義したＦｌｔ−１タンパク質は、示した配列に限定されない。その理由は、いくつかのそのような受容体が公知であり、これらの受容体の変異が種間で発生するからである。付加的なＦｌｔ−１タンパク質配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３６５７．２；ＢＣ０３９００７．１；Ｕ０１１３４．１；ＨＤ０７７７１６．１；Ｘ５１６０２．１；ＥＵ３６０６００．１；ＡＫ３００３９２．１；ＥＵ８２６５６１．１；ＥＵ３６８８３０．１；ＡＢ３８５１９１．１；ＡＫ２９２９３６．１；ＡＫ３０９９０１．１；ＡＢ２０９０５０．１；ＢＣ０２９８４９．１；ＢＣ０３９００７．１；ＮＭ＿００１１６００３１．１；ＮＭ＿００１１６００３０．１；ＮＭ＿００２０１９．４；ＮＭ＿００１１５９９２０．１に見いだすことができる。

シグナル配列を有するまたは有さない、全長タンパク質、およびその断片、ならびに天然配列に対する欠失、付加および置換（本質的に保存的または非保存的）などの修飾を有するタンパク質は、タンパク質が所望の活性を維持している限り、本明細書で使用するものとする。そのような活性変異体および断片は、本発明との関連においてＶＥＧＦ１受容体とみなされる。修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような、意図的なものである可能性があり、あるいはタンパク質を生成する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるなど、偶発的なものである可能性がある。したがって、親配列と実質的に相同である活性タンパク質、例えば、対応するリガンドの活性を調節する能力を保持している７０．．．８０．．．８５．．．９０．．．９５．．．９８．．．９９％などの同一性を有するタンパク質を本明細書で使用することが想定される。

Ｆｌｔ−１受容体のような「天然」ポリペプチドは、天然に由来する対応する分子と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。そのような天然配列は、自然から単離することができ、あるいは組換えまたは合成手段により生成することができる。「天然」配列という用語は、とりわけ天然に存在する切断または分泌型の特定の分子（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に存在する対立遺伝子変異型のポリペプチドを含む。本発明の様々な実施形態では、本明細書で開示する天然分子は、添付図面に示した全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列である。しかし、添付図面に開示した一部の分子は、図でアミノ酸位置１として示されたメチオニン残基から始まり、図におけるアミノ酸位置１から上流または下流に位置する他のメチオニン残基は、特定の分子の出発アミノ酸残基として用いることができる。あるいは、用いる発現システムによって、本明細書で述べる分子は、Ｎ末端メチオニンを欠く可能性がある。

「細胞外ドメイン」とは、細胞外ドメインのすべてまたは断片を含み、膜貫通ドメインのすべてまたは一部を欠き、細胞質ドメインも欠くことがあり得る受容体ポリペプチドの形態を意味する。一般的に、本発明において用いる場合、細胞外ドメインは、膜貫通および細胞質ドメインの両方を実質的に含まない。通常、細胞外ドメインは、膜貫通および／または細胞質ドメインの１０％未満、これらのドメインの５％未満、１％未満、あるいはそのようなドメインの０．５％未満を含む。本明細書で述べる受容体の膜貫通ドメインは、例えば、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５〜１３２頁を用いて計算されるもののような、標準的な疎水性プロットを用いて、疎水性ドメインを同定するために当技術分野で通常用いられる基準に従って同定することができる。

上文で説明したように、本発明で用いる受容体は、天然シグナル配列を含んでいてもまたは含んでいなくてもよい。本明細書で述べる受容体のシグナルペプチドのおおよその位置は、本明細書および添付図面に記載する。しかし、シグナルペプチドのＣ末端境界が、本明細書で述べるシグナルペプチドのＣ末端境界のいずれかの側に一般的に約５アミノ酸以下だけずれていることがあることが指摘される。シグナルペプチドのＣ末端境界は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９７）１０：１〜６頁およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８６）１４：４６８３〜４６９０頁に記載されているような、当技術分野で通常用いられる基準に従って同定することができる。さらに、場合によって、分泌ポリペプチドのシグナル配列の切断は、完全に均一というわけではなく、結果的に複数の分泌種をもたらすことも認識される。シグナルペプチドが本明細書で同定されるシグナルペプチドのＣ末端境界のいずれかの側に約５アミノ酸以下の範囲内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドが、本発明により想定されるものである。

「変異体」とは、対応する全長天然配列との少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書で定義した活性ポリペプチド、シグナルペプチドを欠いているポリペプチド、シグナルペプチドを有するもしくは有さないポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書で開示する全長ポリペプチド配列の任意の他の断片を意味する。そのようなポリペプチド変異体は、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮおよび／またはＣ末端において付加されているか、または欠失しているポリペプチドを含む。複数の実施形態では、変異体は、対応する全長天然配列との少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。複数の実施形態では、変異型ポリペプチドは、長さが少なくとも約２０アミノ酸、例えば、長さが少なくとも約３０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約４０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約５０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約６０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約７０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約８０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約９０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約１００アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約１５０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約２００アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約３００アミノ酸、またはそれ以上のような、長さが少なくとも約１０アミノ酸である。変異体は、本質的に保存的または非保存的である置換を含む。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能が完全のままである限り、最大約５〜１０の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換を、または最大約１５〜２５もしくは５０の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換を、または５〜５０の間の任意の置換数を含み得る。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド部分間の同一性の百分率を意味する。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、配列が分子の規定の長さにわたり少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％〜８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性、少なくとも約９９％、またはそれらの間の任意の百分率を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で用いているように、実質的に相同は、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列との完全な同一性を示す配列も意味する。

一般的に、「同一性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド間またはアミノ酸間の一致を意味する。同一性百分率を決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、同一性百分率は、配列を整列させ、２つの整列配列の間の一致の正確な数を数え、より短い配列の長さで割り、結果に１００を掛けることによって、２つの分子の間の配列情報の直接比較により決定することができる。解析の助けとするために、ペプチド解析のためのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁、１９８１の局所相同性アルゴリズムを利用するＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣにおけるＡＬＩＧＮ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆのような容易に利用できるコンピュータプログラムを用いることができる。ヌクレオチド配列の同一性を測定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手できる）において利用できる。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムにも依拠する、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムなどである。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、上で引用したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに示されているデフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性百分率は、デフォルトスコアリングテーブル（default scoring table）および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定することができる。

本発明に関連して同一性百分率を確定する他の方法は、エディンバラ大学により著作権で保護され、Ｊｏｈｎ Ｆ． ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ． Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により流通されているＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを用いることである。このパッケージ一式から、デフォルトパラメーターがスコアリングテーブルについて用いられる（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ延長部分ペナルティおよび６のギャップ）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができる。得られるデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性百分率を計算するための他の適切なプログラムは、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、他のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに用いられる、ＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを用いて使用することができる：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、当技術分野で周知である。

あるいは、相同性は、相同領域間の安定な二重らせんを形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化断片のサイズの測定により決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムについて規定される厳しい条件のもとでのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を既定することは、当技術分野の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡクローニング、前出；核酸ハイブリダイゼーション、前出を参照のこと。

「同義変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、その同義変異体が由来するもとのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、その核酸配列中に変化を含むポリヌクレオチドを意味する。

「コード配列」または選択されるポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下におかれた場合にポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対する３’に位置し得る。

「ベクター」とは、適切な調節要素と結合された場合に複製の能力があり、遺伝子配列を細胞に転移させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等のような任意の遺伝要素を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。

「組換えベクター」とは、細胞中で発現することができる異種核酸配列を含むベクターを意味する。

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来でない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを意味する。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は、少なくとも１つ、実施形態では、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）が両端に隣接する。

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、実施形態では、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）が両端に隣接した１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを意味する。そのようなｒＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスにより感染させ（または適切なヘルパー機能を発現しており）、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合に複製させ、感染性ウイルス粒子中にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターがより大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体にまたはクローニングもしくはトランスフェクションに用いられるプラスミドのような他のベクターに）組み込まれている場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および適切なヘルパー機能の存在下で複製し、キャプシド封入により「救出」することができる「プロベクター」と呼ぶことができる。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体が、脂質と複合体化したもの、リポソーム内に封入されたもの、およびウイルス粒子、とりわけＡＡＶ粒子中にキャプシド封入されたものを含むが、これらに限定されない、多くの形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスキャプシド中にパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）を得ることができる。

「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物の粒子内への付加または挿入により、遺伝子組換えが行われたウイルスを意味する。

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために用い、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」された。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６頁、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７頁を参照のこと。そのような技術は、１つまたはそれ以上の外因性分子を適切な宿主細胞に導入するために用いることができる。

「異種」という用語は、コード配列および制御配列などの核酸配列に関連する場合、特定の細胞と通常繋ぎ合わされていることはない、かつ／または通常関連しない配列を意味する。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然においてその分子に関連して見いだされない他の核酸分子内のまたはそれに繋ぎ合わされている核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然においてコード配列に関連して見いだされない配列が両端に隣接したコード配列を含む可能性がある。異種コード配列の他の例は、コード配列それ自体が天然に見いだされない構築物である（例えば、天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞中に通常存在しない構築物により形質転換した細胞は、本発明の目的のために異種とみなされる。対立遺伝子変異または天然に存在する突然変異事象は、本明細書で用いる異種ＤＮＡとはならない。

「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。この用語は、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンなどであるが、これらに限定されないＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を取り込む。

ＤＮＡ「制御配列」という用語は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合的に可能にする、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的に指す。選択されるコード配列が適切な宿主細胞中で複製され、転写され、翻訳される可能性がある限り、これらの制御配列のすべてが必ずしも存在する必要はない。

「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために本明細書でその通常の意味で用いる。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質等により誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質等により抑制される）および「構成性プロモーター」を含み得る。

「作動可能に連結した」は、そのように述べられた構成要素がそれらの通常の機能を果たすように構成されている要素の配置を意味する。したがって、コード配列に作動可能に連結した制御配列は、コード配列の発現をもたらすことができる。制御配列は、コード配列の発現を導くように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在未翻訳転写配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在する可能性があり、プロモーター配列がコード配列に「作動可能に連結した」状態であると依然としてみなすことができる。

「多量体化ドメイン」という用語は、本発明に関連して用いているように、直接または「リンカードメイン」を介して、特定のＦｌｔ−１受容体が結合している分子の一部を指すことを意味する。多量体化ドメインは、２つ以上の多量体化ドメインおよび／またはｓＦｌｔ−１受容体ドメインの相互作用を促進するポリペプチドドメインであり得る。

例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域のような免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２つまたはそれ以上の多量体化ドメイン間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチド、または例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている「空洞内突起」ドメインであり得る。突起は、例えば、第１のポリペプチドの界面の小アミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することによって構築される。突起に対する同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって第２のポリペプチドの界面に場合により形成される。

したがって、複数の態様では、多量体化ドメインは、単量体ドメインからの二量体、三量体などの形成を促進または可能にする、分子の当該部分を有する。複数の態様では、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域ドメインである。

「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、抗体または抗原特異性を欠く抗体様分子である、タンパク質、一般的に糖タンパク質である。免疫グロブリンは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成された、通常約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖は、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、アミノ（Ｎ）末端可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くカルボキシ（Ｃ）末端定常ドメインを有する。各軽鎖は、可変Ｎ末端ドメイン（ＶＬ）およびＣ末端定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）は、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。免疫グロブリンポリペプチド鎖のドメインの定義によれば、軽（Ｌ）鎖は、２つの立体配座的に類似のドメインＶＬおよびＣＬを有し、重鎖は、それぞれが１つの鎖内ジスルフィド架橋を有する４つのドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。

重鎖の定常（Ｃ）ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、異なるクラスに帰属させることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。免疫グロブリンのクラスは、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。各重鎖は、１つの末端における可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常ドメインを有する。脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なる種類のうちの１つに帰属させることができる。

