JP4944032B2 - 多量体構築物 - Google Patents

Description

本発明は、喘息、関節症、癌、および傷の再生などの病理的な新血管新生を治療するために組み換え構築された蛋白質の利用に関連する。

病理性新血管新生は、浮腫性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病網膜症、骨関節症、および喘息等の病気を構成する要素の一つである。また、新血管新生は、腫瘍の増殖および転移に重要な役割を果たす。新血管新生は、前駆血管形成因子および抗血管形成因子の厳密な均衡によって制御されている。

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、新血管新生に必須であることが知られる。ＶＥＧＦ活性の阻害は、ＡＭＤ、関節症の動物モデルおよび様々な腫瘍モデルにおいて新血管新生を抑制することが示されている。ＶＥＧＦ活性を阻害する方法は、抗体、受容体融合蛋白質、ペプチド、および小分子を含む。

ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）の蛋白質は、高い結合能でＶＥＧＦに結合することが示されている。Ｆｌｔ−１およびＫＤＲの両方は、細胞外領域に７個のＩｇ様ドメインを有する。ドメイン２は、ＶＥＧＦに結合するために必須であることが示されている。全長、可溶性受容体（ドメイン１−７）、およびドメイン１−３各々ならびにＩｇＧのＦｃとの融合蛋白質が、効果的にＶＥＧＦに結合する。しかしながら、ＩｇＧのＦｃおよびＩｇ様ドメイン２単独との融合は、ＶＥＧＦに結合できないが、Ｉｇ様ドメイン１および２の両方との融合は、結合可能であった。Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，１９９６。それゆえ、Ｉｇ様ドメイン１および３は、ドメイン２を伴うことで効果的なＶＥＧＦ結合に必要とされるようである。

（発明の簡潔な要約）
本発明の一の具体例として、融合蛋白質が提供される。融合蛋白質は、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基のポリペプチドから必須として成る。Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域である。

本発明の別の具体例は、式Ｘ−Ｙ−Ｚのポリペプチドである。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基の空間的な分離を提供するリンカー部分から必須として成る。Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域である。

また、本発明の別の態様としては、式Ｘ−Ｙ−Ｚで示される融合蛋白質である。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基のポリペプチドから必須として成る。Ｚは、抗体分子のＦｃ部位である。

式Ｘ−Ｙ−Ｚで示される融合蛋白質もまた提供される。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドである。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基の空間的分離を提供するリンカー部分から必須として成る。Ｚは、抗体分子のＦｃ部位である。

さらに、本発明の別の態様としては、ポリペプチドＸを多量体化する方法である。ポリペプチドＸは、ポリペプチドＸＹＺを形成するために、ポリペプチドＹを介してポリペプチドＺに結合される。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基のポリペプチドから必須として成る。Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域である。形成されるポリペプチドＸＹＺは、多量体化する。

さらに本発明の別の具体例としては、ポリペプチドＸを多量体化する方法を提供する。ポリペプチドＸは、部分Ｙを介してポリペプチドＺに結合されることで、ポリマ−ＸＹＺを形成する。Ｘは、細胞外受容体、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子から成る群から選択されるポリペプチドを含む。Ｙは、５−２５個のアミノ酸残基の空間的な分離を提供するリンカー部分から必須として成る。Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域である。形成されるポリペプチドＸＹＺは、多量体化する。

本発明の一の具体例において、核酸分子が提供される。本核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２、リンカー、および多量体化ドメインを含む融合蛋白質をコードする。融合蛋白質は、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む。

本発明の別の具体例において、融合蛋白質が提供される。本融合蛋白質は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２、リンカー、および多量体化ドメインを含む。本融合蛋白質は、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む。

本発明の別の具体例において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法が提供される。本核酸分子は、同定された哺乳類細胞に送達される。この核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２、リンカー、および多量体化ドメインを含む融合蛋白質をコードする。融合蛋白質は、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む。融合蛋白質の発現は、プロモーターによって制御される。融合蛋白質を発現する細胞が形成される。

さらに、本発明の別の具体例は、融合蛋白質を哺乳類に送達する方法である。融合蛋白質を発現する哺乳類細胞が、哺乳類に送達される。この細胞は、融合蛋白質を発現および分泌し、それによって融合蛋白質を哺乳類動物に供給する。融合蛋白質は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２、リンカー、および多量体化ドメインを包含する。融合蛋白質は、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む。

本発明の別の態様は、融合蛋白質を哺乳類動物に供給する方法である。ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２、リンカー、および多量体化ドメインを含む融合蛋白質が、哺乳類動物に送達される。融合蛋白質は、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む。代替的に、該融合蛋白質をコードする核酸構築物が、哺乳類動物に送達されることも可能であり、そのことにより、融合蛋白質が哺乳類動物によって発現される。

これらおよび下記により詳細が記述されている本発明の他の具体例は、血管増殖および炎症に関連する病気を治療する方法および薬剤を当該技術分野に提供するであろう。薬剤は、蛋白質の天然型に関連する上昇した安定性と生物利用を提供するかもしれない。

（図の説明）
図１。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ構築物における９−Ｇｌｙリンカーの可撓性領域。ＫａｒｐｕｓとＳｃｈｕｌｔｚ（１９８５年）の方法による予測相対的可撓性は、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ蛋白質中のポリグリシン９ｍｅｒ（９−Ｇｌｙ）のリンカー（アミノ酸９４から１０３）が、９−Ｇｌｙのリンカーを含まないＤ２−Ｆｃ構築物と比較して、平均（＞１）より大きな可撓性を有する領域であることを示す。両方の融合蛋白質は、箱型で囲まれた同一のアミノ酸配列を含む。ｓｐ−シグナルペプチド（アミノ酸−２４から−１）、Ｆｌｔ−１ドメイン２（アミノ酸１から９３）およびＩｇＧ１−Ｆｃ残基（２４４アミノ酸）。矢印は、ＳｉｇｎａｌＰＶ２．０ｐｒｏｇｒａｍを用いて予測したシグナルペプチダ−ゼ切断領域を表す（Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９７）。

図２。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ対Ｄ２−Ｆｃの生物学的活性。２９３細胞は、飢餓培地（Ｍ１９９＋５％ＦＣＳ）で培養され、ＣＭＶプロモーター制御下にあるＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃの発現カセットを含むプラスミドを移入された。条件培地（ＣＭ）は７２時間後に回収された。ＨＵＶＥＣが、９６穴プレート（２Ｅ３細胞／穴）の飢餓培地＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）中に分注され、５０ｕｌのＣＭとＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）が２４時間後に添加された。コントロール（＋／−ＶＥＧＦ）は、コントロールｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；ｐＥＧＦＰは、哺乳類細胞内で、より明るい蛍光およびより高い発現を示すように最適化され、野生型緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の赤色転換変動を有する）に由来するＣＭ中で培養された。陽性対照は、５０ｎｇのＦｌｔ−１−ＩｇＧ組み換え体蛋白質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理された。ＨＵＶＥＣ数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ｒｅｇｅａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、増殖３日間後に測定された。データは、３種類行われた２回の実験各々のＯＤ４９０平均値を表す。

図３。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃのウェスタンブロット解析。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃの蛋白質両方の大きさは、還元ゲルにおける移動と比較して非還元ゲルにおける移動は２倍になると思われる。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃを発現するプラスミドが、２９３細胞に移入された後、条件培地から蛋白質がロードされ、ＳＤＳ−電気泳動により分離され、ＰＶＤＦ膜に移行された。ブロットは、ヤギ抗ヒト抗ＩｇＧ１Ｆｃおよびラビット抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて行われた。

図４。９ＧｌｙのリンカーおよびＶＥＧＦＥｘ３を含むｓＦｌｔ−１複合蛋白質。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と過去に構築された蛋白質との構造比較。３個の蛋白質全ては、アミノ酸２４個のＦｌｔ−１シグナルペプチドおよびアミノ酸９３個のＦｌｔ−１ドメイン２から成るＦｌｔ−１ドメイン２の同一アミノ酸配列を含む。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、アミノ酸９個の９Ｇｌｙリンカー、アミノ酸１４個のＶＥＧＦＥｘ３およびアミノ酸１２０個のヒトＩｇＧ１重鎖ＦｃＣＨ３領域を含む。

図５。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３対Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃの生物学的活性。ドメイン２が９ＧｌｙリンカーおよびＶＥＧＦのＥｘ３を介してＣＨ３領域に結合されている、蛋白質Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、蛋白質Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃと比較して効果的にＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖を阻害する。５０ｎｇの組み換え体Ｆｌｔ−１−ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をコントロールとして使用した。

図６。Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃ蛋白質活性をＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較したＨＵＶＥＣ増殖測定。

