WO2024010067A1

WO2024010067A1 - 中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤

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Publication number: WO2024010067A1
Application number: PCT/JP2023/025156
Authority: WO
Inventors: 正文木下; 春奈高木; 啓之薗田; 洋太嶋田; 博司小林; 十也大橋; 孝樋口; 小貴松島
Original assignee: Ｊｃｒファーマ株式会社
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2023-07-06
Publication date: 2024-01-11

Abstract

本発明は、中枢神経系へ移行しやすい中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤を提供することを目的とする。本発明の核酸分子は、抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含む。

Description

中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤

　本発明は、中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤に関する。

　ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ　ＩＩ）は、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）の欠損により生じるＸ連鎖性のライソゾーム病であり、ＩＤＳの欠損により、その基質であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が蓄積し、それにより中枢神経症状、特徴的顔貌、関節拘縮、肝脾腫、心弁膜症など様々な症状を全身性に呈する。

　ＭＰＳ　ＩＩに対する治療として、酵素補充療法（ＥＲＴ）と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）若しくは骨髄移植（ＢＭＴ）が存在するが、従来のＥＲＴ又はＨＳＣＴ若しくはＢＭＴでは中枢神経病変、骨病変などに対しては十分な効果が得られなかった（例えば非特許文献１）。２０２１年に日本において中枢神経移行型のＩＤＳ及び酵素の脳室内投与を利用するＥＲＴが承認された。ＥＲＴは治療効果が高いものの、毎週の点滴が必要であり薬価も極めて高額なため、より安価かつ有効な治療法の確立は重要な課題である。

　本発明者らはＭＰＳ　ＩＩマウスを用いて、ＨＳＣＴ若しくはＢＭＴの前処置法や移植割合を検討したものの、いずれも中枢神経には効果がなかった（非特許文献４、５）。その一方で、ＥＲＴ及びＨＳＣＴ若しくはＢＭＴ以外の方法として、非特許文献２、３は、ＭＰＳ　ＩＩマウスに対する造血幹細胞遺伝子治療の効果を報告している。

　本発明者らは、モデルマウスに（Ｂ６／ＭＰＳ　ＩＩ）ウイルス・プロモーター（ＭＮＤプロモーター：モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ／骨髄増殖肉腫ウイルスエンハンサー）を用いＩＤＳ遺伝子を造血幹細胞に発現させることで、ＥＲＴ又はＨＳＣＴでは達成できなかった、ＭＰＳ　ＩＩモデルマウスの脳のＧＡＧを減少させることに成功した（非特許文献６）。本発明者らはまた、ムコ多糖症ＩＩ型の遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターシステムを開発した（特許文献１）。本発明者らはさらに、その後造血幹細胞遺伝子治療はマウスＧＭ１－ガングリオシドーシスモデルにおける中枢神経系の病変を改善することも報告した（非特許文献７）。

特開２０１９－１２２３７１号公報特開２０１８－１３４０９５号公報ＷＯ２０１８／１２４１２１特開２０２２－０１７２５８号公報

Akiyama K, et al., Mol Genet Metab. 2014, 111(2):139-146. Miwa S, et al., Mol Genet Metab. 2020, 130(4): 262-273 Wada M, et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020, 19:261-274 Yokoi T, et al., Mol Genet Metab. 2016, 119(3): 232-238 Yokoi K, et al., J Inherit Metab Dis. 2015, 38(2):333-340 Wakabayashi T, et al., Hum Gene Ther. 2015, 26(6):357-366 Tsunogai T, et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2022, 25:448-460 Kyosen SO, et al. Gene Ther. 2010 Apr;17(4):521-30 Matsuda J, et al., Glycoconj J. 1997;14(6):729-36 Toya Ohashi et al., Mol Ther. 2012 Oct;20(10):1924-31

　非特許文献６等の造血幹細胞を標的としたＩＤＳ遺伝子治療では、移植されたＩＤＳ遺伝子導入造血幹細胞由来の細胞が中枢神経へ移行することにより、中枢神経系においてもＩＤＳが分泌され、一定の治療効果を奏すると認められる。一方で、中枢神経外において血液中へと分泌されたＩＤＳは血液脳関門を通過することができず、中枢神経系における治療効果への寄与は限定的である。

　そこで、本発明は、中枢神経系へ移行しやすい中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤を提供することを目的とする。

　本発明者らが、以前開発したムコ多糖症ＩＩ型の遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターシステム（特許文献１）と、ＩＤＳとトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する抗体との融合タンパク質が発現できる核酸分子とを用いた結果、内臓のみならず、中枢神経系におけるＧＡＧの蓄積も大幅に低減できたことを見出し、さらに、この核酸分子においてＩＤＳをほかの中枢神経系で機能させるべきタンパク質に置換することができ、それによって様々な中枢神経系疾患を治療できることを見出し、本発明の完成に至った。

　すなわち、本発明は以下を含む。
［１］
　抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸分子。
［２］
　上記中枢神経系で機能させるべきタンパク質がライソゾーム酵素である、［１］に記載の核酸分子。
［３］
　上記ライソゾーム酵素が、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、又はβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）である、［２］に記載の核酸分子。
［４］
　上記中枢神経系で機能させるべきタンパク質がイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）である、［１］に記載の核酸分子。
［５］
　上記中枢神経系で機能させるべきタンパク質が神経栄養因子である、［１］に記載の核酸分子。
［６］
　上記中枢神経系で機能させるべきタンパク質が抗体である、［１］に記載の核酸分子。
［７］
　［１］～［６］のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
［８］
　上記ベクターを用いて上記核酸分子を宿主細胞導入した場合、上記融合タンパク質を安定発現させるベクターである、［７］に記載のベクター。
［９］
　レンチウイルスベクターである、［８］に記載のベクター。
［１０］
　［７］又は［８］に記載のベクターを用いて上記核酸分子を宿主細胞に導入して得られた、組換え細胞。
［１１］
　上記宿主細胞が、造血幹細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞である、［１０］に記載の組換え細胞。
［１２］
　［１０］に記載の組換え細胞を含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための薬剤。
［１３］
　［１０］に記載の組換え細胞を、必要とする対象に移植することを含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための方法。
［１４］
　中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための、［１０］に記載の組換え細胞の使用。
［１５］
　中枢神経系疾患を診断、予防又は治療における使用のための、［１０］に記載の組換え細胞。
［１６］
　中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための薬剤の製造における、［１０］に記載の組換え細胞の使用。

　本発明は、ＩＤＳ欠損に起因する疾患、及び、ＩＤＳ以外の中枢神経系で機能させるべきタンパク質に関連する疾患等の中枢神経系疾患の治療のための、核酸分子、ベクター、組換え細胞及び薬剤を提供する。本発明によれば、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片と、ＩＤＳ等の中枢神経系で機能させるべきタンパク質との融合タンパク質を発現する造血幹細胞等の宿主細胞を移植することで、中枢神経系へのＩＤＳ等のタンパク質の移行が増加し、それによって、ムコ多糖症ＩＩ型等の中枢神経系疾患を治療できる。本発明は、患者自身の自己造血幹細胞を用いることもできるため、他家移植である従来の造血幹細胞移植等のように適合ドナーを探す必要がなく、移植に伴う移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や拒絶反応による生着不全のリスクも極めて低い。また、基本的に一回の移植で持続的な効果を維持することができるため、酵素補充療法に比べて生涯医療費は安価となると見込まれ、かつ、治療効果も高い。

　本発明者らは、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸分子を用いることによって、上記中枢神経系で機能させるべきタンパク質を中枢神経系に移行させることに成功し、かつ、当該タンパク質が中枢神経系において実際に治療効果を発揮することを初めて証明した。本発明の核酸分子が導入された、造血幹細胞等の組換え細胞自体の中枢神経への移行も考えられる。このように、組換え細胞と当該細胞によって発現・分泌された融合タンパク質（すなわち、ＩＤＳ等の治療用タンパク質と抗ＴｆＲ抗体との融合タンパク質）の両方が中枢神経系に移行するため、融合タンパク質の動態の予測が難しいため、実際に治療効果が得られるかの予測が困難である。また、抗ＴｆＲ抗体の存在によって、融合タンパク質の大部分が中枢組織に移行すると考えられる。そうすると、中枢神経系以外の組織での治療効果が期待できないため、治療用タンパク質を中枢神経系に移行させるような治療法は避けられてきた。しかしながら意外なことに、実施例にも証明されたように、本発明の融合タンパク質は、中枢神経系以外の組織（例えば肝臓等）にも一定の治療効果を発揮できる。さらに、融合タンパク質は、分子量が大きく、また、分子も複雑であるため、組換え細胞は直ちに分子量が大きく、複雑な融合タンパク質を生産しようとしないと考えられる。そのため、融合タンパク質の生産性の低下が予想され、治療効果の予測をさらに困難にする。これらのことを考慮すると、本発明による効果は予想外の顕著な効果である。

実施例１において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植１ヶ月後から６ヶ月後までの血漿中のＩＤＳ活性を示す。実施例１において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植６ヶ月後の肝臓及び脾臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例１において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植６ヶ月後の腎臓及び心臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例１において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植６ヶ月後の大脳及び小脳におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例２において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の血漿におけるＩＤＳ活性の測定結果を示す。実施例２において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の肝臓及び脾臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例２において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の大脳及び小脳におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例３において、遺伝子導入したＴ細胞の移植４週間後の血漿におけるＩＤＳ活性の測定結果を示す。実施例３において、遺伝子導入したＴ細胞の移植４週間後の大脳及び小脳におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を示す。実施例４において、遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＡＡ活性の測定結果を示す。実施例４において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の血清、肝臓及び脾臓におけるＧＡＡ活性の測定結果を示す。実施例４において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の心臓、大腿四頭筋、横隔膜及び腓腹筋におけるＧＡＡ活性の測定結果を示す。実施例４において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の心臓、大腿四頭筋、横隔膜及び腓腹筋におけるグリコーゲン蓄積の測定結果を示す。実施例４において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の大脳及び小脳におけるＧＡＡ活性及びグリコーゲン蓄積の測定結果を示す。実施例５において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の血清におけるＧＬＢ１活性の測定結果を示す。実施例５において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の大脳皮質及び小脳におけるＧＬＢ１活性及びＧＭ１蓄積の測定結果を示す。実施例５において、遺伝子導入した造血幹細胞の移植４週間後の海馬におけるＧＬＢ１活性及びＧＭ１蓄積の測定結果を示す。

〔核酸分子〕
　本発明の一実施形態の核酸分子は、抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含む。上記抗ＴｆＲ抗体が抗ヒトＴｆＲ抗体であり、上記ＩＤＳがヒトＩＤＳであることが好ましい。

＜トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）＞
　トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、血中のトランスフェリンと鉄（Ｆｅ）の結合体を細胞内に取り込む膜貫通タンパク質であり、脳血管内皮細胞等の血管内皮細胞等の表面に存在する。本発明の一実施形態の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲと特異的に結合し、それによって、ＴｆＲによって細胞内に取り込まれる抗体である。その際に、抗ＴｆＲ抗体と融合タンパク質を形成するＩＤＳも一緒に細胞内に取り込まれるため、単独では血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できないＩＤＳが、ＴｆＲによって脳組織へと運ばれ、脳組織でのＩＤＳの生理活性を示すことができる。したがって、抗ＴｆＲ抗体とＩＤＳとの融合タンパク質は、脳内で薬効を発揮させるべき医薬として使用し得る。

　本明細書において、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の由来は限定されず、例えばヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。ヒト由来のＴｆＲとしては、野生型のＴｆＲ（タンパク質：ＮＰ＿００１１２１６２０；遺伝子：ＮＭ＿００１１２８１４８）であってもよく、変異型のＴｆＲであってもよい。変異型ＴｆＲは特に限定されず、それに対する抗体が野生型ＴｆＲにも結合できる抗体であればよく、例えば、生理活性又は抗原性が増強された変異型ＴｆＲであってよい。

