PT1871667E - Sistema de lavagem móvel de motores nas asas e de recuperação de água - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

CONSTRUÇÕES MULTIMÉRICAS

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a proteínas recombinantes, úteis no tratamento de casos de neovascularização patológica, como por exemplo asma, artrite, cancro e degeneração macular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A neovascularização patológica é um componente fundamental de doenças como a degeneração macular relacionada com a idade, (AMD) exsudativa, retinopatia diabética proliferativa, artrite reumatóide, osteoartrite e asma. Esta também desempenha um papel importante no desenvolvimento e no crescimento de tumores. A neovascularização é regulada por um equilíbrio delicado de factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos.

Sabe-se que o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é necessário para a neovascularização. Foi demonstrado que a inibição da actividade do VEGF inibiu a neovascularização em modelos animais com AMD, artrite e em vários modelos de tumores. Os métodos utilizados para inibir a actividade do VEGF incluem o uso de anticorpos, proteínas de fusão receptoras, peptídeos e pequenas moléculas.

Demonstrou-se que as proteínas 1041 VEGF-R1 (Flt-1) e VEGF-R2 (KDR) ligam o VEGF com elevada afinidade. Tanto o Flt-1 como o KDR possuem sete domínios de imunoglobina (Ig) na sua região extracelular. Demontrou-se que o domínio 2 é 1 essencial para a ligação do VEGF. As fusões de cada um dos receptores solúveis (domínios 1-7) e dos domínios 1-3 da IgG Fc ligam o VEGF de forma maneira eficiente. No entanto, as fusões da IgG Fc apenas com o domínio 2 da Igte, não foram capazes de realizar a ligação do VEGF, como o foi uma combinação dos domínios 1 e 2 da Ig. Davis-Smyth, 1996. Portanto, aparentemente são necessários os domínios 1 e 3 da Ig, juntamente com o domínio 2, para uma ligação eficiente do VEGF.

Holash et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. vol. 99(17): 11393-11398 divulga outros polipeptídeos de fusão incluindo porções do receptor VEGF-RI fundido à porção Fc da cadeia pesada humana IgGl. Vangelista et al (2002) Protein Engineering vol. 15(1): 51-57 divulga um polipeptídeo de fusão no qual os dois domínios extracelulares da cadeia humana FccRI são fundidos ao domínio C-terminal dimerizante da cadeia pesada humana IgGl.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente divulgação, produz-se uma proteína de fusão. A proteína de fusão possui a fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo seleccionado no grupo composto por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um resíduo de aminoácido de polipeptídeo 5-25. Zé uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada da IgG.

Outro aspecto da presente divulgação é um polipeptídeo da fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um 2 factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um grupo ligante, que produz a separação espacial dos residuos de aminoácidos 5-25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada da IgG.

Ainda outro aspecto da presente divulgação é uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5-25. Zé uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

Uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z é também fornecida pela presente divulgação. X contém um polipeptídeo seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de uma grupo ligante, que proporciona a separação espacial dos resíduos de aminoácido 5-25. Z é uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

Ainda outro aspecto da presente divulgação é um método de multimerização de um polipeptídeo X. Um polipeptídeo X é ligado a um polipeptídeo Z através de de um polipeptídeo Y para formar o polipeptídeo XYZ. X compreende um polipeptídeo seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5 - 25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. 0 polipeptídeo XYZ que é formado multimeriza-se. 3

Ainda outro aspecto da presente divulgação oferece um método de multimerização de polipeptídeo X. 0 polipeptídeo X é ligado a um polipeptídeo Z através de um grupo Y para formar o polímero XYZ. X contém um polipeptídeo seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de uma grupo ligante, que fornece a separação espacial dos resíduos de aminoácido 5-25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. 0 polipeptídeo XYZ que se forma multimeriza-se.

Num aspecto da presente divulgação produz-se uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão, que contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-Rl (Flt-1); um ligante; e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Noutro aspecto da presente divulgação, produz-se uma proteína de fusão. A proteína de fusão contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-RI (Flt-1), um ligante e um domínio de multimerização. A proteína de fusão contém uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Noutro aspecto da presente divulgação, produz-se um método in vitro. Fornece-se uma molécula de ácido nucleico a uma célula de mamífero isolada. A molécula de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão, que contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-Rl (Flt-1); um ligante; e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência 4 seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25. A expressão da proteína de fusão é controlada por um promotor. Forma-se uma célula que expressa uma proteína de fusão.

Outro aspecto da presente divulgação constitui um método de fornecer uma proteína de fusão a um mamífero. Uma célula de mamífero que expressa a proteína de fusão é fornecida a um mamífero. A célula expressa e segrega a proteína de fusão, fornecendo, assim, a proteína de fusão ao mamífero. A proteína de fusão contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-R1 (Flt-1), um ligante e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Outro aspecto da presente divulgação constitui um método de fornecimento de uma proteína de fusão para um mamífero. A proteína de fusão, que inclui um domínio Ig-like 2 do VEGF-R1 (Flt-1), um ligante e um domínio de multimerização, é fornecido para um mamífero. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25. Uma construção de ácido nucleico, que codifica a referida proteína de fusão pode, em alternativa, ser fornecida ao mamífero, através da qual a proteína de fusão é expressa pelo mamífero.

Estes e outros aspectos da presente divulgação, que serão descritos mais pormenorizadamente de seguida, disponibilizam métodos e agentes para o tratamento de doenças relacionadas com a proliferação e inflamação vascular. Os agentes podem oferecer uma maior estabilidade e biodisponibilidade relativamente às formas naturais das proteínas. 5

Uma parte da divulgação incluída nesta descrição disponibiliza os aspectos e modalidades da presente invenção. Mais especificamente, um primeiro aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, na qual: X contém o domínio Ig-like 2 do VEGF-RI, mas não possui os domínios Ig-like 1 e 3 de VEGF-RI, sendo o domínio Ig-like 2 do VEGF-RI, covalentemente ligado ao gupo Z através do grupo Y; Y consiste de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5 - 25; e Z representa uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG ou uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

Num aspecto relacionado, a presente invenção disponibiliza uma composição que contém a proteína de fusão da invenção, que inclui também um ou mais excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

Noutro aspecto, a presente invenção disponibiliza um método para multimerizar um polipeptídeo X, que compreende: a ligação de um polipeptídeo X a um polipeptídeo Z por meio de um polipeptídeo Y para formar um polipeptídeo XYZ, em que: X contém o domínio Ig-like 2 do VEGF-RI, mas não possui os domínios Ig-like 1 e 3 de VEGF-RI, com o referido domínio Ig-like 2 do VEGF-RI covalentemente ligado ao polipeptídeo Z por meio do polipeptídeo Y; Y consiste de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5-25; e Z representa uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG ou uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo; através do qual o polipeptídeo XYZ se multimeriza.

Noutros aspectos, a presente invenção oferece uma molécula de ácido nucleico, que codifica a proteína de fusão da presente invenção; um vector contendo a molécula de ácido nucleico; uma célula de mamífero contendo a molécula de 6 ácido nucleico; bem como um método in vitro incluindo o fornecimento de molécula de ácido nucleico a uma célula de mamífero isolada para formar uma célula que expressa a proteína de fusão.

Noutros aspectos, a presente invenção fornece a proteína de fusão, o ácido nucleico, o vector ou a célula de mamífero da presente invenção para uso no tratamento de um mamífero. Numa das modalidades, o mamífero apresenta degeneração macular relacionada com a idade (exsudativa) ou retinopatia diabética proliferativa. Noutra modalidade, o mamífero apresenta cancro. Noutra modalidade, o mamífero apresenta artrite reumatóide. Noutra modalidade, o mamífero apresenta asma. Noutra modalidade, o mamífero apresenta osteoartrite.

Os aspectos e modalidades suplementares da presente invenção são estabelecidos nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1. Região flexível do ligante 9-Gly na construção D2-9Gly-Fc. A flexibilidade relativa prevista pelo método de

Carpus and Schultz (1985) mostra o ligante da poliglicina 9-mer (9-Gly) (aa 94 a 103) na proteína D2-9Gly-Fc como uma região com maior flexibilidade que a média (>1) em comparação com a construção D2-Fc, que não contém o ligante 9-Gly. Ambas as proteínas de fusão contêm sequências de aminoácidos idênticas protegidas por caixas: sp - peptídeo sinal (aa -24 a -1), domínio 2 do Flt-1 (aa 1 a 93) e resíduos IgGl-Fc (244 aa) . A seta representa o sítio de clivagem da peptidase sinal conforme previsto através do programa SignalP V2.0 (Nielsen et al., 1997).