図７。ウェスタンブロット。（１）Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、（２）Ｄ２−（Ｇ_４Ｓ）_３−Ｆｃおよび（３）ＥＧＦＰ蛋白質を発現するプラスミドを移入された２９３細胞の条件培地からの蛋白質（非還元と還元）が、ＳＤＳ−電気泳動によって分離され、ＰＶＤＦ膜に移行された。ブロットは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃおよびウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて行われた。

図８。９ＧｌｙリンカーもしくはＶＥＧＦＥｘ３の有無による蛋白質の組み合わせ。９Ｇｌｙリンカーおよび／もしくはＶＥＧＦＥｘ３、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３、Ｄ２−ＣＨ３およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３を有すもしくは有さない、３個の新規蛋白質の構造比較。

図９。９Ｇｌｙ、Ｅｘ３およびＣＨ３の組み合わせを有するＦｌｔ−１（Ｄ２）構築物におけるＨＵＶＥＣ増殖測定。蛋白質Ｄ２−Ｅｘ３／ＣＨ３、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３およびＤ２−ＣＨ３を含む２９３細胞（５ｕｌ）に由来する条件培地をＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較した。

図１０。ウェスタンブロット。２９３細胞に（１）Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、（２）Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３（５２／２６ｋＤａ）、および（３）Ｄ２−ＣＨ３（５０／２５ｋＤａ）を発現するプラスミドが移入された。条件培地（１５ｕｌの非還元および／もしくは還元されたＣＭ）中の２９３細胞に由来する蛋白質は、ＳＤＳ−電気泳動で分離され、ＰＶＤＦ膜に移行された。ブロットは、抗ヒトＶＥＧＦ−Ｒ１−ＨＲＰを用いて行われた（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

図１１。ＶＥＧＦ”ｉｎ ｖｉｔｒｏ”結合測定。既知濃度のＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＦｌｔ−１Ｄ（１−３）のコントロール可溶性受容体（濃度範囲０．２９−１５０ｐＭ）を含む２９３細胞由来の条件培地が、連続的に希釈され、１０ｐＭのＶＥＧＦを添加された。非結合ＶＥＧＦの量がＥＬＩＳＡで測定された。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、他の構築物すべてより高い結合能でＶＥＧＦに結合する。”ｎ”は、（移入および結合測定）非依存的な実験数を表す。

図１２。可溶性Ｆｌｔ−１構築物の結合反応速度が、ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用いた表面プラスモン共鳴によって測定された。ｓＦｌｔ−１構築物がセンサーチップ上に固定され、ＶＥＧＦ１６５が０．２から１５ｎＭの濃度範囲で注入された。センサーグラムの値がＢＩＡ評価プログラムを用いて求められ、速度定数ＫａおよびＫｄが決定され、解離定数（ＫＤ）がＫｄ／Ｋａ＝ＫＤの割合から計算された。より低いＫＤ値はより高い親和性を意味する。

図１３Ａ−１３Ｃ。図１３Ａは、各種リンカーを有するＦｌｔ−１構築物の発現レベルを示す。図１３Ｂは、各種リンカーおよびＩｇＧ１ＦｃのＣＨ３部分を有するＦｌｔ−１構築物の二量体化もしくは多量体化を表す。非還元および還元条件の相違は、蛋白質が多量体化したかである。図１３Ｃは、ＶＥＧＦ存在下のＨＵＶＥＣ増殖測定における条件培地中において、各Ｆｌｔ−１構築物の阻害的な生物活性が存在することを示す。構築物各々は、ＶＥＧＦ非存在下におけるＨＵＶＥＣ増殖レベルに近い阻害活性を示した。

図１４。網膜新生血管（ＮＶ）のマウス酸素誘導型網膜症モデルを用いて、Ｆｌｔ−１構築物の一つがマウスの眼に投与され、新血管新生が特定された。このマウスは高酸素状態に置かれた。血管新生を示す事例数は、同じマウスにおける未処理と処理した眼を比較して特定された。血管新生症例において５０％以上の減少がある場合に、マウスは”ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ”であると判断された。

（発明の詳細な説明）
本発明者の知見は、ドメイン１および３を有さないＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２が、効果的にＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ依存性内皮細胞の増殖を抑制できることである。ドメイン２は、リンカーを介して共有的に多量体化ドメインに結合され得る。リンカーは、一般的にポリペプチド鎖である。鎖の長さは、６、７、９、１１、１３、１５もしくはそれ以上のアミノ酸残基であり得るが、典型的には５から２５残基の間である。長さと側鎖構成物に依存して、リンカーは平均的な可擣性よりも大きな可撓性を有していてもよいが、それは必須ではない。可撓性は、当該技術分野において知られる算法によって計算され得る。多量体化ドメインは、多量体蛋白質の一部分であり、例えば、二量体、三量体、四量体等を形成するサブユニットの連係を増進する。効果的なＶＥＧＦの結合および／もしくはＶＥＧＦ依存性の内皮細胞増殖の抑制に適合可能な組み換え体蛋白質が、配列番号２、８、２１、２３および２５から成る群から選択される。

さらに、発明者は、多量体化ドメインおよびリンカーが、様々な他の蛋白質もしくは蛋白質の部位とともに使用され得ることで、多量体化を誘導することを見い出した。このような蛋白質は、多量体化する時に限りリガンドもしくは受容体に結合する蛋白質であるか、または多量体化する時に結合能が上昇する蛋白質であろう。多量体化に適する蛋白質は、細胞外受容体（その一部分を含む）、抗体可変領域、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子を包含する。適合する蛋白質は、チロシンキナーゼ受容体およびセリンスレオニンキナーゼ受容体を含む。細胞外受容体の詳細な例としては、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、ＦＧＦ受容体、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体等を含む。抗体可変領域の例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＳｃＦｖを含む。サイトカインの例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｂ、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ＴＮＦａ、およびＴＮＦ−１３を含む。ケモカインの例は、ＢＣＡ−１／ＢＬＣ、ＢＲＡＫ、ＣｈｅｍｏｋｉｎｅＣＣ−２、ＣＴＡＣＫ、ＣＸＣＬ−１６、ＥＬＣ、ＥＮＡ、ＥＮＡ−７０、ＥＮＡ−７４、ＥＮＡ−７８、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｘｏｄｕｓ−２、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ、ＧＲＯａｌｐｈａ（ＭＧＳＡ）、ＧＲＯ−ｂｅｔａ、ＧＲＯ−ｇａｍｍａ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、Ｉ−３０９、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＬＡＧ−１、ＬＤ７８−ｂｅｔａ、ＬＥＣ／ＮＣＣ−４、ＬＬ−３７、リンホタクチン（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＭＣＰ、ＭＣＡＦ（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ、ＭＤＣ、ＭＤＣ−２、ＭＤＣ−４、ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１ａｌｐｈａ、ＭＩＰ−１ｂｅｔａ、ＭＩＰ−１ｄｅｌｔａ、ＭＩＰ−３／ＭＰＩＦ−１、ＭＩＰ−３ａｌｐｈａ、ＭＩＰ−３ｂｅｔ、ＭＩＰ−４（ＰＡＲＣ）、ＭＩＰ−５、ＮＡＰ−２、ＰＡＲＣ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−２、ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ、ＳＤＦ−１ｂｅｔａ、ＴＡＲＣ、およびＴＥＣＫを含む。成長因子の例は、ヒトアンヒィレギュリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヒト血管形成蛋白質（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒトＡＣＥ、ヒトアンジオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、ヒトアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヒトアンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ヒトベータセルリン（Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ヒトＢＭＰ、ヒトＢＭＰ−１３／ＣＤＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−１４／ＣＤＭＰ−１、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−７、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトコロニー刺激因子、ヒトｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ、ヒトＧＣＳＦ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ、ヒト結合組織成長因子（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１、ヒトＣｒｙｐｔｉｃ、ヒトＥＣＧＦ、ヒトＥＧＦ、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ、ヒトエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヒトフェツィン（Ｆｅｔｕｉｎ）、ヒトＦＧＦ、ヒトＦＧＦ−１、ヒトＦＧＦ１０、ヒトＦＧＦ−１６、ヒトＦＧＦ−１７、ヒトＦＧＦ−１８、ヒトＦＧＦ−１９、ヒトＦＧＦ２、ヒトＦＧＦ−２０、ヒトＦＧＦ−３、ヒトＦＧＦ−４、ヒトＦＧＦ−５、ヒトＦＧＦ−６、ヒトＦＧＦ−７／ＫＧＦ、ヒトＦＧＦ−８、ヒトＦＧＦ−９、ヒトＦＧＦ−酸性、ヒトＦＧＦ−塩基性、ヒトＧＤＦ−１１、ヒトＧＤＦ−１５、ヒト成長ホルモン遊離因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、ヒトＨＢ−ＥＧＦ、ヒトヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、ヒトＨＧＦ、ヒトＩＧＦ、ヒトＩＧＦ−Ｉ、ヒトＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインヒビン（Ｉｎｈｉｂｉｎ）、ヒトＫＧＦ、ヒトＬＣＧＦ、ヒトＬＩＦ、ヒト Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ヒトＭＳＰ、ヒトミオスチン（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、ヒトミオスタチンプロペプチド（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）、ヒト神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ヒトオンコスタチン Ｍ（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）、ヒトＰＤ−ＥＣＧＦ、ヒトＰＤＧＦ、ヒトＰＤＧＦ（ＡＡホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ（ＡＢホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ(ＢＢホモダイマー)、ヒトＰＤＧＦ(ＣＣホモダイマー)、ヒトＰＩＧＦ、ヒトＰＩＧＦ、ヒトＰＩＧＦ−１、ヒトＰＩＧＦ−２、ヒトＳＣＦ、ヒトＳＭＤＦ、ヒト幹細胞成長因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ヒトＳＣＧＦ−ａｌｐｈａ、ヒトＳＣＧＦ−ｂｅｔａ、ヒトスロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヒト形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ヒトＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ヒトＴＧＦ−ｂｅｔａ、およびヒトＶＥＧＦを含む。