　変異型ＴｆＲは、野生型ＴｆＲの生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸をほかのアミノ酸で置換する場合、置換するアミノ酸の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～３個である。野生型ＴｆＲのアミノ酸を欠失させる場合、欠失させるアミノ酸の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～３個である。また、これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。野生型ＴｆＲにアミノ酸を付加する場合、当該タンパク質のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加、置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた当該タンパク質のアミノ酸配列は、野生型ＴｆＲのアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上の同一性を示し、好ましくは８５％以上の同一性を示し、より好ましくは９０％以上の同一性を示し、さらに好ましくは、９５％以上の同一性を示し、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を示す。

　なお、本発明において、野生型ＴｆＲと比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失、置換、付加）は、野生型及び変異型タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントにより、容易に確認することができる。なお、本発明において、野生型ＴｆＲのアミノ酸配列と変異型ＴｆＲのアミノ酸配列との同一性は、周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば、そのようなアルゴリズムとして、BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10，(1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。

　上記のタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸のほかのアミノ酸による置換は、例えば、アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質において関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は、タンパク質の機能に大きな変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては、例えば以下のものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸、
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン、リシン、及びアルギニン、
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン、
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、及びグルタミン、
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン、
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン、
（９）脂肪族アミノ酸である、アラニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリン、
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン、グリシン、セリン、及びトレオニン、
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。

＜抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体＞
　本明細書において「抗体」とは、抗原に特異的に結合するタンパク質免疫グロブリンを意味する。免疫グロブリンは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む、一般的に知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。一般に、抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含み、軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、すなわちＣＬを含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、それぞれＮ末端からＣ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順に、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

　本明細書において抗体として、モノクローナル抗体、組換えにより生成された抗体、単一特異的抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、２本の重鎖分子及び２本の軽鎖分子を含む四量体抗体が挙げられる。本明細書において、一般的な四量体抗体のほかに、後述の二量体抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体なども抗体に含まれるが、これらは抗体断片（抗原結合断片）とも呼ばれる。

　「ヒト抗体」は、その全体がヒト由来の遺伝子にコードされる抗体のことをいう。ただし、遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で、元のヒトの遺伝子に変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も、ヒト抗体である。また、ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて、ある一つのヒト抗体の一部を、ほかのヒト抗体の一部に置き換えた抗体も、ヒト抗体である。ヒト抗体は、免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは、Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲは、Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。ある一つのヒト抗体のＣＤＲを、その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより、ヒト抗体の抗原特異性、親和性等を改変した抗体も、ヒト抗体である。

　本明細書において、元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより、元の抗体のアミノ酸配列に置換、欠失、付加等の変異を加えた抗体も、ヒト抗体という。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸をほかのアミノ酸へ置換させる場合、置換させるアミノ酸の個数は、好ましくは１～２０個であり、より好ましくは１～１０個であり、さらに好ましくは１～５個であり、さらにより好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合、欠失させるアミノ酸の個数は、好ましくは１～２０個であり、より好ましくは１～１０個であり、さらに好ましくは１～５個であり、更よりに好ましくは１～３個である。また、これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も、ヒト抗体である。アミノ酸を付加させる場合、元の抗体のアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはＣ末端側に、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらにより好ましくは１～３個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加、置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も、ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は、元の抗体のアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上の同一性を示し、より好ましくは９０％以上の同一性を示し、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示し、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を示すものである。つまり、本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは、ヒト由来の元の遺伝子に加えて、ヒト由来の元の遺伝子に改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。

　本明細書において、「ヒト化抗体」の語は、可変領域の一部（例えば、特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり、それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば、ヒト化抗体として、ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ほかの哺乳動物のＣＤＲによって置き換えることにより作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となるほかの哺乳動物の生物種は、ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はヒト以外の霊長類であり、より好ましくはマウス及びラットであり、例えばマウスである。

　本明細書において、抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である場合につき、以下詳述する。ヒト抗体及びヒト化抗体の軽鎖には、λ鎖とκ鎖がある。抗体を構成する軽鎖は、λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また、ヒト抗体及びヒト化抗体の重鎖には、γ鎖、μ鎖、α鎖、σ鎖及びε鎖があり、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに対応している。抗体を構成する重鎖は、γ鎖、μ鎖、α鎖、σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが、好ましくはγ鎖である。さらに、抗体の重鎖のγ鎖には、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖及びγ４鎖があり、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対応している。抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合、そのγ鎖は、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、γ１鎖又はγ４鎖である。抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体であり、かつＩｇＧである場合、その抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく、その抗体の重鎖は、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、γ１鎖又はγ４鎖である。例えば、好ましい抗体の一つの態様として、軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ１鎖であるものが挙げられる。

　本明細書において、「キメラ抗体」の語は、２つ以上の異なる種に由来する、２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。一実施形態において、抗ＴｆＲ抗体がヒト化抗ＴｆＲ抗体である。

　ヒト抗体とほかの哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは、ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は、以下に説明するＦｃ領域、Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として、Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がほかの哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。逆に、Ｆｃ領域がほかの哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するものもキメラ抗体である。ヒンジ部は、ヒト抗体又はほかの哺乳動物の抗体のいずれに由来してもよい。ヒト化抗ＴｆＲ抗体についても同様のことがいえる。

　また、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗ＴｆＲ抗体）は、可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体のほかの具体例として、重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がほかの哺乳動物の抗体に由来するもの、逆に、重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がほかの哺乳動物の抗体に由来する一方で、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものが挙げられる。ここで、ほかの哺乳動物の生物種は、ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はヒト以外の霊長類であり、より好ましくはマウスである。

　ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は、特に、「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には、Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や、逆に、Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は、ヒト抗体又はマウス抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体のほかの具体例として、重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がマウス抗体に由来するもの、逆に、重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がマウス抗体に由来する一方で、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものが挙げられる。

　抗体は、本来、２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。ただし、本発明において、「抗体」というときは、この基本構造を有する四量体抗体に加え、
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなる二量体抗体、
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカーを、そしてさらにそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体、
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカーを、そしてさらにそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体、
（４）免疫グロブリン重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカーを、そしてさらにそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させてなるものである一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、
（５）免疫グロブリン軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカーを、そしてさらにそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域を結合させてなるものである一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、
（６）上記抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２を含む）、並びに、
（７）単一ドメイン抗体も、本明細書における「抗体」に含まれる。さらには、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカーを介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも、本明細書における抗体に含まれる。

　本明細書において、「リンカー」は、例えば、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合したペプチド鎖からなるものをいう。かかるペプチド鎖からなるリンカーは「ペプチドリンカー」ということもできる。「リンカー」は本明細書の文脈において「リンカー配列」と言い換えることもできる。このリンカーのＮ末端とほかのタンパク質のＣ末端がペプチド結合で結合し、当該リンカーのＣ末端にさらにほかのタンパク質のＮ末端が結合することにより、２つのタンパク質がリンカーを介して結合体を形成する。

　本発明の一実施形態において、Ｆａｂとは、可変領域とＣＬ領域（軽鎖の定常領域）を含む１本の軽鎖と、可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む１本の重鎖が、それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて、重鎖は、可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて、さらにヒンジ部の一部を含んでもよいが、この場合のヒンジ部は、ヒンジ部に存在して抗体の重鎖同士を結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて、軽鎖と重鎖とは、軽鎖の定常領域（ＣＬ領域）に存在するシステイン残基と、重鎖の定常領域（ＣＨ１領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂを形成する重鎖のことをＦａｂ重鎖という。Ｆａｂは、ヒンジ部に存在して抗体の重鎖同士を結合するシステイン残基を欠いているので、１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆａｂを構成する軽鎖は、可変領域とＣＬ領域を含む。Ｆａｂを構成する重鎖は、可変領域とＣＨ１領域からなるものであってもよく、可変領域、ＣＨ１領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。ただしこの場合、ヒンジ部で２本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように、ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。Ｆ（ａｂ’）においては、その重鎖は可変領域とＣＨ１領域に加えて、重鎖同士を結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を形成する重鎖のことをＦａｂ’重鎖という。また、複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなる二量体、三量体等の重合体も、抗体である。さらに、これらに限らず、抗体分子の一部を含み、かつ、抗原に特異的に結合する性質を有するものはいずれも、本発明でいう「抗体」に含まれる。すなわち、本発明において軽鎖というときは、軽鎖に由来し、その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また、重鎖というときは、重鎖に由来し、その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。したがって、可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り、例えば、Ｆｃ領域が欠失したものも、重鎖である。

　また、ここでＦｃ又はＦｃ領域とは、抗体分子中の、ＣＨ２領域（重鎖の定常領域の部分２）、及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。

　さらに、本発明の一実施形態における抗体は、
　（８）上記（６）で示したＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を構成する軽鎖と重鎖を、リンカー配列を介して結合させて、それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ、ｓｃＦ（ａｂ’）、及びｓｃＦ（ａｂ’）２も含まれる。ここで、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦ（ａｂ’）、及びｓｃＦ（ａｂ’）２にあっては、軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を、そしてさらにそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく、また、重鎖のＣ末端側にリンカーを、そしてさらにそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。さらには、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とをリンカーを介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも、本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては、軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を、そしてさらにそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく、また、重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を、そしてさらにそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。

　さらに、本明細書でいう「抗体」には、完全長抗体、上記（１）～（８）に示されるものに加えて、（１）～（８）を含むより広い概念である、完全長抗体の一部が欠損したものである抗原結合断片（抗体フラグメント）のいずれの形態も含まれる。抗原結合断片には、重鎖抗体、軽鎖抗体、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、及びこれらの一部が欠損したものも含まれる。

　「抗原結合断片」の語は、抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいい、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（Ｆｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ、ｓｃＦｖの重鎖（Ｈ鎖）に定常領域の一部（ＣＨ３）が結合したものの二量体であるミニボディ、その他の低分子化抗体等を包含する。ただし、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。

　本明細書において、「一本鎖抗体」というときは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカーが結合し、さらにそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり、特定の抗原に特異的に結合することのできるタンパク質をいう。また、免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカーが結合し、さらにそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり、特定の抗原に特異的に結合することのできるタンパク質も、本発明における「一本鎖抗体」である。例えば、上記（２）及び（３）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカーを介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては、通常、免疫グロブリン重鎖は、Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は、抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に、免疫グロブリン重鎖の可変領域も、ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは、抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。したがって、一本鎖抗体には、免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと、免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。ただし、抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り、ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。

　一本鎖抗体において、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカーは、好ましくは２～５０個、より好ましくは８～５０個、さらに好ましくは１０～３０個、さらにより好ましくは１２～１８個又は１５～２５個、例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカーは、これにより両鎖が連結されてなる抗体が抗原に対する親和性を保持する限り、そのアミノ酸配列に限定はないが、好ましくは、グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり、例えば、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号９）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１０）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１１）、又はこれらのアミノ酸配列が２～１０回、あるいは２～５回繰り返された配列を有するものである。例えば、免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側に、リンカーを介して免疫グロブリン重鎖の可変領域を結合させてＳｃＦＶとする場合、配列番号９の３回繰り返された配列を有するリンカーが好適に用いられる。

　本発明の一実施形態において、単一ドメイン抗体とは、単一の可変領域で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体のことをいう。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ＶＨＨ、ＶＮＡＲは単一ドメイン抗体の一種である。