Fig. 2. Actividade biológica de D2-901y-Fc vs. D2-Fc. 7 Células 293 foram cultivadas em meio deficiente (M199 + 5% FCS) e transfectadas com plasmídeos contendo cassetes de expressão D29Gly-Fc e D2-Fc sob o controlo do promotor de CMV. 0 meio condicionado (CM) foi recolhido após 72 horas. As HUVECs foram cultivadas em placas de 96 poços (2E3 células/poço) em meio deficiente + VEGF (10 ng/mL), e 50 ul de CM, juntamente com VEGF (10 ng/mL) foi adicionado 24 horas depois. Os controlos (+/- VEGF) foram incubados com CM do controlo do transfecção do plasmídeo pEGFP (Clontech; o pEGFP contém um variante deslocado para o vermelho ("red-shifted") da proteína fluorescente verde (GFP) em estado natural, que foi optimizada para uma maior fluorescência e uma maior expressão em células de mamíferos). O controlo positivo foi tratado com 50 ng de proteína recombinante Flt-I-IgG (R&D Systems). As HUVECs foram submetidas ao ensaio de proliferação 3 dias após o tratamento com o reagente CellTiter 96® AQue0us (Promega) . Os dados representam os meios dos valores médios de OD490 de duas experiências submetidas ao ensaio em triplicata.

Fig. 3. Análise Western Blot de D2-9Gly-Fc e D2-Fc. A dimensão das proteínas D2-9Gly-Fc e D2-Fc aparenta ser duas vezes maior durante o processo de migração em gel não redutor em comparação com a migração em gel redutor. As proteínas foram carregadas no meio condicionado no seguimento da transfecção de células 293 de plasmídeos expressando D2-9Gly-Fc e D2-Fc foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. O Western Blot foi examinado com os anticorpos anti-IgGl Fc de cabra anti-humano e IgG-HRP de coelho anti-cabra.

Fig. 4. Proteínas híbridas sFlt-1 contendo o ligante 9Gly e o VEGF Ex3. Comparação da estrutura de D2-9Gly-Ex3/CH3 com proteínas previamente construídas. Todas as três proteínas contêm sequência de aminoácidos idênticas para o domínio 2 do Flt-1, constituídas por 24 para o peptídeo sinal do Flt-1 e 93 para o domínio 2 do Flt-1. 0 D2-9Gly-Ex3/CH3 contém 9 do ligante 9Gly, 14 do VEGF Ex3 e 120 da região CH3 da cadeia pesada humana IgGl Fc.

Fig. 5. Actividade biológica de D2-9Gly-Ex3/CH3 vs. D2-9Gly-Fc. A proteína D2-9GlyEx3/CH3, em que o domínio 2 é ligado à região CH3 por meio do ligante 9Gly e do VEGF Ex 3, também inibe de forma eficiente a proliferação dos HUVECs dependentes do VEGF em comparação com as proteínas de controlo D2-9Gly-Fc e D2-Fc. Utilizaram-se 50 ng do recombinante Flt-1-IgG (R&D Systems) para controlo.

Fig. 6. Ensaio de proliferação das HUVECs comparando a actividade da proteína D2-(Gly4Ser) 3-Fc com D2-9Gly-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3.

Fig. 7. Proteínas do Western Blot. (em gel redutor e não redutor) no meio condicionado de células 293 transfectadas (15 ul de CM) com plasmídeos expressando proteínas (1): D2-9Gly-Fc; (2): D2-(G4S)3-Fc e (3) - EGFP foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. O Western Blot foi examinado com os anticorpos IgGl Fc de cabra anti-humano e IgG-HRP de coelho anti-cabra.

Fig. 8. Combinações de proteínas com/sem ligante 901y ou VEGF Ex3. Comparação de estrutura de três proteínas novas com ou sem ligante 9Gly e/ou VEGF Ex3, D2-9Gly-CH3, D2-CH3 e D2-Ex3/CH3.

Fig. 9. Ensaio de proliferação das HUVECs com as construções do Flt-1(D2) contendo combinações de 9Gly, Ex3 e CH3. O meio condicionado das células 293 (5 ul) contendo 9 proteínas D2Ex3/CH3, D2-901y-CH3 e D2-CH3 foi comparado com D2-9Gly-Fc e D2-9GlyEx3/CH3.

Fig. 10. As células 293 do Western Blot foram transfectadas com plasmídeos expressando: (1) D29Gly-Fc; (2) D2-901y-C113 (52/26 kDa); e (3) D2-CH3 (50/25 kDa). As proteínas do meio condicionado das células 293 (15 ul de CM não redutor e/ou redutor) foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. O Western Blot foi examinado com o conjugado anti-humano VEGF-R1 HRP (R&D Systems).

Fig. 11. Ensaio de ligação do VEGF "in vitro". O meio condicionado das células 293 contendo concentrações conhecidas dos receptores solúveis de controlo D2-9Gly-Fc e Flt-1 D(1-3) (variando entre concentrações de 0,29 - 150 pM) foi diluído em série e misturado a 10 pM de VEGF. A quantidade de VEGF livre foi então medida por meio do teste ELISA. D2-9Gly-Fc liga o VEGF com maior afinidade em comparação com as outras construções, "n" representa o número de experiências independentes (transfecção e ensaio de ligação).

Fig. 12. A cinética de ligação das construções do solúvel Flt-1 foi medida por ressonância de plásmons de superfície com um instrumento BlAcore. As construções do sFlt-1 foram imobilizadas num sensor de chip, e o VEGF165 foi injectado em concentrações que variam entre 0,2 e 15 nM. Os sensorgramas foram avaliados através do programa de avaliação BIA, determinaram-se as constantes de velocidade Ka e Kd, e calculou-se a constante de dissociação (KD) a partir da razão entre Kd/Ka = KD. O menor valor de KD significa melhor afinidade. 10

Fig. 13A-13C. A Fig. 13A mostra os níveis de expressão das construções do Flt-1 contendo diversos ligantes. A Fig. 13B mostra a dimerização ou multimerização das construções do Flt-1 contendo diversos ligantes, bem como uma molécula CH3 do Fc do IgGl . A diferença entre as condições reduzidas e não reduzidas indica que as proteínas se multimerizaram. A Fig. 13C mostra a bioactividade inibitória das construções indicadas do Flt-1, presentes no meio de condição de um ensaio de proliferação da HUVEC com a presença do VEGF. Cada uma das construções demonstrou actividade inibitória alcançando os níveis de proliferação da HUVEC na ausência do VEGF.

Fig. 14. Utilizando retinopatia induzida por oxigénio em modelos murinos (01R) de neovascularização da retina (NV) , administrou-se uma das construções do Flt-1 nos olhos de um rato, e estabeleceu-se a neovascularização. Os ratos foram expostos a condições hiperóxicas. 0 número de eventos neovasculares foi determinado nos olhos tratados em comparação com os eventos nos olhos não tratados dos mesmos animais. 0 animal era considerado "respondente" em caso de redução superior a 50% nos eventos neovasculares.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Trata-se de uma descoberta dos presentes inventores que prova que um domínio Ig-like 2 do Flt-1 sem os domínios 1 e 3 tem capacidade de ligar de forma eficiente o VEGF e de inibir a proliferação de células endoteliais dependentes do VEGF. O domínio 2 pode ser covalentemente ligado a um domínio de multimerização por meio de um ligante. Geralmente, os ligantes são cadeias de polipeptídeos. O comprimento da cadeia pode ser de 6, 7, 9, 11, 13, 15 ou mais resíduos de aminoácidos, mas, em geral, situa-se entre 11 5 e 25 resíduos. Dependendo do comprimento e da composição da cadeia lateral, um ligante poderá ter, mas não necessita de ter, uma flexibilidade mais elevada do que a média. A flexibilidade pode ser calculada por meio de algoritmos conhecidos. Os domínios de multimerização são as porções de proteínas multiméricas que promovem a associação de sub-unidades para formar, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros etc. Proteínas recombinantes apropriadas para uma ligação eficiente do VEGF e/ou inibir a proliferação de células endoteliais dependentes do VEGF são seleccionadas no grupo constituído pela SEQ ID: 2, 8, 21, 23 e 25.

