WO2023127879A1 - 安全な遺伝子治療のための抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質 - Google Patents

安全な遺伝子治療のための抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質 Download PDF

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WO2023127879A1
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transferrin receptor
seq
protein
receptor antibody
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正文 木下
春奈 高木
俊輔 飯塚
孝太 大月
啓之 薗田
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Ｊｃｒファーマ株式会社
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding an anti-transferrin receptor antibody.
  • the present invention relates to a gene encoding an anti-transferrin receptor antibody, which is used when constructing a vector.
  • parenteral means such as subcutaneous injection, intramuscular injection, and intravenous injection. If the patient is chronically ill, administration of the drug must be repeated over a long period of time, and therefore the burden imposed on the patient is great if the administration is by parenteral means.
  • Some recombinant proteins are fusion proteins of antibodies and proteins with physiological activity.
  • Examples of such fusion proteins include fusion proteins of antibodies and lysosomal enzymes (Patent Documents 1 to 5, Non-Patent Document 1).
  • Lysosomal disease is a genetic disease caused by decreased or absent activity of lysosomal enzymes due to abnormalities in genes that encode lysosomal enzymes that should be present in lysosomes.
  • Patients with lysosomal diseases are treated with so-called enzyme replacement therapy, in which recombinant lysosomal enzymes are administered by intravenous injection to replace depleted or missing lysosomal enzymes.
  • Patients with lysosomal disorders which are genetic disorders, need to take this enzyme replacement therapy for the rest of their lives.
  • lysosomal diseases affect the brain. To treat brain disorders, it is necessary to replenish the lysosomal enzymes in the brain. cannot recruit lysosomal enzymes to
  • Non-Patent Document 2 As a method for replenishing lysosomal enzymes in the brain, a method has been reported in which lysosomal enzymes are combined with antibodies that recognize molecules present on the surface of vascular endothelial cells as antigens, and administered by intravenous injection.
  • Non-Patent Document 2 Such a fusion protein can bind to the surface of vascular endothelial cells via the antibody portion, and can pass through the BBB to reach the brain. Such fusion proteins can thus replenish lysosomal enzymes in the brain. Even if a lysosomal enzyme is used as such a fusion protein, patients with lysosomal disease, a genetic disease, will need to receive enzyme replacement therapy with this fusion protein for the rest of their lives.
  • hTfR Human transferrin receptor
  • pavinafspalpha a fusion protein of hTfR and human iduronate-2-sulfatase, a type of lysosomal enzyme
  • pavinafsp alfa by intravenous drip infusion once a week
  • Non-Patent Document 4 there is a report that when an anti-TfR antibody is administered to an animal, the number of reticulocytes decreases by acting on reticulocytes that express a large amount of TfR.
  • An object of the present invention is, for example, when a gene encoding a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody (anti-TfR antibody) and a physiologically active protein is used for gene therapy, the anti-TfR antibody is transferred to the transferrin receptor (TfR antibody). ), which encodes a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein that has binding activity to a specific TfR, which can reduce side reactions such as symptoms of anemia caused by binding to It is to provide a nucleic acid molecule into which a gene is integrated.
  • anti-TfR antibody anti-transferrin receptor antibody
  • TfR antibody transferrin receptor
  • the present inventors found that a fusion protein having a certain level of binding activity (affinity) with TfR between an anti-TfR antibody and a protein having physiological activity
  • highly safe viral virions that can be used in gene therapy can be produced by using a nucleic acid molecule containing a gene that encodes, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following. 1.
  • a nucleic acid molecule comprising any of the following nucleotide sequences (1) to (6), wherein a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody encoded by the nucleic acid molecule and a physiologically active protein binds to the transferrin receptor.
  • a binding activity of 0.5 nM to 1 ⁇ M for: (1) a nucleotide sequence containing the first inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof, a nucleotide sequence downstream thereof encoding a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody and a physiologically active protein, further downstream a nucleotide sequence comprising a second inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof; (2) A base sequence containing the first inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof, a base sequence containing a gene expression control site downstream thereof, and a protein having physiological activity with an anti-transferrin receptor antibody further downstream A nucleotide sequence encoding a fusion protein of and further downstream a nucleotide sequence containing a second inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof; (3) a nucleotide sequence containing the first long terminal repeat (LTR) or a functional equivalent thereof, a nucleotide
  • nucleic acid molecule that contains the trailer or its functional equivalent downstream.
  • the nucleic acid molecule according to 1 above which is selected from the following (1) to (4): (1) A base sequence encoding a fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity has physiological activity at the C-terminus of the heavy chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof).
  • nucleotide sequence encoding a conjugate to which a protein having a conjugate and a nucleotide sequence encoding the light chain of an anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof); (2) a nucleotide sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity, which imparts physiological activity to the N-terminus of the heavy chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof); comprising a nucleotide sequence encoding a conjugate to which a protein having a conjugate and a nucleotide sequence encoding the light chain of an anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof); (3) a nucleotide sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity, which has physiological activity at the C-terminus of the light chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof
  • nucleic acid molecule according to 1 above which is selected from the following (1) to (4): (1) A base sequence encoding a fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity has physiological activity at the C-terminus of the heavy chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof).
  • linker is a peptide consisting of 1 to 50 amino acid residues.
  • the linker comprises one glycine, one serine, the amino acid sequence Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and 5.
  • the nucleic acid molecule according to 1 above which is selected from the following (1) to (4): (1) A nucleotide sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is added to the C-terminus of the light chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region).
  • nucleotide sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a physiologically active protein is attached to the C-terminus of the physiologically active protein directly or via a linker to bind to the anti-transferrin receptor.
  • the light chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be its variable region) is bound, and the heavy chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be its variable region) is attached to the C-terminus via a second linker.
  • the nucleic acid molecule according to 6 above, wherein the linker is a peptide consisting of 1 to 50 amino acid residues. 8.
