CN101951925A - 血管发生抑制 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含功能性多肽、接头和IgG重链分子的融合蛋白质，以及编码此类蛋白质的载体，用于抑制具有与新血管形成相关的病理病症的个体中的血管发生。具体而言，本发明提供编码融合VEGF拮抗剂的载体来治疗哺乳动物眼部疾病，所述VEGF拮抗剂包含融合至IgG重链分子的VEGF受体。

Description

血管发生抑制

技术领域

本发明涉及用于抑制血管发生或治疗病理性新血管形成如哮喘、关节炎、癌症和黄斑变性的组合物和方法。

背景技术

病理性新血管形成是如湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病增殖性视网膜病变、类风湿性关节炎、骨关节炎和哮喘的疾病的关键成分。其还在肿瘤的生长和扩散中起重要作用。新血管形成由促血管发生因子和抗血管发生因子的精巧平衡调节。

已知血管内皮生长因子(VEGF)是新血管形成必需的。已显示通过VEGF拮抗剂抑制或降低VEGF活性在AMD，关节炎动物模型和多种肿瘤模型中抑制新血管形成。抑制或降低VEGF活性的VEGF拮抗剂包含但不限于VEGF抗体、可溶性受体、受体融合蛋白质、肽和小分子。

已显示VEGF-R1(Flt-1)和VEGF-R2(KDR)蛋白质以高亲和力结合VEGF。Flt-1和KDR在其胞外区都具有7个Ig-样结构域。已显示结构域2是VEGF结合必需的。全长、可溶性受体(结构域1-7)和结构域1-3各自与IgG Fc的融合蛋白可有效地结合VEGF。然而，Fc与Ig-样结构域2单独融合不能结合VEGF，Ig-样结构域1和2也如此。Davis-Smyth，1996。因此，Ig-样结构域1和3似乎需要与结构域2一起进行有效的VEGF结合。

发明概述

本发明的一个实施方案提供融合蛋白质。该融合蛋白质具有式X-Y-Z。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由5-25个氨基酸残基的多肽组成。Z是IgG重链分子的CH3区。

本发明的另一个实施方案是式X-Y-Z的多肽。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由提供5-25个氨基酸残基的空间间隔(seperation)的接头部分组成。Z是IgG重链分子的CH3区。

本发明的另一个方面是式X-Y-Z的融合蛋白质。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由5-25个氨基酸残基的多肽组成。Z是抗体分子的Fc部分。

还提供式X-Y-Z的融合蛋白质。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由提供5-25个氨基酸残基的空间间隔的接头部分组成。Z是抗体分子的Fc部分。

本发明的另一个方面是多聚化多肽X的方法。通过多肽Y将多肽X连接至多肽Z形成多肽XYZ。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由5-25个氨基酸残基的多肽组成。Z是IgG重链分子的CH3区。形成的多肽XYZ多聚化。

本发明的另一个实施方案提供多聚化多肽X的方法。通过Y部分将多肽X连接至多肽Z形成聚合物XYZ。X包含选自胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本上由提供5-25个氨基酸残基的空间间隔的接头部分组成。Z是IgG重链分子的CH3区。这样形成的多肽XYZ多聚化。

在本发明的一个实施方案中提供核酸分子。该核酸分子编码包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig-样结构域2、接头和多聚化结构域的融合蛋白质。该融合蛋白质包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23和25的序列。

在本发明的另一个实施方案中提供融合蛋白质。该融合蛋白质包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig-样结构域2、接头和多聚化结构域。该融合蛋白质包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23和25的序列。

在本发明的另一个实施方案中提供体外方法。将核酸分子递送至分离的哺乳动物细胞。该核酸分子编码包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig-样结构域2、接头和多聚化结构域的融合蛋白质。该融合蛋白质包含选自SEQ IDNO：2、8、21、23和25的序列。该融合蛋白质的表达由启动子控制。形成表达融合蛋白质的细胞。

本发明的另一个实施方案是递送融合蛋白质至哺乳动物的方法。将表达该融合蛋白质的哺乳动物细胞递送至哺乳动物。细胞表达和分泌该融合蛋白质，从而向哺乳动物供给该融合蛋白质。该融合蛋白质包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig-样结构域2、接头和多聚化结构域。该融合蛋白质包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23和25的序列。

本发明的另一个方面是向哺乳动物供给融合蛋白质的方法。将包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig-样结构域2、接头和多聚化结构域的融合蛋白质递送至哺乳动物。该融合蛋白质包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23和25的序列。备选地，可以将编码所述融合蛋白质的核酸构建体递送至哺乳动物，从而由该哺乳动物表达该融合蛋白质。

本发明的另一个方面是用VEGF拮抗剂治疗哺乳动物眼部疾病的改进方法，所述拮抗剂包含但不限于本发明的融合蛋白质。该改进包含提供对治疗眼部疾病有效的VEGF拮抗剂的降低的量。可以通过蛋白质或基因治疗或其组合施用VEGF拮抗剂。降低的量可以在哺乳动物中保持至少6个月，例如至少9个月或至少1年。

在本发明的一些实施方案中，降低的量可以是约100pg/ml至约100μg/ml、1ng/ml至约95μg/ml、10ng/ml至约85μg/ml、100ng/ml至约75μg/ml、约100ng/ml至约50μg/ml、约1μg/ml至约25μg/ml、约1μg/ml至约15μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml或约1μg/ml至约4μg/ml。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括对哺乳动物施用编码VEGF拮抗剂的核酸。在一些实施方案中，按约100pg/ml至约100μg/ml、约1ng/ml至约95μg/ml、约10ng/ml至约85μg/ml、约100ng/ml至约75μg/ml、约100ng/ml至约50μg/ml、约1μg/ml至约25μg/ml、约1μg/ml至约15μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml或约1μg/ml至约4μg/ml的治疗有效量表达VEGF拮抗剂，以治疗眼部疾病。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括按每单位剂量约2x10⁶至约2x10¹²drp的治疗有效量对哺乳动物施用编码VEGF拮抗剂的病毒载体。

在一些实施方案中，治疗有效量是每单位剂量约2x10⁷至约2x10¹¹drp、约2x10⁸至约2x10¹⁰drp。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括按每单位剂量约0.1mg至约50mg(优选约0.1mg至约5mg，例如约0.1mg至约1mg、约0.1mg至约0.5mg和约0.1mg至约0.25mg)的治疗有效量对哺乳动物施用可溶性VEGF受体或变体。可溶性VEGF受体或其变体包含但不限于本发明的融合蛋白质。

在一些实施方案中，可溶性VEGF受体是FLT1D29GLYFC(SEQ IDNO.1或2)或D2-9GLY-CH3(SEQ ID NO.22或23)。

在一些实施方案中，可溶性VEGF受体的治疗有效量是约0.1mg至约25mg、约0.1mg至约10mg、约0.5mg至约5mg或约0.5mg至约2.5mg。可以反复施用可溶性VEGF受体或其变体。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括对哺乳动物的患病眼施用编码本发明的融合蛋白质的VEGF拮抗剂的核酸以治疗眼部疾病，其中VEGF拮抗剂按约100ng/ml至约75μg/ml的治疗有效量表达。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括递送编码式X-Y-Z的VEGF拮抗剂的核酸至哺乳动物的患病眼，其中VEGF拮抗剂按约100ng/ml至约75μg/ml的治疗有效量在患病眼的变移上皮细胞中表达。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括通过玻璃体内(intravitreal)注射(例如中央玻璃体注射)递送编码式X-Y-Z的VEGF拮抗剂的核酸至哺乳动物的患病眼，其中VEGF拮抗剂按约100ng/ml至约75μg/ml的治疗有效量表达。

在一些实施方案中，VEGF拮抗剂按约100pg/ml至约100μg/ml、1ng/ml至约95μg/ml、10ng/ml至约85μg/ml、100ng/ml至约50μg/ml、约1μg/ml至约25μg/ml、约1μg/ml至约15μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml或约1μg/ml至约4μg/ml的治疗有效量表达。

在一个实施方案中，编码VEGF拮抗剂的核酸是病毒载体。在另一个实施方案中，病毒载体是AAV，例如AAV2。

在一个实施方案中，VEGF拮抗剂在哺乳动物中表达至少6个月，例如至少9个月或1年。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括按每单位剂量约2x10⁶至约2x10¹²drp的治疗有效量对哺乳动物的患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗剂。