「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端（定常）領域を意味する。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異型Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、全長ヒトＩｇＧ１のＣｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端まで広がっている可能性がある。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＩｇＧ１の重鎖における最後の残基リシンは、成熟タンパク質におけるＦｃにおける末端残基として存在する必要はあり得ない。１つのヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、ＮＣＢＩ登録番号Ｐ０１８５７に定義されている。

ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃｙ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、全長ＩｇＧの約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで、ただしヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のＰｒｏ１１１からＬｙｓ２２３まで広がっている。

「ＣＨ３ドメイン」は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基（すなわち、全長ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７まで、ただしヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のＧｌｙ２２４からＬｙｓ３３０まで）を含む。

「ヒンジ領域」は、全長ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌｅｃ．ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）２２：１６１〜２０６頁）、ただしヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域だとＧｌｕ９９からＰｒｏ１１０までに渡ると一般的に定義されている。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによってＩｇＧ１配列とアラインすることができる。

Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、直接的にＣ末端からヒンジ領域までの残基の広がり、すなわち、全長ヒトＩｇＧ１の残基２３３〜２３９と通常定義される。

「天然Ｆｃ領域配列」は、天然に見いだされるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然ヒトＦｃ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；およびヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含むが、これらに限定されない。マウスＦｃ領域のような、他の種の天然Ｆｃ領域も周知である。

「機能性Ｆｃ領域」は、天然Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。具体例としての「エフェクター機能」としては、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などがある。そのようなエフェクター機能は、一般的にＦｃ領域が結合ドメイン（すなわち、本明細書ではＶＥＧＦリガンド）と結合されることを必要とし、当技術分野で公知の様々なアッセイを用いて評価することができる。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１（Ａおよび非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域のような天然配列ヒトＦｃ領域であり得る。そのような配列は公知である。例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０２４４０を参照のこと。

「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され、場合により、適切な条件下で翻訳され、かつ／または発現することができるポリヌクレオチドを意味する。複数の態様では、それは、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、または別の方法で所望の治療もしくは診断結果をもたらす（例えば、所望の治療もしくは診断結果をもたらす分子に転写される）。

ウイルス力価に関連して用いられる「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム相当数」または「ゲノムコピー」という用語は、感染力または機能性を問わず、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含むビリオンの数を意味する。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書における実施例、または例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１〜１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２〜２７８頁に記載されているような手順により測定することができる。

ウイルス力価に関連して用いられる「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」という用語は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３頁に記載されている、複製センターアッセイ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）としても公知の、感染性センターアッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）により測定される感染性および複製可能組換えＡＡＶベクター粒子の数を意味する。

ウイルス力価に関連して用いられる「導入単位（ｔｕ）」という用語は、本明細書における実施例、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３〜１２４頁；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０〜５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載されているような機能アッセイで測定される機能性導入遺伝子産物の生成をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を意味する。

「逆方向末端反復配列」または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見いだされる、反対方向の比較的に短い配列を意味する。

当技術分野で十分に理解されている用語である、「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、天然一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５ヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最外１２５ヌクレオチドは２つの別の配向のいずれかで存在し得、これは、異なるＡＡＶゲノム間および単一ＡＡＶゲノムの２末端間の不均一性をもたらす。最外１２５ヌクレオチドは、鎖内塩基対合がＩＴＲのこの部分の範囲内で起こることを可能にする、自己相補性のいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と呼ぶ）も含む。

「末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質により切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域における配列である。変異型末端分解配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に不応性である。

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（欠損パルボウイルスである）が宿主細胞により複製され、パッケージングされることを可能にするウイルスを意味する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を果たす。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアのようなポックスウイルスを含む、多くのそのようなヘルパーウイルスが同定された。サブグループＣの５型アデノウイルス（Ａｄ５）が最も一般的に用いられているが、アデノウイルスは、多くの異なるサブグループを含む。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類由来の多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託所から入手できる。ＡＴＣＣなどの受託所から入手もできる、ヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）などがある。ＡＶＶの複製のためのアデノウイルスのヘルパー機能の例としては、ＥＩＡ機能、ＥＩＢ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能などがある。

感染性ＡＡＶ粒子と感染性ヘルパーウイルス粒子との比が少なくとも約１０^２：１；少なくとも約１０^４：１；少なくとも約１０^６：１；または少なくとも約１０^８：１である場合、ｒＡＡＶの調製物には、ヘルパーウイルスが「実質的に含まれない」と言われる。調製物には、対応量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子混入物が破綻した形態で存在した場合に、そのようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在し得るタンパク質）も含まれない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の混入は、ＳＤＳゲル上のクーマシー染色バンドの存在として一般的に観測することができる（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）。

「調節する」という用語は、シグナル伝達経路のレベルに影響を与える（例えば、上方制御する、下方制御するまたは他の状態に制御する）ことを意味する。シグナル伝達の制御下の細胞過程は、特定の遺伝子の転写、代謝、増殖、分化、接着、アポトーシスおよび生存などの正常細胞機能、ならびに形質転換、分化の阻害および転移などの異常過程を含むが、これらに限定されない。

本発明の目的のための「活性な」または「活性」は、対応する天然または天然に存在するポリペプチドの生物学的活性（抑制または刺激）を保持しているＦｌｔ−１受容体ポリペプチドの形態を意味する。活性は、対応する天然または天然に存在するポリペプチドで観測されるものより大きい、等しい、または小さい。上で説明したように、活性は、黄斑変性を罹患している対象におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路のレベルを調節することを含む。

ヌクレオチド配列に言及する場合の「単離された」とは、同じ種類の他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で、示された分子が存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離核酸分子」は、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を意味するが、その分子は、組成物の基本的特徴に悪影響を及ぼさない多少の付加的な塩基または部分を含み得る。

特定のヌクレオチド配列が他の配列に対して「上流」、「下流」、「３プライム（３’）」または「５プライム（５’）」に位置すると述べられている場合のような、本出願を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記述する目的のために、それは、当技術分野で慣習であるとされているＤＮＡ分子の「センス」または「コード」鎖における配列の位置であることを理解すべきである。

「精製された」という用語は、目的の物質がそれが存在するサンプルの百分率の大部分を構成するような物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の単離を意味する。一般的にサンプル中で実質的に精製された成分は、サンプルの５０％、８０％〜８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のような、９０〜９９％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製する技術は、当技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度別沈降分離などがある。

「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で同義で用い、脊椎動物、例えば、哺乳動物を意味する。哺乳動物は、マウス、げっ歯類、サル類、ヒト、家畜動物、スポーツ動物および愛玩動物を含むが、これらに限定されない。

本明細書で提供する、組成物または薬剤の「有効量」または「治療上有効量」という用語は、眼におけるＶＥＧＦを調節すること、または黄斑変性に関連する眼における物理的変化を低減させ、その進行を予防もしくは遅延させること、またはそれにより現われた症状（例えば、ドルーゼンの蓄積、眼内の異常な血管の成長、眼内の異常な体液、血液およびタンパク質の漏れなど）を低減、その進行を予防もしくは遅延させることのような、所望の反応をもたらすのに十分な組成物または薬剤の量を意味する。必要とする正確な量は、対象の種、年齢および一般状態、処置を受ける状態の重症度、対象の特定のマクロ分子および投与方法などによって、対象ごとに異なる。個々の場合における適切な「有効」量は、常用の実験を用いて当業者により決定することができる。例えば、Ｌｉｍ Ｊ．（２０１２）Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｋａｎｓｋｉら（２０１１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓを参照のこと。

黄斑変性の「処置」またはそれを「処置すること」は、（１）疾患を予防すること、すなわち、疾患にさらされるもしくはかかりやすい可能性があるが、疾患の症状をまだ経験もしくは示さない対象における疾患の発現を予防すること、または疾患がより低い重症度で起こることをもたらすこと、（２）疾患を抑制すること、すなわち、発現を停止させこと、進行を予防もしくは遅延させること、または疾患状態を元に戻すこと、（３）疾患の症状を軽減させること、すなわち、対象が経験する症状の数を減少させること、あるいは（４）黄斑変性に関連する眼における物理的変化を低減させ、その進行を予防もしくは遅延させることである。処置は、ドルーゼンの蓄積、眼内の異常な血管の成長、眼内の異常な体液、血液およびタンパク質の漏出などの低減を含むが、これらに限定されない。処置は、例えば、眼の中心部における光受容体（桿体および錐体）の喪失の速度および量をモニターすることにより、視力喪失の速度および最高矯正視力（ＢＣＶＡ）をモニターすることにより、網膜下の網膜色素上皮層（および脈絡毛細血管板）の萎縮の速度および量をモニターすることにより、網膜と脈絡膜の間に蓄積するドルーセン（細胞デブリ）の量をモニターすることにより、眼内の異常な血管の成長をモニターすることにより、ならびに眼内の異常な体液、血液およびタンパク質の漏出の量をモニターすることにより検出することができる。

本明細書に記載した範囲は、範囲内の値のすべてを省略表現したものと理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群からのいずれかの数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。

別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の技術者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で述べたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、具体例としての方法、装置および材料をこれから述べる。本明細書で引用したすべての技術および特許公開は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。本明細書における何物も、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利が与えられないという承認と解釈すべきでない。

必ずしも明確に述べるわけではないが、すべての数値表示は、「約」という用語により先行されることを理解すべきである。必ずしも明確に述べるわけではないが、本明細書で述べる試薬は、単に例となるものであり、そのようなものの同等物は、当技術分野で公知であることも理解すべきである。

２． 発明の実施の形態
本発明を詳細に述べる前に、本発明は、特定の製剤または工程パラメーターに限定されず、したがって、もちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書で用いた用語は、本発明の特定の実施形態のみを述べる目的のためのものであり、限定されるものでないことも理解すべきである。

本発明を本明細書で述べる実施例に限定されると解釈すべきでないことを理解すべきである。本明細書で述べたものと類似または同等の方法および材料は、本発明の実施に用いることができ、本発明は、本明細書に記載したありとあらゆる応用および当業者の技術の範囲内のすべての同等の変形形態を含むと解釈すべきである。

本発明の中核をなすものは、ＶＥＧＦ活性を調節することができるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質（本明細書で「可溶性Ｆｌｔ−１タンパク質」または「可溶性Ｆｌｔ−１受容体」とも呼ぶ）をコードする構築物を用いる、ヒト眼への遺伝子送達は、対応するシグナル伝達経路を調節する役割を果たし、黄斑変性の症状を著しく低減させるという発見である。複数の態様では、本発明は、非ヒト霊長類において有効であると以前に報告された用量より低い用量を投与することを含む。例えば、Ｌｕｋａｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒ．（２０１１）１９：２６０〜２６５頁を参照のこと。したがって、可溶性Ｆｌｔ−１タンパク質の投与は、ヒトにおける黄斑変性を処置し、予防するための有用な技術となるものである。本明細書で述べる方法は、単独でまたは伝統的な治療（例えば、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦ−Ｒアンタゴニスト、補体経路阻害剤）と組み合わせて用いることができる。

複数の実施形態では、本発明の方法に用いる可溶性タンパク質は、免疫グロブリン定常領域に連結するように、直接またはリンカーを介して、多量体化ドメインに連結した、少なくとも１つのＦｌｔ−１ドメイン、またはその活性部分を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、可溶性タンパク質は、直接またはリンカーを介して、多量体化ドメインに連結した、ドメイン２あるいはその一部および／または延長部分を含む。リンカーは、長さがアミノ酸５〜２５残基の配列を含み得る。代表的な多量体化ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ領域またはその一部、およびＩｇＧ ＣＨ３領域またはその一部を含むが、これらに限定されない。

受容体は、免疫グロブリン領域から上流または下流に存在し得る。一般的に、融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される場合、多量体として生成される。多量体は、二量体、三量体などであり得る。

本発明の理解を促進するために、黄斑変性、Ｆｌｔ−１受容体、受容体−免疫グロブリン融合物、本発明とともに用いるための様々な遺伝子送達方法に関するより詳細な考察を下文に記載する。