　本発明の一実施形態において、抗ＴｆＲ抗体の具体例として、例えば特許文献２～４に記載されているものが挙げられる。

＜中枢神経系で機能させるべきタンパク質＞
　本明細書において、「中枢神経系で機能させるべきタンパク質」とは、中枢神経系で生理活性を有するタンパク質であって、中枢神経系で機能させることが必要なタンパク質である。ここで、タンパク質はペプチドも含み、例えばアミノ酸残基が２～３０００個、１０～１５００個、又は２０～１０００個であるタンパク質であってもよい。中枢神経系で機能させるべきタンパク質としては、中枢神経系で生理活性を有するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、ライソゾーム酵素、神経栄養因子、抗体、ホルモン、ソマトメジン、インスリン、グルカゴン、サイトカイン、リンホカイン、血液凝固因子、抗体とほかのタンパク質との融合タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、ダルベポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ－ＰＡ）、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ゴナドトロピン、ＤＮａｓｅｌ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、ニューロトロフィン６、ニューレグリン１、アクチビン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン６、ＰＤ－１、ＰＤ－１リガンド、腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ－α受容体）、ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素、エタネルセプト、ペグビソマント、メトレレプチン、アバタセプト、アスホターゼ、及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト、いずれかの抗体医薬の一つが挙げられる。

　中枢神経系で機能させるべきタンパク質がライソゾーム酵素である場合の好適例として、α－Ｌ－イズロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ＧＭ２活性化タンパク質、β－ヘキソサミニダーゼＡ、β－ヘキソサミニダーゼＢ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、サポシンＣ、アリールスルファターゼＡ、α－Ｌ－フコシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、β－グルクロニダーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、酸性セラミダーゼ、アミロ－１，６－グルコシダーゼ、シアリダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１）、トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１）、ヒアルロニダーゼ－１、ＣＬＮ１、ＣＬＮ２、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）等が挙げられる。中枢神経系で機能させるべきタンパク質がライソゾーム酵素である場合、ライソゾーム酵素がβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）又は酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）であることがより好ましい。

　中枢神経系で機能させるべきタンパク質が、酸性α－グルコシダーゼ（ａｃｉｄ　ａｌｆａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ＧＡＡ）であることが好ましく、ＧＡＡは、ポンペ病として知られる筋疾患の原因酵素であり、ＧＡＡが欠乏すると、組織において、ＧＡＡの基質であるグリコーゲンが蓄積してしまうことによって、様々な症状を引き起こす。

　本明細書において、ＧＡＡの由来は限定されず、例えばヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。ヒト由来のＧＡＡとしては、野生型のＧＡＡ（例えば、タンパク質：ＮＰ＿０００１４３（Ｇｅｎｂａｎｋ）；遺伝子：ＮＭ＿０００１５２（Ｇｅｎｂａｎｋ）等）であってもよく、変異型のＧＡＡであってもよい。野生型ＧＡＡは、参照するデータベースによってそのアミノ酸又は塩基配列が数アミノ酸又は数塩基～数十塩基程度変化し得るが、当業者が野生型ＧＡＡであると認識し得るものであれば特に限定されない。変異型ＧＡＡは特に限定されず、例えば、生理活性が増強された変異型ＧＡＡであってよい。なお、変異型ＴｆＲにおける記述は、変異型ＧＡＡについても同様である。ほかの中枢神経系で機能させるべきタンパク質も同様に、ヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。また、野生型のタンパク質であっても、変異型のタンパク質であってもよい。

　中枢神経系で機能させるべきタンパク質が、β－ガラクトシダーゼ（Ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＧＬＢ１）であることが好ましく、ＧＬＢ１は、ＧＭ１ガングリオシドーシスとして知られる遺伝性疾患の原因酵素であり、ＧＬＢ１が欠乏すると、組織において、ＧＬＢ１の基質であるＧＭ１ガングリオシドが蓄積してしまうことによって、様々な症状を引き起こす。

　本明細書において、ＧＬＢ１の由来は限定されず、例えばヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。ヒト由来のＧＬＢ１としては、野生型のＧＬＢ１（例えば、タンパク質：ＡＡＡ５１８２３（ＧｅｎＢａｎｋ）、ＮＰ＿０００３９５（ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｐ１６２７８（Ｕｎｉｐｒｏｔ）；遺伝子：ＮＭ＿０００４０４（ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｍ３４４２３（ＧｅｎＢａｎｋ）等）であってもよく、変異型のＧＬＢ１であってもよい。野生型ＧＬＢ１は、参照するデータベースによってそのアミノ酸又は塩基配列が数アミノ酸又は数塩基～数十塩基程度変化し得るが、当業者が野生型ＧＬＢ１であると認識し得るものであれば特に限定されない。変異型ＧＬＢ１は特に限定されず、例えば、生理活性が増強された変異型ＧＬＢ１であってよい。なお、変異型ＴｆＲにおける記述は、変異型ＧＬＢ１についても同様である。ほかの中枢神経系で機能させるべきタンパク質も同様に、ヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。また、野生型のタンパク質であっても、変異型のタンパク質であってもよい。

　中枢神経系で機能させるべきタンパク質が、イズロン酸－２－スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔｅ；ＩＤＳ）であることが好ましく、ＩＤＳは、ハンター症候群として知られるムコ多糖症ＩＩ型の原因酵素であり、ＩＤＳが欠乏すると、組織において、ＩＤＳの基質であるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ；ＧＡＧ）が蓄積してしまうことによって、様々な症状を引き起こす。

　本明細書において、ＩＤＳの由来は限定されず、例えばヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。ヒト由来のＩＤＳとしては、野生型のＩＤＳ（タンパク質：ＮＰ＿０００１９３；遺伝子：ＮＭ＿０００２０２）であってもよく、変異型のＩＤＳであってもよい。変異型ＩＤＳは特に限定されず、例えば、生理活性が増強された変異型ＩＤＳであってよい。なお、変異型ＴｆＲにおける記述は、変異型ＩＤＳについても同様である。ほかの中枢神経系で機能させるべきタンパク質も同様に、ヒト由来であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又は、ヒト以外の霊長類由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。また、野生型のタンパク質であっても、変異型のタンパク質であってもよい。

＜融合タンパク質＞
　本発明の融合タンパク質は、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療することができる、抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質との融合タンパク質である。該融合タンパク質において、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片、及び中枢神経系で機能させるべきタンパク質は、この順に、又は逆の順に融合されていてもよく、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片がＮ末端に存在することが好ましい。また、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片と中枢神経系で機能させるべきタンパク質との間に、ペプチドリンカーが存在していてもよい。ペプチドリンカーとしては、上記のとおりである。

　本発明の一実施形態の融合タンパク質は、当該融合タンパク質が検出されるためのマーカータンパク質を含んでいてもよく、マーカータンパク質としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。該マーカータンパク質は、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、或いは、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片と中枢神経系で機能させるべきタンパク質との間に位置していてもよい。

　本発明の一実施形態の融合タンパク質は、複数の中枢神経系で機能させるべきタンパク質を含んでもよい。この場合は、複数の中枢神経系で機能させるべきタンパク質は機能的に、好ましくはリンカーを介して融合されている。抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片は、Ｎ末端又はＣ末端のどちらに存在してもよいが、Ｎ末端に存在することが好ましい。

＜核酸分子＞
　本明細書において「核酸分子」とは、デオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により重合したものであるＤＮＡ、又は、リボヌクレオチドがホスホジエステル結合により重合したものであるＲＮＡのいずれかのことをいう。

　「核酸分子」がＤＮＡである場合のＤＮＡは一重鎖（一本鎖）でもよく、又、相補鎖を伴う二重鎖であってもよい。ＤＮＡが一重鎖である場合の、ＤＮＡは（＋）鎖であっても（－）鎖であってもよい。ＤＮＡを構成する個々のデオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡに含まれるタンパク質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内でｍＲＮＡに翻訳されることができる限り、天然に存在する型のものであってもよく、天然型に修飾を加えたものであってもよい。本発明の一実施形態において、ＤＮＡを構成する個々のデオキシリボヌクレオチドは、哺乳動物（特にヒト）の細胞内で、ＤＮＡに含まれるタンパク質をコードする遺伝子がｍＲＮＡに翻訳され、かつ、ＤＮＡの全部又は一部が複製されることができるものである限り、天然に存在する型のものであってもよく、天然型に修飾を加えたものであってもよい。

　また、「核酸分子」がＲＮＡである場合のＲＮＡは一重鎖（一本鎖）でもよく、相補鎖を伴う二重鎖であってもよい。ＲＮＡが一本鎖である場合の、ＲＮＡは（＋）鎖であっても（－）鎖であってもよい。本発明の一実施形態において、ＲＮＡを構成する個々のリボヌクレオチドは、ＲＮＡに含まれるタンパク質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内でＤＮＡに逆転写されることができる限り、天然に存在する型のものであってもよく、修飾されたものであってもよい。また、本発明の一実施形態において、ＲＮＡを構成する個々のリボヌクレオチドは、ＲＮＡに含まれるタンパク質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内でタンパク質に翻訳されることができる限り、天然に存在する型のものであってもよく、修飾されたものであってもよい。リボヌクレオチドの修飾は、例えば、ＲＮＡのＲＮａｓｅによる分解を抑制し、ＲＮＡの細胞内における安定性を高めるために行われる。

　融合タンパク質をコードする核酸分子のうち、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする部分の核酸分子は、特に限定されず、例えば、特許文献２～４に記載されたＤＮＡ配列が挙げられる。

　中枢神経系で機能させるべきタンパク質がＩＤＳである場合、融合タンパク質をコードする核酸分子のうち、ＩＤＳをコードする部分の核酸分子は、ＩＤＳ遺伝子（ＮＭ＿０００２０２）であっても、ｃＤＮＡであってもよい。また、例えば、配列番号３に示されるコドン最適化を行ったＤＮＡであってもよい。中枢神経系で機能させるべきタンパク質がＧＡＡである場合、融合タンパク質をコードする核酸分子のうち、ＧＡＡをコードする部分の核酸分子は、ＧＡＡ遺伝子（例えば、ＮＭ＿０００１５２等）であっても、ｃＤＮＡであってもよい。また、例えば、配列番号１８に示されるＤＮＡであってもよい。中枢神経系で機能させるべきタンパク質がＧＬＢ１である場合、融合タンパク質をコードする核酸分子のうち、ＧＬＢ１をコードする部分の核酸分子は、ＧＬＢ１遺伝子（例えば、ＮＭ＿０００４０４、Ｍ３４４２３等）であっても、ｃＤＮＡであってもよい。また、例えば、配列番号２４に示されるコドン最適化を行ったＤＮＡであってもよい。

　融合タンパク質において、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片と中枢神経系で機能させるべきタンパク質との間にペプチドリンカーが存在する場合は、融合タンパク質をコードする核酸分子も、当該ペプチドリンカーをコードする核酸を含む。

＜ベクター＞
　本発明のベクターは、本発明の核酸分子を含む。ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能なベクター及び／又は宿主細胞の染色体への組込が可能なベクターであって、上記核酸分子を転写できるベクターであり、ベクターを用いて核酸分子を宿主細胞導入した場合、融合タンパク質を安定発現させるベクターであることが好ましい。具体的には、レンチウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン－バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。そのうち、宿主細胞内で安定発現させる観点から、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターであることが好ましい。

　レンチウイルスはレトロウイルス科の亜科の一つであるオルトレトロウイルス亜科の中でレンチウイルス属に属するウイルスであり、一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡゲノム（ｓｓＲＮＡ）を有する。レンチウイルスのゲノムは必須遺伝子としてｇａｇ（カプシドタンパク質を含む構造タンパク質をコードする領域）、ｐｏｌ（逆転写酵素を含む酵素群をコードする領域）、ｅｎｖ（宿主細胞への結合に必要なエンベロープタンパク質をコードする領域）を含み、これらが２つのＬＴＲ（５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ）に挟まれている。またこれらに加え、レンチウイルスのゲノムは、補助遺伝子として、Ｒｅｖ（ウイルスＲＮＡ内に存在するＲＲＥ（ｒｅｖ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合してウイルスＲＮＡを核から細胞質に輸送する機能を有するタンパク質をコードする領域）、ｔａｔ（５’ＬＴＲ内にあるＴＡＲに結合してＬＴＲのプロモーター活性を上昇させる機能を有するタンパク質をコードする領域）、そのほかｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ等を含む。