在一些实施方案中，治疗有效量是每单位剂量约2x10⁷至约2x10¹¹drp或约2x10⁸至约2x10¹⁰drp。

在一些实施方案中，施用第二VEGF拮抗剂。第二VEGF拮抗剂可以是融合多肽，其包含融合至IgG重链分子的VEGF受体，优选融合至IgG的Fc或CH3的VEGF-R1，更优选融合至Fc或CH3的VEGF-R1的结构域2。可以使用接头(例如9Gly)连接VEGF受体和IgG结构域。

第二VEGF拮抗剂可以是VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗(ranibizumab)。

本发明的另一个方面是治疗哺乳动物眼部疾病的方法。该方法包括对哺乳动物的患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗剂，其中VEGF拮抗剂为每单位剂量约0.1mg至约50mg的治疗有效量。

在一些实施方案中，治疗有效量是约0.1mg至约25mg、约0.1mg至约10mg、约0.5mg至约5mg或约0.5mg至约2.5mg。

本发明的另一个方面是降低接受眼部基因治疗的哺乳动物眼内浑浊(haze)的方法。该方法包括对哺乳动物(例如在眼内)施用包含不超过总病毒壳体90％的空病毒壳体的基因治疗病毒体。

在一些实施方案中，空病毒壳体不超过总病毒壳体的80％、70％、60％或50％。在一些实施方案中，基因治疗病毒体基本上无空病毒壳体。

在一个实施方案中，病毒体是AAV病毒体，例如AAV2病毒体。

在一些实施方案中，眼部疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

为本领域提供了治疗血管增殖和炎症相关疾病的方法和物质(agent)的本发明的这些和其他实施方案将在后面更详细地描述。相对于蛋白质的天然形式，该物质提供提高的稳定性和生物利用率。

附图简述

图1.D2-9Gly-Fc构建体中的9-Gly接头的柔性区。通过Karpus和Schultz(1985)法预测的相对柔性显示，与不包含9-Gly接头的D2-Fc构建体相比，D2-9Gly-Fc蛋白质中的作为一个区域的聚甘氨酸九聚体(9-Gly)接头(氨基酸94-103)具有高于平均值的柔性(＞1)。两种融合蛋白质都包含相同氨基酸序列(框内)：sp-信号肽(氨基酸-24至-1)、Flt-1结构域2(氨基酸1至93)和IgG1-Fc残基(244个氨基酸)。箭头表示用SignalPV2.0程序(Nielsen等，1997)预测的信号肽酶切割位点。

图2.D2-9Gly-Fc对D2-Fc的生物学活性。293细胞生长于饥饿培养基(M199+5％FCS)，并用包含CMV启动子控制下的D2-9Gly-Fc和D2-Fc表达盒的质粒转染。72小时后收集条件培养基(CM)。将HUVEC用含VEGF(10ng/mL)的饥饿培养基接种于96孔板中(2E3细胞/孔)，24小时后加入50ul含VEGF(10ng/mL)的CM。将对照(+/-VEGF)与来自对照pEGFP(Clontech；pEGFP携带野生型绿色荧光蛋白质(GFP)的红移变体，该变体已针对在哺乳动物细胞中更亮的荧光和更高的表达进行了优化)质粒转染的CM孵育。用50ng Flt-1-IgG重组蛋白质(R&DSystems)处理阳性对照。处理后3天用CellTiter

AQ_ueous试剂(Promega)对HUVEC的增殖进行测定。数据代表每个实验测定三次的两次实验的OD₄₉₀的平均值的平均值。

图3.D2-9Gly-Fc和D2-Fc的蛋白质印迹分析。与在还原凝胶中的迁移相比，在非还原凝胶中迁移时，D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白质的大小似乎都是两倍大。表达D2-9Gly-Fc和D2-Fc的质粒转染293细胞后，来自条件培养基的蛋白质通过SDS电泳分离，并转移至PVDF膜。用山羊抗-人抗-IgG1 Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗体探测印迹。

图4.包含9Gly接头和VEGF Ex3的sFlt-1杂合蛋白质。D2-9Gly-Ex3/CH3与之前构建的蛋白质的结构比较。三种蛋白质都包含Flt-1结构域2的相同的氨基酸序列，其由Flt-1信号肽的24个氨基酸和Flt-1结构域2的93个氨基酸组成。D2-9Gly-Ex3/CH3包含9Gly接头的9个氨基酸、VEGF Ex3的14个氨基酸和人IgG1重链Fc的CH3区的120个氨基酸。

图5.D2-9Gly-Ex3/CH3对D2-9Gly-Fc的生物学活性。与对照蛋白质D2-9Gly-Fc和D2-Fc相比，蛋白质D2-9Gly-Ex3/CH3(其中结构域2通过9Gly接头和VEGF Ex3连接至CH3区)也有效地抑制VEGF-依赖的HUVEC增殖。用50ng重组Flt-1-IgG(R&D Systems)作为对照。

图6.比较D2-(Gly₄Ser)₃-Fc与D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3的蛋白质活性的HUVEC增殖测定。

图7.蛋白质印迹。来自用表达(1)D2-9Gly-Fc、(2)D2-(G₄S)₃-Fc和(3)EGFP蛋白质的质粒转染的293细胞的条件培养基(15ul CM)的蛋白质(非还原或还原)通过SDS电泳分离，并转移至PVDF膜。用山羊抗-人IgG1 Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗体探测印迹。

图8.有/无9Gly接头或VEGF Ex3的蛋白质的组合。三种有或无9Gly接头和/或VEGF Ex3的新蛋白质D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3的结构比较。

图9.用具有9Gly、Ex3和CH3组合的Flt-1(D2)构建体进行的HUVEC增殖测定。包含蛋白质D2-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-CH3的来自293细胞的条件培养基(5ul)与D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3比较。

图10.蛋白质印迹。用表达(1)D2-9Gly-Fc、(2)D2-9Gly-CH3(52/26kDa)和(3)D2-CH3(50/25kDa)的质粒转染293细胞。来自293细胞条件培养基的蛋白质(15ul CM，非还原和/或还原)通过SDS电泳分离，并转移至PVDF膜。用抗-人VEGF-R1HRP缀合物(R&D Systems)探测印迹。

图11.VEGF“体外”结合测定。将包含已知浓度的D2-9Gly-Fc和Flt-1D(1-3)对照可溶性受体(浓度为0.29至150pM)的来自293细胞的条件培养基连续稀释，并与10pM VEGF混合。然后通过ELISA测量未结合的VEGF的量。D2-9Gly-Fc以高于其他所有构建体的亲和力结合VEGF。“n”代表独立实验(转染和结合测定)的次数。

图12.用BIAcore仪器通过表面等离振子共振测量可溶性Flt-1构建体的结合动力学。将sFlt-1构建体固定于传感芯片，按0.2至15nM的浓度范围注入VEGF165。用BIA Evaluation程序评估传感图(sensorgram)，测定速率常数K_a和K_d，并从K_d/K_a＝K_D的比计算解离常数(K_D)。越低的K_D表示越好的亲和力。

图13A-13C。图13A显示具有多种接头的Flt-1构建体的表达水平。图13B显示具有多种接头和IgG1Fc的CH3部分的Flt-1构建体的二聚化或多聚化。非还原和还原条件间的差异表明蛋白质已多聚化。图13C显示在VEGF存在下的HUVEC增殖测定中，存在于条件培养基中的Flt-1构建体的抑制性生物活性。每种构建体显示接近于无VEGF下的HUVEC增值水平的抑制活性。

图14.用视网膜新血管形成(NV)的鼠的氧诱导视网膜病变(OIR)模型，对小鼠眼部施用Flt-1构建体之一，并测定新血管形成。将小鼠暴露于高氧条件。测定治疗眼中新血管形成事件的数目，与同一动物的未治疗眼中的事件比较。若新血管形成事件降低超过50％，则认为该动物是“反应者”。

图15.原位杂交测定显示AAV2-sFLT1D29GLYFC在一组动物中的表达水平和定位。

发明详述

本发明人发现，无结构域1和3的Flt-1 Ig-样结构域2能够有效地结合VEGF，并抑制VEGF-依赖的内皮细胞增殖。可以通过接头将结构域2共价连接至多聚化结构域。接头一般是多肽链。链的长度可以是6、7、9、11、13、15或更多个氨基酸残基，但一般是5至25个残基。取决于长度和侧链组成，接头可以具有但不需具有高于平均值的柔性。可以用本领域已知的算法计算柔性。多聚化结构域是多聚体蛋白质中促进亚基形成例如二聚体、三聚体、四聚体等的那些部分。适用于有效结合VEGF和/或抑制VEGF-依赖的内皮细胞增殖的重组蛋白质选自SEQ ID NO：2、8、21、23和25。