黄斑変性
上で説明したように、本発明は、ＶＥＧＦ活性を阻害し、それにより、黄斑変性を処置し、予防し、軽減し、かつ／またはその進行を予防もしくは遅延させるためにＦｌｔ−１受容体を使用する。特定の実施形態では、黄斑変性を発現するリスクのある個体に疾患を遅らせまたは予防するのに有効な量を投与する。

少なくとも３種類の型の黄斑変性が同定された。（１）中心地図状萎縮としても公知である、萎縮性、非滲出−乾燥型のＡＭＤは、黄斑変性を有する患者の約８５〜９０％に発生する。乾燥型のＡＭＤは、一般的に網膜下の網膜色素上皮層（およびおそらく脈絡毛細血管板）の萎縮に起因し、眼の中心部における光受容体（桿体および錐体）の喪失による視力喪失をもたらす。網膜と脈絡膜の間に蓄積する細胞デブリ（ドルーゼンと呼ばれる）がさらに存在し得る。（２）新生血管または滲出性ＡＭＤとしても公知である、滲出型のＡＭＤは、最も重症型のＡＭＤである。滲出型のＡＭＤは、一般的に眼内の異常な血管の成長を特徴とし、この場合、欠陥のある血管が体液および血液を漏出させる。それは、異常な血管が脈絡毛細血管板からブルッフ膜を経て網膜下腔内へと成長して最終的に黄斑下の血液およびタンパク質を漏出させるため、視力喪失もたらし得る。無処置で放置した場合、これらの血管からの出血、漏出および瘢痕化が最終的に光受容体の不可逆的損傷、黄斑における瘢痕形成および比較的に速やかな視力喪失をもたらす。（３）色素上皮剥離関連（ＰＥＤ）ＡＲＭＤは、患者の５％未満に発生し、網膜剥離をもたらす。

Ｆｌｔ−１分子および融合物
本発明は、ＶＥＧＦ活性を調節し、それにより、黄斑変性を処置し、予防し、軽減し、かつ／またはその進行を予防もしくは遅延させるために可溶型のＦｌｔ−１受容体を使用する。複数の態様では、Ｆｌｔ−１受容体−免疫グロブリン融合物を本発明に用いる。天然分子、ならびに本明細書でさらに述べるものを含む公知の様々なアッセイおよび動物モデルのいずれかで測定される、ＶＥＧＦに結合し、リガンド活性を調節する能力を保持しているその活性断片および類似体は、本発明とともに用いるのに適している。例えば、ＶＥＧＦ結合アッセイは、公知であり、Ｐｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００９）１６：１０〜１６頁およびその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第７，９２８，０７２号に記載されている。

代表的な全長ヒトＦｌｔ−１受容体のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ図９Ａ〜９Ｂ（配列番号１８）および１０Ａ〜１０Ｅ（配列番号１９）に示す。Ｆｌｔ−１受容体タンパク質は、７つのＩｇ様ドメインを含む図１０Ａ〜１０Ｅの２７〜７５８位に見いだされる細胞外部分を有する。図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１〜２６は、シグナル配列を表す。７つのＩｇ様ドメインは、図１０Ａ〜１０Ｅのそれぞれ残基番号３２〜１２３、１５１〜２１４、２３０〜３２７、３３５〜４２１、４２８〜５５３、５５６〜６５４および６６１〜７４７に位置する。このＦｌｔ−１タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１９（図９Ａ〜９Ｂ、配列番号１８）に示されたＤＮＡ配列によりコードされる。

複数の実施形態では、本発明で用いたＦｌｔ−１分子は、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２を含む。分子がＶＥＧＦ活性を調節する能力を保持している限り、Ｆｌｔ−１分子のいずれの部分も用いることができるが、いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ−１分子は、ドメイン１および３のすべてまたは一部を欠いていることがあり得る。Ｆｌｔ−１ドメイン２は、図１０Ａ〜１０Ｅの１５１〜２１４位に見いだされる。しかし、本融合物のＦｌｔ−１成分は、例えば、Ｆｌｔ−１のドメイン１および２、ドメイン２および３等の間に見いだされるアミノ酸の任意の配列、例えば、図１０Ａ〜１０Ｅの位置１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３６．．．１４０．．．１４５．．．１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５．．．１６０．．．１６５．．．１７０、アミノ酸２１０まで、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９等のいずれか１つにおいて始まるアミノ酸配列のような、図１０Ａ〜１０Ｅの１２４〜２２９位の間に見いだされるアミノ酸配列に対応するアミノ酸のいずれかの配列を含み得る。複数の実施形態では、本明細書で述べた融合物のＦｌｔ−１成分は、図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６を含む。Ｆｌｔ−１成分は、所望の活性が維持されている限り、ドメイン１および３の一部、またはドメイン２の欠失さえも含め、Ｆｌｔ−１タンパク質の細胞外領域に存在する他のいずれかのドメインの一部も含み得る。特定の実施形態では、ドメイン１および３は、それらの全体として存在しない。

さらに、本発明の可溶性タンパク質は、付加的なポリペプチド／部分を含み得る。例えば、本発明の可溶性タンパク質は、制限なく、ＶＥＧＦＲ２のドメイン１、２および／または３を含む、ＶＥＧＦＲ２の様々なドメインのいずれかのような、ＶＥＧＦＲ２のすべてまたは一部、ならびに欠失したこれらのドメインの１つもしくはそれ以上、または一部を含む構築物を含み得る。ＶＥＧＦＲ２融合物およびＶＥＧＦＲ２のドメインとＦｌｔ−１ドメインとのハイブリッド融合物の説明については、例えば、Ｈｏｌａｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：１１３９３〜１１３９８頁およびその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第７，３７８，０９５号を参照のこと。

本発明の特定の融合物は、図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６に対応する、図２Ａ〜２Ｂ、６、８および１２の位置２４〜１１８に示されている配列、またはＶＥＧＦを調節する能力を保持している配列の一部もしくは変異体を有するＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、胎盤増殖因子にも結合する。

シグナル配列も存在し、可溶性タンパク質のＮ末端（例えば、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２配列）に連結されている。シグナル配列は、図１０Ａ〜１０Ｅの位置１〜２６に見いだされる配列のすべてまたは一部のような、天然シグナル配列のすべてまたは一部を含み得る。図２Ａ〜２Ｂ（配列番号１１）、６（配列番号１５）、８（配列番号１７）および１２（配列番号２１）に示す融合物において、２３アミノ酸のシグナル配列（図２Ａ〜２Ｂ、６、８および１２のアミノ酸１〜２３）が存在する。この配列は、Ｆｌｔ−１タンパク質の天然シグナル配列と相同である。あるいは、異種シグナル配列が存在し得る。多数のそのような配列は、当技術分野で公知であり、本明細書に用いる。シグナルペプチドの非限定的な例は、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ウシプロアルブミン、ヒトプロインスリン、ヒトインターフェロン−γ、ヒトα−フィブリノーゲン、ヒトＩｇＧ重鎖、ラットアミラーゼ、マウスα−フェトプロテイン、ニワトリリソザイムおよびトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）レインタンパク質（ｒｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）２２．１、脳由来神経栄養因子、インスリン増殖因子１およびβ−グルクロニダーゼのような分泌タンパク質に存在するものを含む。

上で説明したように、融合物のＦｌｔ−１部分は、直接またはリンカー部分を介して多量体化ドメインに連結されている。多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域のような免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２つまたはそれ以上の多量体化ドメイン間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチド、または例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている「空洞内突起」ドメインであり得る。多量体化ドメインは、単量体ドメインからの二量体、三量体などの形成を促進または可能にする、分子の当該部分を有する。

多量体化ドメインは、単量体融合タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を非変性ポリアクリルアミドゲル上で多量体に適切な速度で移動させる。グリコシル化は、ゲル中のタンパク質の移動に影響を与え得る。特定の配列をここに示すが、対立遺伝子変異体のような変異体も用いることができる。一般的に、そのような変異体は、開示した配列との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

多量体化は、例えば、還元および非還元ゲルを用いてアッセイすることができる。多量体化は、そのリガンド／受容体に対するタンパク質の結合親和力の増加の検出によってもアッセイすることができる。ＢｉａＣｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴アッセイをこれについて用いることができる。これらのアッセイは、センサーチップ表面に近い水性層における屈折率の変化を測定することによって質量の変化を検出する。当技術分野で公知のいずれの方法も多量体化を検出するために用いることができる。

複数の態様では、多量体化ドメインは、重鎖の領域、免疫グロブリン定常領域ドメイン、Ｆｃ領域などを含むが、これらに限定されない、免疫グロブリン分子に由来する。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ラムダ重鎖のＦｃ部分の配列、例えば、図１４Ａ〜１４Ｂのアミノ酸３７１〜４７７のようなＣＨ３単独、またはＣＨ３の一部もしくは延長部分、または図１４Ａ〜１４Ｂのアミノ酸２４７〜４７７のようなＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方、またはその一部もしくは延長部分を用いることができる。

免疫グロブリン分子の一部を得る方法は、当技術分野で周知である。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分は、パパイン酵素による全抗体分子の切断によって得ることができる。これらの部分を得るために他の手段も用いることができる。ＩｇＧ１ラムダ重鎖タンパク質配列については、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｙ１４７３７ならびにそれぞれＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す、図１３（配列番号２２）および１４Ａ〜１４Ｂ（配列番号２３）を参照のこと。例えば、他のＩｇＧ型およびＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体の他のＦｃ領域を用いることができる。ＶＥＧＦの多量体化領域も用いることができる。ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００３３７６および図３（配列番号１２）に示されている。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ１９５１３および図４（配列番号１３）に示されている。ＶＥＧＦエクソン３（ＶＥＧＦ Ｅｘ３）によりコードされる、ＶＥＧＦの多量体化領域は、ＶＥＧＦタンパク質のおおよそアミノ酸残基７５〜８８（図４）であり、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号７）を含む。

多くの異なるリンカー部分を用いることができ、機能的に同等であるが、複数の態様では、９グリシン残基のリンカーを本発明に用いる。他のリンカーは、例えば、５〜１００アミノ酸残基、５〜７５アミノ酸残基、５〜５０アミノ酸残基、５〜２５アミノ酸残基、５〜２０アミノ酸残基、５〜１５アミノ酸残基、５〜１０アミノ酸残基、または５〜９アミノ酸残基から構成される。有用なリンカーの例としては、以下のものが挙げられる：
ｇｌｙ_９（配列番号１）；
ｇｌｕ_９（配列番号２）；
ｓｅｒ_９（配列番号３）；
ｇｌｙ_５ｃｙｓｐｒｏ_２ｃｙｓ（配列番号４）；
（ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_３（配列番号５）；
ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号６）；
ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号７）；
ＧｌｙＡｓｐＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｒｇＡｓｎＧｌｎＬｙｓ（配列番号８）および
Ｇｌｙ_９ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号９）。

用いることができる他のポリペプチドリンカーとしては、５、７または３０残基を含む種々の長さのポリグリシンなどがある。さらに、Ｆｌｔ−１の他の部分、例えば、Ｆｌｔ−１のドメイン３または図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸２３５〜３３６のような、その一部もしくは延長部分をリンカーとして用いることができる。

リンカー分子は、ポリエチレングリコールのような他のポリマーからも製造することができる。そのようなリンカーは、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１００または１０〜５０エチレングリコール単量体単位を有し得る。適切なポリマーは、適切な範囲のアミノ酸残基により占められたサイズと同様のサイズであるべきである。一般的なサイズのポリマーは、約１０〜２５オングストロームの間隔をもたらすであろう。

本発明で用いた融合タンパク質の具体例としての形態を、それぞれ図１（配列番号１０）、５（配列番号１４）、７（配列番号１６）および１１（配列番号２０）に示すポリヌクレオチド配列によりコードされる、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号１１）、６（配列番号１５）、８（配列番号１７）および１２（配列番号２１）に示す。そのような配列は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第７，９２８，０７２号に記載されている。