　レンチウイルスはエンベロープウイルスであり、エンベロープが細胞膜と融合することで細胞に感染する。また、レンチウイルスはＲＮＡウイルスであり、ビリオン中には逆転写酵素が存在する。レンチウイルスの感染後、逆転写酵素により、（＋）鎖ＲＮＡゲノムから一本鎖のプラス鎖ＤＮＡが複製され、さらに二重鎖ＤＮＡが合成される。この二重鎖ＤＮＡからビリオンの構成成分であるタンパク質が発現し、これに（＋）鎖ＲＮＡゲノムがパッケージングされることによりビリオンが増殖する。本発明の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスの一種であるＨＩＶ－１のゲノムに基づき開発されたものがあるが、これに限られるものではない。

　第一世代レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミド、Ｅｎｖプラスミド、及び導入プラスミドの３種のプラスミドからなる。パッケージングプラスミドはＣＭＶプロモーター等の制御下にｇａｇ及びｐｏｌの各遺伝子を有する。ＥｎｖプラスミドはＣＭＶプロモーター制御下にｅｎｖ遺伝子を有する。導入プラスミドは、５’ＬＴＲ、ＲＲＥ、ＣＭＶプロモーター制御下に所望のタンパク質をコードする遺伝子、及び３’ＬＴＲを有する。これらを宿主細胞に一般的なトランスフェクション手法により導入することで、第一のLTRと第二のLTRとの間に外来の遺伝子を含む核酸分子がカプシドタンパク質中にパッケージングされた組換えビリオンが得られる。第一世代レンチウイルスベクターのパッケージングプラスミドには、ウイルス由来のｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆの各補助遺伝子も含まれる。ここにおいて本発明における所望のタンパク質は、リガンドと生理活性を有するタンパク質の融合タンパク質である。なお、所望のタンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターをＣＭＶプロモーター以外のプロモーター、例えばＭＮＤプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ＣＡＧプロモーター（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓエンハンサーとトリβ－アクチンプロモーター、ウサギβグロビンポリＡのハイブリッドプロモーター）レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、マウスアルブミンプロモーター、ヒトアルブミンプロモーター、及びヒトα－１アンチトリプシンプロモーターを含むものが好適である。好ましくは、配列番号１に記載のＭＮＤプロモーターである。

　第二世代レンチウイルスベクターも、第一世代と同じくパッケージングプラスミド、Ｅｎｖプラスミド（エンベローププラスミド）、及び導入プラスミドの３種のプラスミドからなる。ただし、パッケージングプラスミドから、必須遺伝子でないｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆの各補助遺伝子は削除されている。

　第三世代レンチウイルスベクター（すなわち、レンチウイルスベクターシステム）は、第二世代ではパッケージングプラスミドに含まれていたＲｅｖを分離させて、独立したＲｅｖプラスミドとしている。また、ｔａｔもパッケージングプラスミドから削除されている。さらに、導入プラスミドの５’ＬＴＲ内のＵ３領域がＣＭＶプロモーターに置き換えられている。

　パッケージングプラスミドは、エンベロープ以外のウイルス遺伝子をコードしておりウイルス粒子を作るためのタンパク質をトランスに供給する。非分裂細胞への感染に修飾遺伝子産物は必要ではないため、修飾遺伝子（ｖｉｆ、ｆｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ）は削除される。修飾遺伝子産物はＨＩＶ－１の複製に必須ではないが重要であり、ＨＩＶ－１の病原性とも深く関わっているため、削除により安全性は高まる。またｔａｔはＨＩＶ－１の複製に必須であるので、ｔａｔをパッケージングプラスミドから削除することにより安全性はさらに高くなる。なおパッケージングプラスミドは、パッケージングシグナル（Ψ）を持たないので、このプラスミドから転写されたＲＮＡはウイルス粒子内には取り込まれない。

　Ｒｅｖは転写後のＲＮＡに作用し、スプライシングを受けていないｍＲＮＡを選択的に核外へ運びだすことで構造タンパク質が翻訳される。第三世代ではパッケージングプラスミドとは別のプラスミドとしている。

　エンベローププラスミドは、ＨＩＶ－１のエンベロープではＣＤ４陽性細胞にしか感染することができないので、宿主域を広げるためＶＳＶ－Ｇ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　Ｇ　ｇｙｌｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を用いている。ＶＳＶ－Ｇのレセプターはリン脂質であると考えられており、ＶＳＶ－Ｇをエンベロープとして用いることにより、細胞表面の受容体には依存せずにウイルス粒子と細胞との膜融合が起こる。したがって、基本的に動物種、細胞腫を問わずに感染させることができるようになる。またＶＳＶ－Ｇは物理的に強く、超遠心によってウイルス粒子を容易に濃縮することができる。

　ベクターはパッケージングシグナル（Ψ）を含んだ両端のＬＴＲ（転写発現を制御する繰り返し配列）間に目的とする遺伝子が組み込まれている。さらに逆転写に必須のプライマー結合部位を持ち、このプラスミドから転写されたＲＮＡはウイルス粒子内に取り込まれる。ＨＩＶ－１のＬＴＲプロモーター活性は、ｔａｔ非存在下では非常に弱いので、組み込んだ外来遺伝子の発現には内部プロモーターを使用する。一実施形態において、内部プロモーターはＰＧＫ、ＣＤ１１ｂ又はＭＮＤプロモーターであってもよい。

　ＲＲＥ（ｒｅｖ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）は、Ｒｅｖが結合し完全長のウイルスゲノムＲＮＡが効率よく核から細胞質へ輸送されるのに必要である。レトロウイルスは逆転写の際、３’ＬＴＲの直上流にあるＰＰＴ（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ）配列からプラス鎖の合成が始まるが、レンチウイルスにはゲノム中央部分にｃＰＰＴ（ｃｅｎｔｒａｌ　ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ）と呼ばれる同じ配列がもう一箇所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖ｃＤＮＡには中央にＤＮＡフラップと呼ばれる約１００塩基対の３本鎖構造ができる。ｃＰＰＴ配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、ｃＰＰＴ配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなる。ＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｋ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ：ウッドチャック転写後調節エレメント）は、発現効率を上昇させるために組み込まれている。すなわち、ＷＰＲＥはｍＲＮＡの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのｍＲＮＡの安定性を高める役割があるとされており、この配列をベクターに組み込むことにより、ｔｉｔｅｒ及び導入遺伝子の発現効率が上がる。また３’ＬＴＲのＵ３にあるエンハンサー／プロモーター部分を削除することでプロウイルス状態で３’、５’両方のＬＴＲともプロモーター活性を持たないことになり、５’Ｒ領域からの全ゲノムの転写は起こらないことになる。これによりＨＩＶ－１増殖力等欠損株に該当するレンチウイルスベクターでポジションペーパーの要件「３．プロウイルスにおいてＬＴＲのプロモーター活性を持たず、ＨＩＶ全ゲノムが転写されないもの」を満たす、ＳＩＮ（ｓｅｌｆ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ベクターとされる。また５’ＬＴＲのＵ３をＣＭＶプロモーターに置換することによりｔａｔ依存性がなくなり、パッケージングプラスミドからｔａｔを削除することが可能になる。

　一例として、自己不活性化型レンチウイルスｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ　Ｎｅｏベクター（タカラバイオ社製）を用いることができ、さらに、例えば、実施例に記載のような、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ　Ｎｅｏベクターを元に５’ＬＴＲのＵ３プロモーター領域をＣＭＶプロモーターと置換したハイブリッドＬＴＲとし、パッケージングシグナル下流のウイルス由来配列を削減すると共に、内部プロモーターＰＣＭＶＩＥからネオマイシン耐性遺伝子までを除去し、ＭＮＤプロモーターを挿入して得られたｐＪＬＶ１が好ましく用いられる。ベクターの下流に、融合タンパク質をコードする核酸分子を機能的に挿入することで、本発明のベクターを得ることができる。

　組換えビリオンは、感染力を有するので、外来の遺伝子を細胞、組織、又は生体内に導入するために用いることができる。本発明における外来の遺伝子は、融合タンパク質をコードする核酸分子である。当該核酸分子が導入された宿主細胞等ではこの核酸分子から融合タンパク質が発現するようになる。

　レトロウイルスは、一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡゲノム（ｓｓＲＮＡ）を有する。ウイルスゲノムには、ｇａｇ（カプシドタンパク質を含む構造タンパク質をコード）、ｐｏｌ（逆転写酵素を含む酵素群をコード）、ｅｎｖ（宿主細胞への結合に必要なエンベロープタンパク質をコード）及びパッケージングシグナル（Ψ）の各遺伝子がコードされており、これらが２つの長い末端反復（ＬＴＲ、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ）に挟まれている。レトロウイルスは宿主細胞に感染すると、（＋）鎖ＲＮＡ及び逆転写酵素が細胞内に移行し、２本鎖ＤＮＡへと逆転写される。

　レトロウイルスベクターは主にマウス白血病ウイルスに基づき開発され、病原性を失わせ安全性を高めることを目的として、その感染力を保ちつつ自己複製能を欠損させるためにウイルスゲノムが分割されている。第１世代レトロウイルスベクターは、パッケージングプラスミド（パッケージングシグナルを除いたウイルスゲノム）と導入プラスミド（パッケージングシグナル、ｇａｇの一部、外来遺伝子の両端を５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲで挟んだもの）からなる。したがって、パッケージングプラスミドと導入プラスミドに共通して存在するｇａｇ配列部分で相同組み換えが起こると自己複製可能なレトロウイルス、すなわちＲＣ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ）ウイルスが出現する。第２世代レトロウイルスベクターでは、第１世代のパッケージングプラスミドの３’側のＬＴＲをポリＡ付加シグナルに置換している。これにより、ＲＣウイルスが発生するためにはｇａｇ配列及びポリＡ付加シグナル上流の２箇所で同時に相同組み換えが起こる必要があり、その発生確率は非常に低く、安全性が高められている。第３世代は３つのプラスミドから構成されており、第２世代のパッケージングプラスミドがさらにｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミドとｅｎｖをコードするプラスミドに分割されている。これにより、ＲＣウイルスが発生するためには３箇所で同時に相同組み換えが生じる必要があり、その発生確率は極めて低く、さらに安全性が高められている。

　一般に、組換えレトロウイルスビリオンの生産には、まず、これらパッケージングプラスミドと導入プラスミドが、宿主細胞に一般的なトランスフェクション手法により導入される。そうすると５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ、及びこれら２つのＬＴＲの間に配置された所望のタンパク質をコードする遺伝子を含む領域が宿主細胞で複製され、生じた一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡがレトロウイルスのカプシドタンパク質にパッケージングされて、組換えレトロウイルスビリオンが形成される。この組換えレトロウイルスビリオンは、感染力を有するので、外来の遺伝子を細胞、組織、又は生体内に導入するために用いることができる。本発明における外来の遺伝子は、融合タンパク質をコードする核酸分子である。当該核酸分子が導入された宿主細胞等ではこの核酸分子から融合タンパク質が発現するようになる。

　本発明にかかるベクターの作製方法について記載する。ベクターは、目的のインサートＤＮＡ断片（抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子、及び、中枢神経系で機能させるべきタンパク質をコードする核酸分子）を目的のベクター（ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ）に載せるクローニング操作により行われる。この際には、抗ＴｆＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子と中枢神経系で機能させるべきタンパク質をコードする核酸分子とが機能的に連結した状態で準備してもよく、別々に準備してもよい。別々に準備する際には、制限酵素サイトなど切断し連結する際に、両者が機能的に連結されるよう予め設定しておく。