  • the linker comprises one glycine, one serine, the amino acid sequence Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and 8.
  • the nucleic acid molecule according to 7 above which is a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences consisting of 2 to 10 consecutive amino acid sequences. 9.
  • the nucleic acid molecule according to 8 above, wherein the second linker consists of 8 to 50 amino acid residues. 10.
  • the second linker has the amino acid sequence Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Gly, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, and the amino acid of SEQ ID NO: 1 10.
  • the nucleic acid molecule according to 9 above which is selected from the group consisting of an amino acid sequence consisting of 3 consecutive amino acid sequences and an amino acid sequence consisting of 2 to 10 consecutive amino acid sequences. 11. 2.
  • the nucleic acid molecule according to 2 above which is selected from the following (1) to (4): (1) A nucleotide sequence encoding a fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is attached to the C-terminus of the heavy chain (which may be the variable region thereof) of the anti-transferrin receptor antibody. A nucleotide sequence encoding a conjugate to which a protein having activity binds, a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream thereof, and a light chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof) downstream thereof.
  • nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence that encodes (2) a base sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is attached to the N-terminus of the heavy chain of said anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof); A nucleotide sequence encoding a conjugate to which a protein having activity binds, a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream thereof, and a light chain of the anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof) downstream thereof.
  • nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence that encodes (3) a nucleotide sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is attached to the C-terminus of said anti-transferrin receptor antibody light chain (which may be the variable region thereof);
  • the nucleotide sequence encoding the fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and a physiologically active protein comprises the light chain of the anti-transferrin receptor antibody (in its variable region at the N-terminus of the protein having physiological activity, a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream of the nucleotide sequence, and further downstream of the nucleotide sequence of the anti-transferrin receptor antibody.
  • a base sequence that encodes a heavy chain (which may be a variable region thereof). 12.
  • nucleic acid molecule according to any one of 3 to 5 above, which is selected from the following (1) to (4): (1) A nucleotide sequence encoding a fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is attached to the C-terminus of the heavy chain (which may be the variable region thereof) of the anti-transferrin receptor antibody.
  • a nucleotide sequence encoding a conjugate in which an active protein is bound via a linker, a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream thereof, and a light chain of the anti-transferrin receptor antibody downstream thereof (the variable region of which is that contains a base sequence that encodes a (2) a base sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody and a protein having physiological activity is attached to the N-terminus of the heavy chain of said anti-transferrin receptor antibody (which may be the variable region thereof);
  • a nucleotide sequence encoding a conjugate in which an active protein is bound via a linker, a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream thereof, and a light chain of the anti-transferrin receptor antibody downstream thereof (the variable region of which is that contains a base sequence that encodes a (3) a base sequence encoding a fusion protein of said anti-transferrin receptor antibody
  • the internal ribosome binding site is a picornaviridae virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, hepatitis C virus, coronavirus, bovine enteric virus, Cyler's murine encephalomyelitis virus, Coxsackie B virus, human immunity 13.
  • the nucleic acid molecule according to 11 or 12 above which is derived from the 5' untranslated region of a virus or gene selected from the group consisting of globulin heavy chain binding protein gene, Drosophila Antennapedia gene, and Drosophila Ultravitrax gene. 14. 13.
  • the gene expression control site is a cytomegalovirus-derived promoter, SV40 early promoter, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoter, retroviral Rous sarcoma virus LTR promoter, dihydrofolate reductase promoter, is selected from the group consisting of ⁇ -actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse albumin promoter, human albumin promoter, human ⁇ -1 antitrypsin promoter, and mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter;
  • the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 14 above.
  • the physiologically active protein is growth hormone, lysosomal enzyme, somatomedin, insulin, glucagon, cytokine, lymphokine, blood coagulation factor, anti-transferrin receptor antibody, fusion protein of anti-transferrin receptor antibody and other protein, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle stimulating hormone (FSH), gonadotropin releasing hormone (GnRH), gonadotropin, nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epi
  • nucleic acid molecule according to any one of 1 to 17 above, which is selected from the group consisting of etanercept, pegvisomant, metreleptin, abatacept, asfotase, GLP-1 receptor agonists, and antibody drugs. 19.
  • the physiologically active protein is ⁇ -L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, acid ⁇ -glucosidase, glucocerebrosidase, ⁇ -galactosidase, GM2 activating protein, ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ -hexyl sosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, ⁇ -L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, ⁇ -N-acetylgalacto saminidase, acid sphingomyelinase, ⁇ -galactosidase A, ⁇ -glucuronidase, heparan N-sulfatase, ⁇
  • any one of 1 to 17 above which is selected from the group consisting of amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1 and CLN2 nucleic acid molecule.
  • 20. 19 The above 1 to 19, wherein the first inverted terminal repeat and the second inverted terminal repeat are derived from adeno-associated virus, adenovirus, or variants thereof.
  • a nucleic acid molecule according to any one of the above. 21. 20.
  • first inverted terminal repeat comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 and the second inverted terminal repeat comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:6 nucleic acid molecule. 22.
  • the first inverted terminal repeat is selected from (1) to (3) below, and the second inverted terminal repeat is selected from (4) to (6) below 20.
  • nucleic acid molecule according to any one of 1 to 19 above, which is: (1) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, (2) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, or (3) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and (4) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, (5) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, or (6) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 modified by.
  • the functional equivalent of the first inverted terminal repeat comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:7
  • the functional equivalent of the second inverted terminal repeat comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:8. , the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 19 above.
  • the functional equivalent of the first inverted terminal repeat is selected from (1) to (3) below, and the functional equivalent of the second inverted terminal repeat is the following (4 ) to (6), the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 19 above: (1) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, (2) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, or (3) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and (4) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, (5) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, or (6) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 modified by
  • the first long terminal repeat is selected from (1) to (3) below, and the second long terminal repeat is selected from (4) to (6) below , the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 19 above: (1) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52; (2) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52, or (3) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52 and (4) containing a nucleotide sequence showing 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53, (5) Those containing a nucleotide sequence showing 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53, or (6) 1 to 20 substitutions, deletions or additions to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53 modified by.