此外，发明人已发现，多聚化结构域和接头可以与多种其他蛋白质或蛋白质的部分一起使用，以诱导多聚化。这类蛋白质可以是仅在多聚化时结合配体或受体的蛋白质，或可以是多聚化时其结合亲和力增强的蛋白质。适用于多聚化的蛋白质包含胞外受体(包含其部分)、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子。适合的蛋白质包含酪氨酸激酶受体和丝氨酸苏氨酸激酶受体。胞外受体的具体实例包含EGF受体、G蛋白偶联受体、FGF受体、Fc受体、T细胞受体等。抗体可变区的实例包含Fab、F(ab’)₂和ScFv。细胞因子的实例包含GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNF-β。趋化因子的实例包含BCA-1/BLC、BRAK、趋化因子CC-2、CTACK、CXCL-16、ELC、ENA、ENA-70、ENA-74、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化蛋白(Eotaxin)、Exodus-2、CXXXC趋化分子、GCP-2、GRO、GROα(MGSA)、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、HCC-4、I-309、IP-10、I-TAC、LAG-1、LD78-β、LEC/NCC-4、LL-37、淋巴细胞趋化蛋白(Lymphotactin)、MCP、MCAF(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、MDC、MDC-2、MDC-4、MEC/CCL28、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3/MPIF-1、MIP-3α、MIP-3bet、MIP-4(PARC)、MIP-5、NAP-2、PARC、PF-4、RANTES、RANTES-2、SDF-1α、SDF-1β、TARC和TECK。生长因子的实例包含人双调蛋白、人血管发生蛋白质、人ACE、人血管生成素、人血管位蛋白(Angiopoietin)、人制管张素、人β动物纤维素、人BMP、人BMP-13/CDMP-2、人BMP-14/CDMP-1、人BMP-2、人BMP-3、人BMP-4、人BMP-5、人BMP-6、人BMP-7、人BMP-8、人BMP-9、人集落刺激因子、人flt3-配体、人G-CSF、人GM-CSF、人M-CSF、人结缔组织生长因子、人Cripto-1、人Cryptic、人ECGF、人EGF、人EG-VEGF、人促红细胞生成素、人胎球蛋白、人FGF、人FGF-1、人FGF-10、人FGF-16、人FGF-17、人FGF-18、人FGF-19、人FGF-2、人FGF-20、人FGF-3、人FGF-4、人FGF-5、人FGF-6、人FGF-7/KGF、人FGF-8、人FGF-9、人FGF-酸性、人FGF-碱性、人GDF-11、人GDF-15、人生长激素释放因子、人HB-EGF、人调蛋白、人HGF、人IGF、人IGF-I、人IGF-II、人抑制素、人KGF、人LCGF、人LIF、人混合生长因子(Human Miscellaneous Growth Factor)、人MSP、人肌肉生长抑制素(Human Myostatin)、人肌肉生长抑制素前肽、人神经生长因子、人制癌蛋白M、人PD-ECGF、人PDGF、人PDGF(AA同型二聚体)、人PDGF(AB异源二聚体)、人PDGF(BB同型二聚体)、人PDGF(CC同型二聚体)、人PIGF、人PIGF、人PIGF-1、人PIGF-2、人SCF、人SMDF、人干细胞生长因子、人SCGF-α、人SCGF-β、人血小板生成素、人转化生长因子、人TGF-α、人TGF-β和人VEGF。

Flt-1受体蛋白质具有包含7个Ig-样结构域的胞外部分。这些结构域定位于Genbank检索号P17948(也见SEQ ID NO：15)的氨基酸残基编号32...123、151...214、230...327、335...421、428...553、556...654和661...747。残基编号1-26包含信号肽。Flt-1蛋白质由Genbank检索号NM_002019(SEQ ID NO：14)所示DNA序列编码。

可以按本领域已知使用多聚化结构域。可以使用IgG1或IgG2λ重链的Fc部分的序列，例如单独使用CH3(氨基酸371-477)或使用CH2和CH3结构域(247-477)二者。Ig分子的Fc部分是通过用木瓜蛋白酶切割全抗体分子获得的部分。也可以用其他方法获得这些部分。IgG1λ重链蛋白质序列见Genbank检索号Y14737和SEQ ID NO：10。可以使用例如来自其他IgG类型和来自IgA、IgM、IgD或IgE抗体的其他Fc区。还可以使用VEGF的多聚化区。编码VEGF的DNA序列显示于Genbank检索号NM_003376和SEQ ID NO：11。VEGF的氨基酸序列显示于Genbank检索号CAC19513和SEQ ID NO：12。由VEGF外显子3(VEGFEx3)编码的VEGF的多聚化区(SEQ ID NO：13)大致处于VEGF蛋白质(SEQ ID NO：12)的氨基酸残基75-88。多聚化结构域可以引起单体融合蛋白质的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或95％在非变性聚丙烯酰胺凝胶上以适合于多聚体的速率迁移。糖基化可以影响蛋白质在凝胶中的迁移。虽然在此显示具体的序列，但也可以使用诸如等位变体的变体。这类变体一般与所公开的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。

如本文所示，可以用例如还原和非还原凝胶测定多聚化。还可以通过检测蛋白质对其配体/受体的提高的亲和力来测定多聚化。在这一点上，可以使用BiaCore^TM表面等离振子共振测定法。这些测定法通过测量靠近传感芯片表面的水性层中折射率的变化来检测物质变化。可以使用本领域已知的任意方法来检测多聚化。

本发明的接头部分可以包含例如5-100个氨基酸残基、5-75个氨基酸残基、5-50个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基、5-10个氨基酸残基、5-9个氨基酸残基。有用的接头的实例包含：gly9(SEQ ID NO：27)、glu9(SEQ ID NO：28)、ser9(SEQ ID NO：29)、gly₅cyspro₂cys(SEQ ID NO：30)、(gly₄ser)₃(SEQ ID NO：31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：32)、ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：13)、GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys  (SEQ  ID  NO：26)，和Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn  (SEQ  ID  NO：34)。可以使用的其他多肽接头包含不同长度(包含5、7或30个残基)的聚甘氨酸。此外，Flt-1的其他部分可以用作接头，例如Flt-1的结构域3。见SEQ ID NO：15。也可以从其他聚合物产生接头部分，例如聚乙二醇。这类接头可以具有10-1000、10-500、10-250、10-100或10-50个乙二醇单体单位。适合的聚合物应具有与适当范围的氨基酸残基所占据的尺寸相似的尺寸。一般尺寸的聚合物提供约10-25埃的空间。

可以通过本领域已知的任意方法产生本发明的融合蛋白质。虽然可以通过合成或通过连接产生的部分来产生这类蛋白质，但也可以使用重组产生。可以用重组DNA的标准工具产生融合基因序列。可以将融合基因序列插入载体(例如病毒或质粒载体)进行融合基因序列的复制。可以在融合基因上游引入在最终受体细胞中有功能的启动子序列。所使用的启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。每种类型的实例为本领域公知。可以通过本领域已知的任意方法将载体引入宿主细胞或哺乳动物。可以使用的适合的载体包含腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、慢病毒(lentivirus)和质粒。若载体是病毒载体且载体已包装，则可以用病毒体感染细胞。若使用裸DNA，则可以使用适合于具体宿主细胞的转染或转化方法。可以使用利用聚合物类、脂质体或纳米球的裸DNA制剂进行融合基因递送。可以用本发明的重组构建体转化或转染的细胞可以是对技术人员方便的任意细胞。可以使用的示例性细胞类型包含细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。在哺乳动物细胞中，可以按方便选择许多组织类型的细胞。可以使用的示例性细胞是成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、干细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经细胞和角质形成细胞。这些细胞可以用来在体外产生蛋白质，或者可以递送至包含人类的哺乳动物，以在体内产生所编码的蛋白质。这种递送方法是递送核酸至哺乳动物、递送病毒载体至哺乳动物和递送融合蛋白质至哺乳动物外的另一种选择。