Além disso, os inventores descobriram que os domínios de multimerização e os ligantes podem ser utilizados com várias outras proteínas ou porções de proteínas para induzir a multimerização. Essas proteínas podem ser as que se ligam ao ligante ou ao receptor apenas quando sofrem multimerização, ou podem ser aquelas cuja afinidade de ligação aumenta com a multimerização. As proteínas adequadas para a multimerização contêm receptores extracelulares (incluindo porções das mesmas), regiões variáveis de anticorpo, citocinas, quimiocinas e factores de crescimento. As proteínas adequadas contêm receptores tirosina-quinase e receptores serina-treonina quinase. Os exemplos específicos de receptores extracelulares incluem o receptor EGFR, receptores acoplados às proteínas G, o receptor FGFR, receptores Fc, receptores de células T, etc. Os exemplos de regiões variáveis de anticorpo incluem Fab, F(ab')2 e ScFv. Os exemplos de citocinas incluem GM-CSF, IL-la, 1L-113, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, II-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, 11-18, IL-21, IL-23, IFN-a, IFN-0, MlP-la, M1P-13, TGF-13, TNFa e T'NF-13. Os exemplos de quimiocinas incluem BCA-1 / BLC, BRAK, quimiocina CC-2, CTACK, CXCL-16, ELC, ΕΝΑ, ENA-70, ENA-74, ENA-78, Eotaxin, Exodus-2, 12

Fractalquina, GCP-2, GRO, GRO alfa (MGSA), GRO-beta, GRO-gama, HCC-1, HCC-4, 1-309, IP-10, 1-TAC, LAG-1, LD78-beta, LEC / NCC-4, LL-37, Linfotactina, MCP, MCAF (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC, MDC, MDC-2, MDC-4, MEC / CCL28, MIG, NIP, MEP-1 alfa, MIP-1 beta, mrp-l delta, MIP-3 / MPIF-1, MIP-3 alfa, MEP-3 beta, MIP-4 (PARC), MIP-5, NAP-2, PARC, PF-4, RANTES, RANTES-2, SDF-1 alfa, SDF-1 beta, TARC e TECK. Os exemplos de factores de crescimento incluem anfiregulina humana, proteínas angiogénicas humanas, ACE humano, angiogenina humana, angiopoietina humana, angiostatina humana, Betacelulina humana, BMP humana, BMP-13 / CDMP-2 humana, H11111911 BMP-14 /CDMP-1, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana, BMP-7 humana, BMP-8 humana, BMP-9 humana, factores de estimulação de colónias humanas, ligante flt3 humano, GCSF humano, GM-CSF humano, M-CSF humano, factor de crescimento do tecido conectivo humano, Cripto-1 humano, crípticos humanos, ECGF humano, EGF humano, EG-VEGF humano, eritropoietina humana, fetuina humana, FGF humano, FGF-1 humano, FGF-10 humano, FGF-16 humano, FGF-17 humano, FGF-18 humano, FGF-19 humano, FGF-2 humano, FGF-20 humano, FGF-3 humano, FGF-4 humano, FGF-5 humano, FGF-6 humano, FGF-7 / KGF humano, FGF-8 humano, FGF-9 humano, aFGF humano, bFGF humano, GDF-11 humano, GDF-15 humano, factor de libertação do hormona de crescimento humano, HB-EGF humano, heregulina humana, HOF humano, MT humano, IGF-1 humano, IGF-II humano, inibina humana, KGF humano, LCGF humano, LIF humano, diversos factores de crescimento humano, MSP humano, miostatina humana, propeptídio-miostatina humana, factor de crescimento do nervo humano, oncostatina M humana, PD-ECOF humano, PDGF humano, PDGF humano (homodímero AA) , PDGF humano (heterodímero AB), PDGF humano (homodímero BB), PDGF humano (homodímero CC) , PIGF humano, PIGF humano, PIGF-1 humano, PIGF-2 humano, SCF humano, SMDF humano, factor de 13 crescimento de células-tronco hematopoiéticas humano, SCGF-alfa humano, SCGF-beta humano, trombopoietina humana, factor de crescimento transformante humano, TGF-alfa humano, TGF-beta humano e VEGF humano. A proteína receptora Flt-1 possui uma porção extracelular com sete domínios de Ig. Estes localizam-se nos números de resíduos 32...123, 151...214, 230...327, 335...421, 428...553, 556...654 e 661...747 do número de acesso GenBank. P17948, consultar também a SEQ ID: 15. Os números de resíduos 1-26 possuem uma sequência sinal. A proteína Flt-1 é codificada pela sequência de DNA mostrada no número de acesso GenBank. NM_002019 (SEQ ID: 14).

Os domínios de multimerização que podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação são conhecidos pelos especialistas. Podem ser utilizadas sequências da porção do Fc de IgGl ou de IgG2 da cadeia pesada gama, como por exemplo o domínio CH3 isolado (aa 371-477) ou ambos os domínios CH2 e CH3 (aa 247-477) . A porção do Fc das moléculas de Ig é a obtida por meio da clivagem das moléculas de anticorpos completas através da utilização da enzima papaína. Podem ser utilizados outros meios para obtenção dessas porções. Para a sequência de proteína da cadeia pesada gama de IgGI, consulte o número de acesso GenBank Y14737 e a SEQ ID: 10. Podem ser utilizadas outras regiões do Fc, por exemplo a partir de outros tipos de IgG e de anticorpos IgA, IgD ou IgE. Pode também ser utilizada a região de multimerização do VEGF. Demonstra-se uma sequência de DNA realizando a codificação do VEGF no número de acesso GenBank. NM_003376 e SEQ ID: 11. Demonstra-se uma sequência de aminoácidos do VEGF no número de acesso GenBank. CAC19513 e SEQ ID: 12. A região de multimerização do VEGF (SEQ NO: 13), codificada pelo éxon 3 do VEGF (VEGF 14

Ex3), inclui, pelo menos, os resíduos de aminoácidos 7588 da proteína do VEGF (SEQ ID : 12) Os domínios de multimerização irão produzir pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % , 60 %, 75 %, 80 % , 85 % , 90 o o ou 95 % das proteínas de fusão monoméricas para migrar em gel de poliacrilamida não desnaturante a uma taxa adequada para um multimero. A glicosilação pode afectar a migração de uma proteína num gel. Embora algumas sequências sejam mostradas aqui, podem ser utilizadas outras variantes (por exemplo, variantes alélicas). Em termos gerais, essas variantes têm pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência divulgada. A multimerização pode ser ensaiada, por exemplo, em gel redutor e não redutor, conforme se demonstra na presente divulgação. A multimerização também pode ser ensaiada para a detecção de aumento de afinidade de ligação do ligante/receptor de uma proteína. Os ensaios BiaCore™ de ressonância de plásmons de superfície podem ser utilizados para esses fins. Estes ensaios detectam alterações na massa através da medição de alterações no índice de refracção numa camada aquosa próxima da superfície de um sensor de chip. Qualquer método conhecido pode ser utilizado para detectar a multimerização.

Os grupos ligantes, segundo a presente divulgação, podem ser compostas, por exemplo, por 5-100, 5-75, 5-50, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10 ou 5-9 resíduos de aminoácidos. Exemplos de ligantes eficientes incluem: gly9 (SEQ ID: 27), glu9 (SEQ ID: 28), ser9 (SEQ ID: 29), gly5cyspro2cys (SEQ ID: 30), (gly4ser)3 (SEQ ID: 31),

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID: 32), Pro Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID: 13),. Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gin Lys (SEQ ID: 26) 15 e G/y9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID: 34). Outros polipeptídeos ligantes que podem ser utilizados incluem uma poliglicina com comprimentos diferentes, incluindo os resíduos 5, 7, or 30. Além disso, podem ser utilizadas outras porções de Flt-1 como um ligante, por exemplo, o domínio 3 de FR-1. Consultar a SEQ ID: 15. Os grupos ligantes também podem ser produzidas a partir de outros polímeros, como o polietilenoglicol. Estes ligantes podem conter 10-1000, 10-500, 10-250, 10-100 ou 10-50 unidades de monómero etilenoglicol. Os polímeros adequados devem ter um comprimento semelhante à extensão atribuída aos resíduos de aminoácidos. Um polímero de comprimento característico deve apresentar um espaçamento a partir de cerca de 10-25 angstroms.

Independentemente dos aspectos gerais da divulgação acima mencionada, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, em que: X contém o domínio Ig-like 2 do VEGF-RI, mas não contém os domínios Ig-like 1 e 3 do VEGF-R1, sendo o domínio Ig-like 2 do VEGF-RI covalentemente ligado ao grupo Z através do grupo Y; Y consiste de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5 -25; e Z representa uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada da IgG ou uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

As proteínas de fusão, de acordo com a presente divulgação, incluindo as proteínas de fusão da presente invenção, podem ser produzidas através de quaisquer meios conhecidos na técnica. Embora essas proteínas possam ser produzidas sinteticamente, ou através da ligação de suas porções, a produção recombinante também pode ser usada. Uma sequência de gene fundido pode ser produzida através das técnicas padrão de DNA recombinante. A sequência de gene fundido 16 pode ser inserida num vector, por exemplo, num vector virai ou plasmidial, para efectuar a sua replicação. Uma sequência promotora, que é funcional na célula receptora final, pode ser introduzida na orientação reversa da sequência de qene fundido. Os promotores utilizados podem ser constitutivos, induziveis ou reprimíveis. Os exemplos de cada tipo são conhecidos pelos especialistas. 0 vector pode ser introduzido numa célula hospedeira ou num mamifero através de qualaquer meio conhecido na técnica. Os vectores apropriados para uso incluem adenovirus, adenovirus associado, retrovirus, lentivirus e plasmídeos. Se o vector se encontra num vector virai e este foi empacotado, os virions podem ser utilizados para infectar células. Caso seja utilizado o DNA nu, podem ser utilizados os procedimentos de transfecção ou transformação adequados para as células hospedeiras especificas. As formulações do DNA nu que utilizam polímeros, lipossomas ou nanoesferas podem ser utilizadas para o fornecimento do gene de fusão. As células que podem ser transformadas ou transfectadas por meio de construções recombinantes, de acordo com a invenção, podem ser quaisquer células que sejam convenientes para o técnico. Os exemplos de tipos de células que podem ser utilizados incluem bactérias, germes, insectos e células de mamíferos. Nas células de mamíferos, poderão ser seleccionadas células de variados tipos de tecidos de acordo com a conveniência. Os exemplos de células que podem ser utilizadas são fibroblastos, hepatócitos, células endoteliais, células-tronco, células hematopoiéticas, células epiteliais, miócitos, células neuronais e queratinócitos. Essas células podem ser utilizadas para produzir proteínas in vitro, ou podem ser fornecidas a mamíferos, incluindo humanos, para produzir as proteínas codificadas in vivo. Esse meio de fornecimento é uma alternativa ao fornecimento de ácido nucleico, vector 17 virai e proteína de fusão para um mamífero.