  • a plasmid comprising the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 32 above.
  • a viral virion comprising the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 32 above. 38.
  • a pharmaceutical composition comprising the virus virions of 37 above and a carrier. 39. 31.
  • a viral virion comprising the nucleic acid molecule of 31 above. 40. 40. A pharmaceutical composition comprising the viral virion of 39 above. 41. The pharmaceutical composition according to 40 above, wherein the dose per administration is 1.0 ⁇ 10 10 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg.
  • a fusion protein of an anti-TfR antibody with a reduced possibility of inducing anemia symptoms and a protein having physiological activity can be used to express it in a cell, tissue, or in vivo
  • a safe nucleic acid molecule can be provided that contains the gene encoding such a fusion protein.
  • FIG. 10 shows the results of plasma rAAV-derived protein concentration measurement (Example 17).
  • the vertical axis of the bar graph shows the logarithmic representation of the rAAV-derived protein concentration in plasma ( ⁇ g/mL).
  • the black bar indicates the measured value of rAAV-derived protein concentration in plasma 1 week after administration of each rAAV virion, and the white bar indicates the concentration of rAAV-derived protein in plasma 6 weeks after administration of each rAAV virion.
  • FIG. 10 shows the results of rAAV-derived protein concentration measurement in brain tissue (Example 17).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the concentration ( ⁇ g/g) of rAAV-derived protein in brain tissue.
  • the black bar indicates the concentration of rAAV-derived protein in brain tissue 1 week after administration of each rAAV virion, and the white bar indicates the concentration of rAAV-derived protein in brain tissue 6 weeks after administration of each rAAV virion.
  • FIG. 10 shows the results of heparan sulfate concentration measurement in brain tissue (Example 18).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the concentration of heparan sulfate in brain tissue ( ⁇ g/mg tissue weight).
  • the black bar indicates the concentration of heparan sulfate in brain tissue 1 week after administration of each rAAV virion, and the white bar indicates the concentration of heparan sulfate in brain tissue 6 weeks after administration of each rAAV virion.
  • FIG. 11 shows the results of blood hemoglobin concentration measurement (Example 19).
  • the vertical axis of the bar graph indicates blood hemoglobin concentration (g/dL).
  • the black bar indicates the blood hemoglobin level measured one week after administration of each rAAV virion, and the white bar indicates the measured value of blood hemoglobin concentration six weeks after administration of each rAAV virion.
  • a diagram showing the results of concentration measurement of mscFv3-GS3-hI2S in plasma (Example 26).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the plasma mscFv3-GS3-hI2S concentration ( ⁇ g/mL).
  • Vertical bars indicate the concentration of mscFv3-GS3-hI2S in plasma collected 6 weeks after administration of rAAV-mscFv3-GS3-hI2S.
  • Values are mean values and error bars indicate standard deviation.
  • FIG. 10 shows the results of concentration measurement of heparan sulfate in brain tissue (Example 27).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the concentration of heparan sulfate ( ⁇ g/mg wet weight).
  • Vertical bars indicate the concentration of heparan sulfate in brains collected 6 weeks after administration of rAAV-mscFv3-GS3-hI2S.
  • FIG. 11 shows the results of concentration measurement of heparan sulfate in CSF (Example 27).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the heparan sulfate concentration ( ⁇ g/mg).
  • Vertical bars indicate the concentration of heparan sulfate in CSF collected 6 weeks after rAAV-mscFv3-GS3-hI2S administration.
  • (1) normal control group, (2) disease control group, (3) 1.0 ⁇ 10 11 vg/kg administration group, (4) 1.0 ⁇ 10 12 vg/kg administration group, (5) 1.0 ⁇ Results for the 10 13 vg/kg administration groups are shown. Values are mean values and error bars indicate standard deviation.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of concentration measurement of hemoglobin in blood (Example 28).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the hemoglobin concentration (g/dL).
  • Vertical bars indicate the concentration of hemoglobin in blood collected 6 weeks after administration of rAAV-mscFv3-GS3-hI2S.
  • FIG. 10 shows the results of concentration measurement of rAAV-derived proteins in plasma (Example 38).
  • the vertical axis of the bar graph indicates the rAAV-derived protein concentration ( ⁇ g/mL) in plasma.
  • Vertical bars indicate the concentration of rAAV-derived protein in plasma collected 4 weeks after each rAAV virion administration.
  • (1) is the normal control group
  • (2) is the disease control group
  • (3) is the rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group
  • (4) is the rAAV-mscFv-GS3- (5) shows the results of the hGAA 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group and the rAAV-hGAA 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group, respectively. Values are mean values and error bars indicate standard deviation.
  • FIG. 10 shows the results of concentration measurement of rAAV-derived proteins in the brain (Example 38).
  • the vertical axis of the bar graph indicates concentration ( ⁇ g/g wet weight).
  • Vertical bars indicate the concentration of rAAV-derived protein in brains collected 4 weeks after each rAAV virion administration.
  • (1) is the normal control group
  • (2) is the disease control group
  • (3) is the rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group
  • (4) is the rAAV-mscFv-GS3-
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of concentration measurement of hemoglobin in blood (Example 40). The vertical axis of the bar graph indicates concentration (g/dL). Vertical bars indicate hemoglobin concentration in blood collected 4 weeks after each rAAV virion administration.
  • (1) is the normal control group
  • (2) is the disease control group
  • (3) is the rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group
  • (4) is the rAAV-mscFv-GS3- (5) shows the results of the hGAA 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group and the rAAV-hGAA 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg administration group, respectively. Values are mean values and error bars indicate standard deviation.