蛋白质或核酸的组合物可以在载体中，例如缓冲液、水性或亲脂载体、无菌或非无菌、热原性或非热原性载体。非热原性载体用于可注射制剂。制剂可以是液体或固体，例如冻干的。制剂可以作为气雾剂施用。组合物可以包含一种或多种融合蛋白质，或一种或多种核酸，或融合蛋白质和核酸二者。组合物中的融合蛋白质或核酸可以是同型的，这种情况下将形成同型多聚体蛋白质，或者它们在组合物中是异源的，这种情况下形成异源多聚体蛋白质。在异源多聚体的情况中，X部分在融合蛋白质间一般不同，但Z部分在融合蛋白质间是相同的。

可以通过本领域已知的任意方法向细胞或哺乳动物宿主提供融合蛋白质。可以将蛋白质递送至细胞或宿主。可以对细胞或宿主施用核酸。可以对细胞或宿主施用转化或转染的细胞。在后一种情况中，希望得到具有相同遗传背景的细胞，以降低移植排斥。

适合递送至哺乳类宿主动物的细胞包含来自任意器官、肿瘤或细胞系的任意哺乳动物细胞类型。例如，可以使用人、鼠、山羊、绵羊、牛、狗、猫和猪的细胞。适用的细胞类型非限制性地包含成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经细胞和干细胞。

递送融合蛋白质或编码融合蛋白质的核酸的方法包括表达融合蛋白质的细胞的递送、融合蛋白质的递送和编码融合蛋白质的核酸的递送。通过例如注射法、导管插入法或内窥镜法，可以将融合蛋白质、细胞或核酸直接递送至所希望的器官或肿瘤。还可以通过静脉内、支气管内、瘤内、鞘内、肌内、眼内、局部、皮下、经皮或口服递送融合蛋白质、细胞或核酸。可以有效治疗的病人包含患有湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病增殖性视网膜病变、类风湿性关节炎、骨关节炎、葡萄膜炎、哮喘和癌症的病人。治疗将改善症状和/或疾病标志和/或疾病严重度。

当递送至眼睛的前部或中央玻璃体腔(mid-vitreous space)中时，编码分泌蛋白质的基因治疗病毒载体(例如AVV2)转导眼中的变移上皮细胞(例如在非人灵长类动物中)。前房中可获得产生自转导细胞的分泌蛋白质。因此，可以通过玻璃体内的病毒基因递送治疗眼睛前部的疾病。这类前眼疾病(front eye disease)的实例包含但不限于干眼综合症、Sjogren’s综合症、葡萄膜炎、角膜血管发生、角膜移植排斥。分泌蛋白质的实例包含但不限于sFLT1、IL-10、IL1Ra、IL18bp、可溶性PDL1-Ig、CTLA4-Ig、可溶性TNFR-Ig、可溶性IL-17R和可溶性IL23R。

可以以任意希望的载体将核酸递送至哺乳动物，尤其是递送至人类。这些载体包含病毒或非病毒载体，包含腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。示例性病毒类型包含HSV(单纯疱疹病毒)、腺病毒、AAV(腺伴随病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。可以以提供足够有效的递送水平的任意希望的形式递送核酸，包含以病毒颗粒形式、以脂质体形式、以纳米颗粒形式和络合至聚合物类递送。

可以使用蛋白质和核酸治疗的组合。例如，可以对病人施用本发明的融合蛋白质。若观察到良好的反应，则可以为了长期作用施用编码该融合蛋白质的核酸分子。备选地，可以同时或近乎同时施用蛋白质和核酸。在另一种选择中，可以施用配体的抗体或融合蛋白质，随后或同时施用受体的抗体或融合配偶体。另一种选择使用核酸的组合，其中一种核酸编码抗体，另一种核酸编码融合蛋白质。可以与本发明的Flt-1构建体(无论是蛋白质形式或核酸形式)组合使用的一些抗体是贝伐单抗和兰尼单抗，二者均针对VEGF。这些抗体分别对治疗癌症和黄斑变性尤其有用。

除非另作说明，本发明的实施使用本领域技术内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这类技术在文献中阐述透彻，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods In Enzymology (Academic Press，Inc.)；Handbook Of Experimental Immunology(D.M.Wei&C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P. Calos编辑，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等编辑，1994)；Current Protocols In Immunology(J.E.Coligan等编辑，1991)；Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane编辑(1988))；和PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))。

如本文所用，本发明的VEGF拮抗剂的“降低的量”指VEGF拮抗剂的局部浓度(哺乳动物体内)。对相同的疾病指征，当其低于市售“参考VEGF拮抗剂”的局部浓度时，认为局部浓度是降低的量。例如，“降低的量”可以是参考VEGF拮抗剂的局部浓度的90％、75％、50％、25％、10％或5％。作为实例，兰尼单抗(Lucentis)是市售抗-VEGF抗体形式的VEGF拮抗剂，用于治疗AMD。当根据本发明用VEGF拮抗剂治疗AMD时，该VEGF拮抗剂的降低的量定义为局部浓度，该浓度低于对眼部施用抗体后兰尼单抗的局部浓度。据估计，单剂量后兰尼单抗在眼内的局部浓度是约100μg/ml。因此，根据本发明按降低的量提供用来治疗AMD的VEGF拮抗剂，即低于100μg/ml的局部浓度，例如处于或低于95μg/ml、85μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、15μg/ml、10μg/ml或5μg/ml。本发明的VEGF拮抗剂是蛋白质时，其可以通过蛋白质或基因治疗提供。

如本文所用，“参考VEGF拮抗剂”指市售VEGF拮抗剂。只要参考VEGF拮抗剂拮抗VEGF信号传导，其可以是任何形式。例如，参考VEGF拮抗剂可以是融合蛋白质或诸如VEGF抗体的其他类型的分子。

至少约50％-99％或更多存在于贮存物中的病毒体是具有包装基因组的病毒体(例如AAV载体颗粒)时，包含病毒载体颗粒(包装基因组)的病毒体的贮存物或制剂(例如基因治疗病毒体)“基本上无”空病毒壳体。优选地，载体颗粒包含至少约75-85wt％、更优选约90wt％的病毒体存在于贮存物中，甚至更优选至少约95wt％、或甚至99wt％或更多的病毒体存在于贮存物中，或这些范围间的任意整数的病毒体存在于贮存物中。因此，当约40％至约1％或更少、优选约25％至约15％或更少、更优选约10％或更少、甚至更优选约5％至约1％或更少产生的贮存物包含空病毒壳体时，贮存物基本上无空病毒壳体。可以按例如美国专利号7,261,544(在此以其整体引入作为参考)所述制备基本上无空病毒壳体的病毒体。可以通过本领域已知的方法测量空病毒壳体，例如Progen病毒壳体酶联免疫吸附测定法。

基因递送载体可以是可携带插入的多核苷酸进入宿主细胞的任意分子。基因递送载体的实例是脂质体；生物相容性聚合物类，包含天然聚合物类和合成聚合物类；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；细菌；病毒，如杆状病毒、腺病毒和反转录病毒；噬菌体；黏端质粒；质粒；真菌载体；和已描述了其在多种真核和原核宿主中的表达，且可以用于基因治疗以及简单的蛋白质表达的本领域常用的其他重组载体。

如本文所用，基因递送、基因转移等术语是指不考虑用于引入的方法，将外源多核苷酸(有时称为“转基因”)引入宿主细胞。这类方法包括多种公知的技术，如载体介导的基因转移(通过例如病毒感染/转染，或多种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及促进“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔、“基因枪”递送和多种用于多核苷酸引入的其他技术)。引入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地保持在宿主细胞中。稳定保持通常需要所引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或整合入宿主细胞的复制子，如染色体外复制子(例如质粒)或核染色体或线粒体染色体。如本领域已知和本文所述，已知许多载体能够介导基因转移至哺乳动物细胞。

为通过静脉内、肌内、门静脉内(intraportal)或其他给药途径递送，将外源多核苷酸插入载体，如腺病毒、部分删除的腺病毒、完全删除的腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、反转录病毒、慢病毒、裸质粒、质粒/脂质体复合物等。可以在本发明的方法和组合物中使用的表达载体包含例如病毒载体。在体内和离体条件下，最常用的基因治疗给药方法之一是用病毒载体递送基因。已知许多病毒物种，并已为基因治疗的目的研究了许多病毒物种。最常用的病毒载体包含衍生自腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和反转录病毒(包含慢病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV))的病毒载体。