Ｆｌｔ−１受容体蛋白質は、７個のＩｇ様ドメインを含む細胞外部分を有する。これらは、ジェンバンク受託番号Ｐ１７９４８の残基番号３２から１２３、１５１から２１４、２３０から３２７，３３５から４２１、４２８から５５３、５５６から６５４、６６１から７４７に位置する。配列番号１５も参照。残基番号１から２６は、シグナル配列を含む。Ｆｌｔ−１蛋白質は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００２０１９（配列番号１４）で示されるＤＮＡ配列によってコードされる。

多量体化ドメインは、当該技術分野で知られるように使用され得る。例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２のラムダ重鎖Ｆｃ部分の配列は、ＣＨ３単独（アミノ酸３７１−４７７）もしくはＣＨ２およびＣＨ３両方のドメイン（アミノ酸２４７−４７７）について使用され得る。Ｉｇ分子のＦｃ部分は、酵素パパインによって抗体分子全体を切断することで得られる。他の方法を使用することでもこれらの部分が得られる。ＩｇＧ１のラムダ重鎖の蛋白質配列は、ジェンバンク受託番号Ｙ１４７３７および配列番号１０を参照のうえ。例えば、他のＩｇＧ型に由来およびＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ抗体に由来するような別のＦｃ領域が使用され得る。ＶＥＧＦの多量体化領域もまた使用され得る。ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列は、ジェンバンク受託番号ＮＭ００３３７６および配列番号１１に記載されている。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、ジェンバンク受託番号ＣＡＣ１９５１３および配列番号１２に記載されている。ＶＥＧＦ ｅｘｏｎ３（ＶＥＧＦ Ｅｘ３）にコードされるＶＥＧＦの多量体化領域（配列番号１３）は、ＶＥＧＦ蛋白質のアミノ酸残基７５−８８（配列番号１２）に相当する。多量体化ドメインは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の単量体融合蛋白質が、多量体に適合する速度で非変性ポリアクリルアミドゲル上を移動することを引き起こす。糖鎖付加は、ゲル中の蛋白質の移動に影響し得る。特定の配列がここで示されるが、対立形質のような変異体もよく使用され得る。典型的なこのような変異体は、開示された配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する。

多量体化は、例えば、ここで示されるように還元および非還元ゲルを使用して検証され得る。多量体化はまた、リガンド／受容体に対する蛋白質の上昇した結合能を検出することによって測定され得る。これに関連してＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）の表面プラスモン共鳴測定が使用され得る。これらの測定は、センサーチップ表面に近接する水層の屈折率の変化を測定することによって質量の変化を検出する。当該技術分野で知られるいくつかの方法が、多量体化を検出するのに使用され得る。

本発明によるリンカー部分は、例えば、５−１００個のアミノ酸残基、５−７５個のアミノ酸残基、５−５０個のアミノ酸残基、５−２５個のアミノ酸残基、５−２０個のアミノ酸残基、５−１５個のアミノ酸残基、５−１０個のアミノ酸残基、５−９個のアミノ酸残基を包含され得る。有用なリンカーの例は、ｇｌｙ_９（配列番号２７）、ｇｌｕ_９(配列番号２８）、ｓｅｒ_９（配列番号２９）、ｇｌｙ_５ｃｙｓｐｒｏ_２ｃｙｓ（配列番号３０）、（ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_３（配列番号３１）、ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ(配列番号３２）、ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号１３）、ＧｌｙＡｓｐＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｒｇＡｓｎＧｌｎＬｙｓ（配列番号２６）、およびＧｌｙ_９ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号３４）を包含する。使用され得る他のポリペプチドリンカーは、５、７、もしくは３０残基を含む異なる長さのポリグリシンを包含する。加えて、Ｆｌｔ−１の他部位、例えば、Ｆｌｔ−１のドメイン３などがリンカーとして使用され得る。配列番号１５を参照のうえ。リンカー部分はまた、ポリエチレングリコールのような他の重合体から作製され得る。かかるリンカーは、１０から１０００個、１０から５００個、１０から２５０個、１０から１００個もしくは１０から５０個のエチレングリコール単量体単位で存在し得る。適合する重合体は、アミノ酸残基が占める適当な範囲の大きさに近い大きさである必要がある。典型的な大きさの重合体は、約１０−２５オングストロームの空間を提供し得る。

本発明による融合蛋白質は、当該技術分野において知られる方法で作製され得る。かかる蛋白質が合成によって、あるいは作製される部分を連結することによって作製され得るが、組み換えによる製法を用いることもできる。融合される遺伝子配列は、組み換えＤＮＡの標準的な方法を利用して作製され得る。融合された遺伝子配列は、融合遺伝子配列を複製するために、ウイルスもしくはプラスミドベクターのようなベクター内に挿入され得る。最終的な受容細胞において機能するプロモーター配列が、融合遺伝子配列の上流に配置され得る。使用されるプロモーターは、構成的、誘導的もしくは抑制的であり得る。それぞれの型の例は、当該技術分野でよく知られている。当該技術分野で公知の方法によってベクターを宿主細胞もしくは哺乳類動物に導入することが可能である。使用に適合するベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびプラスミドを含む。仮に、ベクターがウイルスベクターであり、そのベクターがパッケージされる場合、ビリオンが感染細胞で利用され得る。裸のＤＮＡが使用されるなら、特定の宿主細胞に適合する移入もしくは形質転換の手段が使われ得る。重合体、リポゾームもしくはナノ粒子を利用する裸のＤＮＡの製剤形態が、融合遺伝子の送達に利用され得る。本発明による組み換え構築物を形質転換または移入された細胞は、当業者に利便性があるかもしれない。利用され得る典型的な細胞型は、バクテリア、酵母、昆虫および哺乳類細胞を包含する。利便性があることに、哺乳類細胞間では、多くの組織型細胞が、選択可能であるかもしれない。利用され得る典型的な細胞は、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、幹細胞、造血細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞およびケラチン生成細胞である。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質を生成するために利用され得るか、もしくはｉｎ ｖｉｖｏでコードされた蛋白質を生成するためにヒトを含む哺乳類動物に送達され得る。この送達方法は、核酸を哺乳類動物に、ウイルスベクターを哺乳類動物に、および融合蛋白質を哺乳類動物に送達することにとって代わるものである。

蛋白質もしくは核酸の組成物は、緩衝液のような担体、水溶性もしくは親油性担体、無菌性もしくは菌性、発熱性もしくは非発熱性担体中で存在し得る。非発熱性担体は、注射製剤として有用である。製剤は、例えば、凍結乾燥されたような液状もしくは固形状であり得る。製剤はまた、エアロゾルとして投与され得る。組成物は、一以上の融合蛋白質もしくは一以上の核酸、または融合蛋白質および核酸の両方を包含するであろう。組成物中の融合蛋白質および／もしくは核酸が単一種であり得、その場合には、ホモ多量体蛋白質が形成し、あるいは、組成物中の融合蛋白質および／もしくは核酸が異種であり得、その場合には、ヘテロ多量体蛋白質が形成する。ヘテロ多量体である場合において、典型的には、Ｘ部分は融合蛋白質間で異なるが、Ｚ部分は融合蛋白質間で同一である。