As composições de ácidos proteicos ou nucleicos podem encontrar-se em transportadores, como “tampões", transportadores aquosos e lipofílicos, veículos estéreis ou não estéreis, pirogénicos ou não pirogénicos. Os veículos não pirogénicos são úteis para as formulações injectáveis. As formulações podem ser líquidas ou sólidas, a exemplo das formulações liofilizadas. As formulações também podem ser administradas sob a forma de aerossóis. As composições podem conter uma ou mais proteínas de fusão, um ou mais ácidos nucleicos, ou ambos, simultaneamente. As proteínas de fusão e/ou ácidos nucleicos numa composição podem ser homogéneos, dando origem a homomultímeros, ou podem ser heterogéneas, dando origem a heteromultímeros. No caso dos heteromultímeros, geralmente o grupo X varia entre as proteínas de fusão, mas o grupo Z permanece inalterado.

As proteínas de fusão podem ser fornecidas a uma célula hospedeira ou a um mamífero hospedeiro através de qualquer um dos meios conhecidos na técnica. Podem ser fornecidas proteínas podem à célula ou ao hospedeiro. Podem ser administrados ácidos nucleicos à célula ou ao hospedeiro. Células transformadas ou transfectadas podem ser administradas à célula ou ao hospedeiro. Em último caso, espera-se que as células com o mesmo fundamento genético reduzam a rejeição de transplante.

As células apropriadas para serem fornecidas a animais mamíferos hospedeiros incluem quaisquer tipos de células de mamíferos de qualquer órgão, tumor ou linha celular. Por exemplo, podem ser utilizadas células de humanos, murinos, cabras, ovinos, bovinos, cães, gatos e suínos. Tipos de células adequadas para serem utilizadas incluem, sem 18 limitação, fibroblastos, hepatócitos, células endoteliais, queratinócitos, células hematopoiéticas, células epiteliais, miócitos, células neuronais e células-tronco.

Os meios de fornecimento de proteínas de fusão ou ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão incluem o fornecimento de células que expressam as proteínas de fusão, o fornecimento das proteínas de fusão e o fornecimento de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão. As proteínas de fusão, células ou ácidos nucleicos podem ser fornecidos directamente ao órgão ou ao tumor desejado, por exemplo, por meio de injecção, cateterização ou endoscopia. Estes também podem ser administrados por via intravenosa, intrabronquial, intratumoral, intratecal, intramuscular, intraocular, tópica, subcutânea, transdermal ou por via oral.Os pacientes com possibilidades de conseguir um tratamento eficiente incluem os que apresentam degeneração macular relacionada com a idade (exsudativa) retinopatia diabética proliferativa, artrite reumatoide, osteoartrite, uveíte, asma e cancro. Os tratamentos melhorarão os sintomas e/ou os marcadores e/ou a gravidade da doença.

Podem ser ministrados ácidos nucleicos a mamíferos, e em particular, a humanos, em qualquer vector desejado. Estes compreendem vectores virais ou não virais, incluindo vectores adenovírus, vectores adenovírus associados, vectores retrovírus, vectores lentivírus e vectores plasmidiais. Exemplos de tipos de vírus incluem o HSV (vírus Herpes Simplex), o adenovírus, o AAV (adenovírus associado), o HIV (vírus da imunodeficiência humana), o BIV (vírus da imunodeficiência bovina) e o MLV (vírus da leucemia murina). Podem ser administrados ácidos nucleicos em qualquer formato desejado para produzir níveis de 19 fornecimento suficientemente eficientes, inclusive em partículas, lipossomas, nanopartícuias, e complexados com polímeros.

Podem ser utilizadas combinações de tratamentos com proteína e ácido nucleico. Por exemplo, pode ser administrada a um paciente uma proteína de fusão, de acordo com a presente divulgação, ou uma proteína de fusão, de acordo com a presente invenção. Caso se observe uma resposta favorável, poderá ser administrada uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão para um efeito a longo prazo. Em alternativa, a proteína e o ácido nucleico podem ser administrados simultânea ou quase simultaneamente. Noutra alternativa, um anticorpo ou uma proteína de fusão de um ligante pode ser administrado concomitantemente ou na sequência da administração de um anticorpo ou de um antígeno de proteína de um receptor.

Outra opção emprega uma combinação de ácidos nucleicos, onde um deles codifica um anticorpo e o outro codifica uma proteína de fusão. Alguns anticorpos que podem ser empregadas em combinação com as construções Fit-1 da presente divulgação, por exemplo, em combinação com as construções Fit-1 da presente invenção (na forma de proteína ou ácido nucleico), são o bevacizumab e ranibizumab, ambos aplicados directamente ao VEGF. Esses anticorpos são particularmente eficientes no tratamento de cancro e degeneração macular, respectivamente. A prática da presente divulgação, incluindo a prática da presente invenção, emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (bem como técnicas recombinantes) , microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que fazem parte da técnica. Essas 20 técnicas são explicadas por completo na literatura da área, como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al, 1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); Oligonucleotide Synthesis (MI. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.L Freshney, ed., 1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook Of Experimental Immunology (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors For Mamiferoian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols In Immunology (J.E. Coligan et al. , eds., 1991); Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane eds. (1988)); and PCR 2: A Practical Approach (Mi. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)). 0 veiculo de fornecimento genético consiste em qualquer molécula com capacidade para transportar polinucleotideos inseridos numa célula hospedeira. Os veículos de fornecimento genético incluem lipossomos, polímeros biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e sintéticos, lipoproteínas, polipeptídeos e polissacarídeos, lipopolissacarídeos, envelopes virais artificiais, partículas metálicas, além de bactérias, vírus, como o baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vectores fúngicos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica, que têm sido descritos na expressão de uma variedade de hospedeiras eucarióticas e procarióticas, e podem ser utilizados na terapia genética, bem como na expressão de proteínas simples.

Fornecimento genético, transferência genética, entre outros, conforme aqui utilizado, são termos que se referem 21 à introdução de um polinucleotídeo exógeno (ocasionalmente referido como um "transgene") numa célula hospedeira, independente do método usado para essa introdução. Esses métodos incluem uma variedade de técnicas conhecidas, como a transferência genética mediada por vectores (por exemplo, por infecção/transfeção virai, ou por diversos outros complexos de fornecimento genético com base em proteínas ou lipídios), bem como técnicas para facilitar o fornecimento de polinucleotídeos "nus" (como a eletroporação, o "gene gun" (biolística), e várias outras técnicas utilizadas para a introdução de polinucleotídeos). 0 polinucleotídeo introduzido pode ser estável ou transitoriamente mantido na célula hospedeira. A manutenção estável geralmente exige que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se combine num "replicon" da célula hospedeira, como um "replicon" extracromossómico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossoma nuclear ou mitocondrial. Inúmeros vectores são conhecidos pela sua capacidade de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, conforme se conhece na técnica e se descreve na presente divulgação. 0 polinucleotídeo exógeno é inserido num vector, como um adenovírus, um adenovírus parcialmente eliminado, um adenovírus completamente eliminado, um adenovírus associado (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um plasmídeo "nu", um complexo de plasmídeos/lipossomas etc., para o fornecimento ao hospedeiro por via intravenosa, intramuscular, intraportal ou outra via de administração.