腺病毒是无包膜的核DNA病毒，具有约36 kb的基因组，已通过经典遗传学和分子生物学中的研究良好地对其进行了表征(Hurwitz，M.S.，Adenoviruses Virology，第3版，Fields等编辑，Raven Press，纽约，1996；Hitt，M.M.等，Adenovirus Vectors，The Development of Human Gene Therapy，Friedman，T.编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约1999)。病毒基因分为涉及两类时序病毒蛋白质产生的早期(命名为E1-E4)和晚期(命名为L1-L5)转录单位。这些事件的分界是病毒DNA复制。根据包含红血细胞凝集、致癌性、DNA和蛋白质氨基酸的组成和同源性，以及抗原关系的性质，将人腺病毒划分为许多血清型(约47种，相应地编号并划分为6个组：A、B、C、D、E和F)。

重组腺病毒载体用作基因递送载体具有几个优势，包含对分裂和非分裂细胞都具有向性、最小的致病潜力、复制达到高效价用于载体贮存物制备的能力和携带大的插入片段的潜力(Berkner，K.L.，Curr.Top.Micro.Immunol.158：39-66，1992；Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 1：51-64 1994)。已将多种腺病毒基因序列缺失的腺病毒载体设计为利用所希望的腺病毒特征，这些特征使其成为递送核酸至受体细胞的适合载体。

具体而言，假腺病毒载体(pseudoadenoviral vectors)(PAV)(也称为“gutless腺病毒”或微型腺病毒载体)是衍生自腺病毒基因组的腺病毒载体，其包含病毒基因组复制和包装所需的最少限度的顺式作用核苷酸序列，且其可以包含一个或多个转基因(参见涉及假腺病毒载体(PAV)和产生PAV的方法的美国专利号5,882,877，其在此引入作为参考)。已将PAV设计为利用所希望的腺病毒特征，这些特征使其成为基因递送的适合载体。虽然通过缺失对病毒生长可有可无的区域，腺病毒载体一般可以携带大小至多为8kb的插入片段，但是用包含大部分病毒编码序列缺失的腺病毒载体(包含PAV)可以达到最大载量。见Gregory等的美国专利号5,882,877；Kochanek等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93：5731-5736，1996；Parks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13565-13570，1996；Lieber等，J.Virol. 70：8944-8960，1996；Fisher等，Virology 217：11-22，1996；美国专利号5,670,488；1996年10月24日公开的PCT公开号WO96/33280；1996年12月19日公开的PCT公开号WO96/40955；1997年7月19日公开的PCT公开号WO97/25446；1995年11月9日公开的PCT公开号WO95/29993；1997年1月3日公开的PCT公开号WO97/00326；Morral等，Hum.Gene Ther.10：2709-2716，1998。这类可以容纳至多约36kb外源核酸的PAV是有利的，因为优化了载体的载量，而降低了宿主对载体产生免疫应答或产生复制型病毒的潜力。PAV载体包含5′反向末端重复(ITR)和3′ITR核苷酸序列，其包含复制起点、PAV基因组包装所需的顺式作用核苷酸序列，且可以容纳一个或多个具有适当调节元件(例如启动子、增强子等)的转基因。

另外，部分删除的腺病毒载体提供了部分删除的腺病毒(称为“DeAd”)载体，其中从载体上删除病毒复制所需的大部分腺病毒早期基因，并将这些基因在条件启动子的控制下置于生产者细胞的染色体内。置于生产者细胞中的可删除的腺病毒基因可以包含E1A/E1B、E2、E4(只需将ORF6和ORF6/7置入细胞)、pIX和pIVa2。还可以从载体删除E3，但由于其不是载体产生所需的，所以在生产者细胞中可以省略。载体中存在腺病毒晚期基因(通常在主要晚期启动子(MLP)的控制下)，但可以用条件启动子替换MLP。

适用于DeAd载体和生产者细胞系的条件启动子包含具有以下特征的条件启动子：非诱导状态下低的基础表达，以使细胞毒性的或抑制细胞的病毒基因不以对细胞有害的水平表达；诱导状态下高水平表达，以产生足够量的病毒蛋白质来支持载体的复制和组装。适用于DeAd载体和生产者细胞系的优选的条件启动子包含基于免疫抑制剂FK506和瑞帕霉素的二聚体剂(dimerizer)基因控制系统、蜕皮素基因控制系统和四环素基因控制系统。Abruzzese等，Hum.Gene Ther.1999 10：1499-507中所述的GeneSwitch^TM技术(Valentis，Inc.，Woodlands，TX)也可以用于本发明，其公开内容在此引入作为参考。部分删除的腺病毒表达系统进一步描述于WO99/57296中，其公开内容在此引入作为参考。

腺伴随病毒(AAV)是单链人DNA细小病毒，其基因组大小为4.6kb。AAV基因组包含两个主要的基因：rep基因，其编码rep蛋白质(Rep 76、Rep 68、Rep 52和Rep 40)；和cap基因，其编码AAV复制、拯救、转录和整合，而cap蛋白质形成AAV病毒颗粒。AAV因其依赖于腺病毒或其他辅助病毒(例如疱疹病毒)供给允许AAV进行生产性感染(即在宿主细胞中繁殖其自身)的必需基因产物而得名。在无辅助病毒的情况下，AAV作为原病毒整合入宿主细胞的染色体，直至为辅助病毒(通常是腺病毒)超感染宿主细胞所拯救(Muzyczka，Curr.Top.Micor.Immunol. 158：97-127，1992)。

对AAV作为基因转移载体的兴趣产生自其几种独特的生物学特征。AAV基因组的两端都是称为反向末端重复(ITR)的核苷酸序列，其包含病毒复制、拯救、包装和整合所需的顺式作用核苷酸序列。由rep蛋白质反向介导的ITR的整合功能允许AAV基因组感染后在无辅助病毒的情况下整合入细胞染色体。病毒的这一独特特性与在基因转移中的AAV使用相关，因为其允许包含目的基因的重组AAV整合入细胞基因组。因此，通过使用rAAV载体可以达到稳定的遗传转化，这是许多基因转移目标的理想结果。此外，很好地确定了AAV的整合位点并已将其定位于人的19号染色体(Kotin等，Proc.Natl.Acad.Sci. 87：2211-2215，1990)。整合位点的这种可预测性降低了随机插入细胞基因组的事件的危险，这些事件可以激活或失活宿主基因或间断编码序列，这是可以限制整合AAV的载体的使用的结果，在rAAV载体的设计中去除这个基因可以产生已用rAAV载体观察到的改变的整合模式(Ponnazhagan等，Hum Gene Ther.8：275-284，1997)。

用AAV进行基因转移有其他优势。AAV的宿主范围广。此外，不同于反转录病毒，AAV可以感染休眠细胞和分裂细胞。同时AAV尚未与人类疾病相关联，消除了反转录病毒衍生的基因转移载体已出现的许多顾虑。

产生重组rAAV载体的标准方法需要协调一系列细胞内事件：用包含两侧有AAV ITR序列的目的转基因的rAAV载体基因组转染宿主细胞、通过编码反向所需的AAV rep和cap蛋白质基因的质粒转染宿主细胞和用辅助病毒感染转染的细胞来供给反向所需的非AAV辅助病毒功能(Muzyczka，N.，Curr.Top.Micor. Immunol.158：97-129，1992)。腺病毒(或其他辅助病毒)的蛋白质激活AAV rep基因的转录，然后rep蛋白质激活AAV cap基因的转录。然后cap蛋白质利用ITR序列来将rAAV基因组包装入rAAV病毒颗粒。因此，包装的效率部分地由足量结构蛋白质的可获得性，以及rAAV载体基因组中所需的任意顺式作用包装序列的可接近性决定。

反转录病毒是常见的基因递送工具(Miller，Nature(1992)357：455-460)。反转录病毒载体递送非重排的单拷贝基因进入广泛的啮齿类动物、灵长类动物和人的体细胞的能力使反转录病毒载体非常适合用于转移基因至细胞。

反转录病毒是其中病毒基因组是RNA的RNA病毒。当用反转录病毒感染宿主细胞时，基因组RNA反转录为非常有效地整合入所感染细胞染色体DNA的DNA中间体。这种整合的DNA中间体称为原病毒。原病毒的转录和组装为感染性病毒发生在存在适合的辅助病毒的情况下，或发生在包含能够在无污染辅助病毒同时产生的情况下壳体化的适当序列的细胞系中。若用适当的载体通过共转染提供用于壳体化的序列，则重组反转录病毒的产生不需要辅助病毒。