融合蛋白質は、当該技術分野で知られる方法によって細胞もしくは哺乳類宿主に供給され得る。蛋白質は、細胞もしくは宿主に送達され得る。核酸は、細胞もしくは宿主に投与され得る。形質転換もしくは移入された細胞は、細胞もしくは宿主に投与され得る。後者の場合、同一の遺伝学的背景を有する細胞が、移植の拒絶反応を減らすことに望ましい。

哺乳類の宿主動物への送達に適合する細胞は、器官、腫瘍、もしくは細胞系列に由来する哺乳類細胞型を包含する。例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、およびブタの細胞が使用され得る。使用制限がなく、適合する細胞型は、線維芽細胞、幹細胞、ケラチン生成細胞、造血細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、および幹細胞を包含する。

融合蛋白質もしくは融合蛋白質をコードする核酸の送達手段は、融合蛋白質を発現する細胞の送達、融合蛋白質の送達および融合蛋白質をコードする核酸の送達を包含する。融合蛋白質、細胞、もしくは核酸は、例えば、注射、カテーテル法、もしくは内視鏡によって望ましい器官もしくは腫瘍に直接送達され得る。それらはまた、静脈内、気管支内、腫瘍内、随腔内、筋肉内、眼内、局所、皮下、経皮もしくは経口によって送達され得る。浮腫加齢黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、慢性関節リウマチ、骨関節症、ブドウ膜炎、喘息および癌を患う患者を効果的に処置することが可能である。これらの処置は、症状および／もしくは病気の重症度および／もしくは病気の進行を改善するであろう。

核酸は、望ましいベクターを用いて、哺乳類動物、特にヒトに送達され得る。これらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびプラスミドベクターを包含するウイルス性もしくは非ウイルス性のベクターが含まれる。ウイルスの典型的な型には、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）を含む。核酸は、ウイルス粒子、リポゾーム、ナノ粒子および混合された重合体を含む十分に効果的な送達レベルを付与する望ましい形式で投与され得る。

蛋白質および核酸を組み合わせた処置が使用され得る。例えば、本発明による融合蛋白質が患者に投与され得る。もし、好ましい応答が観察される場合、融合蛋白質をコードする核酸分子が、長期間の効果を調べるために投与され得る。あるいは、蛋白質もしくは核酸が同時、もしくはほぼ同時に投与され得る。別の方法として、リガンドに対する抗体もしくは融合蛋白質が投与され、続けてもしくは同時に、受容体に対する抗体もしくは融合蛋白質が投与され得る。別の選択肢として、一方が抗体をコードし、他方が融合蛋白質をコードする核酸の組み合わせを用いる。本発明のＦｌｔ−１構築物（蛋白質もしくは核酸の形のどちらか）との組み合わせによって使用し得る幾つかの抗体は、ベバシマズムおよびラニビズマズであり、両者ともＶＥＧＦに結合する。これらは特に、癌および黄斑変性症それぞれを治療するのに有効である。

本発明の実施は、別段の表示がない限り、当該技術分野の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の一般的技術によって行われる。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉとＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら編．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９１）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅｅｄｓ．（１９８８））ならびに、ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））のような文献において十分に説明されている。

遺伝子送達の担体は、宿主細胞内へ挿入するポリヌクレオチドを運搬することが可能な分子である。遺伝子送達担体の例としては、リポゾーム、リポ蛋白質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルス外被、金属粒子およびバクテリアを含む天然型重合体と合成型重合体である生体適合性重合体、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに多くの原核生物および真核生物の宿主で発現を示す当該技術分野内で典型的に利用されるその他の組み換え用担体を含み、これらは単一種の蛋白質発現だけではなく、遺伝子治療にも利用され得るかもしれない。

遺伝子送達、遺伝子移入およびここで使用するそれらに類似する言葉は、導入に使用される方法に関わりなく、外因性ポリヌクレオチド（時に”トランスジーン”と呼ばれる）を宿主細胞に導入することを意味する。かかる方法は、”裸の”ポリヌクレオチドの送達に使用する技術（ポリヌクレオチドの導入に使用されるエレクトロポレーション、”遺伝子ガン”送達および多くの他技術）だけでなく、ベクター介在遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／移入、または多種の他蛋白質由来もしくは脂質由来の遺伝子送達複合体による）のような多くのよく知られている技術を包含する。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的にもしくは一時的に維持されるであろう。安定的な維持は、典型的には、導入されるポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合可能である複製開始点を含むか、あるいは染色体外レプリコン（例えばプラスミド）のような宿主細胞のレプリコンまたは核もしくはミトコンドリアの染色体に組み入られる必要がある。当該技術分野で周知であり、ここで記述されるように、多くのベクターが哺乳類細胞に遺伝子移入を仲介できることが知られている。

外因性ポリヌクレオチドを静脈内、筋肉内、門脈内もしくは別の方法による投与を介して宿主へ送達するために、外因性ポリヌクレオチドが、アデノウイルス、部分的に欠失されたアデノウイルス、完全に欠失されたアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、裸のプラスミド、プラスミド／リポゾーム複合体等のようなベクターに挿入される。本発明で示す方法および組成物で使用され得る発現ベクターは、例えばウイルスベクターを包含する。Ｉｎ ｖｉｖｏとｅｘ ｖｉｖｏの両方において、遺伝子治療で最も頻繁に使用される投与方法の一つは、遺伝子送達用ウイルスベクターの使用である。多種類のウイルスが知られ、その多くが遺伝子治療の目的で研究されている。最も一般的に使用されるウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスを包含する。

アデノウイルスは、非外皮性であり、古典的遺伝学と分子生物学における研究を通してよく特徴づけられた約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウイルスである（Ｈｕｒｗｉｔｚ， Ｍ．Ｓ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓら編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｈｉｔｔ， Ｍ．Ｍ．ら，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９９）。ウイルス遺伝子からウイルス蛋白質が、時間経過によって２つに分かれて生成されることから、ウイルス遺伝子は、早期（Ｅ１−Ｅ４と表す）および後期（Ｌ１−Ｌ５と表す）の転写単位に区分けされる。これらの事象の境界は、ウイルス性ＤＮＡの複製である。ヒトアデノウイルスは、赤血球の血球凝集、発癌能、ＤＮＡおよび蛋白質のアミノ酸組成および相同性、ならびに抗原的関連性を包含する特性に基づいて、多くの血清型（約４７個がそれに応じて番号付けられ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦの６グループに区分けされた）に分けられる。

組み換え体アデノウイルスベクターは、遺伝子送達の担体としての使用に対していくつかの有利な点を有し、すなわち、それらは、分裂と非分裂細胞の指向性、極小な病原性、ベクターのストックを調製するための高い力価で複製する能力、および大きい挿入物を運搬する能力を包含する（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９９２；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４ １９９４）。擬性アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）および部分的に欠失されたアデノウイルス（”ＤｅＡｄ”と呼ばれる）のように多くのアデノウイルス遺伝子配列欠失を有するアデノウイルスベクターは、核酸の受容細胞への送達に適合した担体として望ましいアデノウイルスの特性を有するように設計されている。

特に、擬性アデノウイルスベクター（ＰＡＶｓ）はまた、’弱いアデノウイルス’もしくはミニ−アデノウイルスベクターとして知られ、ベクターの複製およびパッケージに必要である最小のシス作用性ヌクレオチド配列を含み、一以上の導入遺伝子を包含することが可能である、アデノウイルスのゲノムに由来するベクターである（米国特許第５，８８２，８７７号には、擬性ベクター（ＰＡＶ）とＰＡＶを生成する方法を含み、出典明示により、本明細書に一体化させる）。ＰＡＶｓは、遺伝子送達に適合する担体としてアデノウイルスの望ましい特性を有するように設計されている。アデノウイルスベクターは、ウイルスの増殖に不必要である領域の欠失によって一般的に８ｋｂまでの大きさを挿入することが可能である一方で、最大の運搬能力は、ＰＡＶｓを包含する多くのウイルスのコード配列を欠失したアデノウイルスベクターを使用することで達成し得る。Ｇｒｅｇｏｒｙらの米国特許第５，８８２，８７７号；Ｋｏｃｈａｎｅｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５，７３１−５，７３６，１９９６；Ｐａｒｋｓら,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３５６５−１３５７０，１９９６；Ｌｉｅｂｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８９４４−８９６０，１９９６；Ｆｉｓｈｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：１１−２２，１９９６；米国特許第５，６７０，４８８号;ＰＣＴ公開番号Ｗ０９６／３３，２８０,１９９６年１０月２４日に公開；ＰＣＴ公開番号Ｗ０９６／４０９５５，１９９６年１２月１９日に公開 ＰＣＴ公開番号Ｗ０９７／２５４４６，１９９７年７月１９日に公開；ＰＣＴ公開番号 Ｗ０９５／２９９９３，１９９５年１１月９日に公開； ＰＣＴ公開番号Ｗ０９７／００３２６，１９９７年１月３日に公開；Ｍｏｒｒａｌら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２７０９−２７１６，１９９８を参照のうえ。このようなＰＡＶｓは、外部からの核酸を約３６ｋｂまで受け入れることが可能であり、ベクターの運搬能力は、最適化されているので優位である一方で、ベクターに対する宿主の免疫反応もしくは複製可能なウイルスの生成能力は減少する。ＰＡＶベクターは、複製開始点を包含する５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ならびにＰＡＶゲノムのパッケージに必要であるシスヌクレオチド配列を含み、例えば、プロモーター、エンハンサー等の適切な調節エレメントを有する一以上の導入遺伝子に適合することが可能である。