Os vectores de expressão que podem ser utilizados em métodos e composições da presente divulgação, por exemplo, nas composições da presente invenção, incluem, por exemplo, vectores virais. Um dos métodos de administração de terapia 22 genética mais utilizados, tanto "in vivo" como "ex vivo", compreende o uso de vectores virais para o fornecimento do gene. São conhecidas muitas espécies de vírus, e muitas delas foram estudadas para os propósitos da terapia genética. Os vectores virais frequentemente utilizados incluem os derivados de adenovírus, adenovírus associados (AAV) e retrovírus, incluindo lentivírus, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV). 0 adenovírus é um vírus de DNA nuclear e não envelopado com um genoma de aproximadamente 36 kb, que foi bem caracterizado por meio de estudos em genética clássica e biologia molecular (Hurwitz, M.S., Adenoviruses Virology, 314 edition, Fields et al., eds., Raven Press, New York, 1996; Hitt, M.M. et al., Adenovírus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1999). Os genes virais são classificados em unidades transcricionais precoces (designadas E1-E4) e tardias (designadas L1-L5), em referência à geração de duas classes temporais de proteínas virais. A demarcação desses eventos compreende a replicação do DNA virai. Os adenovírus humanos são divididos em inúmeros sorotipos (aproximadamente 47, numerados de acordo e classificados em 6 grupos: A, B, C, D, E e F) , com base em propriedades que incluem hemaglutinação de glóbulos vermelhos, oncogenicidade, composições e homologias de aminoácidos de proteínas e de DNA, bem como relações antigénicas.

Os vectores adenovirais recombinantes oferecem inúmeras vantagens enquanto veículos de fornecimento genético, incluindo tropismo em células divisoras e não divisoras, potencial patogénico mínimo, capacidade de replicação em "titer" elevado para a preparação de populações de 23 vectores, e potencial para o transporte de grandes inserções (Berkner, KL., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D., Câncer Gene Therapy 1:51-64 1994). Produziram-se vectores adenovirais com deleções de várias sequências de genes adenovirais, como vectores pseudoadenovirais (PAVs) e adenovirus parcialmente sumprimidos (denominados de "DeAd") para explorar os aspectos desejáveis do adenovirus que o tornam um veiculo apropriado para o fornecimento de ácidos nucleicos para células receptoras.

Em particular, os vectores pseudoadenovirais (PAVs), também conhecidos como adenovirus do tipo "gutless" ou vectores mini-adenovirais, são vectores adenovirais derivados do genoma de um adenovirus que contém sequências mínimas de nucleotídeos com interacções intramoleculares necessárias para a replicação e o empacotamento do genoma do vector, e que podem conter um ou mais transgenes (Consultar U.S. Patent No. 5,882,877, que aborda os vectores pseudoadenovirais (PAV) e os seus métodos de produção). Os PAVs foram produzidos para explorar os aspectos desejáveis do adenovirus que o tornam um veículo apropriado para o fornecimento genético. Enquanto os vectores adenovirais podem, em termos gerais, transportar inserções de até 8kb em tamanho por meio da deleção de regiões que são dispensáveis ao crescimento virai, a capacidade máxima de transporte pode ser alcançada pelo uso de vectores adenovirais contendo as deleções da maioria das sequências de códigos virais, inclusive as dos PAVs. Consultar U.S. de Gregory et al.; Kochanek et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:5731-5736, 1996; Parks et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:13565-13570, 1996; Lieber et al., J. ViraL 70:8944-8960, 1996; Fisher et aL, Virology 217:11-22, 1996; 5,670,488; PCT Publication No. W096/33280, published 24

October 24, 1996; PCT Publication No. W096/40955, published December 19, 1996; PCT. Publication No. W097/25446, published July 19, 1997; PCT Publication No. W095/29993, published November 9, 1995; PCT Publication No. W097/00326, published January 3, 1997; Morral et al., Hunt. Gene Ther. 10:2709-2716,1998. Os PAVs, que podem acomodar até 36 kb de ácido nucleico externo, aproximadamente, apresentam vantagens, visto que a capacidade de transporte do vector é aumentada, enquanto o potencial de resposta imunológica do hospedeiro ao vector ou à geração de virus com capacidade de replicação é reduzido. Os vectores PAV contêm a repetição terminal invertida (ITR) 5' e as sequências de nucleotideos de ITR 3' que contêm a origem da replicação, bem como a sequência de nucleotideos com interações intramoleculares necessária para o empacotamento do genoma do PAV, e podem acomodar um ou mais transgenes com elementos regulatórios apropriados, por exemplo, promotores, potencializadores etc.

De outro modo, os vectores adenovirais parcialmente eliminados produzem um vector adenoviral parcialmente eliminado (designado de "DeAd")»· no qual a maior parte dos genes adenovirais precoces necessários para a replicação virai é eliminada do vector e inserida no cromossoma produtor de uma célula sob o controlo de um promotor condicional. Os genes adenovirais elimináveis que são inseridos na célula produtora podem incluir E1A/E1B, E2, E4 (apenas ORF6 e ORF6/7 necessitam de ser inseridos na célula), pIX e pNa2. E3 pode também ser eliminado do vector, mas, visto não ser necessário para a produção do vector, pode ser omitido da célula produtora. Os genes adenovirais tardios, geralmente sob o controlo do promotor tardio principal (MLP), estão presentes no vector, mas o MLP pode ser substituído por um promotor condicional. 25

Os promotores condicionais apropriados para o uso em vectores DeAd, bem como em linhas de células produtoras incluem os que apresentam as seguintes caracteristicas: baixa expressão basal no estado não induzido, de forma a que os genes adenovirais citotóxicos ou citostáticos não sejam expressados em níveis prejudiciais à célula; e expressão de alto nível no estado induzido, de froma a que se produzam as quantidade suficientes de proteínas virais para oferecer suporte à replicação e ao conjunto de vectores. Promotores condicionais apropriados para uso em vectores DeAd e em linhas de células produtoras incluem o sistema de controlo genético do dimerizador, com base nos agentes imunosupressores FK506 e rapamicina, o sistema de controlo genético da ecdisona e o sistema de controlo genético da tetraciclina. Também útil na presente divulgação, incluindo a presente invenção, é a tecnologia "GeneSwitch™" (Valentis, Inc., Woodlands, TX) , descrita em Abruzzese et al., Hum. Gene Ther. 1999 10:1499-507. O sistema de expressão adenoviral parcialmente eliminado também é descrito em W099/57296. O adenovírus associado (AAV) é um DNA de parvovírus humano cujo genoma apresenta um tamanho de 4,6 kb. O genoma AAV contém dois genes principais: o gene "rep", que codifica as proteínas "rep" (Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40) envolvidas na replicação, no resgate, na transcrição e na integração do AAV; e o gene "cap", que codifica as proteínas "cap" que formam a partícula virai do AAV. O nome AAV é derivado da sua dependência do adenovírus ou outro vírus auxiliar (por exemplo, o herpesvírus) para fornecer produtos genéticos essenciais que permitam que o AAV seja submetido a uma infecção produtiva, ou seja, que este se reproduza na célula hospedeira. Na ausência de vírus 26 auxiliares, o AAV integra-se na forma de um provirus no cromossoma da célula hospedeira, até que este seja resgatado por superinfecção da célula hospedeira com um virus auxiliar, geralmente um adenovirus (Muzyczka, Curr. Top. Micor. Immunol. 158:97-127, 1992). 0 interesse no AAV como vector de transferência genética é justificado pelas diversas caracteristicas exclusivas da sua biologia. Em ambas as extremidades do genoma AAV há uma sequência de nucleotideos conhecida como repetição terminal invertida (ITR), que contém as sequências de nucleotideos com interações intramoleculares necessárias para a replicação, o resgate, o empacotamento e a integração do virus. A função de integração da ITR mediada pela proteína "rep" em "trans" permite que o genoma AAV se integre num cromossoma celular após a infecção, na ausência de um vírus auxiliar. Essa propriedade exclusiva do vírus tem relevância para o uso do AAV na transferência genética, já que permite a integração de um AAV recombinante contendo o gene de interesse no genoma celular. Portanto, a transformação genética estável, ideal para muitos dos objectivos da transferência genética, pode ser alcançada através da utilização de vectores rAAV. Além disso, o sítio de integração do AAV é bem estabecido e foi localizado no cromossoma 19 dos humanos (Kotin et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:2211-2215, 1990). A previsão do sítio de integração reduz o risco de eventos de inserção aleatórios no genoma celular que possam activar ou desactivar genes hospedeiros, ou interromper sequências de códigos, consequências estas que podem limitar o uso de vectores cuja integração do AAV e remoção do gene na produção dos vectores rAAV pode resultar em padrões de integração alterados, que foram observados nos vectores rAAV (Ponnazhagan et aL, Hum Gene Ther. 8:275-284, 1997). 27

Existem outras vantagens no uso do AAV para a transferência genética. A gama de hospedeiros do AAV é extensa. Além disso, ao contrário dos retrovirus, o AAV pode infectar células quiescentes e células divisoras ao mesmo tempo. Além disso, o AAV não foi associado a doenças humanas, obviando muitas das questões que têm sido levantadas em relação aos vectores de transferência genética derivados de retrovirus.