反转录病毒基因组和原病毒DNA具有3个基因：gag、pol和env，其两侧是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部的结构(基质、病毒壳体和核病毒壳体)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(反转录酶)；env基因编码病毒的包膜糖蛋白。5′LTR和3′LTR促进病毒体RNA的转录和多聚腺苷化。LTR包含病毒复制必需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有包含vit vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)的其他基因。与5′LTR相邻的是基因组反转录必需的序列(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效病毒壳体化进入颗粒必需的序列(Psi位点)。若病毒壳体化(或将反转录病毒RNA包装入感染性病毒体)必需的序列从病毒基因组缺失，则结果是阻止基因组RNA病毒壳体化的顺式缺陷。但是，产生的突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白质的合成。

慢病毒是复杂的反转录病毒，除共有的反转录病毒基因gag、pol和env外，其还包含具有调节或结构功能的其他基因。如在潜伏性感染的过程中，较高的复杂性使慢病毒能够调节其生活周期。人免疫缺陷病毒(HIV)(AIDS的致病因子)是典型的慢病毒。在体内，HIV可以感染几乎不分裂的终端分化细胞，如淋巴细胞和巨噬细胞。在体外，HIV可以感染单核细胞源性巨噬细胞(monocyte-derived macrophag，MDM)的原代培养物，以及通过用阿非科林(aphidicolin)或γ辐射处理阻断在细胞周期中的HeLa-Cd4或淋巴细胞。细胞的感染依赖于HIV预整合复合物通过靶细胞核孔的活跃核转运。用靶细胞的核转运装置，通过复合物中多个部分冗余的分子决定因素的相互作用发生转运。已鉴定的决定因素包含gag基质(MA)蛋白质中的功能性核定位信号(NLS)、亲核的病毒体相关蛋白质、vpr和gag MA蛋白质C端的磷酸酪氨酸残基。反转录病毒对基因治疗的用途描述于例如美国专利6,013,516和美国专利5,994,136，其公开内容在此引入作为参考。

递送DNA至细胞的其他方法不使用病毒进行递送。例如，可以用阳离子型两亲性化合物递送本发明的核酸。因为设计用来促进生物学活性分子的细胞内递送的化合物必须与非极性和极性环境二者相互作用(例如在质膜、组织液、细胞内区室和生物学活性分子自身之内或之上)，所以一般将这类化合物设计为包含极性和非极性结构域二者。这两类结构域都具有的化合物可以称为两亲物，已公开用于促进这种细胞内递送(无论用于体外或体内应用)的许多脂质和合成脂质符合这一定义。这类两亲物中尤其重要一类是阳离子型两亲物。一般而言，阳离子型两亲物具有能够在生理pH或生理pH附近成为带正电荷的极性基团，本领域将这一特性理解为在确定两性物如何与多种类型的生物学活性(治疗性)分子(包含例如带负电荷的多核苷酸，如DNA)相互作用中很重要。

包含阳离子型两亲性化合物的组合物对基因递送的用途描述于例如美国专利5,049,386、美国5,279,833、美国5,650,096、美国5,747,471、美国5,767,099、美国5,910,487、美国5,719,131、美国5,840,710、美国5,783,565、美国5,925,628、美国5,912,239、美国5,942,634、美国5,948,925、美国6,022,874、美国5,994,317、美国5,861,397、美国5,952,916、美国5,948,767、美国5,939,401和美国5,935,936中，其公开内容在此引入作为参考。

此外，可以用“裸DNA”递送本发明的核酸。递送非感染性、非整合DNA序列的方法描述于美国专利5,580,859、美国5,963,622、美国5,910,488，其公开内容在此引入作为参考，所述DNA序列编码有效连接至启动子的所希望的多肽或肽，不结合促进转染的蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电脂质和磷酸钙沉淀剂。

已报道了组合病毒和非病毒成分的基因转移系统。Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11548；Wu等(1994)J.Biol. Chem.269：11542；Wagner等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099；Yoshimura等(1993)J.Biol. Chem.268：2300；Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88：8850；Kupfer等(1994)Human Gene Ther.5：1437；和Gottschalk等(1994)Gene Ther. 1：185。在大多数情况下，已将腺病毒整合入基因递送系统以利用其内体水解(endosomolytic)特性。已报道的病毒和非病毒成分的组合一般涉及共价连接腺病毒至基因递送复合物或未结合的腺病毒与阳离子脂(DNA复合物)的共内化。

对于递送DNA和蛋白质至眼部，一般是局部施用。这具有限制所需施用的DNA量和限制系统性副作用的优势。可以使用许多可能的递送模式，其包含但不限于：通过基因枪在角膜上局部施用、结膜下注射、前房内注射、经滴眼液滴至角膜、经termporal limbus注射入前房、基质内注射、与电脉冲组合的角膜应用、角膜内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射(例如前部、中央或后部玻璃体注射)和眼内注射。备选地，可以在离体条件下转染或转导细胞并通过眼内移植递送。见Auricchio，Mol. Ther.6：490-494，2002；Bennett，Nature Med.2：649-654，1996；Borrás，Experimental Eye Research 76：643-652，2003；Chaum，Survey of Ophthalmology 47：449-469，2002；Campochiaro，Expert Opinions in Biological Therapy 2：537-544(2002)；Lai，Gene Therapy 9：804 813，2002；Pleyer，Progress inRetinal and Eye Research，22：277-293，2003。

可以在具体疾病的适合的动物模型中测试多种已提出的治疗剂和给药法的效果。例如，可以按Smith，Investigative Ophthalmology & VisualScience，35：101-111，1994中所述，在小鼠的氧诱导视网膜病变模型中测试早产儿视网膜病变。小鼠中激光诱导的脉络膜新血管形成可以用作发生于如年龄相关性黄斑变性的疾病的人脉络膜新血管形成(CNV)的模型。已在灵长类、大鼠类、小型猪类和兔类中发展了CNV的其他模型。已在遗传缺陷小鼠中发展了年龄相关性黄斑变性的小鼠模型。单核细胞趋化蛋白-1或C-C趋化因子受体-2缺陷的小鼠发展出年龄相关性黄斑变性的特征。Ambati，Nature Med.9：1390-1397，2003。

对于疾病的预防或治疗，本发明VEGF拮抗剂(蛋白质或基因治疗)的适合剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重度和进程，施用VEGF拮抗剂是为了预防性目的或治疗性目的、既往治疗、临床病史和对VEGF拮抗剂的应答和主治医生的判断。VEGF拮抗剂适合于一次或在一系列治疗中对病人施用。在组合治疗方案中，按治疗有效量或协同量施用本发明的组合物。如本文所用，治疗有效量是这样的量，VEGF拮抗剂和一种或多种其他治疗剂共同施用、或施用本发明的组合物，导致目标疾病或病症的降低或抑制。治疗协同量是协同地或显著地降低或消除与具体疾病相关的状态或症状必需的VEGF拮抗剂和一种或多种其他治疗剂的量。

取决于疾病的类型和严重度，可以如此施用VEGF拮抗剂，使所提供的局部浓度为约100pg/ml至约100μg/ml、1ng/ml至约95μg/ml、10ng/ml至约85μg/ml、100ng/ml至约75μg/ml、约100ng/ml至约50μg/ml、约1μg/ml至约25μg/ml、约1μg/ml至约15μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml或约1μg/ml至约4μg/ml。当通过病毒体通过基因治疗递送VEGF拮抗剂时，剂量可以是每单位剂量约2x10⁶至约2x10¹²、约2x10⁷至约2x10¹¹drp或约2x10⁸至约2x10¹⁰drp。当通过蛋白质治疗施用VEGF拮抗剂时，剂量可以是每单位剂量约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约25mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约4mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约2.5mg、约0.1mg至约2mg、约0.1mg至约1.5mg、约0.1mg至约1mg、约0.1mg至约0.75mg、约0.1mg至约0.5mg、约0.1mg至约0.25mg、约0.25mg至约5mg、约0.5mg至约5mg、约1mg至约5mg、约1.5mg至约5mg、约2mg至约5mg、约2.5mg至约5mg、约0.5mg至约5mg或约0.5mg至约2.5mg。

本发明的VEGF拮抗剂可以作为单剂量施用或反复施用。对于数天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗持续至发生所希望的疾病症状的抑制。通过常规技术和测定法监测本发明治疗的进展。

动物或病人对VEGF拮抗剂发生免疫应答时，必要时，可尝试通过例如使用可获得的免疫抑制剂来降低免疫应答(炎症和/或浑浊或抗体)。当根据本发明的一些实施方案使用基因治疗时，降低空病毒病毒壳体的数目有助于降低免疫应答。根据一些实施方案，降低针对病毒载体的免疫应答有助于提高VEGF拮抗剂(例如D29GLYFC)的表达，并因此增强VEGF拮抗剂的治疗效果。