　まずインサートＤＮＡの準備では、あらかじめ目的ＤＮＡ断片の制限酵素切断箇所を確認し、次に使用するベクターのクローニングサイトに合わせて、切り出しに使用する制限酵素を選定する。制限酵素サイトは特に限定されないが、例えば５’－ＮｏｔＩ　ＧＣＧＧＣＣＧＣ／３’－ＸｈｏＩ　ＣＴＣＧＡＧであってよい。

　次にベクターの準備では、目的のベクター（ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ）のクローニングサイトを制限酵素で切断して、ベクターの線状化を行う。そしてインサートＤＮＡと線状化プラスミドとのライゲーションを行い本発明にかかるベクターを作製する。

　パッケージングプラスミド、Ｅｎｖプラスミド、Ｒｅｖプラスミド、及び導入プラスミド（ベクター）を含むプラスミドシステムは、第３世代レンチウイルスベクターとも呼ばれており、システム全体でＨＩＶ－１ゲノムの１／３以上を削除しており、野生型のＨＩＶ－１が産生する可能性はほとんどない。各プラスミド間の相同領域も最小限にしてあるので、相同組み換えによって自立増殖能を持ったウイルスが産生する可能性もほとんどない。

　次にレンチウイルスベクターの使用態様を記載する。構築したベクターにそれぞれ、第三世代パッケージングプラスミド、Ｒｅｖプラスミド、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドを大量培養した例えば２９３Ｔ細胞にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、３日後に上清の培養液を回収する。この時点で培養液はウイルス粒子が含まれており、これを超遠心で精製し、－８０℃で分注保存する。

　本発明の一実施形態において、核酸分子は、これをリポソーム、脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ＬＮＰ）等に内包させた形態とすることもできる。リポソームとは、脂質二重層を持つ球状の小胞をいい、主にリン脂質、特にホスファチジルコリンから構成される。ただしこれに限らず、脂質二重層を形成する限り、リポソームは卵黄ホスファチジルエタノールアミン等のほかの脂質を加えられたものであってもよい。細胞膜は主にリン脂質二重膜から構成されているため、リポソームは生体適合性に優れるという利点がある。脂質ナノ粒子は、直径１０ｎｍ～１０００ｎｍ、典型的には約２００ｎｍ未満の、脂質を主成分とする粒子をいい、疎水性（親油性）分子を内包させることができ、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪酸、ステロイド等の生体適合性のある脂質を主な構成成分とする。リポソーム又は脂質ナノ粒子に内包させた遺伝子を生体内に投与すると、細胞の細胞膜と直接融合、又はエンドサイトーシス等により細胞に取り込まれ、その後核に移行して遺伝子が細胞に導入されると考えられている。リポソーム又は脂質ナノ粒子による遺伝子導入方法は、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入と比較して、導入する遺伝子の大きさに制限が無い点や、安全性が高い点において優れている。本発明の核酸分子を内包させたリポソーム、脂質ナノ粒子等は、リガンドと生理活性を有するタンパク質の融合タンパク質の遺伝子を細胞、組織、又は生体内に導入するために用いることができる。当該遺伝子が導入された細胞等ではこの遺伝子から融合タンパク質が発現するようになる。本明細書において「リポソーム、脂質ナノ粒子等」というときは、上述のリポソーム及び脂質ナノ粒子に加え、ポリマーナノ粒子、ミセル、エマルジョン、ナノエマルジョン、マイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセル、ナノカプセル、デンドリマー、ナノゲル、金属ナノ粒子、その他薬物送達システム（ＤＤＳ）として用いられることのできるあらゆるナノ・マイクロ粒子を含むものとする。

　本発明において、ベクターの形態、組換ウイルスビリオンに内包された形態、又はリポソーム、脂質ナノ粒子等に内包された形態で細胞、組織、又は生体内に導入された核酸分子の挙動について、以下に（１）～（９）に例示する。ただし、核酸分子の挙動はこれらに限られるものではない。
（１）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入されると、核酸分子に含まれるリガンドと生理活性を有するタンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子が翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（２）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子が逆転写されて一本鎖の（＋）鎖ＤＮＡとなり、次いでこのＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（３）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖ＲＮＡ又は（－）鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子が逆転写された後に二重鎖ＤＮＡとなり、次いでこのＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（４）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖又は（－）鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子が逆転写された後に二重鎖ＤＮＡとなり、次いでこのＤＮＡが宿主細胞のゲノムとランダム組換え又は相同組換えを起こしてゲノム内に組込まれ、組み込まれたＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（５）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖ＤＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子が転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（６）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（－）鎖ＤＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子から二重鎖ＤＮＡが合成され、次いでこの二重鎖ＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（７）一実施形態において、核酸分子は一本鎖の（＋）鎖ＤＮＡ又は（－）鎖ＤＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子から二重鎖ＤＮＡが合成され、次いでこのＤＮＡが宿主細胞のゲノムとランダム組換え又は相同組換えを起こしてゲノム内に組込まれ、組み込まれたＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（８）一実施形態において、核酸分子は二重鎖ＤＮＡであり、細胞内に導入されると、該核酸分子が転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。
（９）一実施形態において、核酸分子は二重鎖ＤＮＡであり、このＤＮＡが宿主細胞のゲノムとランダム組換え又は相同組換えを起こしてゲノム内に組込まれ、組み込まれたＤＮＡが転写・翻訳されて該融合タンパク質が発現する。

　ベクターの形態、組換ウイルスビリオンに内包された形態、又はリポソーム、脂質ナノ粒子等に内包された形態の核酸分子は、細胞、組織、又は生体内に導入することができる。

　核酸分子の導入先が生体内である場合、核酸分子は、ベクターの形態、組換ウイルスビリオンに内包された形態、又はリポソーム、脂質ナノ粒子等に内包された形態で、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の非経口的手段により投与される。

　プラスミドの形態、組換ウイルスビリオンに内包された形態、又はリポソーム、脂質ナノ粒子等に内包された形態の核酸分子は、種々の医薬として用いることができる。

＜組換え細胞＞
　本発明の組換え細胞は、本発明のベクターを宿主細胞に導入して得られた、組換え細胞である。宿主細胞の種類に特に限定はないが、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄由来幹細胞、胚性幹細胞、内皮幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、及びｉＰＳ細胞である等の幹細胞、或いはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞が挙げられる。

　核酸分子が導入された組換え細胞は、本発明の融合タンパク質を発現するようになるので、これを治療目的で患者に移植することができる。

〔薬剤〕
　本発明の薬剤は、本発明の組換え細胞を含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための薬剤である。中枢神経系疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病等の神経変性疾患；統合失調症、うつ症等の精神障害；多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、脳腫瘍を含む中枢神経系の腫瘍、脳障害を伴うリソソーム病、糖原病、筋ジストロフィー、脳虚血、脳炎症性疾患、プリオン病、外傷性の中枢神経系障害等が挙げられる。また、ＩＤＳ欠損に起因する疾患、ゴーシェ病、ＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＡＢ異型、サンドホフ病及びティサックス病、サンドホフ病、Ｉ－細胞病、α－マンノシドーシス、β－マンノシドーシス、クラッベ病、ゴーシェ病様蓄積症、異染性白質変性症（異染性白質ジストロフィー）、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シンドラー病、川崎病、ニーマン・ピック病、ファブリー病、スライ症候群、サンフィリッポ症候群、ハーラー症候群、ファーバー病、コリ病（フォーブス・コリ病）、シアリダーゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ病、神経セロイドリポフスチン症、Ｊａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病、ヒアルロニダーゼ欠損症、ポンペ病、バッテン病などの中枢神経障害があげられる。そのうち、ＩＤＳ欠損に起因する疾患、ＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型、又はポンペ病であることが好ましい。ＩＤＳ欠損に起因する疾患としては、ムコ多糖症ＩＩ型、Ｈｕｎｔｅｒ症候群が挙げられ、特にムコ多糖症ＩＩ型であることが好ましい。

　一実施形態の薬剤は、有効量の上記組換え細胞を含み、有効量は投与経路、投与間隔、体重・年齢によって異なり得るが、例えば１０^４個～１０^１０個の細胞、好ましくは、１０^６個～１０^９個の細胞、さらに好ましくは１０^７個～１０^８個の細胞であることが好ましい。

　一実施形態の薬剤は、組換え細胞の他、細胞を保存でき、医薬として許容される担体を含んでもよい。このような担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、薬剤には、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

〔方法〕
　本発明の方法は、本発明の組換え細胞を必要とする対象に移植することを含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための方法である。該対象としては、中枢神経系疾患を有する患者であってよく、特にＩＤＳ欠損に起因する疾患、ＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型、又はポンペ病の患者であってよい。

　移植方法としては、有効量の上記組換え細胞を含む細胞液を対象の静脈から投与する方法が挙げられる。

　組換え細胞が造血幹細胞である場合、移植してから、１４～２８日間後骨髄に生着し、生着した組換え細胞が自己増殖しつつ、様々な血液細胞の他にミクログリア様細胞へ分化し、中枢神経系に生着することができる。このように、組換え細胞が中枢神経組織を含めた様々な組織において継続的に中枢神経系で機能させるべきタンパク質を発現することができる。

〔使用〕
　本発明の使用は、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための、本発明の組換え細胞の使用である。本発明の使用はまた、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための薬剤の製造における、本発明の組換え細胞の使用である。本発明はまた、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療における使用のための本発明の組換え細胞を提供する。

［実施例１：抗マウスＴｆＲ抗体－ヒトＩＤＳを用いた造血幹細胞遺伝子治療］
＜マウス＞
　マウスＩＤＳ遺伝子の欠損をヘテロ接合に有する雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（GarciaAR, et al. J Inherit Metab Dis.2007;30(6):924-34.）と雄の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスを交配し、作出した雄の中から欠損ＩＤＳをヘミ接合に有するマウスをＰＣＲ解析により選抜した。ＩＤＳ欠損をヘミ接合に持つ雄マウスをＭＰＳ　ＩＩマウス、野生型のＩＤＳを持つ雄マウスを正常コントロールとした。

＜レンチウイルスベクターの構築＞
　自己不活性化型レンチウイルスベクターであるｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）のＭＮＤプロモーター（ＤＮＡ：配列番号１）直下にヒトＩＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＧ＿０１１９００）を搭載したｐＪＬＶ１－ＩＤＳ（特許文献１：ＣＭＶ　ｈｙｂｒｉｄ　５’ＬＴＲ－Ψ－ＲＲＥ－ｃＰＰＴ－ＭＮＤ－ＩＤＳ　ｃＤＮＡ－ＷＰＲＥｍｕｔ９－３’ＬＴＲ（配列番号２））と、同じくＭＮＤプロモーターの直下に抗マウスＴｆＲ抗体（ｍＴｆＲ）－ＩＤＳを搭載したｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳを構築した。

（１）ｐＪＬＶ１－ＩＤＳの構築
　レンチウイルスベクターｐＪＬＶ１－ＩＤＳは、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ　Ｎｅｏベクター（タカラバイオ）を元に、構築を行った。具体的には、５’ＬＴＲのＵ３プロモーター領域をＣＭＶプロモーターと置換したハイブリッドＬＴＲとし、パッケージングシグナル下流のウイルス由来配列を削減すると共に、内部プロモーターＰＣＭＶＩＥからネオマイシン耐性遺伝子までを除去し、ＭＮＤプロモーターを挿入した。ＭＮＤプロモーターの下流にヒトＩＤＳ（配列番号４）をコードし、コドン最適化を行ったＤＮＡ断片（配列番号３）を配置し、該ＤＮＡ断片の上流と下流に制限酵素サイトとしてＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩサイトを挿入した。さらにＸｈｏＩサイトの下流には改変型のＷＰＲＥ配列（４１７番目にアデニンを１塩基追加）及びＵ３領域を欠失している３’ＬＴＲにｃＨＳ４　ｃｏｒｅ　ｉｎｓｕｌａｔｏｒ配列を挿入した３’　ＳＩＮ　ＬＴＲを配置し、配列番号２の塩基配列を有するｐＪＬＶ１－ＩＤＳを得た。