  • nucleic acid molecule mainly refers to either DNA, in which deoxyribonucleotides are polymerized through phosphodiester bonds, or RNA, in which ribonucleotides are polymerized through phosphodiester bonds.
  • the DNA may be single-stranded (single-stranded) or double-stranded with a complementary strand.
  • the DNA may be the (+) strand or the (-) strand.
  • the individual deoxyribonucleotides that make up the DNA must be of the naturally occurring type, as long as the protein-encoding genes contained in the DNA can be translated into mRNA in mammalian (especially human) cells. It may also be a modified version of the natural type.
  • the individual deoxyribonucleotides that make up DNA are translated into mRNA in mammalian (especially human) cells, and the gene encoding the protein contained in the DNA is translated into mRNA, and all or As long as a part can be replicated, it may be a naturally occurring form or a modified version of the natural form.
  • the RNA when the "nucleic acid molecule" is RNA, the RNA may be single-stranded (single-stranded) or double-stranded with a complementary strand. When the RNA is single-stranded, the RNA may be (+) stranded or (-) stranded.
  • the individual ribonucleotides that make up the RNA are naturally occurring as long as the gene encoding the protein contained in the RNA can be reverse transcribed into DNA in mammalian (particularly human) cells. can be of a type that exists in the , or modified.
  • each ribonucleotide that constitutes RNA is used as long as the gene encoding the protein contained in the RNA can be translated into protein in mammalian (particularly human) cells. It may be of the naturally occurring type or may be modified. Modification of ribonucleotides is performed, for example, to suppress degradation of RNA by RNase and to enhance the stability of RNA in cells.
  • the term inverted terminal repeat refers to a nucleotide sequence in which the same sequence is repeated at the end of the viral genome.
  • ITRs derived from adeno-associated viruses and those derived from adenoviruses can be preferably used as ITRs.
  • the ITR of adeno-associated virus is a region with a chain length of approximately 145 bases and functions as a replication origin and the like.
  • there are two inverted terminal repeats (ITRs) in the nucleic acid molecule referred to as the first inverted terminal repeat (ITR) and the second inverted terminal repeat (ITR). .
  • the ITR located on the 5' side is called the first inverted terminal repeat (ITR), and the ITR located on the 3' side
  • the ITR is called the second inverted terminal repeat (ITR).
  • the inverted terminal repeat (ITR) is derived from any virus as long as it has at least one of the functions of the original ITR such as a function as a replication origin and gene insertion into host cells. and the ITR of adeno-associated virus is one of the preferred ones.
  • the AAV serotype is not particularly limited and may be any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. good too.
  • the inverted terminal repeats (ITRs) of serotype 2 AAV have the first ITR comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 and the second ITR comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:6.
  • the ITR is not limited to a wild-type ITR, and may be a wild-type ITR with modifications such as substitutions, deletions, and additions.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3. Mutations combining substitution and deletion of these bases can also be added.
  • nucleotide sequence of the mutated ITR preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and still more preferably 90% or more identity with the wild-type ITR nucleotide sequence. more preferably 95% or more identity, more preferably 98% or more identity.
  • a functional equivalent of an ITR is something that can be functionally replaced with an ITR.
  • An ITR artificially constructed based on an ITR is also a functional equivalent of an ITR as long as it can replace the ITR.
  • a functional equivalent of an AAV ITR is one that can be functionally used in place of an AAV ITR.
  • ITRs artificially constructed based on AAV ITRs are also functional equivalents of AAV ITRs as long as they can substitute for AAV ITRs.
  • Functional equivalents of the artificially constructed first AAV inverted terminal repeat include those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (first AAV- functional equivalent of ITR). Substitutions, deletions, and mutations added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 can be functionally substituted for the ITR of the first AAV, so long as the first AAV-ITR included in the functional equivalents of
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, still more preferably is 1 to 3.
  • an ITR with mutations that combine substitution and deletion of these bases is also a functional equivalent of the first AAV-ITR.
  • adding a base to the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 in the base sequence or at the 5' end or 3' end 1, more preferably 1 to 3 bases are added.
  • ITRs with mutations combining additions, substitutions and deletions of these bases are also included in the functional equivalents of the first AAV-ITR.
  • the mutated ITR nucleotide sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7. It exhibits identity, more preferably 95% or more identity, even more preferably 98% or more identity.
  • functional equivalents of the artificially constructed second inverted terminal repeat include those having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 (second AAV- functional equivalent of ITR). Substitutions, deletions, and mutations added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be functionally substituted for the ITRs of the second AAV, and the ITRs of the second AAV included in the functional equivalents of
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, still more preferably is 1 to 3.
  • an ITR with a combination of these nucleotide substitutions and deletions is also a functional equivalent of the second AAV ITR.
  • adding a base to the base sequence shown by SEQ ID NO: 8 preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 in the base sequence or at the 5' end or 3' end 1, more preferably 1 to 3 bases are added.
  • ITRs mutated by combining additions, substitutions and deletions of these bases are also included in the functional equivalents of the second AAV ITRs.
  • the mutated ITR nucleotide sequence preferably exhibits 85% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8. It exhibits identity, more preferably 95% or more identity, even more preferably 98% or more identity.
  • long terminal repeats when referring to long terminal repeats (LTRs), hundreds to thousands of the same sequences are present at the ends of, for example, eukaryotic retrotransposons, or retroviral genomes, lentiviral genomes, etc. It refers to a base sequence that exists repeatedly.
  • LTRs long terminal repeats
  • LTRs long terminal repeats
  • LTR long terminal repeats
  • the long terminal repeat is derived from any virus as long as it has at least one of the functions of the original LTR such as a function as a replication origin and gene insertion into a host cell. and suitable include retroviral genomes and lentiviruses.