その他には、部分的に欠失されたアデノウイルスベクターは、ウイルスの複製に必要であるアデノウイルス早期遺伝子の大部分がベクターから欠失し、条件プロモーターの制御下にある生成細胞の染色体内に置かれる部分的欠失（”ＤｅＡｄ”と呼ばれる）ベクターを供給する。生成細胞に配置される欠失可能なアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４（ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７のみが細胞内で必要とされる）、ｐＩＸおよびｐＩＶａ２を包含する。Ｅ３もまたベクターから欠失され得るが、ベクターの産生に必須ではないことから、生成細胞から除去することが可能である。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子は、一般的にはベクター内に存在するが、ＭＬＰは条件プロモーターに置換され得る。

ＤｅＡｄベクターおよび生成細胞系列の使用に適合可能な条件プロモーターは、以下の性質を有するものを包含する。すなわち、細胞障害性もしくは細胞増殖抑制性のアデノウイルス遺伝子が、細胞を害するレベルで発現しないような、未誘導状態における低い基礎発現、およびベクターの複製と組み立てを支持するウイルス蛋白質が、十分量生成されるような、誘導状態における高いレベルの発現を有するものである。ＤｅＡｄベクターおよび生成細胞系列における使用に適合する望ましい条件プロモーターは、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパミシンに基づく二量体化物（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）遺伝子制御システム、エクジソン遺伝子制御システム、およびテトラサイクリン遺伝子制御システムを包含する。本発明において、Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら,Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９ １０：１４９９−５０７に記載されているＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）の技術（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）が有用であり、出典明示により本明細書に一体化させる。部分的に欠失されたアデノウイルス発現システムは、さらにＷＯ９９／５７２９６で示され、出典明示により本明細書に一体化させる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ゲノムの大きさが４．６ｋｂである一本鎖のヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは２つの主要な遺伝子を含む：ｒｅｐ蛋白質（Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子ならびにＡＡＶの複製、レスキュー、転写および組込みをコードするｃａｐ遺伝子であり、さらに、ｃａｐ蛋白質はＡＡＶのウイルス粒子を形成する。ＡＡＶは、アデノウイルスもしくは他のヘルパーウイルス（例えばヘルペスウイルス）に依存して必須遺伝子産物を供給することにその名前が由来し、それらの産物は、ＡＡＶに生産的な感染、すなわち、宿主細胞における自身の再合成を可能にする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、一般的にはアデノウイルスに感染している宿主細胞に重複感染することによってレスキューされるまで前駆体ウイルスとして宿主細胞の染色体に組み込まれる（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｏｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２７，１９９２）。

遺伝子移入ベクターとしてのＡＡＶの利点は、いくつかの生物学的な特徴に起因する。ＡＡＶゲノムの両末端には、逆位末端配列（ＩＴＲ）として知られるヌクレオチド配列が存在し、その配列は、ウイルスの複製、レスキュー、パッケージおよび組込みに必要であるシス作動性のヌクレオチド配列を含む。トランス活性におけるｒｅｐ蛋白質を介するＩＴＲの組み込み機能は、ヘルパーウイルス非存在下において、ＡＡＶゲノムが感染後に細胞内の染色体に組み込まれることを可能にする。このウイルス独特な特性は、細胞内ゲノムへの遺伝子の利点を含む組み換え体ＡＡＶの組み込みを可能にするとともに、遺伝子移入におけるＡＡＶの利用に関連する。それゆえに、遺伝子移入の目的に適した多くの安定な遺伝学的な形質転換が、ｒＡＡＶベクターの使用によって成し遂げられるかもしれない。さらに、ＡＡＶの組み込み部位がよく解明され、その部位はヒト染色体１９番に位置する（Ｋｏｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２２１１−２２１５，１９９０）。この組込み部位の予測可能性は、宿主の遺伝子を活性化もしくは不活性化、またはコード領域を分断してしまうかもしれない細胞内ゲノムへのランダムな挿入事象の危険、ｒＡＡｖベクターの使用を制限しうる結果を減らす。ｒＡＡＶベクターのデザインにおけるこの遺伝子の除外は、ｒＡＡＶベクターとともに観察された変動した組み込みパターンを生じるかもしれない（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：２７５−２８４，１９９７）。

遺伝子移入のためのＡＡＶ利用には、他の有利な点がある。ＡＡＶ宿主の範囲が広いことである。さらに、ＡＡＶは、レトロウイルスと異なり、停止状態および分裂状態の両状態の細胞に感染することが可能である。加えて、ＡＡＶは、ヒトの病気に関連せず、レトロウイルス由来の遺伝子移入ベクターで生じる多くの事象を防ぐ。

組み換え体ｒＡＡＶベクターを作製する標準的なアプローチには、一連の細胞内イベントに協調することが必要である：ＡＡＶのＩＴＲ配列に隣接させた導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターゲノムの宿主細胞への移入、トランス活性で必要となるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ蛋白質の遺伝子をコードするプラスミドによる宿主細胞への移入、ならびにトランス活性で必要となる非ＡＡＶヘルパーの機能を提供するヘルパーウイルスを移入された細胞の感染である（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｏｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９，１９９２）。アデノウイルス（もしくは他のヘルパーウイルス）蛋白質は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子の転写を活性化し、ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子の転写を活性化する。ｃａｐ蛋白質は、ｒＡＡＶゲノムをｒＡＡＶウイルス粒子内にパッケージするのにＩＴＲ配列を利用する。それゆえ、パッケージの効率は、ｒＡＡＶベクターゲノムに必要とされるシス活性のパッケージ配列への近接可能性とともに、適当量の構造蛋白質の利用可能性によってある程度決定される。

レトロウイルスベクターは、遺伝子送達に用いられる一般的な道具である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：４５５−４６０）。再配列されていない単コピー遺伝子を齧歯類、霊長類およびヒト体細胞のような広い範囲内で送達するレトロウイルスベクターの能力は、遺伝子を細胞へ送達するのに最適である。

レトロウイルスはＲＮＡウイルスであり、そのゲノムはＲＮＡである。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、ゲノムＲＮＡは、中間体であるＤＮＡに逆転写され、感染細胞の染色体ＤＮＡへ非常に効率的に組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと呼ばれている。プロウイルスの転写および感染性ウイルスへの構築は、混入するヘルパーウイルスが同時生成することなしに、キャプシド形成を可能にする適当な配列を含む適合するヘルパーウイルスの存在下、もしくは細胞系列で生じる。もしキャプシド形成に必要な配列が適合するベクターとの共移入によって提供されるならば、ヘルパーウイルスは、組み換え体レトロウイルスの生成に必要でない。

レトロウイルスのゲノムおよびプロウイルスのＤＮＡは、３個の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、それらは２個の末端反復（ＬＴＲ）配列で挟まれている。ｇａｐ遺伝子は、内部構造（マトリックス、キャプシドおよびヌクレオキャプシド）蛋白質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし、およびｅｎｖ遺伝子は、ウイルス外皮性糖蛋白質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する働きがある。ＬＴＲは、ウイルスの複製に必要である他のシス活性配列全てを含む。レンチウイルスは、（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および／もしくはＳＩＶ中に）ｖｉｔ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含む付加遺伝子を有する。ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子内への効率的なキャプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要である配列が、５’ＬＴＲに隣接する。仮に、キャプシド形成（もしくはレトロウイルスの感染性ビリオンへのパッケージ）に必要な配列がウイルスゲノムから喪失しているなら、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成を阻害するシス活性の欠失となる。しかしながら、得られる変異体は、ビリオン蛋白質全ての合成を指示し得る。

レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに付加して、調節的もしくは構造的な機能を有する遺伝子を包含する複合体レトロウイルスである。より高度な複雑性は、潜伏感染時にレンチウイルスが自身のライフサイクルを調節することを可能にする。典型的なレンチウイルスには、ＡＩＤＳの病原因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がある。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨＩＶは、リンパ球およびマクロファージのような稀にしか分裂しない最終的に分化した細胞に感染し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＩＶは、アフィディコリンもしくはガンマ線照射の処理によって細胞周期が停止した状態のＨｅＬａ−Ｃｄ４もしくはＴリンパ球のみならず、初代培養の単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）にも感染し得る。細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を介する、活性化したＨＩＶ前駆組込み複合体の核移行に依存する。これは、標的細胞の核移入機能を有する複合体における多様で一部重複する分子決定因子の相互作用によって生じる。同定された決定因子は、ｇａｐマトリックス（ＭＡ）蛋白質における機能的な核局在シグナル（ＮＬＳ）、核親和性ビリオン関連蛋白質、ｖｐｒ、およびＭＡ蛋白質におけるＣ末端のリン酸化チロシン残基を包含する。遺伝子治療に用いられるレトロウイルスは、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号および米国特許第５，９９４，１３６号で示され、出典明示により本明細書に一体化させる。

ＤＮＡを細胞に送達する他の方法は、送達にウイルスを使用しない方法である。例えば、陽イオン両親媒性化合物が、本発明の核酸を送達するのに使用され得る。生物学的な活性分子の細胞内送達に利用するために設計された化合物は、非極性および極性の両方の環境（例えば、細胞膜、組織液、細胞内構築物、および生物学的活性分子自身内もしくは上）において相互作用する必要があることから、このような化合物は、典型的には、極性および非極性ドメインを含むように設計される。かかるドメイン両方を有する化合物は、両親媒性物質と呼ばれ、このような細胞内送達（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのどちらかに応用）を促進する利用が公知されている多くの脂質および合成脂質が、この定義に適合する。このような両親媒性物質の中で特に重要なクラスの一つが、陽イオン両親媒性物質である。一般的に、陽イオン両親媒性物質は、物理学的ｐＨ付近において陽に帯電を示し得る極性グループであり、この特性は、例えば、ＤＮＡのように負に帯電したポリヌクレオチドを包含する、多種類型の生物学的な活性（医薬上）分子と相互作用するのに重要であることが当該技術分野で理解されている。

遺伝子送達用の陽イオン両親媒性物質を含む組成物の利用は、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；米国特許第５，２７９，８３３号；米国特許第５，６５０，０９６号；米国特許第５，７４７，４７１号；米国特許第５，７６７，０９９号；米国特許第５，９１０，４８７号；米国特許第５，７１９，１３１号；米国特許第５，８４０，７１０号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第５，９２５，６２８号；米国特許第５，９１２，２３９号；米国特許第５，９４２，６３４号；米国特許第５，９４８，９２５号；米国特許第６，０２２，８７４号；米国特許第５，９９４，３１７号；米国特許第５，８６１，３９７号；米国特許第５，９５２，９１６号；米国特許第５，９４８，７６７号；米国特許第５，９３９，４０１号；および米国特許第５，９３５，９３６号で示され、出典明示により本明細書に一体化させる。

加えて、本発明の核酸は、”裸のＤＮＡ”を使用して送達され得る。移入促進蛋白質、ウイルス粒子、リポソーム製剤、荷電脂質およびカルシウムリン酸沈殿剤とは関連せず、プロモーターを結合した望ましいポリペプチドもしくはペプチドをコードする非感染性で非組込み型のＤＮＡ配列を送達する方法が、米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，９６３，６２２号；米国特許第５，９１０，４８８号に記述され、出典明示により本明細書に一体化させる

また、ウイルス性と非ウイルス性の要素を組み合わせる遺伝子移入システムが報告されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１５４８；Ｗｕら．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１１５４２；Ｗａｇｎｅら.（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６０９９；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら．（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３００；Ｃｕｒｉｅｌら．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８８５０；Ｋｕｐｆｅｒら． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：１４３７およびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋら／．（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ. １：１８５．多くの場合、アデノウイルスが、そのエンドソームの特性を生かして遺伝子送達システムに取り入れられている。報告されたウイルス性と非ウイルス性要素の組み合わせは、一般的には、アデノウイルスの遺伝子送達複合体への共有結合もしくは陽イオン脂質：ＤＮＡ複合体を伴う非結合アデノウイルスの共内部移行のいずれかに関連する。

眼にＤＮＡおよび蛋白質を送達するため、典型的には、局所的な投与が施される。これは、投与する必要のＤＮＡ量および全身性副作用を制限するという点で有利である。多くの送達可能な形態が使用され得る。それらは、角膜への点眼を介した遺伝子銃による局所投与、結膜下注射、前房内注射、角膜を介した前房内注射、基質内注射、電磁波を用いた角膜への応用、角膜内注射、網膜下注射、硝子体内注射、および眼球内注射を包含する。代替的には、細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏで移入もしくは形質導入され、眼内移植によって送達され得る。Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：４９０−４９４，２００２；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：６４９−６５４，１９９６；Ｂｏｒｒａｓ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７６：６４３−６５２，２００３；Ｃｈａｕｍ，Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ４７：４４９−４６９，２００２；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５３７−５４４（２００２）； Ｌａｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：８０４ ８１３，２００２；Ｐｌｅｙｅｒ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：２７７−２９３，２００３を参照のうえ。

様々な提唱された治療用薬剤および投与の効果が、特定の病気に対応する動物モデルを用いて試験され得る。例えば、未熟児網膜症は、Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５：１０１−１１１，１９９４に記載されるようにマウスの酸素誘導型網膜症モデルで試験され得る。マウスにおけるレーザー誘導型脈絡膜新生血管は、加齢黄斑変性症のような病気の際に生じるヒト脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）のモデルとして利用され得る。Ｔｏｂｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５３：１６４１−１６４６，１９９８。ＣＮＶの他のモデルが、霊長類、ラット、ミニブタ、およびウサギにおいて開発された。加齢黄斑変性症のマウスモデルは、遺伝子欠損マウスを用いて開発された。単球走化性蛋白質−１もしくはＣ−Ｃケモカイン受容体−２のどちらか一方を欠損させたマウスが加齢黄斑変性症の特性を示す。Ａｍｂａｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１３９０−１３９７，２００３。

本発明は、現時点で発明を実施するのに望ましい様式を包含する特定の例に関して記述されている一方で、当業者は、添付した請求の範囲を説明する本発明の精神および範囲内である上述したシステムおよび技術に対する多くのバリエーションと置き換えが存在することを理解するであろう。

実施例１
２個の構築物が作製された。第一に、ポリグリシン９−ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）のリンカーを含むＤ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃであり、第二として、９Ｇｌｙリンカーを除いて同一の配列のＤ２−Ｆｃである（図１）。

我々は、配列解析プログラムＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．５．１（ＩＢＩ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｂｏｘを用いて、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃとＤ２−Ｆｃ蛋白質のアミノ酸配列について解析を行った。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ配列におけるポリグリシン９−ｍｅｒリンカーが、Ｋａｒｐｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９８５）Ｎａｔｕｒｗｉｓｓ，７２：２１２−２１３の可撓性予測法による平均の可撓性より高い領域として同定された。このような領域は、Ｄ２−Ｆｃ配列中では検出されなかった（図１）。

実施例２
我々は、同定された可撓性ポリグリシン９−ｍｅｒリンカーによってＩｇＧ１のＦｃ領域に連結させたＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ）を検証した。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ融合蛋白質は、効果的にＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ依存ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害することが可能である。図２参照。対照的に、Ｆｌｔ−１のＩｇＧ１様ドメイン２が直接ＩｇＧ１重鎖（Ｆｃ）に結合して、Ｄ２−Ｆｃを形成する時には、最少量のＶＥＧＦ結合のみが観察された。図２参照。ＩｇＧ１のＦｃを介した二量体化と可撓性リンカー挿入の両方が、Ｆｌｔ−１ドメイン２のＶＥＧＦ結合を促進すると考えられる。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃにおける二量体型の存在は、ウェスタンブロット解析で確認された。図３参照。