「ｓＦＬＴ０１タンパク質」と呼ぶ、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号１１）に示す融合物は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、図２Ａ〜２Ｂの１〜２３位に見いだされるシグナル配列；図２Ａ〜２Ｂの２４〜１１８位（図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６に対応する）に見いだされる、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２およびこのドメインの延長部分；図２Ａ〜２Ｂの１１９〜１２７位に見いだされる、９個のグリシンの配列；ならびに図２Ａ〜２Ｂの１２８〜３５８位におけるＩｇＧ１−Ｆｃ ＣＨ２／ＣＨ３残基を含む。

図６（配列番号１５）に示す融合物は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、図６の１〜２３位に見いだされるシグナル配列；図６の２４〜１１８位（図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６に対応する）に見いだされる、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２およびこのドメインの延長部分；図６の１１９〜１２７位に見いだされる、９個のグリシンの配列；ならびに図６の１２８〜１４１位におけるＶＥＧＦ多量体化ドメインを含む。

図８（配列番号１７）は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、図８の１〜２３位に見いだされるシグナル配列；図８の２４〜１１８位（図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６に対応する）に見いだされる、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２およびこのドメインの延長部分；図８の１１９〜１２７位に見いだされる、９個のグリシンの配列；図８の１２８〜１４１位におけるＶＥＧＦ多量体化ドメイン；ならびに図８の１４２〜２４７位におけるＩｇＧ ＣＨ２／ＣＨ３領域の配列を含む。

図１２（配列番号２１）にＮ末端からＣ末端への順序で、図１２の１〜２３位に見いだされるシグナル配列；図１２の２４〜１１８位（図１０Ａ〜１０Ｅのアミノ酸１３２〜２２６に対応する）に見いだされる、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２およびこのドメインの延長部分；図１２の１１９〜１２７位に見いだされる、９個のグリシンの配列；ならびに図１２の１２８〜２３３位に見いだされるＩｇＧ ＣＨ２／ＣＨ３残基を含む、本明細書で「ｓＦＬＴ０２」と呼ぶ融合物を示す。

特定の配列を本明細書で述べるが、対立遺伝子変異体のような変異体も用いることができる。一般的に、そのような変異体は、開示した配列との少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、多量体化およびＶＥＦＧに結合する能力を含む、本明細書で述べた機能を保持している。

本発明とともに用いるためのＦｌｔ−１受容体およびその融合物をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術を用いて作製することができる。例えば、上述の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子を発現する細胞からのｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによる、または上記のものを含むことが公知のベクターから遺伝子を得ることによるなどの、組換え法を用いて得ることができる。目的の遺伝子は、公知の配列に基づいて、クローニングではなく、合成によっても作製することができる。分子は、特定の配列に対する適切なコドンを用いて設計することができる。標準的な方法により作製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから完全な配列をアセンブルし、完全なコード配列にアセンブルする。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６頁；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９頁；およびＪａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１頁を参照のこと。

したがって、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を含むベクターから得るか、あるいは適切な場合、部位特異的突然変異誘発法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のような、当技術分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて完全または部分的に合成することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、通常の自動ポリヌクレオチド合成装置で生成したオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドの相補的セットのアニーリングの後の適切なＤＮＡリガーゼによるライゲーション、およびライゲーションされたヌクレオチド配列のＰＣＲによる増幅による方法である。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４０８４〜４０８８頁を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）５４：７５〜８２頁）、先在性ヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３〜３２７頁およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４〜１５３６頁）、およびＴ_４ ＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップを有するオリゴヌクレオチドの酵素的フィルイン（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１００２９〜１００３３頁）は、対象方法に用いるための分子を得るために用いることができる。

得られたならば、受容体をコードするポリヌクレオチドは、上述のように、直接またはリンカー部分を介して多量体化ドメインに連結することができる。構築物は、下文でさらに述べるように組換えウイルスベクターを用いて対象に送達することができる。

遺伝子送達技術
上述のような、ｓＦｌｔ−１構築物は、いくつかの遺伝子送達技術のいずれかを用いて問題の対象に送達することができる。遺伝子の送達のためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。一般的に、組換えベクターは、下文で述べるように医薬組成物に製剤化し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ導入技術を用いて対象に導入する。ｅｘ ｖｉｖｏで導入する場合、所望のレシピエント細胞を対象から除去し、組換えベクターを用いて導入し、対象に再導入する。あるいは、対象における不適切な免疫応答を生じさせない場合、同遺伝子型または異種細胞を用いることができる。

導入済み細胞の対象への送達および導入の適切な方法が記載されている。例えば、組換えベクターは、対象の細胞と例えば適切な培地中で混ぜ合わせ、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来の技術を用いて、または選択可能マーカーを用いることにより、目的のＤＮＡを含む細胞をスクリーニングすることによって細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入することができる。

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの哺乳類細胞への遺伝子の移入のために多くのウイルスベースのシステムが開発された。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムの好都合なプラットフォームとなる。選択される遺伝子は、当技術分野で公知の技術を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが記載された。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０〜９９０頁；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５〜１４頁；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９〜８５２頁；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３〜８９３７頁）；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２〜１０９頁を参照のこと。複製欠損型マウスレトロウイルスベクターは、広く用いられている遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）により包まれ、宿主範囲を決定する糖タンパク質外被（ｅｎｖ）により囲まれた核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合体化した一本鎖ＲＮＡを含む。レトロウイルスのゲノム構造は、５’および３’長末端反復（ＬＴＲｓ）において閉鎖されたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株にトランスで供給されるならば、レトロウイルスベクターシステムは、５’および３’ＬＴＲｓならびにパッケージングシグナルを含む最小ベクターが、ベクターのパッケージングおよび感染ならびに標的細胞への組込みを可能にするのに十分であるという事実を活用する。遺伝子導入用のレトロウイルスベクターの基本的な利点は、大部分の細胞型における効率的な感染および遺伝子発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの正確な単一コピーベクターの組込みならびにレトロウイルスゲノムの操作の容易さなどである。

多くのアデノウイルスベクターも記載された。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続し、それにより、挿入突然変異誘発に関連するリスクを最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７〜２７４頁；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１〜５９２１頁；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７〜７２９頁；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３〜９４０頁；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１〜５８頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６〜６２９頁；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１〜４７６頁）。対象方法に用いるアデノウイルスベクターは、下文でより詳細に述べる。

さらに、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが遺伝子送達用に開発された。ＡＡＶベクターは、当技術分野で周知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および国際公開第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８〜３９９６頁；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ Ｂ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３〜５３９頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９頁；Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３〜８０１頁；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５〜１６９頁；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７〜１８７５頁を参照のこと。ＡＡＶベクターシステムも下文でさらに詳細に述べる。

目的の核酸分子を送達するために使用される追加のウイルスベクターは、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む、ポックスウイルス科に由来するものが挙げられる。例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築することができる。特定のポリペプチドをコードするＤＮＡを、それがワクシニアプロモーターおよびチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列のような、フランキングワクシニアＤＮＡ配列に隣接するように最初に適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを用いて、ワクシニアにより同時に感染させた細胞にトランスフェクトする。相同的組換えは、ワクシニアプロモーターとタンパク質をコードする遺伝子とをウイルスゲノムに挿入する役割を果たす。得られるＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、それに対して抵抗性のウイルスプラークを採取することによって選択することができる。

あるいは、家禽ポックスおよびカナリアポックスウイルスのような、鳥類ポックスウイルスも遺伝子を送達するために用いることができる。鳥類ポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳類種において特に望ましい。その理由は、鳥類ポックス属のメンバーは、感受性鳥類においてのみ生産的に複製することができ、したがって、哺乳類細胞において感染性でないからである。組換え鳥類ポックスウイルスを作製する方法は、当技術分野で公知であり、ワクシニアウイルスの作製に関して上述したように、遺伝的組換えを用いる。例えば、国際公開第９１／１２８８２号、国際公開第８９／０３４２９号および国際公開第９２／０３５４５号を参照のこと。

Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９頁およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３頁に記載されているアデノウイルスキメラベクターのような、分子コンジュゲートベクターも遺伝子送達に用いることができる。

例えば、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルスに由来するベクターなどであるが、これらに限定されない、アルファウイルス属のメンバーも融合物をコードするポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとして用いられるであろう。本方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来ベクターの説明については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８〜５１９頁ならびに国際公開第９５／０７９９５号および国際公開第９６／１７０７２号を参照のこと。

あるいは、いずれもその全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，４１３，９４２号、第６，２１４，８０４号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、第５，７６３，２７０号および第５，６９３，６２２号に記載されているようなプラスミドベースの核酸送達システムを用いることなどにより、ウイルスベクターを用いずにＦｌｔ−１構築物を送達することができる。プラスミドは、タンパク質産物のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を誘導する制御要素に作動可能に連結した目的の遺伝子を含む。そのような制御要素は、当技術分野で周知である。

アデノウイルス遺伝子送達システム
対象発明の一実施形態では、上述の融合物のような、Ｆｌｔ−１受容体をコードするヌクレオチド配列をアデノウイルスベースの発現ベクターに挿入する。アデノウイルスゲノムは、各鎖の５’末端に共有結合した５５ｋＤａの末端タンパク質を有する約３６０００塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ分子である。アデノウイルス（「Ａｄ」）ＤＮＡは、血清型に依存する正確な長さを有する約１００塩基対の同一の逆方向末端反復配列（「ＩＴＲｓ」）を含む。ウイルスの複製起点は、ゲノム末端のＩＴＲｓ内に正確に位置する。ＤＮＡ合成は、２段階で起こる。最初に、複製が鎖置換によって進み、娘二重らせん分子および親置換鎖を生成する。置換鎖は、一本鎖であり、複製開始および娘二重らせん分子の生成を可能にする、「フライパンの柄」状の中間体を形成し得る。あるいは、複製は、同時にゲノムの両末端から進み、フライパンの柄状の構造を形成する必要性がない。

生産的感染サイクル中に、ウイルス遺伝子は、２期で発現する。初期は、ウイルスＤＮＡ複製までの期間であり、後期は、ウイルスＤＮＡ複製の開始と一致する。初期の期間中に領域Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４によりコードされる初期遺伝子産物のみが発現し、ウイルス構造タンパク質の合成のために細胞を準備する多くの機能を果たす。後期中、後期ウイルス遺伝子産物が初期遺伝子産物に加えて発現し、宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質合成が停止される。その結果として、細胞は、ウイルスＤＮＡおよびウイルス構造タンパク質の生成に専用となる。

アデノウイルスのＥ１領域は、標的細胞の感染後に発現する最初の領域である。この領域は、２つの転写単位であるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子からなる。Ｅ１Ａ遺伝子産物の主な機能は、休止細胞が細胞周期に入り、細胞ＤＮＡ合成を再開することを誘導すること、ならびにＥ１Ｂ遺伝子および他の初期領域（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）を転写的に活性化することである。Ｅ１Ａ遺伝子単独による初代細胞のトランスフェクションは、無制限の増殖（不死化）を誘導し得るが、完全な形質転換をもたらさない。しかし、ほとんどの場合におけるＥ１Ａの発現は、プログラム細胞死（アポトーシス）、およびほんの時折不死化の誘導をもたらす。アポトーシスの誘導を防ぎ、完全な形態学的形質転換が起こるためには、Ｅ１Ｂ遺伝子の共発現が必要である。樹立された不死細胞株では、Ｅ１Ａの高レベル発現は、Ｅ１Ｂの非存在下での完全形質転換をもたらし得る。

Ｅ１Ｂコード化タンパク質は、ウイルス複製を可能にするための細胞機能を再誘導するに際してＥ１Ａを補助する。核内に実質的に局在する複合体を形成する、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤおよびＥ４ ３３ｋＤタンパク質は、宿主タンパク質の合成の阻害およびウイルス遺伝子の発現の促進の機能を果たす。それらの主な影響は、後期の感染の開始と同時の、核から細胞質へのウイルスｍＲＮＡの選択的輸送を確立することである。Ｅ１Ｂ ２１ｋＤタンパク質は、生産的感染サイクルの適正な時間的制御に重要であり、それにより、ウイルスライフサイクルが完結する前の宿主細胞の早期の死を妨げる。