  • the LTR is not limited to a wild-type LTR, and may be a base sequence of a wild-type LTR modified by substitution, deletion, addition, or the like.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1-20, more preferably 1-10, and even more preferably 1-3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-3. Mutations combining substitution and deletion of these bases can also be added.
  • adding a base to a wild-type LTR preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3 bases in the nucleotide sequence of the LTR or at the 5' end or 3' end is added. Mutations combining addition, substitution and deletion of these bases can also be added.
  • the base sequence of the mutated LTR preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and still more preferably 90% or more identity with the wild-type LTR nucleotide sequence. more preferably 95% or more identity, still more preferably 98% or more identity.
  • a functional equivalent of LTR is something that can be functionally replaced with LTR.
  • An LTR artificially constructed based on an LTR is also a functional equivalent of an LTR as long as it can replace the LTR.
  • a functional equivalent of a lentiviral LTR is one that can be functionally used in place of the lentiviral LTR.
  • An artificially constructed LTR based on a lentiviral LTR is also a functional equivalent of a lentiviral LTR as long as it can replace the lentiviral LTR.
  • a functional equivalent of a retroviral LTR is one that can be functionally used in place of the retroviral LTR.
  • An artificially constructed LTR based on a retroviral LTR is also a functional equivalent of a retroviral LTR as long as it can replace the retroviral LTR.
  • a functional equivalent of the first LTR is one having the base sequence shown in SEQ ID NO: 52. Substitutions, deletions, and mutations added to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52 are also functional equivalents of the first LTR as long as they can be functionally used as the first LTR. included.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to 5, More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, still more preferably is 1 to 3.
  • an LTR with mutations that combine substitution and deletion of these bases is also a functional equivalent of the first LTR.
  • the functional equivalents of the first LTR also include LTRs mutated by combining additions, substitutions and deletions of these bases.
  • the mutated LTR nucleotide sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52. It exhibits identity, more preferably 95% or more identity, even more preferably 98% or more identity.
  • functional equivalents of the second LTR include those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 53. Substitutions, deletions, and mutations added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 53 are also functional equivalents of the second LTR as long as they can be functionally used as the second LTR. included.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, still more preferably is 1 to 3.
  • an LTR with mutations that combine substitution and deletion of these bases is also a functional equivalent of the second LTR.
  • the functional equivalents of the second LTR also include LTRs with mutations that combine the addition, substitution and deletion of these bases.
  • the mutated LTR nucleotide sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53. It exhibits identity, more preferably 95% or more identity, even more preferably 98% or more identity.
  • the terms leader and trailer refer to partially complementary nucleotide sequences present at the ends of the viral genome.
  • those derived from Sendai virus can be preferably used.
  • the Sendai virus leader and trailer are both about 50-base long regions. Usually the leader is on the 5' side and the trailer is on the 3' side.
  • a Sendai virus-derived leader having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 54 and a Sendai virus-derived trailer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 55 are preferably used in one embodiment of the present invention.
  • Mutations of the wild-type Sendai virus-derived leader and trailer can also be suitably used in the present invention.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3. Mutations combining substitution and deletion of these bases can also be added.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 3 bases in the leader or / and the base sequence of the trailer or at the 5' end or 3' end added.
  • the mutated base sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, more preferably 90% or more identity with the wild-type base sequence, More preferably, they exhibit 95% or greater identity, and even more preferably 98% or greater identity.
  • a mammal to which a gene encoding a fusion protein is introduced into a nucleotide sequence that can be used as a nucleotide sequence containing a gene expression control site that controls the expression of the fusion protein gene There is no particular limitation as long as the fusion protein can be expressed in (especially human) cells, tissues, or in vivo, but cytomegalovirus-derived promoter (optionally including enhancer), SV40 early promoter, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoter, retroviral Rous sarcoma virus LTR promoter, dihydrofolate reductase promoter, and ⁇ -actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse Preferred are those containing the albumin promoter, the human albumin promoter, and the human alpha-1 antitrypsin promoter.
  • cytomegalovirus-derived promoter optionally including enhancer
  • a synthetic promoter (mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 containing a mouse albumin promoter downstream of a mouse ⁇ -fetoprotein enhancer can be suitably used as a gene expression control site.
  • a chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 may be arranged downstream of the mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter. Placing such an intron can increase the expression level of the protein controlled by the gene expression control site.
  • the 1st to 219th nucleotide sequences are the mouse ⁇ -fetoprotein enhancer, and the 241st to 549th nucleotide sequences are the mouse albumin promoter.
  • the gene control site may be the promoter of a gene that is expressed organ-specifically or cell-type-specifically.
  • organ-specific expression promoter or a cell type-specific expression promoter By using an organ-specific expression promoter or a cell type-specific expression promoter, a gene encoding a fusion protein integrated into a nucleic acid molecule can be specifically expressed in a desired organ or cell.
  • the term "internal ribosome binding site” refers to a region (structure) that is present inside the mRNA chain, to which a ribosome can directly bind and initiate translation in a cap structure-independent manner. It is the region (structure) of the DNA strand that gives rise to the region.
  • "a gene encoding an internal ribosome binding site” is a region (structure) of a DNA strand that produces the region by being transcribed.
  • the internal ribosome binding site is generally referred to as an IRES (internal ribosome entry site), and includes picornaviridae viruses (poliovirus, rhinovirus, mouse encephalomyocarditis virus, etc.), foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, type C virus. Hepatitis virus, coronavirus, bovine enteric virus, Cyler's murine encephalomyelitis virus, Coxsackie virus 5' untranslated region, human immunoglobulin heavy chain binding protein, Drosophila Antennapedia, Drosophila Ultrabitrax, etc. is found in the 5' untranslated region of the gene.
  • picornaviridae viruses Poliovirus, rhinovirus, mouse encephalomyocarditis virus, etc.
  • foot-and-mouth disease virus hepatitis A virus, type C virus. Hepatitis virus, coronavirus, bovine enteric virus, Cyler's murine encephalomyelitis virus, Cox
  • the IRES is a region of approximately 450 bp located in the 5' untranslated region of mRNA.