尽管已就具体实施例(包含当前优选的实施本发明的模式)描述了本发明，但是本领域技术人员应理解，存在上述系统和技术的多种变化和变换，如所附权利要求中所阐明，这些变化和变换也在本发明的精神和范围内。本文公开的所有参考文献明确引入作为参考。

实施例

实施例1

产生两个构建体：第一个是D2-9Gly-Fc，包含聚甘氨酸九聚体(9Gly)接头；第二个是D2-Fc，除9Gly接头外具有相同的序列(图1)。

我们用序列分析程序MacVector 6.5.1.(IBI，New Haven，CT)的Protein Analysis Toolbox分析了D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白质的氨基酸序列。通过Karpus和Schultz(1985)Naturwiss，72：212-213的柔性预测方法，将D2-9Gly-Fc序列中的聚甘氨酸九聚体接头鉴定为具有高于平均值的柔性。在D2-Fc序列中未检测到这种区域(图1)。

实施例2

我们通过柔性聚甘氨酸九聚体接头测试了分离的连接至IgG1 Fc区的Flt-1 Flt-1 Ig-样结构域2(D2-9Gly-Fc)。D2-9Gly-Fc融合蛋白质能够有效地结合VEGF和抑制VEGF依赖的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖。见图2。相反，当Flt-1 Ig-样结构域2直接连接至IgG1重链(Fc)形成D2-Fc时，仅观察到最小限度的VEGF结合。见图2。通过IgG1 Fc的二聚化和柔性接头的插入都显示促进VEGF结合至Flt-1结构域2。通过蛋白质印迹分析确认了二聚体形式在D2-9Gly-Fc和D2-Fc二者中的存在。见图3。

实施例3

通过玻璃体内注射对新生(P0)或1日龄(P1)C57BL/6小鼠施用AAV载体(1x 10⁸至1x 10⁹颗粒于0.0005mL体积中)。通过将P7仔鼠和它们的哺育母鼠暴露于高氧条件5天，降低了C57BL/6小鼠中的视网膜新血管形成(NV)。仔鼠在P12回到室内空气并在P17(峰值NV的时间)进行安乐死。(Smith LEH、Weslowski E、McLellan A、Kostyk SK、D’AmatoR、Sullivan和D’Amore PA.Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse.Invest Opth Vis Sci. 1994；35：101-111)。按5微米间隔对整个石蜡包埋的眼部进行连续横切。通过计数每100微米采集的切片中内界膜内部的内皮细胞核数目来确定NV的程度。

将编码抗血管发生剂的AAV载体处理的动物群体与编码无关转基因的载体或不编码转基因的载体处理的动物群体进行比较。将每只处理的眼中内皮细胞核的平均数与每一动物的未处理的对侧眼进行比较。

实施例4

D2-9Gly-Ex3/CH3的产生

已显示Flt-1的结构域2是VEGF₁₆₅结合必需的。但是，已表明Flt-1结构域2不能单独结合VEGFA。(Davis-Smyth等，1996)。当作为二聚体存在时，VEGF A通过允许配体诱导的受体二聚化的可能机制的酸性残基(成熟蛋白质的氨基酸63-67)结合Flt-1(Keyt等，1996)。

因此，将Flt-1结构域2的二聚化用作恢复Flt-1结构域2与VEGFA结合的策略。与IgG重链片段融合可以用于蛋白质的二聚化(Davis-Smyth等，1996)。我们在此表明，VEGF A(SEQ ID NO：12)的氨基酸75-88(即PSCVPLMRCGGCCN；SEQ ID NO：13)提高了sFlt-1杂合蛋白质的生物学活性。

首先，改造了三种杂合蛋白质：D2-9Gly-Fc、D2-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3(图4)。三种杂合蛋白质都包含与D2-9Gly-Fc相同的Flt-1结构域2。用不含聚甘氨酸九聚体(9Gly)接头的D2-Fc未观察到VEGF结合。第三种蛋白质D2-9Gly-Ex3/CH3包含聚甘氨酸九聚体(9Gly)接头和VEGF的多聚化结构域(氨基酸PSCVPLMRCGGCCN；SEQ IDNO：13；VEGF Ex3)，但其还包含人IgG1重链Fc的CH3区(SEQ ID NO：10的氨基酸371-477)。

蛋白质D2-Fc在HUVEC增殖测定中不显示有效的抑制活性(图5)，暗示其不能有效地结合VEGF₁₆₅。但是，第三种蛋白质D2-9Gly-Ex3/CH3(其包含通过9Gly接头和VEGF₁₆₅的二聚化区(Ex 3)二者融合至CH3区的Flt-1结构域2)在VEGF依赖的HUVEC增殖测定中确实表现抑制活性(图5)。这暗示这种杂合蛋白质能有效地结合VEGF₁₆₅。

实施例5

在Flt-1 D2构建体中使用接头(Gly₄Ser)₃

之前已描述了使用几种聚甘氨酸接头来改进蛋白质特征(Mouz等，1996；Qiu等，1998)。对下一种构建体，我们使用了另一种类型的接头，十五聚体(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(Huston等，1988)。产生了D2-(Gly₄Ser)₃-Fc蛋白质，其包含Flt-1结构域2、(Gly₄Ser)₃接头和人IgG1重链的Fc区。

进一步在HUVEC增殖测定中表征了D2-(Gly₄Ser)₃-Fc。如通过HUVEC增殖的抑制所测量，D2-(Gly₄Ser)₃-Fc的生物学活性类似于D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3(图6)。

通过蛋白质印迹和与D2-9Gly-Fc比较进一步表征了D2-(Gly₄Ser)₃-Fc构建体(图9)。两种构建体都是大部分以二聚体形式存在，分离还原样品后检测了单体形式。

实施例6

9Gly或VEGF Ex3在Flt-1(D2)构建体中的作用

为了研究9Gly接头或VEGF二聚化序列Ex3对可溶性受体VEGF结合的作用，产生了另外三种构建体：D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3(图8)。产生了所有三种构建体，且与之前的所有构建体一样，也将它们置于CMV启动子的控制下。在HUVEC增殖测定中评估它们的VEGF封闭活性(图9)。

包含IgG1 CH3区的蛋白质的HUVEC增殖测定已显示，与亲本D2-9Gly-Ex3/CH3蛋白质相比，D2-9Gly-CH3(无Ex3)和蛋白质D2-Ex3/CH3(无9Gly接头)具有相似的VEGF阻断潜能。但是，蛋白质D2-CH3显示为它们中最弱的VEGF抑制物(图9)。

对D2-9Gly-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-Ex3/CH3和D2-CH3，来自转染293细胞的条件培养基的Flt-1酶联免疫吸附测定数据已显示相似的Flt-1水平(70-90ng/ml)，活性最低的D2-CH3形式略高(～150ng/ml)。D2-9Gly-CH3和D2-CH3构建体的蛋白质印迹(图10)显示非还原条件下以二聚体形式为主。

实施例7

D2-9Gly-Fc比所有构建体更好地结合VEGF

VEGF结合测定允许我们在无细胞系统中比较我们的可溶性VEGF受体的相对VEGF结合亲和力。

简言之，将包含已知浓度的可溶性受体(浓度在0.29-150pM的范围内)的条件培养基连续稀释并与10pM VEGF混合。然后通过ELISA测量未结合的VEGF的量。在0.001至约0.2pM的受体浓度，D2-9Gly-Fc以高于其他所有构建体结合VEGF的亲和力结合VEGF。D2-CH3具有最低的结合VEGF的亲和力(图11)。

实施例8

AAV2-sFLT1D29GLYFC基因组成分由两个AAV2 ITR和sFLT1D29GLYFC表达盒组成。用杂合鸡β-肌动蛋白启动子驱动sFLT1D29GLYFC的表达，该启动子由CMV IE增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和部分属于β-肌动蛋白转录本的94bp的外显子1的片段组成。杂合鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白内含子也是CBA启动子的部分，其包含许多隐藏的转录因子结合位点。多聚腺苷化区域获自SV40病毒基因组。

分别将测试样AAV2-sFLT1D29GLYFC和AAV2载体对照、含0.014％20的磷酸缓冲盐溶液(批号NBR 15045-108)配制为聚丙烯管中的贮存冷冻液和预先配置的水溶液。制备测试样和载体样，以产生处于适合浓度的给药溶液，以在所希望的剂量体积达到预定剂量。