アデノウイルスベースのベクターは、遺伝子産物ペプチドを高レベルで発現する。アデノウイルスベクターは、低い力価のウイルスを用いた場合でさえも、高効率の感染性を有する。さらに、ウイルスは、無細胞ビリオンとして十分に感染性であり、そのため、プロデューサー細胞株は必要でない。アデノウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでの異種遺伝子の長期発現を達成する。アデノウイルスは、重度のヒト病変を随伴せず、ウイルスは、様々な細胞を感染させることができ、広い宿主範囲を有し、またウイルスを比較的に容易に大量に作製することができ、ウイルスゲノムの初期領域１（「Ｅ１」）の欠損によってウイルスを複製不完全の状態にすることができる。したがって、少なくともＥ１領域が欠損し、目的の遺伝子により置換されている、ヒトアデノウイルスに由来するベクターは、前臨床および臨床フェーズにおける遺伝子治療実験に広範に用いられている。

本発明とともに使用するためのアデノウイルスベクターは、血清型２、５、１２、４０および４１のような、アデノウイルスの４０を超える血清型系統のいずれかを制限なく含む、様々なアデノウイルス血清型のいずれかに由来する。本明細書で用いたアデノウイルスベクターは、複製欠損であり、アデノ随伴ウイルスに関連して下文で述べるプロモーターのいずれかのような、適切なプロモーターの制御下の目的の遺伝子を含む。例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，０４８，５５１号は、抗炎症サイトカインＩＬ−１０のヒト遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスベクター、ならびにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下の抗炎症サイトカインＩＬ−Ｉｒａの遺伝子を含むベクター（それぞれＡｄ．ＲＳＶＩＬ−１０およびＡｄ．ＲＳＶＩＬ−Ｉｒａと呼ばれる）を記載している。

当業者は、アデノウイルス血清型のいずれかに由来し、異なるプロモーターシステムを有する他の組換えアデノウイルスを用いることもできる。例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第６，３０６，６５２号は、Ｅ２Ａ過剰発現による細胞死を予防するための、ｈｒ突然変異およびｔｓ４００と呼ばれるｔｓ１２５突然変異を含むＥ２Ａ配列を有するアデノウイルスベクター、ならびに誘導性プロモーターの制御下のｈｒ突然変異のみを含むＥ２Ａ配列を有するベクター、ならびに誘導性プロモーターの制御下のｈｒ突然変異およびｔｓ１２５突然変異（ｔｓ４００）を含むＥ２Ａ配列を有するベクターを記載している。

さらに、米国特許第６，３０６，６５２号に記載されている「最小」アデノウイルスベクターは、本発明とともに用いられるであろう。そのようなベクターは、ウイルス粒子内へのゲノムのキャプシド封入に必要であるウイルスゲノムの少なくとも一部（キャプシド封入シグナル（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ））、ならびにＩＴＲの少なくとも機能部分または誘導体の少なくとも１つのコピーを保持している。最小アデノウイルスベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルスとの、または別法として、米国特許第６，３０６，６５２号に記載されているパッケージング欠損複製ヘルパーシステムとの共感染により達成することができる。

目的の遺伝子の送達のための他の有用なアデノウイルスベースのベクターは、ウイルスゲノムの大部分が除去された「ガットレス」（ヘルパー依存性）アデノウイルス（Ｗｕら、Ａｎｅｓｔｈｅｓ．（２００１）９４：１１１９〜１１３２頁）を含む。そのような「ガットレス」アデノウイルスベクターは、ウイルスタンパク質を実質的に作らず、したがって、ウイルス駆動型遺伝子治療を単回投与後１年間にわたり成功裏に保証することを可能にし（Ｐａｒｋｓ Ｒ．Ｊ．、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００）５８：１〜１１頁；Ｔｓａｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２：５１５〜５２３頁）、免疫系による妨害を排除する。さらに、ウイルスゲノムの除去は、全身投与薬物による発現調節をもたらす制御配列の挿入のための場所を作りだし（Ｂｕｒｃｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：３５５〜３６０頁）、ウイルス駆動タンパク質発現の安全性および制御の両方を加味する。これらおよび他の組換えアデノウイルスは、本方法とともに用いられるであろう。

アデノ随伴ウイルス遺伝子送達システム
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を遺伝子治療のための遺伝子を送達するために用いて成功を収めた。ＡＡＶゲノムは、約４６８１ヌクレオチドを含む線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは、一般的に逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）が各末端に隣接した内部非反復ゲノムを含む。ＩＴＲｓは、長さが約１４５塩基対（ｂｐ）である。ＩＴＲｓは、ＤＮＡ複製の起点の具備、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルを含む、複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）およびキャプシド（ｃａｐ）遺伝子として公知の２つの大きい読取り枠を含む。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ウイルスを複製させ、ビリオン内にパッケージングするウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質のファミリーは、それらの見かけの分子量によって命名されたＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０というＡＡＶ ｒｅｐ領域から発現する。ＡＡＶ ｃａｐ領域は、少なくとも３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。

ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの内部非反復部分（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を欠失させ、ＩＴＲｓ間に異種遺伝子（この場合、Ｆｌｔ−１受容体または融合物をコードする遺伝子）を挿入することによって目的の遺伝子を送達するように遺伝子組換えした。異種遺伝子は、適切な条件下で患者の標的細胞における遺伝子発現を駆動することができる異種プロモーター（構成性、細胞特異的、または誘導性）に一般的に機能的に連結している。ポリアデニル化部位のような、終結シグナルも含めることができる。

ＡＡＶは、ヘルパー依存性ウイルスである。すなわち、ＡＡＶは、ＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染が存在しない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムが宿主細胞の染色体に挿入されるが、感染性ビリオンは生成しないという潜在状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染が、組み込まれたゲノムを「救出」し、それを複製させ、そのゲノムを感染性ＡＡＶビリオン内にパッケージングする。ＡＡＶは、異なる種の細胞を感染させることができるが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種のものでなければならない。したがって、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスにより共感染させたイヌ細胞中で複製する。

目的の遺伝子を含む組換えＡＡＶビリオンは、下文でより十分に述べる様々な当技術分野で承認されている技術を用いて生成することができる。野性型ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶビリオンを生成するための必要な複製機能を持たせるために用いることができる（例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと）。あるいは、周知のヘルパーウイルスの１つによる感染と組み合わせた、ヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドは、複製機能の源として用いることができる（例えば、その全体を参照によって両方を本明細書に組み入れる、米国特許第５，６２２，８５６号および米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと）。同様に、補助機能遺伝子を含むプラスミドは、必要な複製機能を持たせるために、野性型ＡＡＶによる感染と組み合わせて用いることができる。これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベクターと組み合わせて用いる場合、それぞれｒＡＡＶビリオンを生成するのに十分である。当技術分野で周知である、他のアプローチも、ｒＡＡＶビリオンを生成するために当業者により用いることができる。

本発明の一実施形態では、トリプルトランスフェクション法（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載されている）を用いてｒＡＡＶビリオンを生成する。その理由は、この方法が、検出可能なヘルパーウイルスの存在なしにｒＡＡＶビリオンが生成されることを可能とし、感染性ヘルパーウイルスの使用を必要としないからである。これは、ｒＡＡＶビリオンの生成のための次の３つのベクターの使用によって達成される：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクターおよびｒＡＡＶ発現ベクター。しかし、当業者は、これらのベクターによりコードされる核酸配列を様々な組合せで２つまたはそれ以上のベクター上に備えることができることを理解するであろう。

本明細書で説明したように、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製およびキャプシド封入のためにトランス（ｉｎ ｔｒａｎｓ）で機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能なｗｔ ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成せずに効率的なＡＡＶベクターの生成を補助し得る。そのようなベクターの例であるｐＨＬＰ１９は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，００１，６５０号に記載されている。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、上文で説明したように、公知のＡＡＶ血清型のいずれかから得ることができる。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２に由来するｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−６に由来するｃａｐ遺伝子を有し得る。当業者は、他のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の組合せが可能であり、決定的な特徴がｒＡＡＶビリオンの生成を補助する能力であることを認識するであろう。

補助機能ベクターは、非ＡＡＶ由来ウイルスのヌクレオチド配列および／またはＡＡＶが複製のために依存する細胞機能（すなわち、「補助機能」）をコードする。補助機能は、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶキャプシドアセンブリの活性化に関与するそれらの部分を、制限なしに含む、ＡＡＶ複製に必要な機能を含む。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純疱疹ウイルス以外）およびワクシニアウイルスのような周知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。複数の実施形態では、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５を用いる（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，００４，７９７号に記載されている）。このプラスミドは、ＡＡＶベクターの作製のためのアデノウイルス補助機能の完全なセットを備えているが、複製能力のあるアデノウイルスを形成するために必要な成分を欠いている。

ＡＡＶの理解を促進するために、組換えＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパーならびに補助機能に関するより詳細な考察を下文に記載する。

組換えＡＡＶ発現ベクター
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、少なくとも、転写開始領域、目的のポリヌクレオチドおよび転写終結領域を含む制御要素を転写の方向の作動可能に連結した構成要素として得るための公知の技術を用いて構築する。制御要素は、哺乳類細胞中のような、目的の細胞中で機能し得るように選択する。作動可能に連結した構成要素を含む得られる構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合している（５’および３’）。

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、公知である。ＡＡＶ−２配列については、例えば、Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１頁；Ｂｅｒｎｓ Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。本発明のベクターに用いるＡＡＶ ＩＴＲｓは、野性型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変することができる。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲｓは、制限なく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２および同類のものを含む、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されるヌクレオチド配列の両端に隣接する５’および３’ＩＴＲｓは、それらが意図したように機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の除去および救出を可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組込みを可能にする限り、必ずしも同一または同じＡＡＶ血清型に由来するまたは単離される必要はない。

ＡＡＶベクター用の適切なポリヌクレオチド分子は、サイズが約５キロ塩基（ｋｂ）未満である。選択されるポリヌクレオチド配列は、対象におけるｉｎ ｖｉｖｏでのその転写または発現を導く制御要素に作動可能に連結している。そのような制御要素は、選択される遺伝子と通常結合した制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列は、一般的に哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例は、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどを含むが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子のような、非ウイルス遺伝子に由来する配列も本明細書で用いられるであろう。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。

ＡＡＶ ＩＴＲｓにより結合されている目的のポリヌクレオチド分子を含むＡＡＶ発現ベクターは、それから除去された主要ＡＡＶ読取り枠（「ＯＲＦｓ」）を有していたＡＡＶゲノムに選択される配列（複数可）を直接挿入することによって構築することができる。複製およびパッケージング機能を可能にするのに十分な、ＩＴＲｓの部分が残存している限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失させることができる。そのような構築物は、当技術分野で周知の手法を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および国際公開第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８〜３９９６頁；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９頁；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１頁；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９頁；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７〜１８７５頁を参照のこと。

あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲｓは、ウイルスゲノムから、またはそれならびに他のベクターに存在する選択される核酸構築物の融合５’および３’を含むＡＡＶベクターから、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されているような、標準的なライゲーション技術を用いて除去することができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０℃の４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション用）または１４℃の１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション用）中で遂行することができる。分子間「付着末端」のライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌ総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭ総最終濃度）で行われる。ＩＴＲｓを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載された。特に、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６のもとにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手できるいくつかのＡＡＶベクターがそこに記載されている。

本発明の目的のために、ＡＡＶ発現ベクターからｒＡＡＶビリオンを生成するのに適する宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして用いることができ、または用いられており、例えば、懸濁培養、バイオリアクターもしくは同類のものにおいて増殖することができる微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞などである。この用語は、トランスフェクトされた最初の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」は、本明細書で用いているように一般的に外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を意味する。安定ヒト細胞株２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３のもとにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを介して容易に入手できる）からの細胞を本発明の実施に用いることができる。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片により形質転換され（Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁）、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９４：４６０頁）ヒト胚腎臓細胞株である。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成するためのとりわけ好都合のプラットフォームとなる。