As abordagens clássicas da geração de vectores rAAV recombinantes têm exigido a coordenação de uma série de eventos intracelulares: transfecção da célula hospedeira por meio do genoma de um vector rAAV contendo um transgene de interesse acompanhado pelas sequências AAV ITR; transfecção da célula hospedeira por meio de um plasmídeo codificando os genes das proteínas "rep" e "cap" do AAV que são necessárias in "trans"; e infecção da célula transfectada por meio de um virus auxiliar para satisfazer as funções auxiliares não-AAV necessárias em "trans" (Muzyczka, N., Curr. Top. Micor. ImmunoL 158:97-129, 1992). As proteínas adenovirais (ou outro vírus auxiliar) activam a transcrição do gene "rep" do AAV, e as proteínas "rep", por sua vez, activam a transcrição dos genes "cap" do AAV. As proteínas "cap", então, utilizam as sequências ITR para empacotar o genoma rAAV numa partícula virai rAAV. Portanto, a eficiência do empacotamento é determinada, em parte, pela disponibilidade de quantidades adequadas de proteínas estruturais, bem como pela acessibilidade de quaisquer sequências de empacotamento com actividade intracelular necessária ao genoma do vector rAAV.

Vetores retrovirais são parte de uma técnica comum de fornecimento genético (Miller, Nature (1992) 357:455-460). 28 A capacidade dos vectores retrovirais fornecerem um gene de cópia única não reorganizado, numa ampla variedade de células somáticas de roedores, primatas e humanos torna os vectores retrovirais bem adaptados para a transferência de genes para uma célula.

Os retrovirus são virus RNA, nos quais o genoma virai é o RNA. Quando uma célula hospedeira é infectada com um retrovirus, o RNA genómico sofre transcrição reversa num DNA intermediário, que é integrado de forma eficiente no DNA cromossómico das células infectadas. Esse DNA intermediário integrado é referido como provirus. A transcrição do provirus e do conjunto para o virus infeccioso ocorre na presença de um vírus auxiliar adequado ou numa linha celular contendo sequências apropriadas que permitem a encapsidação sem a produção coincidente de um virus auxiliar contaminante. Não é necessário um vírus auxiliar para a produção de retrovirus recombinantes, se as sequências de encapsidação forem produzidas por meio da co-transfecção com vectores apropriados. 0 genoma retroviral e o DNA proviral possuem três genes: o "gag", o "pol" e o "env", que são acompanhados por duas sequências de repetição terminal invertida (LTR). 0 gene "gag" codifica as proteínas da estrutura interna (matriz, capsídeo e nucleocapsídeo); o gene "pol" codifica a DNA polimerase orientada por RNA (transcriptase reversa) e o gene "env" codifica as glicoproteínas do envelope virai. As LTRs 5' e 3' servem para promover a transcrição e a poliadenilação dos RNAs dos vírions. A LTR contém todas as outras sequências de interação intracelular necessárias para a replicação virai. Os lentivírus possuem genes adicionais incluindo "vit vpr", "tat", "rev", "vpu", "nef" e "vpx" (em HIV-1, HIV-2 e/ou SIV). Paralelamente à LTR 5' 29 encontram-se as sequências necessárias para a transcrição reversa do genoma (o sitio de ligação primário tRNA) e para a encapsidação eficiente do RNA virai em partículas (o sitio do Psi). Se as sequências necessárias para a encapsidação (ou empacotamento do RNA retroviral em virions infecciosos) estiverem ausentes no genoma virai, o resultado é um defeito intracelular que impede a encapsidação do RNA genómico. Entretanto, o mutante resultante é ainda capaz de conduzir a síntese de todas as proteínas dos virions.

Lentiviroses são retrovírus complexos que, juntamente com os genes retrovirais comuns "gag", "pol" e "env", contêm outros genes com função regulatória ou estrutural. A elevada complexidade permite que o lentivírus module o seu ciclo vital, assim como no curso da infecção latente. Um lentivírus típico é o vírus da imunodeficiência humana (HIV) , o agente etiológico da AIDS. In vivo, o HIV pode infectar de maneira terminal, diferentes células, que raramente se dividem, como os linfócitos e os macrófagos. In vitro, o HIV pode infectar culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos (MDM), bem como HeLa-Cd4 ou células linfóides T retidas no ciclo celular por meio do tratamento com afidicolina ou irradiação gama. A infecção das células depende de uma importação nuclear activa de complexos de pré-integração do HIV por meio dos poros nucleares das células de interesse. Isso ocorre através da interacção de determinantes moleculares múltiplos e parcialmente redundantes no complexo contendo os mecanismos de importação nuclear da célula de interesse. Determinantes identificados incluem um sinal de localização nuclear (NLS) funcional na proteína da matriz "gag" (MA) , uma proteína cariofílica associada a virions, um "vpr" e um resíduo de f osf ot irosina C-terminal na proteína "gag MA". 0 uso de 30 retrovírus na terapia genética é descrito, por exemplo, na patente US 6.013.516; e na Patente US 5.994.136.

Outros métodos para o fornecimento de DNA para células não utilizam vírus. Por exemplo, os compostos anfifílicos catiónicos podem ser utilizados para fornecer o ácido nucleico da presente divulgação, por exemplo, o ácido nucleico da presente invenção. Uma vez que os compostos produzidos para facilitar o fornecimento intracelular das moléculas biologicamente activas devem interagir, ao mesmo tempo, com ambientes polares e não polares (por exemplo, no interior ou na superfície da membrana plasmática, dos fluidos teciduais, dos compartimentos no interior da célula e da própria molécula biologicamente activa), estes são produzidos geralmente para conter domínios polares e não polares. Compostos contendo ambos os domínios podem ser designados como anfifílicos, e muitos lipídios e lipídios sintéticos que foram divulgados para facilitar o fornecimento intracelular (para aplicação in vitro ou in vivo) atendem a esta definição. Uma classe particularmente importante de anfifílicos é a dos anfifílicos catiónicos. Em geral, os anfifílicos catiónicos possuem grupos polares capazes de ser carregados positivamente com ou por pH fisiológico, e esta propriedade é conhecida na técnica por ser importante para definir o modo como os anfifílicos interagem com os variados tipos de moléculas biologicamente activas (terapêuticas) incluindo, por exemplo, polinucleotídeos carregados negativamente, como o DNA.

Divulga-se a utilização das composições que compreendem compostos anfifílicos catiónicos para a entrega de gene, por exemplo, Pedidos de Patente US 5.049.386; US 5.279.833; US 5.650.096; US 5.747.471; US 5.767.099; US 5.910.487; US 5.719.131; US 5.840.710; US 5.783.565; US 5.925.628; US 31 5.912.239; US 5.942.634; US 5.948.925; US 6.022.874; U.S. 5.994.317; U.S. 5.861.397; U.S. 5.952.916; U.S. 5.948.767; U.S. 5.939.401; e U.S. 5.935.936.

Além disso, o ácido nucleico da presente divulgação, por exemplo, ácido nucleico da presente invenção, pode ser entregue utilizando "DNA simples". Os métodos para entrega de sequência de DNA não-infeccioso, não-integrante que codifica um polipeptídeo desejado ou peptídeo ligado de forma operável a um promotor, livre de associação com as proteínas que facilitam a transfecção, partículas virais, formulações lipossomais, lipídios carregados e fosfato de cálcio que precipitam agentes que são descritos na Patente US 5.580.859; U.S. 5.963.622; U.S. 5.910.488.

Também foram informados sistemas de transferência de genes que combinam componentes virais e não-virais. Cristiano et al., (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:11548 ; Wu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:11542 ; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. &L USA 89:6099; Yoshimura et al . (1993) . 1. Biol. Chem. 26 8 :2300; Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8850; Kupfer et al. (1994) Human Gene Ther. 5:1437; e Gottschalk et a/.(1994) Gene Ther. 1:185.

Na maioria dos casos, o adenovírus foi incorporado nos sistemas de entrega de genes para aproveitar as suas propriedades endossomolíticas. As combinações informadas de componentes virais e não-virais, em geral, envolvem a sua fixação covalente do adenovírus para o complexo da entrega de genes ou co-internalização de adenovírus não-ligados com lipídio catiônico: complexos de DNA.

Para a entrega de DNA e proteína para os olhos, a administração será, em geral, local. Esta tem a vantagem de limitar a quantidade DNA que precisa ser administrada e 32 limitar efeitos colaterais sistémicos. Muitos modos possíveis de entrega podem ser utilizados, incluindo, entre outros; administração tópica sobre a córnea de uma arma genética, injecção subconjuntival, injecção intracameral, colírio para a córnea, injecção na câmara anterior através do limbus temporal, intra aplicação de injecção, aplicação da córnea combinada com pulsos elétricos, injecção intracorneal, injecção sub-retiniana, injecção intravitreal e injecção intra-ocular

Em alternativa, as células podem ser transfectadas ou transduzidas ex vivo e entregues por implantação intraocular. Ver, Auricchio, Mol. Ther. 6: 490-494, 2002; Bennett, Nature Med. 2: 649-654, 1996; Borras, Experimental Eye Research 76: 643-652, 2003; Chaum, Survey of Ophthalmology 47: 449-469, 2002; Campochiaro, Expert Opinions in Biological Therapy 2: 537-544 (2002); Lai, Gene Therapy 9: 804 813, 2002; Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research, 22: 277-293, 2003.