実施例３
ＡＡＶベクターの硝子体腔内注射（０．０００５ｍＬの体積中１ｘ１０^８から１ｘ１０^９個の粒子）が、新生仔（Ｐ０）もしくは生後１日後（Ｐ１）のＣ５７ＢＬ／６系統マウスに施される。網膜新生血管（ＮＶ）が、Ｐ７の仔とこの仔らを養育中の雌親を５日間過酸素状態におくことによって、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスで誘発される。これらの仔をＰ１２で通常の大気に戻し、Ｐ１７（ＮＶピーク状態時）で安楽死させる。（Ｓｍｉｔｈ ＬＥＨ、 Ｗｅｓｌｏｗｓｋｉ Ｅ、 ＭｃＬｅｌｌａｎ Ａ、 Ｋｏｓｔｙｋ ＳＫ、Ｄ’Ａｍａｔｏ Ｒ、 Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ。マウスにおける酸素誘発網膜症。Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈ Ｖｉｓ Ｓｃｉ。 １９９４；３５：１０１−１１１）眼全体をパラフィンで包埋し、５マイクロン間隔で連続的に横断面を作製する。ＮＶの程度は、１００マイクロン毎に選んだ切片において境界膜の内側の内皮細胞核の数を数えることで決定される。

抗血管形成薬剤をコードするＡＡＶベクターで処理した動物の同齢集団を、無関連な導入遺伝子をコードするベクターもしくは導入遺伝子をコードしないベクターで処理した同齢集団と比較する。各々の処理した眼における内皮細胞核の平均数が、各々の動物の未処理の眼におけるその数と比較される。

実施例４、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３の作製
Ｆｌｔ−１のドメイン２がＶＥＧＦ１６５の結合に必須であることが示されている。しかし、Ｆｌｔ−１のドメイン２単独ではＶＥＧＦのＡに結合できないことが示されていた（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６．）。ＶＥＧＦのＡは、二量体として存在する時、酸性残基（成熟蛋白質のアミノ酸６３−６７）を介してＦｌｔ−１に結合し、リガンド誘導型二量体受容体として機能することが可能である（Ｋｅｙｔら．， １９９６）。

それゆえ、Ｆｌｔ−１のドメイン２の二量体化は、Ｆｌｔ−１のドメイン２がＶＥＧＦのＡへ結合する方法として使用されてきた。ＩｇＧ重鎖の断片との融合は、蛋白質の二量体化に用いられ得る（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら．， １９９６．）。ここで、我々は、ＶＥＧＦのＡ（配列番号１２）のアミノ酸７５−８８（すなわちＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮ；配列番号１３）が、ｓＦｌｔ−１混合蛋白質の生物学的活性を上昇させることを示す。

最初に３個の混合蛋白質が設計された。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、Ｄ２−ＦｃおよびＤ２−９ＧｌｙＥｘ３／ＣＨ３である（図４）。３個の混合蛋白質全ては、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃのように同一のＦｌｔ−１のドメインＤ２を含む。ＶＥＧＦへの結合は、ポリグリシン９−ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）リンカーを含まないＤ２−Ｆｃにおいて観察されなかった。３番目の蛋白質であるＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、ポリグリシン９−ｍｅｒ（９Ｇｌｙ）リンカーおよびＶＥＧＦの多量体化ドメイン（アミノ酸ＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮ；配列番号１３；ＶＥＧＦ Ｅｘ３）を包含するが、また、ヒトＩｇＧ１重鎖ＦｃのＣＨ３領域（配列番号１０のアミノ酸３７１−４７７）をも含む。

蛋白質Ｄ２−Ｆｃは、ＨＵＶＥＣ増殖測定（図５）において効果的な阻害活性を示さず、それに伴い、効果的にＶＥＧＦ１６５に結合しなかった。しかしながら、３番目の混合蛋白質であるＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３は、９ＧｌｙリンカーおよびＶＥＧＦ１６５の二量体化領域（Ｅｘ３）の両方を介してＣＨ３領域に融合した、Ｆｌｔ−１のドメイン２を含み、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣの増殖測定法において阻害活性を示した（図５）。これは、この混合蛋白質がＶＥＧＦ１６５に効果的に結合することを意味する。

実施例５、Ｆｌｔ−１のＤ２構築物におけるリンカー（Ｇｌｙ _４ Ｓｅｒ） _３ の使用
以前に、数個のポリグリシンリンカーの使用が、蛋白質の性状を改変すると報告されている（Ｍｏｕｚら，１９９６；Ｑｉｕら，１９９８）。次の構築物のために、我々は、別の型のリンカーである１５−ｍｅｒ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３を試した（Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８）。Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃ蛋白質が作製され、この蛋白質は、Ｆｌｔ−１ドメイン２、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーおよびヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ領域を含む。

Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃは、さらにＨＵＶＥＣ増殖測定法で検査された。Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃの生物学的活性は、ＨＵＶＥＣの増殖阻害によって測定され、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３の生物学的活性に類似した（図６）。

Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃ構築物は、さらにウェスタンブロットを用いて検査され、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃと比較された（図９）。両方の構築物は、二量体型で多く存在し、単量体型は、還元されたサンプルの分離後に検出された。

実施例６、Ｆｌｔ−１（Ｄ２）構築物における９ＧｌｙもしくはＶＥＧＦＥｘ３の役割
可溶性受容体ＶＥＧＦへの結合に対する９ＧｌｙリンカーもしくはＶＥＧＦ二量体化配列Ｅｘ３の役割を調べるために、３個の異なる構築物、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ、Ｄ２−ＣＨ３およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３が作製された（図８）。３個の構築物全てが作製され、以前の構築物と同様にＣＭＶプロモーターの制御を受けるようにした。これらのＶＥＧＦ抑制活性はＨＵＶＥＣ増殖測定法で測定された（図９）。

ＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む蛋白質のＨＵＶＥＣ増殖測定法は、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３（Ｅｘ３無し）および蛋白質Ｄ２−Ｅｘ３／ＣＨ３（９Ｇｌｙリンカー無し）が、Ｄ２−９ＧｌｙＥｘ３／ＣＨ３と比較して、同様のＶＥＧＦ抑制能力を有することを示した。しかし、蛋白質Ｄ２−ＣＨ３は、これら全ての中で最も弱いＶＥＧＦ阻害剤であると思われた（図９）。

移入された２９３細胞由来条件培地のＦｌｔ−１におけるＥＬＩＳＡデータでは、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３については、同様のＦｌｔ−１レベル（７０−９０ｎｇ／ｍｌ）を示し、最小のＤ２−ＣＨ３活性形態については、やや高いレベル（約１５０ｎｇ／ｍｌ）を示した。Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３およびＤ２−ＣＨ３の構築物のウェスタンブロット（図１０）は、非還元条件での二量体型の普及を示している。

実施例７、Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、全ての構築物より一層ＶＥＧＦに結合する。
ＶＥＧＦ結合測定は、細胞遊離中における可溶性ＶＥＧＦ受容体に対する相対的なＶＥＧＦ結合能の比較を可能にする。

簡潔に説明すると、既知濃度の可溶性受容体（０．２９−１５０ｐＭの濃度範囲）を含む条件培地は、連続的に希釈され、１０ｐＭのＶＥＧＦを添加された。非結合ＶＥＧＦ量は、ＥＬＩＳＡによって測定された。Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃは、０．００１から０．２ｐＭの受容体濃度において全ての他の構築物より高いＶＥＧＦ結合能を示す。Ｄ２−ＣＨ３は、ＶＥＧＦに対して最も低い結合能を有する（図１１）。

（参考文献）
Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら,ＥＭＢＯ Ｊ．１５，１９９６,４９１９
Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.２０３,４６−８８
Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕｓａ，８５，５８７９−５８８３．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.２０３，８８−９８ Ｋａｒｐｕｓ,Ｐ．Ａ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｗｉｓｓ.,７２，２１２−２１３．
Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．,ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５６３８−５６４６．Ｋｏｒｔｔ，Ａ．Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ，１０，４２３−４３３．Ｌｅｅ，Ｙ−Ｌ．ら（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９，４５７−４６５
Ｍｏｕｚ Ｎ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９４１４−９４１９．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，ら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１０，１
Ｑｉｕ，Ｈ．，ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１１７３−１１１７６．

Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ構築物における９−Ｇｌｙリンカーの可撓性領域を示す。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ対Ｄ２−Ｆｃの生物学的活性を示す。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−Ｆｃのウェスタンブロット解析を示す。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と過去に構築された蛋白質との構造比較を示す。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３対Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃの生物学的活性を示す。 Ｄ２−（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３−Ｆｃ蛋白質活性をＤ２−９Ｇｌｙ−ＦｃおよびＤ２−９Ｇｌｙ−Ｅｘ３／ＣＨ３と比較したＨＵＶＥＣ増殖測定。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、Ｄ２−（Ｇ_４Ｓ）_３−Ｆｃ、およびＥＧＦＰ蛋白質を用いたウェスタンブロットの結果を示す。 ９Ｇｌｙ−ＣＨ３、Ｄ２−ＣＨ３およびＤ２−Ｅｘ３／ＣＨ３を有すもしくは有さない、３個の新規蛋白質の構造比較を示す。 ９Ｇｌｙ、Ｅｘ３およびＣＨ３の組み合わせを有するＦｌｔ−１（Ｄ２）構築物におけるＨＵＶＥＣ増殖測定を示す。 Ｄ２−９Ｇｌｙ−Ｆｃ、Ｄ２−９Ｇｌｙ−ＣＨ３およびＤ２−ＣＨ３を用いたウェスタンブロットの結果を示す。 ＶＥＧＦ“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”結合測定を示す。 ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用いた表面プラスモン共鳴によって測定された可溶性Ｆｌｔ−１構築物の結合反応速度を示す。 各種リンカーを有するＦｌｔ−１構築物の発現レベルを示す。 網膜新生血管（ＮＶ）のマウス酸素誘導型網膜症モデルを用いて、Ｆｌｔ−１構築物の一つがマウスの眼に投与され、新血管新生が特定された。

Claims (57)

1. 式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン２を含むが、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン１および３を欠き、該ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン２は、Ｙを介してＺに共有結合しており、Ｙは、９−２５個のアミノ酸残基のポリペプチドからなり、Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域または抗体分子のＦｃ部分である）で示される、融合蛋白質。
2. ＸがＶＥＧＦ−Ｒ１（ＦＬＴ−１）のＩｇ様ドメイン２である、請求項１記載の融合蛋白質。
3. ポリペプチドＹが可撓的である、請求項１記載の融合蛋白質。
4. ポリペプチドＹが、ｇｌｙ_９（配列番号２７）、ｇｌｕ_９（配列番号２８）、ｓｅｒ_９（配列番号２９）、ｇｌｙ_５ｃｙｓｐｒｏ_２ｃｙｓ (配列番号３０)、（ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_３(配列番号３１)、ＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号３２）、ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号１３）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ-Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号２６）、およびＧｌｙ_９ＰｒｏＳｅｒＣｙｓＶａｌＰｒｏＬｅｕＭｅｔＡｒｇＣｙｓＧｌｙＧｌｙＣｙｓＣｙｓＡｓｎ（配列番号３４）から成る群から選択される、請求項１記載の融合蛋白質。
5. ＺがＩｇＧ１のＣＨ３領域である、請求項１記載の融合蛋白質。
6. ＺがＩｇＧ２のＣＨ３領域である、請求項１記載の融合蛋白質。
7. ＦｃがＩｇＧ Ｆｃである、請求項１記載の融合蛋白質。
8. ＩｇＧ ＦｃがＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項７記載の融合蛋白質。
9. さらに一以上の医薬上許容される添加物もしくは担体を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の融合蛋白質を含む、組成物。
10. 液体製剤である、請求項９記載の組成物。
11. 凍結乾燥製剤である、請求項９記載の組成物。
12. 該融合蛋白質の多量体を含む組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項記載の一以上の融合蛋白質を含む組成物。
13. ホモ多量体を形成する単一種の融合蛋白質から必須として成る、請求項１２記載の組成物。
14. ヘテロ多量体を形成する２種以上の融合蛋白質から必須として成る組成物であって、少なくとも１つの融合蛋白質におけるＸ部分が、別の融合蛋白質におけるＸ部分と異なる、請求項１２記載の組成物。
15. さらに一以上の医薬上許容される添加物もしくは担体を含む、請求項１２記載の組成物。
16. 液体製剤である、請求項１５記載の組成物。
17. 凍結乾燥製剤である、請求項１５記載の組成物。
18. ポリペプチドＸを多量体化する方法であって、ポリペプチドＸをポリペプチドＹを介してポリペプチドＺに結合させて、ポリペプチドＸＹＺ（Ｘは、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン２を含むが、ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン１および３を欠き、該ＶＥＧＦ−Ｒ１のＩｇ様ドメイン２は、ポリペプチドＹを介してポリペプチドＺに共有結合しており、Ｙは、９−２５個のアミノ酸残基のポリペプチドからなり、Ｚは、ＩｇＧ重鎖分子のＣＨ３領域または抗体分子のＦｃ部分である）を形成し、それにより、ポリペプチドＸＹＺが多量体化することを含む、方法。
19. 結合工程が、Ｘ、Ｙ、およびＺ各々をコードする核酸分子を単一の翻訳領域として構築することを含み、該ポリペプチドＸＹＺが宿主細胞において核酸構築物から発現される、請求項１８記載の方法。
20. ＸがＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２である、請求項１８記載の方法。
21. 請求項１記載の融合蛋白質をコードする核酸分子。
22. Ｚが抗体分子のＦｃ部分である、請求項２１記載の核酸分子。
23. Ｘが、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２である、請求項２１もしくは２２記載の核酸分子。
24. 融合蛋白質が配列番号８、２１、および２３から成る群から選択される配列を含む、請求項２３記載の核酸分子。
25. 融合蛋白質が配列番号２および２５から成る群から選択される配列を含む、請求項２３記載の核酸分子。
26. Ｘが、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２であり、融合蛋白質が、配列番号８、２１、および２３から成る群から選択される配列を含む、請求項１記載の融合蛋白質。
27. Ｘが、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）のＩｇ様ドメイン２であり、融合蛋白質が、配列番号２および２５から成る群から選択される配列を含む、請求項１記載の融合蛋白質。
28. 請求項２１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子を含む、哺乳類細胞。
29. ヒト細胞である、請求項２８記載の哺乳類細胞。
30. 線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、造血系細胞、滑膜細胞、上皮細胞、網膜細胞、および幹細胞から成る群から選択される、請求項２９記載の哺乳類細胞。
31. 請求項２１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子を、該融合蛋白質を発現する細胞を作製するために単離された哺乳類細胞に送達することを含む、インビトロの方法。
32. 融合蛋白質が、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む、請求項３１記載の方法。
33. さらに、該融合蛋白質を発現する細胞を、哺乳類動物に送達するための組成物の製造のために使用することを含む、請求項３１または３２記載の方法。
34. 哺乳動物の治療において使用するための、請求項２８〜３０のいずれか１項記載の哺乳類細胞。
35. 哺乳動物の治療において使用するための請求項２１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子であって、そのことにより該融合蛋白質が哺乳類動物で発現される、核酸分子。
36. 融合蛋白質が、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む、請求項３５記載の核酸分子。
37. 哺乳類動物が浮腫加齢黄斑変性症もしくは増殖性糖尿病網膜症にかかっている、請求項３４記載の哺乳類細胞または請求項３５記載の核酸分子。
38. 哺乳類動物が癌にかかっている、請求項３４記載の哺乳類細胞または請求項３５記載の核酸分子。
39. 哺乳類動物が慢性関節リウマチにかかっている、請求項３４記載の哺乳類細胞または請求項３５記載の核酸分子。
40. 哺乳類動物が喘息にかかっている、請求項３４記載の哺乳類細胞または請求項３５記載の核酸分子。
41. 哺乳類動物が骨関節症にかかっている、請求項３４記載の哺乳類細胞または請求項３５記載の核酸分子。
42. 哺乳動物の治療において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項記載の融合蛋白質。
43. 哺乳類動物が、浮腫加齢黄斑変性症もしくは増殖性糖尿病網膜症にかかっている、請求項４２記載の融合蛋白質。
44. 哺乳類動物が癌にかかっている、請求項４２記載の融合蛋白質。
45. 哺乳類動物が慢性関節リウマチにかかっている、請求項４２記載の融合蛋白質。
46. 哺乳類動物が喘息にかかっている、請求項４２記載の融合蛋白質。
47. 哺乳類動物が骨関節症にかかっている、請求項４２記載の融合蛋白質。
48. 融合蛋白質が、配列番号２、８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列を含む、請求項４２記載の融合蛋白質。
49. 請求項２１〜２５のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
50. アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから成る群から選択されるウイルスベクターである、請求項４９記載のベクター。
51. アデノ随伴ウイルベクターである、請求項５０記載のベクター。
52. 哺乳動物の治療において使用するための、請求項４９〜５１のいずれか１項記載のベクター。
53. 哺乳類動物が、浮腫加齢黄斑変性症もしくは増殖性糖尿病網膜症にかかっている、請求項５２記載のベクター。
54. 哺乳類動物が癌にかかっている、請求項５２記載のベクター。
55. 哺乳類動物が慢性関節リウマチにかかっている、請求項５２記載のベクター。
56. 哺乳類動物が喘息にかかっている、請求項５２記載のベクター。
57. 哺乳類動物が骨関節症にかかっている、請求項５２記載のベクター。

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