ＡＡＶヘルパー機能
上述のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、のＡＡＶ ＩＴＲｓが両端に隣接したヌクレオチド配列を複製およびキャプシド封入してｒＡＡＶビリオンを生成するために、ＡＡＶヘルパー機能を果たすことができるようにしなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般的に、ＡＡＶ遺伝子産物を得るために発現させることができるＡＡＶ由来のコード配列であって、このＡＡＶ遺伝子産物は次に、生産的ＡＡＶ複製のためにトランスで機能する、コード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから欠落している必要なＡＡＶ機能を補完するためにここで用いる。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶ ＯＲＦｓすなわち、ｒｅｐおよびｃａｐコード領域、またはその機能的相同体の１つもしくは両方を含む。

「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当技術分野で認識されている領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターによる転写の調節を含む、多くの機能を有することが示された。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムの複製のために集合的に必要である。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９頁；およびＫｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３〜８０１頁を参照のこと。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切な相同体は、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することも公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：３０４〜３１１頁）などである。

「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３またはそれらの機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの当技術分野で認識されている領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要であるパッケージング機能を提供する。ＡＡＶ ｃａｐコード領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．およびＫｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．（前出）を参照のこと。

ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前またはそれと同時に宿主細胞をＡＡＶヘルパー構築物をトランスフェクトすることによって宿主細胞に導入する。したがってＡＡＶヘルパー構築物は、生産的ＡＡＶ感染のために必要である欠落したＡＡＶ機能を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一時的な発現をもたらすために用いる。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲｓを欠いており、それら自体を複製することもパッケージングすることもできない。

これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする一般的に用いられているプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５のような、多くのＡＡＶヘルパー構築物が記載された。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８頁；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５頁を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多くの他のベクターが記載された。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。

ＡＡＶ補助機能
宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、ｒＡＶＶビリオンを生成するために非ＡＡＶ由来機能または「補助機能」も果たすことができるようにしなければならない。補助機能は、ＡＡＶがその複製のために依存する非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能である。したがって、補助機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶキャプシドアセンブリに関与するものを含む、ＡＡＶ複製に必要である少なくともそれらの非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡを含む。ウイルスベースの補助機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかから得ることができる。

特に、補助機能は、当業者に公知の方法を用いて宿主細胞に導入し、次に発現させることができる。一般的に、補助機能は、非関連ヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によってもたらされる。アデノウイルス；１および２型単純疱疹ウイルスのようなヘルペスウイルス；ならびにワクシニアウイルスを含む、多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。様々な公知の薬剤のいずれかを用いた細胞同期化によってもたらされるもののような、非ウイルス補助機能も本明細書で用いられるであろう。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１〜２４７頁；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１４７：２１７〜２２２頁；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２：１１０〜１１７頁を参照のこと。

あるいは、補助機能は、上で定義した補助機能ベクターを用いて実現することができる。例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，００４，７９７号および国際公開第０１／８３７９７号を参照のこと。補助機能を果たす核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムのような、天然源から得ることができ、あるいは当技術分野で公知の組換えまたは合成法を用いて構築することができる。上文で説明したように、補助ヘルパー機能にはアデノウイルス遺伝子の完全相補体は必要でないことが示された。特に、ＤＮＡ複製の能力のないアデノウイルス変異体および後期遺伝子合成は、ＡＡＶ複製に許容されることが示された。Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３頁；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７頁。同様に、Ｅ２ＢおよびＥ３領域内の変異体がＡＡＶ複製を持続させることが示され、Ｅ２ＢおよびＥ３領域は、補助機能を果たすことにおそらく関与していないことがわかる。Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５頁。しかし、Ｅ１領域が欠損した、または欠失Ｅ４領域を有するアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を持続させることができない。したがって、Ｅ１ＡおよびＥ４領域は、直接的または間接的に、ＡＡＶの複製に必要である可能性がある。Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８頁；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５頁；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５頁。他の特徴付けられたＡｄ変異体は、Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）、前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１）、前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２頁）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９頁；Ｓｔｒａｕｓｓら（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０頁；Ｍｙｅｒｓら（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５頁；Ｊａｙら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７頁；Ｍｙｅｒｓら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７頁）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、ｉｎ Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出）およびＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））などである。Ｅ１Ｂコード領域に突然変異を有するアデノウイルスによってもたらされる補助機能の試験で矛盾した結果が得られたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６〜２１０頁は、Ｅ１Ｂ５５ｋがＡＡＶビリオンの生成に必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要でないことを報告した。さらに、国際公開第９７／１７４５８号およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８〜９４５頁は、様々なＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載している。補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、および完全なＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。そのようなベクターは、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。

ヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染、または補助機能ベクターによる宿主細胞のトランスフェクションの結果として、ＡＡＶヘルパー構築物を転写活性化する補助機能が発現して、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を生成する。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）を除去する。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムを複製する役割も果たす。発現Ｃａｐタンパク質は、キャプシドにアセンブリし、組換えＡＡＶゲノムがキャプシド内にパッケージングされる。したがって、生産的ＡＡＶ複製が結果として起こり、ＤＮＡがｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされる。「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶ ＩＴＲｓが両端に隣接した目的の異種ヌクレオチド配列をキャプシド封入する、ＡＡＶタンパク質シェルを含む感染性の複製欠損ウイルスであると本明細書では定義する。

組換えＡＡＶ複製の後に、ｒＡＡＶビリオンは、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配および同類のものなどの様々な従来の精製方法を用いて宿主細胞から精製することができる。例えば、アニオン交換カラム、アフィニティーカラムおよび／またはカチオン交換カラム上の精製のような、複数のカラム精製工程を用いることができる。例えば、国際公開第９２／１２４５５号を参照のこと。さらに、補助機能を発現させるために感染を用いる場合、公知の方法を用いて、残存ヘルパーウイルスを不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは、約６０℃の温度に例えば、２０分間またはそれ以上加熱することにより不活性化することができる。ヘルパーアデノウイルスは熱に不安定であるが、ＡＡＶは極めて熱に安定であるので、この処理は、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活性化する。

目的のヌクレオチド配列を含む得られたｒＡＡＶビリオンは、次に下記の技術を用いた遺伝子送達に用いることができる。

ｒＡＡＶ粒子
いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲｓが両端に隣接した導入遺伝子を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子にキャプシド封入されている。ＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含んでいる。いくつかの実施形態では、核酸は、目的のタンパク質コード配列（複数可）（例えば、治療用導入遺伝子）、転写の方向の作動可能に連結した構成要素、転写開始および終結配列を含む制御配列を含み、それにより発現カセットを形成する。発現カセットは、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列が５’および３’末端に隣接している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングを目的として機能することを意味する。いずれもその全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）：３４２８〜３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４〜４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０〜１６頁を参照のこと。本発明のいくつかの態様を実施するために、組換えベクターは、キャプシド封入およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造に必須のＡＡＶの配列の少なくともすべてを含む。本発明のベクターに用いるＡＡＶ ＩＴＲｓは、野性型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３〜８０１頁に記載される）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により改変することができ、あるいはＡＡＶ ＩＴＲｓは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来するものであってもよい。ＡＡＶの４０を超える血清型が現在公知であり、新たな血清型および既存の血清型の変異型が同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４〜６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１〜６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９〜８１０頁を参照のこと。ＡＡＶ血清型の使用は、本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、制限なく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または同類のものを含む、ＡＡＶ血清型に由来するベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶにおける核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または同類のもののＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または同類のもののキャプシドタンパク質を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｃｌａｄｅｓ Ａ−ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１頁）。

特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、罹患組織）内の特定の細胞型を標的とするために、異なるＡＡＶ血清型を用いる。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含み得る。各組合せを本明細書で明確に述べたかのように、ｒＡＡＶ粒子の生成のためのＡＡＶ血清型の任意の組合せを本明細書に記載する。

自己相補的ＡＡＶウイルスゲノム
いくつかの態様では、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用の方法は、それぞれその全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；第７，７６５，５８３号；第７，７８５，８８８号；第７，７９０，１５４号；第７，８４６，７２９号；第８，０９３，０５４号；および第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１頁に記載されている。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的相補性配列（例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖）により二本鎖ＤＮＡ分子を速やかに形成する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。ここで、ｒＡＡＶゲノムは、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子コード鎖）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子の非コードまたはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列は、大部分またはすべてのその長さに沿って第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態では、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対合を促進する配列、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造により連結されている。ヘアピン構造は、当技術分野で、例えば、ｓｉＲＮＡ分子において公知である。いくつかの実施形態では、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）により連結されている。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムを複製するに際して、ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを突然変異ＩＴＲにおいて切断せず、そのため、次のものを５’→３’の順序で含む組換えウイルスゲノムは、ウイルスキャプシド内にパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

ｒＡＡＶベクターの生成
トランスフェクション、安定細胞株の作製、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッドおよびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス作製システムを含む、ｒＡＡＶベクターの生成のための多くの方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の生成のためのｒＡＡＶ生成培養はすべて、１）例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９もしくは２９３細胞のようなヒト由来細胞株、またはバキュロウイルス生成システムの場合、ＳＦ−９のような昆虫由来細胞株を含む、適切な宿主細胞；２）野性型もしくは変異型アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスのような）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスまたはヘルパー機能を有するプラスミド構築物によってもたらされる、適切なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列が両端に隣接した導入遺伝子（治療用導入遺伝子のような）；ならびに５）ｒＡＡＶの生成を補助するための適切な培地および培地成分を必要とする。当技術分野で公知の
適切な培地をｒＡＡＶベクターの生成に用いることができる。これらの培地は、制限なく、修飾イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨにより製造された培地、とりわけ組換えＡＡＶベクターの生成用の特別注文培地製剤に関して、それぞれその全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているような特別注文製剤、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているようＳｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含む。

本発明の適切なｒＡＡＶ生成培地は、０．５％〜２０％（容積／容積または重量／容積）のレベルの血清または血清由来組換えタンパク質を添加してもよい。あるいは、当技術分野で公知のように、ｒＡＡＶベクターは、動物由来産物を含まない培地とも呼ぶことができる無血清条件で生成することができる。当業者は、ｒＡＡＶベクターの生成を補助するように設計された市販または特別注文培地に、生成培地中のｒＡＡＶの力価を増加させるために、制限なく、グルコース、ビタミン、アミノ酸および／または増殖因子を含む、当技術分野で公知の１つまたはそれ以上の細胞培養構成要素も添加することができることを十分に理解することができる。

ｒＡＡＶ生成培養は、利用する特定の宿主細胞に適する様々な条件（広い温度範囲にわたる、様々な時間にわたるなど）のもとで生育させることができる。当技術分野で公知のように、ｒＡＡＶ生成培養は、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリアおよび充填床または流動床バイオリアクターのような適切な付着依存性容器中で培養することができる付着依存性培養を含む。ｒＡＡＶベクター生成培養は、例えば、スピナーフラスコ、撹拌槽型バイオリアクターおよびＷａｖｅバッグシステムのようなディスポーザブルシステムを含む様々な方法で培養することができるＨｅＬａ、２９３およびＳＦ−９細胞のような、懸濁液に適合させた宿主細胞も含み得る。

本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、生成培養の宿主細胞の溶解により、または米国特許第６，５６６，１１８号により十分に記載されているように、無傷細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子の放出をもたらす当技術分野で公知の条件下で細胞が培養されるならば、生成培養からの使用済み培地の収集により、ｒＡＡＶ生成培養から収集することができる。細胞を溶解する適切な方法も当技術分野で公知であり、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、微細流動化および界面活性剤および／またはプロテアーゼのような化学物質による処理を含む。

ｒＡＡＶベクターの精製
収集時に、本発明のｒＡＡＶ生成培養は、以下の１つまたはそれ以上のものを含み得る：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；および（７）例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリンおよび他の低分子量タンパク質を含む培地構成要素。さらに、ｒＡＡＶ生成培養は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または同類のものからなる群から選択されるＡＡＶキャプシド血清型を有するｒＡＡＶ粒子をさらに含む。