Os efeitos de diversos agentes terapêuticos propostos e das administrações podem ser testados em modelos de animais apropriados para doenças específicas. Por exemplo, a retinopatia da prematuridade pode ser testada num modelo de retinopatia induzida por oxigénio no rato, conforme se descreve em Smith, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 35: 101-111, 1994. A neovascularização coroidal induzida por laser num rato pode ser utilizada como modelo para neovascularização coroidal humana (CNV) que ocorre em doenças tais como degeneração macular relacionada com a idade. Tobe, American Journal of Pathology 153: 1641-1646, 1998. Outros modelos de CNV foram desenvolvidos em primatas, ratazanas, miniporcos e coelhos. Os modelos de ratos de degeneração macular relacionada com a idade foram 33 desenvolvidos em ratos geneticamente deficientes. Os ratos deficientes na proteína-1 quimioatraentre de monócito ou no receptor-2 C-C quimiocina desenvolveram caracteristicas de degeneração macular relacionada com a idade. Ambati, Nature Med. 9: 1390-1397, 2003.

Embora a invenção seja descrita em relação aos exemplos específicos incluindo modos preferidos de execução da invenção, os especialistas considerarão que há diversas variações e permutações dos sistemas acima descritos e técnicas que se encontram no âmbito das reivindicações em anexo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Foram gerados dois constructos: o primeiro, D2-9Gly-Fc, com um ligante poliglicina 9-mer (901y) e o segundo, D2-Fc, com a mesma sequência à excepção do ligante 9Gly (Fig. 1).

Analisámos as sequências de aminoácido de proteínas D2-9Gly-Fc e D2-Fc utilizando o Protein Analysis Toolbox do programa de análise de sequência MacVector 6.5.1. (IBI, New Haven, CT) . O ligante poliglicina 9-mer na sequência D2-9Gly-Fc foi identificado como uma região com uma flexibilidade superior à média pelo método de previsão de flexibilidade de Karpus and Schultz (1985) Naturwiss, 72: 212-213. Nenhuma região foi detectada na sequência D2-Fc sequência (Fig. 1).

Exemplo 2

Testámos um domínio Ig-like 2 da Flt-1 ligado à região IgGl 34

Fc por um ligante poliglicina 9-mer flexível (D2-9Gly-Fc). A proteína de fusão D2-9Gly-Fc é capaz de se ligar de forma eficiente ao VEGF e inibir a proliferação de células endoteliais na veia umbilical humana dependente de VEGF (HUVEC). Ver Fig. 2. Em contraste, quando o domínio Ig-like 2 da Flt-1 está ligado directamente à cadeia pesada de IgGl (Fc) para formar D2-Fc, apenas se observou a ligação mínima VEGF. Ver a figura 2. Tanto a dimerização através de IgGl Fc e a inserção de um ligante flexível parecem facilitar a ligação de VEGF a Flt-1 domínio 2. A presença de formas diméricas tanto no D2-901y-Fc como no D2-Fc foram confirmadas pela análise de Western blot. Ver Fig. 3.

Exemplo 3

Uma injecção intravitreal do vector AAV (1 x 108 to 1 x 109 partículas num volume de 0,0005 mL) é administrada a ratos C57BL/6 recém-nascidos (PO) ou com 1 dia de vida (Pl). A neovascularização retinal (NV) é induzida em ratos C57BL/6 através da exposição das crias P7 e as suas mães a hiperoxia durante 5 dias. As crias são devolvidas ao meio ambiente em P12 e sofrem eutanásia em P17 (tempo de pico NV). (Smith LEH, Weslowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan and D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse. Ihvest Opth Vs Sei. 1994;35:101-111.). Os olhos embebidos totalmente em parafina são seccionados a intervalos de 5 míerons. O grau de NV é determinado pela contagem do número de núcleos de células endoteliais internas da membrana de limitação interna nas seções retiradas a cada 100 microns.

Coortes de animais tratados com a codificação de vectores de AAV para os agentes anti-angiogénicos são comparados com coortes tratados com a codificação de vectores para 35 transgenes irrelevantes ou com vectores que não codificam um transgene. 0 número médio de núcleos de células endoteliais em cada olho tratado é comparado com o outro olho não tratado de cada animal.

Exemplo 4

Geração de D2-9Gly-Ex3/CH3 0 domínio 2 de Flt-1 tem se mostrado essencial para a ligação de VEGFi65. No entanto, foi demonstrado que Flt-1 de Domínio 2 por si só foi incapaz de se ligar a VEGF A. (Davis-Smyth et al., 1996). 0 VEGF A, quando presente enquanto dímero, liga-se a Flt-1 através de resíduos de ácido (aminoácidos 63 -67 da proteína madura) que permite que um mecanismo possível para a dimerização induzida pelo ligante do receptor (Keyt et al., 1996).

Portanto, a dimerização de domínio 2 do Flt-1 foi utilizada como uma estratégia para restabelecer a ligação de domínio 2 de Flt-1 e VEGF A. A fusão com um fragmento de IgO de cadeia pesada pode ser utilizada para a dimerização de proteínas (Davis-Smyth et al., 1996). Aqui demonstramos que aminoácidos 75-88 (ou seja, PSCVPLMRCGGCCN; SEQ ID N°: 13) do VEGF-A (SEQ ID N°: 12) aumentaram a actividade biológica de proteínas híbridas sFlt-1.

Inicialmente, três proteínas híbridas foram projectadas: D2-9Gly-Fc, D2-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 4). Todas as três proteínas híbridas contêm o mesmo Flt-1 de domínio D2 como D2-9Gly-Fc. Nenhuma ligação do VEGF foi observada com D2-Fc, que não contém o ligante poliglicina 9-mer (9Gly). A terceira proteína, D2-9Gly-Ex3/CH3, contém o ligante 36 poliglicina 9-mer (9Gly) e o domínio de multimerização de VEGF (aa PSCVPLMRCGGCCN, SEQ ID N° : 13; Ex3 VEGF) , mas também contém a região CH3 de cadeia pesada humana IgGl Fe (aa 371-477 da SEQ ID N°: 10). A proteína D2-Fc não mostrou actividade inibitória eficiente no ensaio de proliferação HUVEC (Fig. 5) e, por implicação, não se liga a VEGFi65 eficiente. No entanto, a terceira proteína híbrida, D2-9Gly-Ex3/CH3, que compreende Domínio 2 de Flt-1 fundida à região CH3 através tanto do ligante 9Gly como na região de dimerização VEGF165 (Ex 3), não demonstrou actividade inibitória num ensaio de proliferação HUVECs dependente de VEGF (Fig. 5). Isto implica que esta proteína híbridase liga a VEGF165 de forma eficiente.

Exemplo 5

Uso do ligante (Gly4Ser)3 em constructo Flt-1 D2 O uso de vários ligantes poliglicina foi descrito previamente para a melhoria das características da proteína (Mouz et al. , 1996; Qiu et al, 1998) . Para os próximos constructos, usámos outro tipo de ligante, o 15-mer (Gly-Oly-Gly-Gly-Ser) 3 (Huston et al., 1988). A proteína D2-(Gly4Ser)3-Fc foi gerada e contém Domínio 2 de Flt-1, ligante (Gly4Ser)3 e a região Fc da cadeia pesada humana IgGl. D2-(Gly4Ser) 3-Fc foi caracterizadomais detalhadamente num ensaio de proliferação HUVECs. A actividade biológica de D2-(Gly4Ser) 3-Fc segundo a medição da inibição da proliferação de HUVEC era similar à de D2-9Gly-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 6). 37 0 construto D2-(01y4Ser) 3-Fc foi caracterizado com mais detalhe por Western blot e comparado com D2-9Gly-Fc (Fig.9). Ambos os contrutos estão presentes sobretudo em formas dimeras e as formas monómeras foram detectadas após a separação de amostras reduzidas.

Exemplo 6

Papel de 9Gly ou construtos VEGF Ex3 em Flt-I (D2)

Para investigar o papel do ligante 9Gly ou a sequência de dimerização VEGF Ex3 na ligação VEGF do receptor solúvel, foram gerados três outros constructos: D2-9Gly-CH3, D2-CH3 e D2-Ex3/CH3 (Fig. 8). Todos os três constructos foram gerados e como todos os constructos anteriores também foram colocados sob o controlo do promotor CMV. A sua actividade de bloqueio VEGF foi avaliada em ensaio de proliferação HUVECs (Fig. 9) . 0 ensaio de proliferação HUVEC de proteínas contendo a região CH3 de IgGl demonstrou que D2-9Gly-CH3 (sem Ex3) e a proteína D2-Ex3/CH3 (sem ligante 9Gly) foram semelhantes à força de bloqueio de VEGF relativamente à proteína D2-9Gly Ex3/CH3 parenteral. No entanto, a proteína D2-CH3 parecia ser o inibidor mais fraco de VEGF de todos eles (Fig. 9).