当将其通过玻璃体内注射进入食蟹猴(cynomolgus monkey)眼部时，我们发现，如在房水和玻璃体液中所测量，AAV2-sFLT1D29GLYFC(2x10⁸、2x10⁹和2x10¹⁰于50ul剂量体积中)产生剂量依赖的sFLT1D29GLYFC表达，且这些水平在施用AAV载体后持续至少一年。

我们在非人灵长类动物(NHP)中进行了激光-CNV实验，并显示在这种NHP模型中，sFLT1D29GLYFC非常有效地抑制脉络膜新血管形成。在一组实验中，将2x10⁸和2x10⁹载体颗粒注射入前部/中央玻璃体腔导致剂量依赖的表达，但未在这组实验中观察到功效。当将2x10¹⁰sFLT1D29GLYFC注射入中央玻璃体腔(中央玻璃体注射)时，其在所注射的眼内表达(例如，显示mRNA表达的变移上皮细胞和视网膜神经节细胞)，且在房水中测量到治疗有效量：111ng/ml、277ng/ml、885ng/ml、967ng/ml、1,057ng/ml和1,584ng/ml。玻璃体液中的水平约比房水中高三倍。这些浓度在抑制激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)中有效。图15显示另一组接受2x10¹⁰sFLT1D29GLYFC的动物中表达的定位。

在高剂量组中观察到了轻度或中度玻璃体混浊，其在大部分动物中随时间流逝而消除。虽然在一些动物中观察到存在抗AAV的T细胞应答，但没有检测到抗转基因的T细胞应答。接受对照AAV2病毒体的动物也在高剂量下出现浑浊，这表明混浊不是由转基因sFLT引起，而是由病毒病毒壳体引起。对玻璃体混浊评分，并与Nussenblatt等(1985，Opthalmology92：467)开发的系统比较。在一些带有玻璃体混浊的动物(用AAV2-sFLT1D29GLYFC或用对照病毒体)中观察到了炎症变化，其由trabeclar meshwork和前房角中的淋巴细胞或浆细胞、玻璃体中的炎症细胞或视网膜中的血管周淋巴管组成。未观察到组织破坏或重建。炎症持续时间最长的动物具有最低的转基因表达。

在另一组动物中，没有动物在房水或血清中具有预存的AAV效价。针对sFLT01蛋白质，以及抗sFLT01抗体和载体AAV2的抗体，对血清和房水和玻璃体液进行评估。使用这种测定法，在此研究的整个过程中，在一些动物(包含载体对照组中的一些动物)中观察到时断时续的不一致的阳性。血清中未发现针对sFLT01的抗体。血清中具有抗AAV2效价的动物存在剂量和时间依赖的增加。房水效价最高的动物具有最低的表达，房水效价最低的动物具有最高的表达。

针对其他临床指征、定性的食物消耗、体检、体重、眼科检查、荧光素血管造影术、视网膜电描记术、张力测量法中的变化，对一些动物进行评估。结束后，对动物进行全面尸体剖检，收集和保存组织。处理来自对照和高剂量猴的组织并进行镜检。未观察到对视网膜电活性的影响。

对一些动物，在AAV2-sFLT1D29GLYFC后11周施用兰尼单抗(2x10⁸、2x10⁹和2x10¹⁰的剂量)，未观察到不良反应。

参考文献

Davis-Smyth等EMBO J.，15，1996，4919

Huston，J.S.等(1991)Methods Enzymol. 203，46-88

Huston，J.S.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883.

Johnson，S.等(1991)Methods Enzymol. 203，88-98

Karpus，P. A.等(1985)Naturwiss.，72，212-213.

Keyt，B.A.等(1996)J.Biol. Chem.271：5638-5646.

Kortt，A.A.等(1997)Protein Engng，10，423-433.

Lee，Y-L.等(1998)Human Gene Therapy，9，457-465

Mouz N.等(1996)Proc.Natl Acad.Sci.USA，93，9414-9419.

Nielsen等(1997)Protein Eng.，10，1

Qiu，H.等(1998)J.Biol.Chem.273：11173-11176.

Claims (46)

1.治疗哺乳动物眼部疾病的方法，所述方法包括以约2x10⁸至约2x10¹⁰drp的治疗有效量对所述哺乳动物的患病眼施用编码VEGF拮抗剂的病毒载体。

2.权利要求1的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。

3.权利要求2的方法，其中所述AAV载体是AAV2。

4.权利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗剂是融合多肽，其包含融合至IgG重链分子的VEGF受体。

5.权利要求4的方法，其中所述VEGF受体包含VEGF-R1(FLT-1)。

6.权利要求4的方法，其中所述VEGF受体包含VEGF-R1的IgG-样结构域2(FLT-1D2)。

7.权利要求4的方法，其中所述IgG重链分子包含重链的Fc部分。

8.权利要求4的方法，其中所述IgG重链分子包含重链的CH3部分。

9.权利要求4的方法，其中所述VEGF受体通过氨基酸接头融合至所述IgG重链分子。

10.权利要求9的方法，其中所述氨基酸接头是9Gly接头。

11.权利要求4的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或FLT-1D2-9GLY-CH3。

12.权利要求1的方法，其中通过玻璃体内注射对患病眼施用所述VEGF拮抗剂。

13.权利要求12的方法，其中通过中央玻璃体注射对患病眼施用所述VEGF拮抗剂。

14.权利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗剂表达于患病眼的变移上皮细胞中。

15.权利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗剂在患病眼中表达至少6个月。

16.权利要求15的方法，其中所述VEGF拮抗剂在患病眼中表达至少1年。

17.权利要求1的方法，其中所述眼部疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

18.权利要求1的方法，其进一步包含施用第二VEGF拮抗剂。

19.权利要求18的方法，其中所述第二VEGF拮抗剂是融合多肽，其包含融合至IgG重链分子的VEGF受体。

20.权利要求18的方法，其中所述蛋白质是VEGF抗体。

21.权利要求20的方法，其中所述VEGF抗体是贝伐单抗或兰尼单抗。

22.治疗哺乳动物眼部疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的患病眼施用编码VEGF拮抗剂的核酸，其中所述VEGF拮抗剂以约100ng/ml至约1,500ng/ml的治疗有效量表达，以治疗所述眼部疾病。

23.权利要求22的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。

24.权利要求23的方法，其中所述AAV载体是AAV2。

25.权利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗剂是融合多肽，其包含融合至IgG重链分子的VEGF受体。

26.权利要求25的方法，其中所述VEGF受体包含VEGF-R1(FLT-1)。

27.权利要求25的方法，其中所述VEGF受体包含VEGF-R1的IgG-样结构域2(FLT-1D2)。

28.权利要求25的方法，其中所述IgG重链分子包含重链的Fc部分。

29.权利要求25的方法，其中所述IgG重链分子包含重链的CH3部分。

30.权利要求25的方法，其中所述VEGF受体通过氨基酸接头融合至所述IgG重链分子。

31.权利要求30的方法，其中所述氨基酸接头是9Gly接头。

32.权利要求25的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或FLT-1D2-9GLY-CH3。

33.权利要求22的方法，其中通过玻璃体内注射对患病眼施用所述VEGF拮抗剂。

34.权利要求33的方法，其中通过中央玻璃体注射对患病眼施用所述VEGF拮抗剂。

35.权利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗剂表达于患病眼的变移上皮细胞中。

36.权利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗剂在患病眼中表达至少6个月。

37.权利要求36的方法，其中所述VEGF拮抗剂在患病眼中表达至少1年。

38.权利要求22的方法，其中所述眼部疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

39.权利要求22的方法，其进一步包含施用第二VEGF拮抗剂。

40.权利要求39的方法，其中所述第二VEGF拮抗剂是融合多肽，其包含融合至IgG重链分子的VEGF受体。

41.权利要求39的方法，其中所述蛋白质是VEGF抗体。

42.权利要求41的方法，其中所述VEGF抗体是贝伐单抗或兰尼单抗。

43.降低接受用于眼部的AAV基因治疗的哺乳动物眼内浑浊的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用基因治疗AAV病毒体，其包含不超过总病毒壳体90％的空病毒壳体。

44.权利要求43的方法，其中所述基因治疗AAV病毒体包含不超过总病毒壳体80％、70％、60％或50％的空病毒壳体。

45.权利要求44的方法，其中所述基因治疗AAV病毒体基本上无空病毒壳体。

46.权利要求43的方法，其中所述AAV是AAV2。

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