したがって、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生成培養収集物を清澄化して、宿主細胞デブリを除去する。いくつかの実施形態では、生成培養収集物は、例えば、グレードＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ^＋ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒ、グレードＡ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ^＋ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒ、および０．２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅフィルターを含む一連の深層フィルターによるろ過により清澄化する。清澄化は、遠心分離または０．２μｍもしくは当技術分野で公知のより大きい孔径の酢酸セルロースフィルターによるろ過のような当技術分野で公知の様々な他の標準的技術によっても達成することができる。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生成培養収集物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）によりさらに処理して、生成培養中に存在する高分子量ＤＮＡを消化する。いくつかの実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、３０分から数時間までの期間にわたる室温から３７℃までの範囲の温度におけるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）の１〜２．５単位／ｍｌの最終濃度を含む当技術分野で公知の標準的条件下で実施する。

ｒＡＡＶ粒子は、以下の１つまたはそれ以上の精製工程を用いて単離または精製することができる：遠心分離、流通式アニオン交換ろ過、ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流ろ過（ＴＦＦ）、アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、ヘルパーウイルスの熱不活性化、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換、ナノろ過、およびアニオン交換クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらの工程は、単独で、様々な組合せで、または異なる順序で用いることができる。いくつかの実施形態では、本方法は、下記の順序のすべての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、米国特許第６，９８９，２６４号および第８，１３７，９４８号ならびに国際公開第２０１０／１４８１４３号に見いだされる。

組成物および送達
ｓＦｌｔ−１受容体、または上述の融合物のような、前述のものをコードするベクター（もしくはビリオン）が得られたら、黄斑変性を処置するために眼への直接送達に適する組成物に製剤化する。遺伝子治療が望まれる場合、組成物は、目的のＦｌｔ−１の治療上有効量、例えば、結合し、対応するシグナル経路の効果を媒介するのに、または問題の疾患状態の症状を低減もしくは改善するのに十分な量、あるいは所望の恩恵をもたらすのに十分な量をもたらすのに十分な遺伝物質を含む。適切な用量は、数ある因子の中でもとりわけ、処置を受ける対象の状態、年齢、処置を受ける状態の重症度、投与方法にも依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定することができる。

したがって、「治療上有効量」は、臨床試験により決定することができる比較的に広い範囲にある。例えば、ｒＡＡＶビリオンのｉｎ ｖｉｖｏ注射については、治療上有効な用量は、１０^８〜１０^１４ｖｇ、例えば、１０^８〜１０^１０ｖｇ、１０^８〜１０^９ｖｇのような１０^８〜１０^１２ｖｇまたは、．５ｘ１０^８ｖｇ．．．１ｘ１０^８ｖｇ．．．１．５ｘ１０^８ｖｇ．．．２ｘ１０^８ｖｇ．．．５ｘ１０^８ｖｇ．．．１ｘ１０^９ｖｇ．．．２ｘ１０^９ｖｇ．．．３ｘ１０^９ｖｇ．．．５ｘ１０^９ｖｇ．．．６ｘ１０^９ｖｇ．．．１ｘ１０^１０ｖｇ．．．２ｘ１０^１０ｖｇ．．．５ｘ１０^１０ｖｇ．．．１ｘ１０^１１ｖｇ．．．５ｘ１０^１１ｖｇ．．．１ｘ１０^１２ｖｇ．．．５ｘ１０^１２ｖｇ、等のような間の整数のような、約１０^６〜１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）の程度の組換えウイルスである。

複数の態様では、組成物は、眼科学的に許容される賦形剤も含む。組成物は、水剤、ゲル剤、軟膏剤、懸濁剤、使用前に媒体で復元する乾燥散剤として、または他の適切かつ耐容性良好な眼送達システムとして、製剤化することができる。そのような賦形剤は、過度の毒性を伴うことなく投与することができる、眼への直接送達に適する医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤は、ソルビトール、種々のＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、ならびに水、生理食塩水、グリセリンおよびエタノールのような液体を含むが、これらに限定されない。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩などの薬学的に許容される塩がそれに含まれていてよい。さらに、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質がそのような媒体中に存在していてもよい。薬学的に許容される賦形剤の十分な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で閲覧できる。

投与は、処置期間を通して１回、持続的または間欠的に行うことができる。最も有効な投与手段を決定する方法は、当業者に周知であり、ベクター、治療の組成物、標的細胞および処置を受ける対象によって異なる。単回および反復投与は、主治医によって選択された用量レベルおよびパターンを用いて行うことができる。

複数回投与する場合、投与する最初の製剤は、その後の製剤と同じまたは異なっていてよい。したがって、例えば、初回投与は、ＡＡＶビリオンの形であってよく、２回目投与は、アデノウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、ＡＡＶビリオン、サブユニットワクチン組成物などの形であってよい。さらに、その後の送達も、２回目の送達の形態と同じまたは異なっていてよい。

複数の導入遺伝子を送達済み組換えベクターによって発現させることができることを理解すべきである。あるいは、それぞれが１つまたはそれ以上の異なる導入遺伝子を発現する、別個のベクターを本明細書で述べるように対象に送達することもできる。したがって、複数の導入遺伝子は、同時または逐次的に送達することができる。さらに、本発明の方法により送達されるベクターを他の適切な組成物および治療と組み合わせることも意図される。例えば、黄斑変性を処置するための他の化合物が存在し得る。

上で説明したように、眼へのｓＦｌｔ−１受容体構築物の送達のために（遺伝子治療によるかまたはタンパク質治療によるかを問わず）、投与は、一般的に局所的である。これは、投与する必要がある物質（タンパク質またはＤＮＡ）の量を制限し、全身性副作用を制限するという利点がある。遺伝子銃による角膜への局所投与；結膜下注射、眼房内注射、角膜への点眼剤による、側頭辺縁を経る前房内への注射、基質内注射、電気パルスと組み合わせた角膜適用、角膜内注射、網膜下注射、硝子体内注射（例えば、前部、中部または後部硝子体注射）および眼内注射を含むが、これらに限定されない、多くの可能な送達方法を用いることができる。あるいは、細胞にｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトまたは形質導入し、眼内移植により送達することができる。Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００２）６：４９０〜４９４頁；Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（１９９６）２：６４９〜６５４頁、１９９６；Ｂｏｒｒａｓ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）７６：６４３〜６５２頁；Ｃｈａｕｍ、Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）４７：４４９〜４６９頁；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２）２：５３７〜５４４頁；Ｌａｉ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）９：８０４〜８１３頁；Ｐｌｅｙｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）２２：２７７〜２９３頁を参照のこと。

したがって、眼科用製剤は、眼薬物投与に適するいずれかの形態で、例えば、局所投与に適する剤形、点眼剤、洗眼剤としての投与のための水剤もしくは懸濁剤、または注射剤、軟膏剤、ゲル剤、リソソーム分散系、コロイド微粒子懸濁剤、もしくは同類のもの、または眼内挿入物、例えば、場合による生分解性制御放出ポリマーマトリックスで投与する。眼内挿入物は、結膜、胸膜、扁平歩、眼の前部または後部に埋植する。インプラントは、眼表面への製剤の制御放出、一般的に長期にわたる持続放出を可能にする。さらに、複数の実施形態では、製剤は、天然に存在し、かつ／または米国食品医薬品局によりＧＲＡＳ（「一般的に安全とみなされる」）構成要素により完全に構成されている。

タンパク質および核酸処置の組合せを用いることができる。例えば、本発明の融合タンパク質を患者に投与することができる。好ましい反応が認められた場合、融合タンパク質をコードする核酸分子を長期効果を得るために投与することができる。あるいは、タンパク質および核酸を同時またはほぼ同時に投与することができる。

投与による処置は、単回投与計画または反復投与計画であり得る。さらに、対象に適宜多数回投与することができる。当業者は、適切な投与回数を容易に決定することができる。

複数の態様において、本明細書で述べた組成物は、本明細書で述べた方法のいずれでも用いられる。

本発明のキット
本発明は、キットも提供する。特定の実施形態では、本発明のキットは、精製ｓＦｌｔ−１受容体、それを含む融合物、それをコードする組換えベクター、またはそれをコードするＡＡＶビリオン／ｒＡＡＶベクターを含む１つまたはそれ上の容器を含む。複数の実施形態では、キットは、眼科学的に許容される賦形剤を含む。キットは、眼への送達に適する送達装置も含み得る。キットは、本明細書で述べた方法のいずれかのためのキットの使用および内容物に関する、適切な一連の使用説明、一般的に使用説明書をさらに含み得る。

キットは、好都合には、適切なパッケージ中に構成要素を含んでいてよい。例えば、核酸、タンパク質、ベクターまたはビリオンを乾燥製剤（例えば、凍結乾燥または乾燥粉末）として供給する場合、弾性栓を通して液体を注入することによってベクターを再懸濁することができるように、弾性栓付きのバイアルを用いることができる。非弾性の除去可能な密閉部（例えば、封止ガラス）または弾性栓を備えたアンプルは、液体製剤に用いることができる。特定の装置（例えば、注射器）と組み合わせて用いるパッケージも考えられる。

使用説明書は、一般的に、意図する使用の方法に対応する投与量、投与計画および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量パッケージ（例えば、多回投与パッケージ）または副単位用量であってもよい。本発明のキットに供給される使用説明書は、一般的にラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）における使用説明書であるが、機械可読の使用説明書（磁気または光学記憶ディスク上に記録された使用説明書）も考えられる。

２． 実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。例は、例示の目的のみのために示すものであって、本発明の範囲を制限するものではない。

用いた数値（例えば、量、温度等）に関する正確さを保証するための努力がなされたが、多少の実験誤差および偏差は、もちろん許容すべきである。

材料および方法
可溶性ベクターの構築
図１（配列番号１０）および２Ａ〜２Ｂ（配列番号１１）に、「ｓＦＬＴ０１」と呼ぶ融合タンパク質のＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。この構築物は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、図２Ａ〜２Ｂの１〜２３位に見いだされるシグナル配列；図２Ａ〜２Ｂの２４〜１１８位に見いだされる、Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２およびこのドメインの延長部分；図２Ａ〜２Ｂの１１９〜１２７位に見いだされる、９グリシンの配列；および図２Ａ〜２Ｂの１２８〜３５８位のＩｇＧ１−Ｆｃ ＣＨ２／ＣＨ３残基を含む。

ＤＮＡは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ）を含む、プラスミドｐＣＢＡ（２）−ｉｎｔ−ＢＧＨにクローニングした。Ｘｕら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．（２００１）１２：５６３〜５７３頁。

次に全ｓＦＬＴ０１発現カセットを、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）を含むプレウイルスプラスミドベクターｐＡＡＶＳＰ７０にクローニングした。Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）９：２３１〜２４０頁。ＩＴＲｓが両端に隣接した領域を含むプラスミドｓｐ７０．ＢＲ／ｓＦＬＴ０１における得られたＡＡＶゲノムの総サイズは、４．６ｋｂであった。

組換えベクターＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１は、ヘルパープラスミドｐ５ｒｅｐ−Δ−ＣＭＶｃａｐおよびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた２９３細胞のトリプルトランスフェクションにより作製し、ÅＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でイオジキサノール段階勾配およびＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いたプロトコールに従って精製した。Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：１８９７〜１９０５頁；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２８：１５８〜１６７頁。

ウイルス力価は、ＢＧＨポリＡ配列に対して特異的であったプライマーを用いた実時間ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

硝子体内注射
実施例１のために、２．１〜２．８ｋｇの雌カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をケタミンおよびジアゼパムにより沈静させた。投与前に、眼をポビドンヨード局所消毒剤で消毒し、滅菌済み生理食塩水ですすいだ。散瞳薬（１％トロピカミド）および局所麻酔薬（プロパラカイン）を各注射眼に点眼した。開瞼器を挿入し、処置中に眼瞼が開いた状態を維持し、眼球を後退させた。投与注射器の２７ゲージ針を強膜および輪部の約４ｍｍ後方の扁平部に挿入した。針を水晶体の後方の次の３つの位置のうちの１つに導いた：周辺網膜に隣接した前部硝子体、中部硝子体または黄斑に隣接する後部硝子体。ＡＡＶベクターは、５０μｌまたは１００μｌの総容積で注射した。

脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘導
被験物質の投与後導入遺伝子が最大発現に到達するのに十分な時間をおいて、ＣＮＶを霊長類において誘導した。５３２ｎｍの波長を有するダイオードレーザー（Ｉｒｉｄｅｘ
Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）および細隙灯アダプターを用いブルッフ膜を破裂させて、ＣＮＶを誘導した。１００〜２００ミリ秒にわたり５００〜７００ｍＷで７５μｍのスポットサイズで作動した同じタイプのレーザーを用いて３ｘ３グリッドパターンで黄斑領域に９カ所の熱傷を配置した。

ＣＮＶの評価
サルにおけるＣＮＶ病変からの漏出は、レーザー誘導の後の２、３および４週目にフルオレセイン血管造影により評価した。沈静動物にフルオレセイン色素（１０％フルオレセインナトリウム、約０．１ｍＬ／ｋｇ）を注射し、色素の注射後の数時点に眼底を撮像して、動脈および静脈相をモニターした。眼底鏡画像を収集し、各熱傷部位の漏洩ＣＮＶの存在について解析した。

非ヒト霊長類におけるＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の効能
硝子体内に投与したＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の効能を判定するために非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における２つの試験を実施した。第１の試験（試験Ａ）において、カニクイザルに２×１０^８または２×１０^９ｖｇのＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１で硝子体内処置した。対側対照眼には、導入遺伝子をコードしていなかった同じ用量のＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２−Ｎｕｌｌ）で処置した。レーザーＣＮＶ誘導は、ベクター投与後の６週目に行った。ＣＮＶの程度は、３週目のフルオレセイン血管造影時に最大であることがわかった。したがって、これを、処置の効能を評価するために用いる時点とした。漏洩病変の数をＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１処置した眼と対側対照眼とで比較した（表１）。ｓＦＬＴ０１処置群のいずれも、ＡＡＶ２−Ｎｕｌｌ対照眼と比較して漏洩ＣＮＶ病変の統計的に有意な減少を示さなかった。

第２の試験（試験Ｂ）では、２×１０^１０ｖｇのＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１またはＡＡＶ２−Ｎｕｌｌを硝子体内に送達したが、対側眼は、処置を受けないままとした。両眼におけるレーザーＣＮＶ誘導をベクターの投与後２２週目に行った。ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１処置した眼の６つすべてが無処置の対側対照眼と比較してＣＮＶ漏洩の量の有意な減少を示し、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１処置した熱傷の７％のみが漏洩ＣＮＶを示したが、対照眼における熱傷の５６％が漏洩していた。この差は、フィッシャーの直接確率検定により判定すると統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。ＡＡＶ２−Ｎｕｌｌ対照ベクターを処置した眼は、無処置対照眼と比較してＣＮＶの減少を示さなかった。

要約すると、ＶＥＧＦに対する可溶性受容体をコードするＡＡＶ２遺伝子治療ベクターの硝子体内投与は、非ヒト霊長類眼における導入遺伝子産物の用量依存的発現による網膜細胞の形質導入をもたらした。発現は、初期投与後３週目と早期に測定したが、測定した最終時点（２３週）まで比較的に安定であることがわかった。

ｓＦＬＴ０１発現レベルが房水中１００ｎｇ／ｍＬ超であった８匹の動物のうちの７匹のＮＨＰモデルで効能が認められたことから、このモデルにおける血管新生の変化をもたらすために達成されなければならないｓＦＬＴ０１の閾値が存在する可能性があることが示唆される。ベクター投与後２２週目にレーザー処理した２×１０^１０ｖｇ投与動物の６匹すべてが対照眼と比較してＣＮＶの減少を示した。

ヒトにおけるＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の効能
ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の単回硝子体内注射の安全性、耐容性および効能を評価するためにヒトにおける用量漸増試験を実施した。ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１は、上述のように作製した。本試験に用いた患者は、末期新生血管ＡＭＤ患者であった。試験に適格とするための基準は、以下の通りであった：
・ 患者の病歴およびＣＮＶの確認済み診断により確認された、ＡＭＤに二次的な脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶ）。
・ 試験眼における２０／１００またはより悪化した距離最高矯正視力（ＢＣＶＡ）。
・ 他眼は、２０／４００またはより良好な距離ＢＣＶＡを有さなければならない。
・ 試験眼、すなわち、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の投与を受けた眼は、最悪ＣＶＡを有していた（他眼と比較して）。
・ 試験の用量漸増部分における試験眼の中心窩下円板状瘢痕化。患者は、試験の第２の部分（最大耐用量（ＭＴＤ）相）における試験眼に黄斑瘢痕化を有していても有していなくてもよい。さらに、試験の第２の部分に登録された患者は、スクリーニングの前および抗ＶＥＧＦ治療による患者の最近の処置後の１２カ月以内の抗ＶＥＧＦ治療に対する反応性を示していなければならない。
・ 網膜内または網膜下液の存在が確認された。
・ 十分な眼の吟味および検査を可能にするのに十分な瞳孔の散大。

除外基準は、以下の通りであった：
・ ＡＭＤ以外の原因による試験眼におけるＣＮＶ。
・ 視力を変化させ得る、または試験における検査に支障を来し得るスクリーニング中の試験眼における状態の既往歴。
・ 制御されていない活動性の緑内障。
・ 登録の３カ月以内に試験眼の眼内手術を受けた、または処置の１年以内において試験眼の眼内手術（白内障手術を含む）の既知もしくは有力候補である。
・ 試験眼における急性または慢性感染。
・ 試験眼における炎症の既往歴またはいずれかの眼における持続性炎症。
・ 硝子体内注射に対する禁忌。
・ ６０日以内に試験眼における光線力学的治療、またはスクリーニングの前の１４日以内にレーザー光凝固を受けた。
・ スクリーニングの前の１カ月以内にラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））もしくはペガプタニブナトリウム（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））を現在使用しているまたは使用した。
・ スクリーニングの前の４カ月以内にアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））を現在使用しているまたは使用した。
・ スクリーニングの前の３カ月以内に眼周囲（試験眼）、硝子体内（試験眼）または全身（経口もしくは静脈内）ステロイドを現在使用している。
・ 眼内または顔面上の活動性ヘルペス感染、特に活動性病変。
・ 試験遵守および追跡を不可能にし得る制御不十分の重大な疾患。
・ 網膜または視神経に有毒であることが公知の薬物の現在または事前の使用。
・ 眼または全身遺伝子導入産物による事前の処置。
・ スクリーニングの前の１２０日以内に治験薬の投与を受けた。

試験の第１の部分では、患者の４つの別個の群に１００μＬの一定容量の異なる用量のＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１を以下のように投与した。（１）群１は、２×１０^８ｖｇの一眼への単回硝子体内注射を受け、（２）群２は、２×１０^９ｖｇの一眼への単回硝子体内注射を受け、（３）群３は、６×１０^９ｖｇの一眼への単回硝子体内注射を受け、（４）群４は、２×１０^１０ｖｇの一眼への単回硝子体内注射を受けた。

これらの用量は、安全で、耐容性が良好であると判断された。特に、用量制限毒性（ＤＬＴ）は認められず、ＭＴＤに達しなかった。

ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１の効能を判断するために、網膜下および網膜内液の量のベースラインからの変化を光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定した。さらに、ＢＣＶＡは、前房穿刺により房水中のｓＦＬＴ０１タンパク質レベルとして測定した。

驚くべきことに、２×１０^８ｖｇの単回硝子体内注射を受けた患者は、ＯＣＴにより測定すると網膜下および網膜内液の有意な減少を示した。図１５Ａおよび１５Ｂを参照のこと。

試験の第２の部分では、最初の試験で用いた最高用量（２×１０^１０ｖｇ）の単回硝子体内注射を異なる患者に行った。この用量も、注射後２カ月後にＯＣＴにより測定すると網膜下および網膜内液の有意な減少をもたらした。図１６Ａおよび１６Ｂを参照のこと。

表２に予測されたレスポンダーおよびノンレスポンダーの数を示す。予測されたレスポンダーは、それらのベースライン特徴に基づいて、抗ＶＥＧＦ処置に対する反応を示すと予測された患者として特徴付けた。予測されたレスポンダーは、次に以下のように特徴付けた。完全レスポンダー：頑健な反応、乾性網膜、および追加の処置を必要としない正常な網膜生体構造への回復を示した患者。部分レスポンダー：体液の多少の減少を示した患者。ノンレスポンダー：効果が認められず。

表２に示すように、１１例の予測されたレスポンダーのうちの６例は、処置に対する少なくとも部分的反応を示した。

このように、黄斑変性を処置する方法、ならびにｓＦｌｔ−１受容体およびその融合物を含む組成物を記載してある。対象発明の実施形態をある程度詳細に記載したが、本明細書で規定した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変形形態を実施することができることが理解される。

Claims (20)

1. ＶＥＧＦ活性を調節することができるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）の少なくとも１つのドメインを含む可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む医薬組成物であって、最大約２×１０ ⁸ のｒＡＡＶビリオンを対象の眼に送達することによりヒト対象における黄斑変性または黄斑浮腫を処置するために使用するための、前記医薬組成物。
2. 眼圧、網膜厚、網膜下液、または網膜内液が減少する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 約１×１０⁷、約２×１０⁷、約６×１０⁷、約１×１０⁸、または約２×１０⁸ｒＡＡＶビリオンが眼に送達される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 医薬組成物は、眼科学的に許容される媒体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. ｒＡＡＶビリオンの単回硝子体内注射が眼に送達される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 可溶性タンパク質は （ａ）Ｆｌｔ−１の少なくとも１つのドメイン； （ｂ）免疫グロブリン重鎖に由来する多量体化ドメイン； および （ｃ）（ａ）を（ｂ）に連結する長さが５〜２５アミノ酸残基のリンカー を含み、該可溶性タンパク質が発現される場合、該可溶性タンパク質の多量体が生成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 少なくとも１つのドメインはＦｌｔ−１のドメイン２を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 多量体はホモ二量体である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
9. 多量体化ドメインは、ＩｇＧのＦｃ領域またはその活性断片を含む、請求項６〜８のい
   ずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 多量体化ドメインは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインまたはその活性断片を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 多量体化ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 多量体化ドメインは、ＩｇＧ１重鎖の定常領域に由来する、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. リンカーは： ｇｌｙ₉（配列番号１）； ｇｌｕ₉（配列番号２）； ｓｅｒ₉（配列番号３）； ｇｌｙ₅ｃｙｓｐｒｏ₂ｃｙｓ（配列番号４）； （ｇｌｙ₄ｓｅｒ）₃（配列番号５）； ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号６）； ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号７）； ＧｌｙＡｓｐＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｒｇＡｓｎＧｌｎＬｙｓ（配列番号８）および Ｇｌｙ₉ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号９） からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 可溶性タンパク質は式Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘは、Ｆｌｔ−１のＩｇＧ様ドメイン２を含み、Ｙは、Ｇｌｙ₉であり、Ｚは、ＩｇＧ Ｆｃ領域またはＩｇＧ ＣＨ３領域である、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 多量体化ドメインはヒト化されている、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 可溶性タンパク質は、（ａ）図２Ａ〜２Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１１）；（ｂ）図６に示すアミノ酸配列（配列番号１５）；（ｃ）図８に示すアミノ酸配列（配列番号１７）；（ｄ）図１２に示すアミノ酸配列（配列番号２１）；および（ｅ）それと少なくとも９０％の配列同一性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の活性型変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 黄斑変性は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 黄斑変性は滲出型ＡＭＤである、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. ｒＡＡＶビリオンはＡＡＶ２に由来する、請求項１９に記載の医薬組成物。