  • viral 5' untranslated region refers to the 5' untranslated region of the viral mRNA, or the region (structure) of the DNA strand that is transcribed to give rise to this region.
  • the internal ribosome binding site is not particularly limited as long as it functions as an internal ribosome binding site in mammalian (especially human) cells, tissues, or in vivo, and any one can be used. can be done. Among them, preferably an internal ribosome binding site derived from the 5' untranslated region of a virus, more preferably an internal ribosome binding site derived from the 5' untranslated region of a picornaviridae virus, more preferably mouse brain myocardium An internal ribosome binding site derived from the 5' untranslated region of the mucosal virus is included.
  • One embodiment of the internal ribosome binding site derived from the 5' untranslated region of murine encephalomyocarditis virus has the base sequence shown in SEQ ID NO:11.
  • the internal ribosome binding site having the wild-type base sequence can be used as it is.
  • Mutant-type internal ribosome binding sites obtained by adding one or more mutations (e.g., substitution, deletion, and/or insertion) to the base sequence of these wild-type internal ribosome binding sites may also be used in mammals. Anything can be used as long as it functions as an internal ribosome binding site in animal (especially human) cells, tissues or in vivo.
  • Chimeric internal ribosome binding sites, in which two or more internal ribosome binding sites are fused together, can also be used.
  • the physiologically active protein that binds to an anti-transferrin receptor antibody to form a fusion protein is not particularly limited as long as it exhibits physiological activity in vivo.
  • Suitable proteins having such physiological activities include those to be administered to patients over a long period of time as pharmaceuticals.
  • Such drugs include, for example, growth hormones, lysosomal enzymes, neurotrophic factors, somatomedins, insulin, glucagon, cytokines, lymphokines, blood coagulation factors, antibodies, fusion proteins of antibodies and other proteins, granulocyte-macrophage colony-stimulating factors ( GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle-stimulating hormone (FSH) , gonadotropin-releasing hormone (GnRH), gonadotropin, DNasel, thyroid-stimulating hormone (TSH), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell lines Neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin
  • preferred examples include ⁇ -L-iduronidase, iduronic acid-2-sulfatase, acid ⁇ -glucosidase, glucocerebrosidase, ⁇ -galactosidase, GM2-activating protein, ⁇ -hexylase.
  • the physiologically active protein is a human protein.
  • the protein may be wild-type, or may be mutated as long as the protein retains its original physiological activity.
  • a protein having an intrinsic physiological activity means that the protein has a physiological activity that is 10% or more of that of the wild-type protein of the protein.
  • the physiological activity of the wild-type protein is preferably 20% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 50% or more, and even more preferably 80% or more. Preferably, 90% or more is even more preferred.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to There are 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-3. Mutations combining substitution and deletion of these bases can also be added.
  • bases to the wild-type protein preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3 in the base sequence of the protein or at the 5' end or 3' end base is added. Mutations combining addition, substitution and deletion of these bases can also be added.
  • the nucleotide sequence of the mutated protein preferably exhibits 80% or more identity, preferably 85% or more identity, more preferably 90% or more identity with the wild-type protein nucleotide sequence. It exhibits identity, more preferably 95% or more identity, even more preferably 98% or more identity.
  • the position of each mutation and its form (deletion, substitution, addition) when compared with the wild-type protein can be easily confirmed by alignment of the amino acid sequences of the wild-type and mutant proteins.
  • the identity between the amino acid sequence of the wild-type protein and the amino acid sequence of the mutant protein can be easily calculated using a well-known homology calculation algorithm.
  • homology calculation algorithm include BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson and Lipman's similarity search method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith and Waterman's local homology algorithm (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)).
  • substitutions of amino acids in the amino acid sequence of the above proteins by other amino acids occur, for example, within amino acid families related in their side chains and chemical properties of the amino acids. Substitutions within such an amino acid family are expected not to cause significant changes in protein function (ie, conservative amino acid substitutions).
  • amino acid families include, for example: (1) acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid, (2) basic amino acids histidine, lysine, and arginine (3) aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine, tryptophan, (4) serine and threonine, which are amino acids having a hydroxyl group (hydroxy amino acids), (5) the hydrophobic amino acids methionine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; (6) the neutral hydrophilic amino acids cysteine, serine, threonine, asparagine, and glutamine; (7) amino acids glycine and proline that affect the orientation of the peptide chain; (8) asparagine and glutamine, which are amide-type amino acids (polar amino acids), (9) the aliphatic amino acids alanine, leucine, isoleucine, and valine; (10) small side chain amino acids alanine, glycine, serine, and threonine, (1
  • anti-transferrin receptor antibody constituting the fusion protein of the anti-transferrin receptor antibody and the physiologically active protein in the present invention is described in detail below.
  • anti-transferrin receptor antibody As long as the anti-transferrin receptor antibody (anti-TfR antibody) has the property of specifically binding to the antigen transferrin receptor (TfR), there are no particular restrictions on the animal species of the anti-TfR antibody.
  • the anti-TfR antibody may be a non-human mammalian anti-TfR antibody, or a chimeric anti-TfR antibody of a human anti-TfR antibody and another non-human mammalian anti-TfR antibody. .
  • anti-TfR antibody is a comprehensive concept of antibodies that have the property of specifically binding to the transferrin receptor (TfR) of any animal species. Therefore, the antigen-binding fragment described below is also included in the anti-TfR antibody as long as it has the property of specifically binding to the transferrin receptor (TfR).
  • a human anti-transferrin receptor antibody refers to an anti-TfR antibody that is entirely encoded by a human-derived gene.
  • an anti-TfR antibody encoded by a gene obtained by mutating the original human gene for the purpose of increasing gene expression efficiency is also a human anti-TfR antibody.