Os dados ELISA de Flt-1 de meios condicionados de 293 células transfectadas mostraram níveis de Flt-1 similares para D2-9Gly-Ex3/CH3, D2-9Gly-CH3 e D2-Ex3/CH3 D2 e CH3 (70-90 ng / ml) e um pouco mais elevados (-150 ng/ml) para a forma menos activa de D2-CH3. O Western blot de constructos D2-9Gly-CH3 e CH3-D2 (Fig.10) mostrou uma prevalência das formas dimeras em condições não reduzidas. 38

Exemplo 7 D2-9Gly-Fc liga-se a 'VEGF melhor do que todos os constructos 0 ensaio de ligação VEGF permite-nos comparar as afinidades de ligação de VEGF dos nossos receptores VEGF solúveis num sistema livre de células.

Em resumo, os meios condicionados contendo concentrações conhecidas de receptor solúvel (em concentrações que variam entre 0,29 e 150 pM) foram diluídos em série e misturados com 10 pM de VEGF. A quantidade de VEGF desligado foi então medida por ELISA. D2 9Gly Fc-VEGF liga-se a VEGF com maior afinidade às concentrações do receptor que variam de 0,001 a 0,2 pM de todos os outros constructos. D2-CH3 tem a menor afinidade para se ligar a VEGF (Fig. 11). 39

Claims (57)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão de fórmula X-Y-Z, em que: X compreende o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1, mas não possui os domínios Ig-like 1 e 3 de VEGF-R1, sendo o referido domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 covalentemente ligado ao grupo Z através do grupo Y; e Y consiste num polipeptídeo de resíduo de aminoácidos 5-25; e Z é uma região CH3 de uma molécula IgG de cadeia pesada ou uma porção Fc de uma molécula de anticorpo.
2. 2. A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que X constitui o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 (FLT-1).
3. 3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo Y é flexível.
4. 4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que Y é seleccionado do grupo consistido por gly9 (SEQ ID N° : 2 7) , glu9 (SEQ ID N°:28), ser9 (SEQ ID N° : 29), gly9cyspro2cys (SEQ ID N°:30), (gly4ser)3 (SEQ ID N°:31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID N°:32), Pro Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID N°: 13), Gly-Asp-Leu-Ili-Tyr-Arg-Asn- Gln-Lys (SEQ ID N°:26) e Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn ((SEQ ID N° : 34) .
5. 5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que Z é uma região IgGl CH3. 1
6. 6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que Z é uma região IgG2 CH3.
7. 7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que Fc é um IgG Fc.
8. 8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, em que IgG Fc é IgGl Fc.
9. 9. Composição compreendendo a proteína de fusão, de qualquer reivindicação anterior, que compreende ainda um ou mais excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, em que a referida composição é uma formulação líquida.
11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, em que a referida composição é uma formulação liofilizada.
12. 12. Composição compreendendo uma ou mais proteínas de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a referida composição compreende multímeros das referidas proteínas de fusão.
13. 13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que a referida composição consiste essencialmente duma espécie simples da proteína de fusão que forma homomultímeros.
14. 14. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que a referida composição consiste essencialmente de proteínas de fusão, em que a o grupo ο X das referidas proteínas de fusão são heterogéneas na composição. 2
15. 15. Composição, de acordo com a reivindicação 12, que compreende ainda um ou mais excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
16. 16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, em que a referida composição é uma formulação liquida.
17. 17. Composição, de acordo com a reivindicação 15, em que a referida composição é uma formulação liofilizada.
18. 18. Método de multimerização de um polipeptídeo X, compreendendo: ligar um polipeptídeo X a um polipeptídeo Y através de um polipeptídeo Y para formar um polipeptídeo XYZ, em que: X compreende o domínio Ig-like 2 de VEGF-Rl, mas não possui os domínios Ig-like 1 e 3 de VEGF-Rl, sendo o referido domínio Ig-like 2 de VEGF-Rl covalentemente ligado ao polipeptídeo Z através do polipeptídeo Y Y consiste em polipeptídeo de resíduo de aminoácidos 5-25; e Z é uma região CH3 de uma molécula IgG de cadeia pesada ou uma porção Fc de uma molécula de anticorpo; em que o polipeptídeo XYZ se multimeriza.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que a etapa de ligação compreende construir uma molécula de ácido nucleico que codifica cada X, Y e Z como uma estrutura de leitura aberta simples, em que tal polipeptídeo XYZ é expresso por um constructo de ácido nucleico numa célula hospedeira. 3
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que X é o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 (Flt-1).
21. 21. Molécula de ácido nucleico, em que codifica uma proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1.
22. 22.Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 21, em que Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo.
23. 23.Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que X é o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 (Flt-1).
24. 24.Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 23, em que a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 21 e 23. 23, em que sequência na SEQ ID com a reivindicação compreende uma grupo que consiste
25. 25.Ácido nucleico, de acordo a proteína de fusão seleccionada a partir do N° : 2 e 25.
26. 26.Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que X é o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 21 e 23.
27. 2 7.Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que X é o domínio Ig-like 2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 2 e 25. 4
28. 28. Célula de mamífero que compreende o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25.
29. 29. Célula de mamífero, de acordo com a reivindicação 28, que é uma célula humana.
30. 30. Célula de mamífero, de acordo com a reivindicação 29, que é seleccionada do grupo que consiste num fibroblasto, hepatócito, uma célula endotelial, um queratinócito, uma célula hematopoiética, um sinoviócito, uma célula epitelial, uma célula retinal e uma célula tronco.
31. 31. Método in vitro, que compreende: o fornecimento do ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, a uma célula de mamífero humana isolada para formar uma célula que expressa a referida tal proteína de fusão.
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2, 21, 23 e 25.
33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, que compreende: a utilização da célula que expressa a referida proteína de fusão no fabrico de uma composição para ser fornecida a um mamífero.
34. 34. Célula do mamífero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, para ser utilizada no tratamento dum mamífero. 5 uma das
35. 35. Ácido nucleico, de acordo com qualquer reivindicações 21 a 25, para ser utilizado no tratamento de um mamífero, em que tal proteína de fusão é expressa no mamífero.
36. 36. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 35, em que a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2, 21, 23 e 25.
37. 37. Célula do mamífero, de acordo com a reivindicação 34 ou o ácido nucleico da reivindicação 35, em que o mamífero sofre de degeneração macular exsudativa relacionada com a idade ou retinopatia diabética proliferativa.
38. 38. Célula do mamífero, de acordo com a reivindicação 34 ou o ácido nucleico da reivindicação 35, em que o mamífero sofre de cancro.
39. 39. Célula do mamífero, de acordo com a reivindicação 34 ou o ácido nucleico da reivindicação 35, em que o mamífero sofre de artrite reumatóide.
40. 40. Célula do mamífero, de acordo com a reivindicação 34 ou o ácido nucleico da reivindicação 35, em que o mamífero sofre de asma.
41. 41.Célula do mamífero, de acordo com a reivindicação 34 ou o ácido nucleico da reivindicação 35, em que o mamífero sofre de osteoartrite. 6
42. 42. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações la 8, para ser utilizada no tratamento de um mamífero.
43. 43. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que o mamífero sofre de degeneração macular exsudativa relacionada com a idade ou retinopatia diabética proliferativa.
44. 44. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que o mamífero sofre de cancro.
45. 45. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que o mamífero sofre de artrite reumatóide.
46. 46. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que o mamífero sofre de asma.
47. 47. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que o mamífero sofre de osteoartrite.
48. 48. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 42, em que a proteína de fusão compreende uma sequência seleccionada do grupo que consiste na SEQ ID N° 2, 21, 23 e 25.
49. 49. Vector que compreende o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-25.
50. 50.Vector, de acordo com a reivindicação 49, em que o vector é um vector virai que é seleccionado do grupo que consiste num vector adenovírus, um vector de vírus adeno-associado, um vector de retrovírus e um vector de lentivirus. 7
51. 51.Vector de acordo com a reivindicação 50, em que o vector é um vector de vírus adeno-associado. para ser em que o exsudativa diabética
52. 52. Vector, de acordo com a reivindicação 49-51 utilizado no tratamento de um mamífero.
53. 53. Vector, de acordo com a reivindicação 52, mamífero sofre de degeneração macular relacionada com a idade ou retinopatia proliferativa.
54. 54.Vector, mamífero de acordo com a sofre de cancro. reivindicação 52,
55. 55.Vector, mamífero de acordo com a reivindicação sofre de artrite reumatóide. 52, em que o em que o
56. 56.Vector, mamífero de acordo com sofre de asma. a reivindicação 52,
57. 57.Vector, mamífero de acordo com a reivindicação sofre de osteoratrite. 52, em que o em que o 8