（２）ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳの構築
　抗マウスＴｆＲ抗体（抗マウスＴｆＲ＿ｓｃＦＶ、配列番号６；コドン最適化を行ったＤＮＡ：配列番号５）の３’末端にリンカーを介してヒトＩＤＳ（配列番号４）が機能的に融合した融合タンパク質（ｍＴｆＲ－ＩＤＳ、配列番号８）をコードし、コドン最適化を行ったＤＮＡ断片（配列番号７）をベクターｐＪＬＶ１に載せるクローニング操作により、ベクターｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳ（配列番号１３）を作製した。

　具体的には、ｍＴｆＲ－ＩＤＳをコードするＤＮＡは、５’側にＥｃｏＲＩサイト、３’側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した状態で人工合成し、制限酵素処理した。次に、ｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＥｃｏＲＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ）を用いて、ｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ－ｍＴｆＲ－ＩＤＳを作成した。その後、ｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ－ｍＴｆＲ－ＩＤＳ並びにｐＪＬＶ１－ＩＤＳを制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｍＴｆＲ－ＩＤＳ及びｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄの切り出しを行い、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、それらのライゲーションを行うことで、ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳ（配列番号１３）を作製した。

（４）ウイルスのパッケージング
　レンチウイルスのパッケージングでは、上記（１）又は（２）で作製した自己不活性化型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ｐＪＬＶ１－ＩＤＳ又はｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳ）に加えて、パッケージングプラスミドであるｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ＶＳＶ－Ｇ／ＲｅｖプラスミドであるｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを使用し、標準的なプロトコールを一部改変して行った（例えば、特許文献１に記載のプロトコール）。

　具体的には、Ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ処理した２４５ｍｍ×２４５ｍｍのディッシュ上で７０～８０％コンフレントに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、
パッケージングプラスミド（ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ）　　３０μｇ
ＶＳＶ－Ｇ，Ｒｅｖプラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖ）　　３０μｇ
ＳＩＮレンチウイルスベクター　　６０μｇ
の各プラスミドＤＮＡを２．５ＭＣａＣｌ_２を用いてトランスフェクションし、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１６～２０時間培養した。

　培養上清を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄後ＤＭＥＭ培地６０ｍｌと置換した後に、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで約４８時間培養を行った。その後、培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターを通した後にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　Ｐｌｕｓ－７０（１００Ｋ）を用いて濃縮を行った。

　濃縮したウイルス液をＰＢＳで遠心チューブ上限までメスアップし、７０，０００×ｇ、４℃で１．５時間超遠心を行った。遠心上清を除去し、ペレットを１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた後に、５０ｍｌの遠心管に移して３時間Ｖｏｒｔｅｘした。

　Ｖｏｒｔｅｘ懸濁液を５０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清をピペットでスクリューキャップのついたチューブに分注し－８０℃で保存した。

　作成したレンチウイルス力価は、ｐ２４タンパク質に対するＥＬＩＳＡであるＱｕｉｃｋ　Ｔｉｔｅｒ　ＨＩＶ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて測定した。力価はそれぞれ、ｐＪＬＶ１－ＩＤＳ：１．６×１０^９ＩＵ／ｍｌ、ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳ：１．９×１０^９ＩＵ／ｍｌであった。

＜遺伝子導入造血幹細胞の作製及び移植＞
　２ヶ月齢のＭＰＳ　ＩＩマウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、Ｌｉｎｅａｇｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス造血幹細胞を分離した。分離したマウス造血幹細胞に上記得られたレンチウイルスを遺伝子導入（感染）した。マウス造血幹細胞へのレンチウイルス感染は既報の文献の方法にしたがって行い、多重感染度（ＭＯＩ＝５０）で行った（非特許文献２）。具体的には、マウス造血幹細胞２×１０^６個（レシピエント１匹当たりの移植用細胞数）につき、１×１０^８ＩＵのレンチウイルスで行った。

　また、遺伝子導入された造血幹細胞の移植に関しても既報の文献（非特許文献２）に従って行った。Ｘ線照射装置ＭＢＲ－１５２０－Ｒ（日立パワーソリューションズ）を用いて９Ｇｙの致死量放射線照射を行った２ヶ月齢のＭＰＳ　ＩＩマウスに尾静脈から、上記遺伝子導入された造血幹細胞を投与した。投与後１ヶ月ごとに血漿を採取し、６ヶ月経過した時点で肝臓、脾臓、腎臓、心臓、大脳、小脳を採取した。コントロールマウスとして、移植していない野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）を使用した。

＜ＩＤＳ活性測定及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）測定＞
　既報の文献（非特許文献２）に従って、上記組織の抽出を行い、ＩＤＳ活性及びＧＡＧ測定を行った。タンパク定量についてはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＩＤＳ活性測定については蛍光基質である４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ　α－Ｌ－ｉｄｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　２－ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて、ＧＡＧ測定についてはトリプル四重極型高速液体クロマトグラフ質量分析器ＬＣＭＳ－８０４０（島津製作所）を用いて測定した。

　移植１ヶ月後から６ヶ月後までの血漿中のＩＤＳ活性を図１に示す。図１中のＩＤＳ活性は、野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１とする際の相対活性である。図１から、ｐＪＬＶ１－ＩＤＳを含むレンチウイルスを導入したＭＰＳ　ＩＩマウス（図１中のＩＤＳ）において、移植後６ヶ月間にわたりＷＴの約２５倍以上高い活性を維持したことが分かった。また、ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＩＤＳを含むレンチウイルスを導入したＭＰＳ　ＩＩマウス（図１中のｍＴｆＲ－ＩＤＳ）におけるＩＤＳ活性はＷＴと同等以上の活性が認められ、６ヶ月時点でもＷＴと同程度であったことが分かった。一方、ＭＰＳ　ＩＩマウスにおいては、ＩＤＳ活性がほとんど認められなかった。また、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスは、ＩＤＳマウスの血漿中のＩＤＳ活性の約３０分の１程度であり、このことはｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスにおける細胞単位でのＩＤＳの分泌量は、ＩＤＳマウスよりも少ないことを示唆した。

　移植６ヶ月後の肝臓及び脾臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を図２に示す。ＩＤＳ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１００とする際の相対活性（％）であり、ＧＡＧ蓄積はＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）におけるＧＡＧ蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図２から、ＩＤＳマウス及びｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスの肝臓及び脾臓におけるＩＤＳ活性は共に野生型を上回っており、ＧＡＧの蓄積もＭＰＳ　ＩＩに比べて共に著しく減少した。

　移植６ヶ月後の腎臓及び心臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を図３に示す。図３から、心臓のＩＤＳ活性に関しては、ＩＤＳマウス及びｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスは共に野生型（ＷＴ）と同等以上を示したが、腎臓のＩＤＳ活性に関しては、ＩＤＳマウスでのみ野生型を上回った。しかしながら、心臓及び腎臓のＧＡＧの蓄積はＩＤＳマウス及びｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスのいずれにおいても著しく減少した。

　移植６ヶ月後の大脳及び小脳におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を図４に示す。図４から、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスに関しては、ＩＤＳ活性が低かったものの、ＧＡＧ蓄積の減少は優れていた。また、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスの大脳におけるＩＤＳ活性は、ＩＤＳマウスのそれの約６分の１であり、血漿中の活性比の約５倍高かった。このことは、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスでは大脳内でのＩＤＳ分泌のみならず、血液中のＩＤＳが大脳へと移行していることを示唆した。さらに、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスの大脳でのＧＡＧ蓄積の低減率は、ＩＤＳマウスのそれより高かった。これらのことから、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスの中枢神経組織へのＩＤＳの供給は、移植造血幹細胞に由来する細胞の中枢神経への移行及び局所での分泌に加えて、血液から移行したＩＤＳが組織に広く分布した可能性が示唆された。

　以上の結果から、抗マウスＴｆＲ抗体を融合したことによりＩＤＳの組織分布が改善し、従来のＩＤＳよりも優れた効果をもたらしたと考えられる。これまでＭＰＳ　ＩＩの中枢神経病変の治療には野生型（ＷＴ）を大幅に上回る高い血中ＩＤＳ活性が必要であるとされてきたが、ｍＴｆＲ－ＩＤＳマウスでは野生型（ＷＴ）と同程度の血中ＩＤＳ活性でＩＤＳマウスよりも優れた治療効果（大脳及び小脳におけるＧＡＧ蓄積の低減）が実現できることが明らかとなった（図１及び図４参照）。

［実施例２：抗ヒトＴｆＲ抗体－ヒトＩＤＳを用いた造血幹細胞遺伝子治療］
＜マウス＞
　マウスＩＤＳ遺伝子の欠損をヘテロ接合に有する雌のＣ５７ＢＬ／６マウス(Higuchi T et al., Mol. Genet. Metab. 2012;107:122-128)とヒトトランスフェリン受容体をヘテロ接合に有する雄のノックインマウス（Sonoda H, et al, Mol Ther. 2018 May 2;26(5):1366-1374）を交配し、作出した雄の中から欠損ＩＤＳをヘミ接合、ｈＴｆＲをヘテロ接合に有するマウス（ヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス）をＰＣＲ解析により選抜した。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを正常コントロールとした。

＜レンチウイルスベクターの構築＞
　ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）のＭＮＤプロモーター（ＤＮＡ：配列番号１）直下にＦａｂ型の抗ヒトＴｆＲ抗体－ＩＤＳ（ｈＴｆＲ－ＩＤＳ）を搭載したｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳを構築した。

（１）ｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳの構築
　Ｆａｂ型の抗ヒトＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に、リンカーを介してヒトＩＤＳのＮ末端が機能的に融合し、さらにヒトＩＤＳのＣ末端側に、自己切断ペプチドｐ２Ａを介して該Ｆａｂ型の抗ヒトＴｆＲ抗体の軽鎖のＮ末端が機能的に融合した融合タンパク質（ｈＴｆＲ－ＩＤＳ、配列番号１４）をコードするＤＮＡ断片（配列番号１５）を、ベクターｐＪＬＶ１に載せるクローニング操作によりベクターｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳ（配列番号１６）を作製した。

　具体的には、ＭＮＤ－ｈＴｆＲ－ＩＤＳをコードするＤＮＡは５’側にＭｌｕＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加した状態で人工合成し、制限酵素処理した。次に、ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄについてもＭｌｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、ｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳ（配列番号１６）を作製した。

　また、実施例１における「（１）ｐＪＬＶ１－ＩＤＳの構築」で作製したレンチウイルスベクターｐＪＬＶ１－ＩＤＳも、実施例２において用いた。

（２）ウイルスのパッケージング
　実施例１と同様にして、レンチウイルスのパッケージングでは、上記で作製した自己不活性化型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ｐＪＬＶ１－ＩＤＳ又はｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳ）に加えて、パッケージングプラスミドであるｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ＶＳＶ－Ｇ／ＲｅｖプラスミドであるｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを使用し、標準的なプロトコールを一部改変して行った（例えば、特許文献１に記載のプロトコール）。

　作成したレンチウイルス力価は、ｐ２４タンパク質に対するＥＬＩＳＡであるＱｕｉｃｋ　Ｔｉｔｅｒ　ＨＩＶ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて測定した。力価はそれぞれ、ｐＪＬＶ１－ＩＤＳ：１．６×１０^９ＩＵ／ｍｌ、ｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳ：１．７×１０^９ＩＵ／ｍｌであった。