  • an anti-TfR antibody obtained by combining two or more genes encoding a human anti-TfR antibody and replacing a part of one human anti-TfR antibody with a part of another human anti-TfR antibody is also a human anti-TfR antibody. is an antibody.
  • Human anti-TfR antibodies usually have 3 complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin light chain and 3 complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin heavy chain.
  • the three CDRs of the immunoglobulin light chain are called CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • the three CDRs of the immunoglobulin heavy chain are called CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • An anti-TfR antibody in which the antigen specificity, affinity, etc. of a human anti-TfR antibody is altered by replacing the CDRs of one human anti-TfR antibody with the CDRs of another human anti-TfR antibody is also a human anti-TfR antibody. .
  • an antibody obtained by modifying the gene of the original human anti-TfR antibody to mutate the amino acid sequence of the original human anti-TfR antibody, such as substitution, deletion, or addition, is also referred to as a human anti-TfR antibody.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3.
  • Antibodies with mutations that combine these amino acid substitutions and deletions are also human anti-TfR antibodies.
  • amino acids are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, in the amino acid sequence of the original human anti-TfR antibody or on the N-terminal side or C-terminal side, More preferably 1 to 3 amino acids are added.
  • Antibodies with mutations that combine these amino acid additions, substitutions and deletions are also human anti-TfR antibodies.
  • the amino acid sequence of the mutated human anti-TfR antibody preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, and even more preferably Those exhibiting 95% or greater identity, and even more preferably 98% or greater identity.
  • the term "human-derived gene" in the present invention includes not only the original human-derived gene, but also genes obtained by modifying the original human-derived gene.
  • humanized anti-TfR antibody means that the amino acid sequence of part of the variable region (e.g., all or part of the CDRs in particular) is derived from mammals other than humans, and the other regions are human It refers to the anti-TfR antibody from which it is derived.
  • the three complementarity determining regions (CDRs) of the immunoglobulin light chain and the three complementarity determining regions (CDRs) of the immunoglobulin heavy chain that constitute the human anti-TfR antibody are and anti-TfR antibodies made by replacing the mammalian CDRs of Other mammalian species from which CDRs to be transplanted into appropriate positions of human anti-TfR antibodies are derived are not particularly limited as long as they are mammals other than humans, but are preferably mice, rats, rabbits, and horses. , or non-human primates, more preferably mice and rats, such as mice.
  • the anti-TfR antibody is a human anti-TfR antibody or a humanized anti-TfR antibody
  • Light chains of human anti-TfR antibodies and humanized anti-TfR antibodies include ⁇ chains and ⁇ chains.
  • the light chain that constitutes the anti-TfR antibody may be either a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • the heavy chains of human anti-TfR antibodies and humanized anti-TfR antibodies include ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain, corresponding to IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively.
  • the heavy chain that constitutes the anti-TfR antibody may be any of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain, preferably ⁇ chain.
  • the heavy ⁇ chains of anti-TfR antibodies include ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 and ⁇ 4 chains, which correspond to IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, respectively.
  • the heavy chain constituting the anti-TfR antibody is a ⁇ chain
  • the ⁇ chain may be any of ⁇ 1 chain, ⁇ 2 chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 4 chain, preferably ⁇ 1 chain or ⁇ 4 chain .
  • the light chain of the anti-TfR antibody may be either a ⁇ chain or a ⁇ chain
  • the heavy chain may be any of ⁇ 1 chain, ⁇ 2 chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 4 chain, preferably ⁇ 1 chain or ⁇ 4 chain.
  • a preferred anti-TfR antibody is one in which the light chain is the ⁇ chain and the heavy chain is the ⁇ 1 chain.
  • chimeric anti-TfR antibody refers to an anti-TfR antibody formed by linking two or more different anti-TfR antibody fragments derived from two or more different species.
  • a chimeric anti-TfR antibody of a human anti-TfR antibody and another mammalian anti-TfR antibody is an anti-TfR antibody in which a portion of the human anti-TfR antibody is replaced with a portion of a non-human mammalian anti-TfR antibody.
  • An anti-TfR antibody consists of the Fc region, Fab region and hinge region described below. Specific examples of such chimeric anti-TfR antibodies include chimeric anti-TfR antibodies in which the Fc region is derived from a human anti-TfR antibody while the Fab region is derived from another mammalian anti-TfR antibody.
  • the hinge region is derived from either a human anti-TfR antibody or another mammalian anti-TfR antibody.
  • chimeric anti-TfR antibodies are included in which the Fc region is derived from another mammal while the Fab region is derived from a human anti-TfR antibody.
  • the hinge region may be derived from either a human anti-TfR antibody or another mammalian anti-TfR antibody. The same is true for humanized anti-TfR antibodies.
  • an anti-TfR antibody consists of a variable region and a constant region.
  • the heavy chain constant region (CH) and the light chain constant region (CL) are derived from a human anti-TfR antibody, while the heavy chain variable region (VH) and the light chain
  • the variable region (VL) is derived from another mammalian anti-TfR antibody, and conversely, the heavy chain constant region (CH) and light chain constant region (CL) are derived from another mammalian anti-TfR antibody while derived from a human anti-TfR antibody in which the variable region of the heavy chain (VH) and the variable region of the light chain (VL) are derived.
  • mammalian species are not particularly limited as long as they are mammals other than humans, but are preferably mice, rats, rabbits, horses, or non-human primates, more preferably mice is.
  • humanized anti-TfR antibodies when simply referred to as a heavy chain, this can be appropriately replaced with a portion containing the variable region of the heavy chain. can be replaced with a portion containing the variable region of
  • a chimeric anti-TfR antibody consisting of a human anti-TfR antibody and a mouse anti-TfR antibody is particularly referred to as a "human/mouse chimeric anti-TfR antibody".