＜遺伝子導入造血幹細胞の作製及び移植＞
　５ヶ月齢のヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、Ｌｉｎｅａｇｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，　Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス造血幹細胞を分離した。分離したマウス造血幹細胞にＩＤＳ又はｈＴｆＲ－ＩＤＳを搭載した上記得られたレンチウイルスを遺伝子導入（感染）した。マウス造血幹細胞へのレンチウイルス感染は既報の文献の方法にしたがって行い（非特許文献２）、多重感染度（ＭＯＩ）５０で行った。具体的には、マウス造血幹細胞２×１０^６個（レシピエント１匹あたりの移植用細胞数）につき、１×１０^８ＩＵのレンチウイルスで行った。

　また、遺伝子導入された造血幹細胞の移植に関しても既報の文献（非特許文献２）にしたがって行った。Ｘ線照射装置ＭＢＲ－１５２０－Ｒ（日立パワーソリューションズ）を用いて９Ｇｙの致死量放射線照射を行った５ヶ月齢のｈＴｆＲ－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウスに尾静脈から、上記遺伝子導入された造血幹細胞を投与した。投与後４週間経過した時点で血漿、肝臓、脾臓、大脳、及び小脳を採取した。コントロールマウスとして、移植していない野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）を使用した。

＜ＩＤＳ活性測定及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）測定＞
　ＩＤＳ活性及びＧＡＧ測定は、実施例１と同様にして行った。

　移植４週間後の血漿におけるＩＤＳ活性を図５に示す。図５中のＩＤＳ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１００とする際の相対活性（％）である。図５から、ＩＤＳマウス及びｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスの血漿におけるＩＤＳ活性は共に野生型マウスを上回っており、ＩＤＳマウスでは野生型マウスの９．３６倍、ｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスでは野生型マウスの１．８５倍であった。

　移植４週間後の肝臓及び脾臓におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を図６に示す。ＩＤＳ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１００とする際の相対活性（％）であり、ＧＡＧ蓄積はヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）におけるＧＡＧ蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図６から、ｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスの肝臓におけるＩＤＳ活性は野生型マウスの３２．６％、脾臓におけるＩＤＳ活性は野生型マウスの１４７％であり、いずれの臓器でもＧＡＧ蓄積の大幅な減少が認められた。

　移植４週間後の大脳及び小脳におけるＩＤＳ活性及びＧＡＧ蓄積の測定結果を図７に示す。ＩＤＳ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１００とする際の相対活性（％）であり、ＧＡＧ蓄積はヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）におけるＧＡＧ蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図７から、ｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスに関しては、実施例１のｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスと同様に、ＩＤＳ活性は低かったものの、ＧＡＧ蓄積の減少は優れていた。

［実施例３：抗ヒトＴｆＲ抗体－ヒトＩＤＳを用いたＴ細胞遺伝子治療］
＜マウス＞
　実施例２で得たマウスと同様のマウスを用いた。

＜レンチウイルスベクターの構築＞
　レンチウイルスのパッケージングでは、上記実施例２で作製した自己不活性化型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ｐＪＬＶ１－ＩＤＳ又はｐＪＬＶ１－ｈＴｆＲ－ＩＤＳ）に加えて、パッケージングプラスミドであるｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ＶＳＶ－Ｇ／ＲｅｖプラスミドであるｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを使用し、標準的なプロトコールを一部改変して行った（例えば、特許文献１に記載のプロトコール）。

＜遺伝子導入Ｔ細胞の作製及び移植＞
　５ヶ月齢のヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウスの脾臓からＰａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＩＩ　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてマウスＴ細胞を分離した。分離したマウスＴ細胞にＩＤＳ又はｈＴｆＲ－ＩＤＳを搭載した上記得られたレンチウイルスを遺伝子導入（感染）した。マウスＴ細胞へのレンチウイルス感染は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）のプロトコールにしたがって２４時間の刺激を加えた後にレンチウイルスの感染を行い、多重感染度（ＭＯＩ）５０で行った。具体的には、マウスＴ細胞１×１０^６個（レシピエント１匹あたりの移植用細胞数）につき、５×１０^７ＩＵのレンチウイルスで行った。

　また、遺伝子導入されたＴ細胞の移植に関して、５ヶ月齢のヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウスに尾静脈から、上記遺伝子導入されたマウスＴ細胞を投与した。投与後４週間経過した時点で血漿、大脳、及び小脳を採取した。コントロールマウスとして、移植していない野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）を使用した。

　移植４週間後の血漿、大脳、及び小脳におけるＩＤＳ活性、並びに大脳及び小脳におけるＧＡＧ蓄積の測定結果を図８～９に示す。ＩＤＳ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＩＤＳ活性を１００とする際の相対活性（％）であり、ＧＡＧ蓄積はヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウス（ＭＰＳ　ＩＩ）におけるＧＡＧ蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図８から、ＩＤＳマウス及びｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスの血漿におけるＩＤＳ活性は共にヒトトランスフェリン受容体－ＫＩ／ＭＰＳ　ＩＩマウスを上回っていた。図９から、マウスＴ細胞を用いた場合でも、ｈＴｆＲ－ＩＤＳマウスでは、大脳及び小脳においてＧＡＧ蓄積の減少が認められた。

［実施例４：抗マウスＴｆＲ抗体－ヒトＧＡＡを用いた造血幹細胞遺伝子治療］
＜マウス＞
　酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子をホモ接合に欠損するマウスを、交配することにより作成した（ＧＡＡ－ＫＯマウス）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを正常コントロールとした。

＜レンチウイルスベクターの構築＞
　自己不活性化型レンチウイルスベクターであるｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）のＭＮＤプロモーター（ＤＮＡ：配列番号１）直下にヒトＧＡＡ（野生型ヒトＧＡＡ、配列番号１７）を搭載したｐＪＬＶ１－ＧＡＡと、同じくＭＮＤプロモーターの直下に抗マウスＴｆＲ抗体－ＧＡＡ（ｍＴｆＲ－ＧＡＡ）を搭載したｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＡＡを構築した。

（１）ｐＪＬＶ１－ＧＡＡの構築
　ヒトＧＡＡ（配列番号１７）をコードするＤＮＡ（配列番号１８）を、５’側にＮｏｔＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加した状態で人工合成し、制限酵素処理した。次に、ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）についてもＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断を行い、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてｐＪＬＶ１－ＧＡＡ（配列番号１９）を作製した。

（２）ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＡＡの構築
　抗マウスＴｆＲ抗体（抗マウスＴｆＲ＿ｓｃＦＶ、配列番号６；コドン最適化を行ったＤＮＡ：配列番号５）の３’末端にリンカーを介してヒトＧＡＡ（配列番号１７）が機能的に融合した融合タンパク質（ｍＴｆＲ－ＧＡＡ、配列番号２０）をコードするＤＮＡ（配列番号２１）を、５’側にＮｏｔＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加した状態で人工合成し、制限酵素処理した。次に、ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）についてもＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断を行い、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＡＡ（配列番号２２）を作製した。

（３）ウイルスのパッケージング
　実施例１と同様にして、レンチウイルスのパッケージングでは、上記（１）又は（２）で作製した自己不活性化型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ｐＪＬＶ１－ＧＡＡ又はｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＡＡ）に加えて、パッケージングプラスミドであるｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ＶＳＶ－Ｇ／ＲｅｖプラスミドであるｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを使用し、標準的なプロトコールを一部改変して行った（例えば、特許文献１に記載のプロトコール）。

　作成したレンチウイルス力価は、ｐ２４タンパク質に対するＥＬＩＳＡであるＱｕｉｃｋ　Ｔｉｔｅｒ　ＨＩＶ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて測定した。力価はそれぞれ、ｐＪＬＶ１－ＧＡＡ：１．７×１０^９ＩＵ／ｍｌ、ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＡＡ：１．２×１０^９ＩＵ／ｍｌであった。

＜レンチウイルスベクターに搭載したｍＴｆＲ－ＧＡＡのＧＡＡ活性の評価＞
　１×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してＭＯＩ　１０、１、０．１でＧＡＡ又はｍＴｆＲ－ＧＡＡを搭載したレンチウイルスを感染させ、２４時間培養した。その後、レンチウイルスを含まない培地に交換し、さらに４８時間培養した後に培地及び細胞を回収した。蒸留水で抽出した細胞抽出液及び培地についてＧＡＡ活性を測定した。ＧＡＡ活性の測定は以下のとおりに実施した。

＜ＧＡＡ活性測定＞
　タンパク定量についてはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＧＡＡ活性測定については既報の文献（非特許文献８）にしたがって蛍光基質である４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　α－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて測定した。

　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液及び培地についてＧＡＡ活性の測定結果を図１０に示す。図１０から、ｍＴｆＲ－ＧＡＡ搭載レンチウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、細胞内活性はＧＡＡ搭載レンチウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞より低い一方で、細胞外活性（分泌酵素活性）はＧＡＡ搭載レンチウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞よりも大幅に高かった。この結果から、意外なことに、ＧＡＡを抗マウスＴｆＲ抗体と融合させることによりＧＡＡの細胞外への分泌が促進された。すなわち、抗ＴｆＲ抗体を中枢神経系で機能させるべきタンパク質に融合させることにより、タンパク質そのものの血液脳関門通過性が向上するだけでなく、細胞外へのタンパク質分泌量も増加させるという効果をもたらすことが分かった。このような効果により、ｅｘ　ｖｉｖｏ遺伝子治療の効果を飛躍的に高めることが期待できる。

＜遺伝子導入造血幹細胞の作製及び移植＞
　３ヶ月齢のＧＡＡ－ＫＯマウスにおいて、実施例１と同じ手順で遺伝子導入造血幹細胞を作成し、３ヶ月齢のＧＡＡ－ＫＯマウスに移植した。また、遺伝子導入された造血幹細胞の移植に関しても、投与後４週間経過した時点で血清、肝臓、脾臓、心臓、大腿四頭筋、横隔膜、腓腹筋、大脳、及び小脳を採取したこと、コントロールマウスとして、移植していない野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス、及びＧＡＡ－ＫＯマウス、組換えＧＡＡタンパク質（Ａｖａｌｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ａｌｐｈａ　（Ｓａｎｏｆｉ社））を尾静脈から２週間に１度２０ｍｇ／ｋｇで投与したＧＡＡ－ＫＯマウス（ＥＲＴ）を使用したこと以外は実施例１と同様にして行った。

＜ＧＡＡ活性測定及びグリコーゲン測定＞
　タンパク定量についてはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＧＡＡ活性測定については上述のとおりに測定した。グリコーゲン測定については、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　（ａｂｃａｍ社）を用いて、下記の方法で実施した。Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社）では、初めにグリコーゲンをグルコースに加水分解し、次いで酸化させた中間体をＯｘｉＲｅｄ　Ｐｒｏｂｅで標識し、Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ社）により蛍光を測定することでグリコーゲンを定量する。まず、９６Ｆ　Ｎｏｎｔｒｅａｔｅｄ　Ｂｌａｃｋ　ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に既知濃度のグリコーゲンを含む検量線用標準試料及び組織ホモジネート上清をそれぞれ５０μＬずつ加える。次いで、加水分解反応試薬であるＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘを各ウェル１μＬずつ添加混合し、室温にて３０分反応させる（ただし、内在性グルコース測定用のウェルには添加しない）。次いで、ＯｘｉＲｅｄ　Ｐｒｏｂｅを含むＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘを各ウェルに５０μＬずつ添加混合し遮光下、室温にて３０分間反応させ、Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて励起波長５３５ｎｍ、検出波長５８７ｎｍで測定した。

　移植４週間後の血清、肝臓、及び脾臓におけるＧＡＡ活性の測定結果を図１１に示す。ＧＡＡ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＧＡＡ活性を１００とする際の相対活性（％）である。図１１から、治療群（ＥＲＴマウス、ＧＡＡマウス、ｍＴｆＲ－ＧＡＡマウス）間で血清中、肝臓、脾臓におけるＧＡＡ活性を比較すると、いずれにおいてもｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスが最も高かった。

　移植４週間後の心臓、大腿四頭筋、横隔膜、及び腓腹筋におけるＧＡＡ活性の測定結果を図１２に示す。ＧＡＡ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＧＡＡ活性を１００とする際の相対活性（％）である。図１２から、心臓、大腿四頭筋、横隔膜、腓腹筋等の筋肉においても、治療群間でＧＡＡ活性を比較すると、いずれの筋肉においてもｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスが最も高かった。また、心臓、大腿四頭筋、腓腹筋においては、野生型マウスと同等以上のＧＡＡ活性が認められた。ＧＡＡマウスもｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスに次いで高いＧＡＡ活性を示し、大腿四頭筋及び腓腹筋においては野生型マウスと同等以上のＧＡＡ活性が認められた。

　移植４週間後の心臓、大腿四頭筋、横隔膜、及び腓腹筋におけるグリコーゲン蓄積の測定結果を図１３に示す。グリコーゲン蓄積はＧＡＡ－ＫＯマウス（ＮＴ）におけるグリコーゲン蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図１３から、各種筋組織においてｍＴｆＲ－ＧＡＡ群では劇的なグリコーゲン蓄積の改善が得られ、横隔膜では正常化が認められた。一方、ＧＡＡマウスでは大腿四頭筋等でｍＴｆＲ－ＧＡＡに匹敵するＧＡＡ活性が認められたにも関わらず、グリコーゲン蓄積の減少は治療群で最も少なかった。このことから、抗ＴｆＲ抗体の融合により、ＧＡＡの分布及び局在が改善されていることが示唆された。

　ポンペ病においては、筋組織にａｕｔｏｐｈａｇｉｃ　ｂｕｉｌｄｕｐと呼ばれる異常が生じて治療酵素（例えばＧＡＡ）の局在異常を引き起こすことで抵抗性を示すことが知られている。ＧＡＡマウスにおいて、ＧＡＡの酵素活性が比較的高いにもかかわらず、グリコーゲンの減少効果が低い理由として、上述したＧＡＡの局在異常の影響が考えられる。ｍＴｆＲ－ＧＡＡも細胞内に取り込まれた後に、ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ　ｂｕｉｌｄｕｐに集積すると予想されるが、意外なことに、ｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスではグリコーゲン蓄積が劇的に減少していた。これは、驚くべき結果である。

　移植４週間後の大脳、及び小脳におけるＧＡＡ活性及びグリコーゲン蓄積の測定結果を図１４に示す。ＧＡＡ活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＧＡＡ活性を１００とする際の相対活性（％）であり、グリコーゲン蓄積はＧＡＡ－ＫＯマウス（ＮＴ）におけるグリコーゲン蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図１４から、ｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスでのみＧＡＡ活性の上昇が認められ、グリコーゲン蓄積も大幅に減少した。

＜治療後のマウスにおける血清中の抗ＧＡＡ抗体価の評価＞
　遺伝子導入造血幹細胞を用いた遺伝子治療後のＧＡＡ－ＫＯマウスにおける、血清中の抗ＧＡＡ抗体価の測定を、既報の文献（非特許文献１０）のＥＬＩＳＡを一部改変して行った。ＥＬＩＳＡは、以下の手順で行った。マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に２５０ｎｇの組換えＧＡＡタンパク質（Ａｖａｌｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ａｌｐｈａ　（Ｓａｎｏｆｉ社））を４℃で一晩結合させ、次いで１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２時間ブロッキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を用いて各ウェルを洗浄後、上記各マウスの血清又は検量線作成用に抗ヒトＧＡＡ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を加え、１時間常温で反応させた。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルの洗浄後、上記各マウス血清を加えたウェルについてはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｍ）、ニチレイバイオサイエンス社）、検量線作成用ウェルにはペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｒ）、ニチレイバイオサイエンス社）を加え１時間常温で反応させた。その後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、テトラメチルベンチジン（ＳｅｒａＣａｒｅ社）を加えて１０分発色させた後に、１．２Ｎ　硫酸を加えて反応を停止した。測定については、Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて４５０ｎｍ、６５０ｎｍで吸光度を測定し、その差を真の吸光度とした。結果を表１に示す。

　ＥＲＴにより治療したＥＲＴマウスでは、治療後の血清中の抗ＧＡＡ抗体の抗体価が最も高かった。また、ＧＡＡ導入造血幹細胞を用いて遺伝子治療したＧＡＡマウスは、ＥＲＴマウスと比較すると治療後の血清中の抗ＧＡＡ抗体の抗体価は低かった。このような結果は、現行の標準治療であるＥＲＴでは治療中に抗ＧＡＡ抗体が産生されることが多く、治療効果を減弱するほか、アレルギー反応により治療継続が困難となる例が存在すること、また、他の疾患で造血幹細胞遺伝子治療では抗体産生されにくいことが指摘されていることと一致していた。一方、予想外なことに、ｍＴｆＲ－ＧＡＡ導入造血幹細胞を用いて遺伝子治療したｍＴｆＲ－ＧＡＡマウスでは、最も抗ＧＡＡ抗体の抗体価が低く、未治療マウス及び野生型マウスと同レベルであった。

［実施例５：抗マウスＴｆＲ抗体－ヒトＧＬＢ１を用いた造血幹細胞遺伝子治療］
＜マウス＞
　βガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）遺伝子をヘテロ接合に欠損するマウス（非特許文献９）を、交配することにより作成した（ＧＬＢ１－ＫＯマウス）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを正常コントロールとした。

＜レンチウイルスベクターの構築＞
　自己不活性化型レンチウイルスベクターであるｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）のＭＮＤプロモーター（ＤＮＡ：配列番号１）直下にヒトＧＬＢ１（野生型ヒトＧＬＢ１、配列番号２３）を搭載したｐＪＬＶ１－ＧＬＢ１と、同じくＭＮＤプロモーターの直下に抗マウスＴｆＲ抗体－ＧＬＢ１（ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１）を搭載したｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１を構築した。

（１）ｐＪＬＶ１－ＧＬＢ１の構築
　ヒトＧＬＢ１（配列番号２３）をコードするＤＮＡ（配列番号２４）はＭＮＤプロモーターの下流に配置し人工合成により作成した。具体的には、５’側にＭｌｕＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加したＭＮＤ－ＧＬＢ１を人工合成し、各制限酵素で処理した。次に、ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）についてもＭｌｕＩＩ及びＸｈｏＩで切断を行い、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてｐＪＬＶ１－ＧＬＢ１（配列番号２５）を作製した。

（２）ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１の構築
　抗マウスＴｆＲ抗体（抗マウスＴｆＲ＿ｓｃＦＶ、配列番号６；コドン最適化を行ったＤＮＡ：配列番号５）の３’末端にリンカーを介してヒトＧＬＢ１（配列番号２３）が機能的に融合した融合タンパク質（ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１、配列番号２６）をコードするＤＮＡ（配列番号２７）を、ＭＮＤプロモーターの下流に配置し人工合成により作製した。具体的には、５’側にＭｌｕＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加したＭＮＤ－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１を人工合成し、各制限酵素で処理した。次に、ｐＪＬＶ１　ｐｌａｓｍｉｄ（配列番号１２）についてもＭｌｕＩ及びＸｈｏＩで切断を行い、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１（配列番号２８）を作製した。

（３）ウイルスパッケージング
　実施例１と同様にして、レンチウイルスのパッケージングでは、上記（１）又は（２）で作製した自己不活性化型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ｐＪＬＶ１－ＧＬＢ１又はｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１）に加えて、パッケージングプラスミドであるｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ＶＳＶ－Ｇ／ＲｅｖプラスミドであるｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを使用し、標準的なプロトコールを一部改変して行った（例えば、特許文献１に記載のプロトコール）。

　作成したレンチウイルス力価は、ｐ２４タンパク質に対するＥＬＩＳＡであるＱｕｉｃｋ　Ｔｉｔｅｒ　ＨＩＶ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて測定した。力価はそれぞれ、ｐＪＬＶ１－ＧＬＢ１：１．８×１０^８ＩＵ／ｍｌ、ｐＪＬＶ１－ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１：４．３×１０^８ＩＵ／ｍｌであった。

＜遺伝子導入造血幹細胞の作製及び移植＞
　１０週齢のＧＬＢ１－ＫＯマウスにおいて、実施例１と同じ手順で遺伝子導入造血幹細胞を作成し、１０週齢のＧＬＢ１－ＫＯマウスに移植した。

＜ＧＬＢ１活性測定及びＧＭ１ガングリオシド測定＞
　タンパク定量についてはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＧＬＢ１活性測定については既報の文献（非特許文献７）にしたがって蛍光基質である４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＧＭ１ガングリオシド測定についても既報の文献（非特許文献７）にしたがってトリプル四重極型高速液体クロマトグラフ質量分析器ＬＣＭＳ－８０４０（島津製作所）を用いて測定した。

　移植４週間後の血清、大脳皮質、小脳、及び海馬におけるＧＬＢ１活性及びＧＭ１ガングリオシド蓄積（ＧＭ１蓄積）の測定結果を図１５～１７示す。ＧＬＢ１活性は野生型マウス（ＷＴ）におけるＧＬＢ１活性を１００とする際の相対活性（％）であり、ＧＭ１蓄積はＧＬＢ１－ＫＯマウス（ＮＴ）におけるＧＭ１蓄積の量を１００とする際の相対量（％）である。図１６～１７から、ｍＴｆＲ－ＧＬＢ１マウスでは大脳皮質、小脳、及び海馬いずれにおいてもＧＬＢ１活性が高く、ＧＭ１蓄積も大幅に減少した。

　一般的に、抗ｍＴｆＲ抗体の融合により融合タンパク質の活性が融合タンパク質を形成していないタンパク質の活性よりも低いと考えられるが、予想外なことに、ＧＬＢ１については抗ｍＴｆＲ抗体融合タンパク質のほうが野生型酵素よりも血中活性が高かった。抗ｍＴｆＲ抗体の融合によってもたらされたのであろう細胞外分泌量の増加及び酵素の血中での安定化作用等が、活性の低下を上回っている可能性があると考えられる。ＧＡＡやＧＬＢ１は元々分泌されにくい又は不安定な酵素であるため、抗ｍＴｆＲ抗体の融合により、安定化されるためか、血中活性が下がるどころか、上昇していたことはまさに予想外の結果であった。

Claims

　抗トランスフェリン受容体抗体又はその抗原結合断片と、中枢神経系で機能させるべきタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸分子。
　前記中枢神経系で機能させるべきタンパク質がライソゾーム酵素である、請求項１に記載の核酸分子。
　前記ライソゾーム酵素が、酸性α－グルコシダーゼ、又はβ－ガラクトシダーゼである、請求項２に記載の核酸分子。
　前記中枢神経系で機能させるべきタンパク質がイズロン酸－２－スルファターゼである、請求項１に記載の核酸分子。
　前記中枢神経系で機能させるべきタンパク質が神経栄養因子である、請求項１に記載の核酸分子。
　前記中枢神経系で機能させるべきタンパク質が抗体である、請求項１に記載の核酸分子。
　請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
　前記ベクターを用いて前記核酸分子を宿主細胞導入した場合、前記融合タンパク質を安定発現させるベクターである、請求項７に記載のベクター。
　レンチウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
　請求項７に記載のベクターを用いて前記核酸分子を宿主細胞に導入して得られた、組換え細胞。
　前記宿主細胞が、造血幹細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞である、請求項１０に記載の組換え細胞。
　請求項１０に記載の組換え細胞を含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための薬剤。
　請求項１０に記載の組換え細胞を、必要とする対象に移植することを含む、中枢神経系疾患を診断、予防又は治療するための方法。