  • Human / mouse chimeric anti-TfR antibodies include chimeric anti-TfR antibodies whose Fc region is derived from human anti-TfR antibody and Fab region is derived from mouse anti-TfR antibody, and conversely, chimeric anti-TfR antibody whose Fc region is derived from mouse anti-TfR antibody
  • chimeric anti-TfR antibodies in which the Fab region is derived from a human anti-TfR antibody are included.
  • the hinge region is derived from either human anti-TfR antibody or mouse anti-TfR antibody.
  • the heavy chain constant region (CH) and light chain constant region (CL) are derived from a human anti-TfR antibody, while the heavy chain variable region (VH) is and light chain variable region (VL) derived from mouse anti-TfR antibody, conversely, heavy chain constant region (CH) and light chain constant region (CL) derived from mouse anti-TfR antibody,
  • heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) are derived from a human anti-TfR antibody. The same is true for humanized anti-TfR antibodies.
  • Anti-TfR antibodies originally have a basic structure consisting of four polypeptide chains: two immunoglobulin light chains and two immunoglobulin heavy chains.
  • anti-TfR antibody in addition to those having this basic structure, (1) those consisting of a total of two polypeptide chains, one immunoglobulin light chain and one immunoglobulin heavy chain, or, as detailed below, (2) a single-chain antibody obtained by binding a linker to the C-terminal side of an immunoglobulin light chain and further binding an immunoglobulin heavy chain to the C-terminal side; (3) a single-chain antibody comprising a linker on the C-terminal side of an immunoglobulin heavy chain and an immunoglobulin light chain on the C-terminal side thereof; (4) A single-chain antibody (scFv), which is formed by binding a linker to the C-terminal side of the immunoglobulin heavy chain variable region, and further binding the immunoglobulin light chain variable region to the C-terminal side, and
  • the antibodies of the present invention also include scFv, which is a single-chain antibody obtained by linking the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain via a linker.
  • Antibodies of the present invention also include those containing all or part of an Fc region whose amino acid sequence has been altered to have affinity for TfR.
  • linker refers to, for example, a peptide chain in which multiple amino acids are linked by peptide bonds.
  • a linker composed of such a peptide chain can also be called a "peptide linker”.
  • a “linker” can also be interchanged with a "linker sequence” in the context of the present specification.
  • the N-terminus of this linker and the C-terminus of a certain protein are linked by a peptide bond, and the N-terminus of another protein is further linked to the C-terminus of the linker, forming a conjugate between the two proteins via the linker. .
  • An antibody with a basic structure consisting of four polypeptide chains, two light chains and two heavy chains, has three complementarity determining regions (CDRs) in the light chain variable region (V L ) and a heavy chain. It has three complementary determining regions (CDRs) in the variable region (V H ) of the chain.
  • the three CDRs of the light chain are called CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • the three CDRs of the heavy chain are also referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • Regions other than the CDRs of light and heavy chain variable regions are referred to as framework regions (FR).
  • the FRs are called FR1, FR2, FR3 and FR4 in order from the N-terminal side. Normally, CDRs and FRs are present in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the N-terminal side.
  • Fab means one light chain comprising the variable region and the C L region (constant region of the light chain) and the variable region and the C H 1 region (part 1 of the constant region of the heavy chain). ) are linked by disulfide bonds between the cysteine residues present in each heavy chain.
  • the heavy chain may contain a part of the hinge region in addition to the variable region and the CH 1 region (part 1 of the constant region of the heavy chain), but the hinge region in this case is It lacks the cysteine residues that are present and link the heavy chains of the antibody together.
  • the light chain and heavy chain are cysteine residues present in the constant region of the light chain ( CL region) and cysteine residues present in the constant region of the heavy chain (C H 1 region) or hinge region It is bound by a disulfide bond formed between A heavy chain that forms a Fab is called a Fab heavy chain.
  • Fabs lack the cysteine residues present in the hinge region that bind antibody heavy chains together, and thus consist of one light chain and one heavy chain.
  • a light chain that constitutes Fab contains a variable region and a CL region.
  • a heavy chain that constitutes Fab may consist of a variable region and a C H 1 region, or may contain a part of the hinge region in addition to the variable region and C H 1 region.
  • the hinge region is selected so as not to contain cysteine residues linking the heavy chains so that no disulfide bond is formed between the two heavy chains at the hinge region.
  • the heavy chain contains all or part of the hinge region containing the cysteine residues that connect the heavy chains, in addition to the variable and C H 1 regions.
  • F(ab') 2 refers to a molecule in which two F(ab')s are linked via a disulfide bond between cysteine residues present in the hinge regions of each other. Heavy chains forming F(ab') or F(ab') 2 are referred to as Fab' heavy chains. Polymers such as dimers and trimers in which multiple antibodies are bound directly or via linkers are also antibodies.
  • any antibody containing a part of an antibody molecule and having the property of specifically binding to an antigen is included in the "antibody” of the present invention.
  • the term "light chain” as used in the present invention includes those derived from a light chain and having the amino acid sequence of all or part of the variable region thereof.
  • the term “heavy chain” includes those derived from a heavy chain and having the amino acid sequence of all or part of the variable region thereof. Therefore, as long as it has the amino acid sequence of all or part of the variable region, for example, one lacking the Fc region is also a heavy chain.
  • the Fc or Fc region is a fragment consisting of the CH2 region (heavy chain constant region part 2) and CH3 region (heavy chain constant region part 3) in the antibody molecule.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is (8)
  • the light chain and heavy chain constituting Fab, F(ab') or F(ab') 2 shown in (6) above are bound via a linker sequence to form a single-chain antibody, respectively.
  • scFab, scF(ab'), and scF(ab') 2 are also included.
  • a linker sequence is attached to the C-terminal side of the light chain, and a heavy chain is attached to the C-terminal side.
  • a linker may be attached to the C-terminus of the heavy chain, and the light chain may be attached to the C-terminus of the linker.
  • the antibodies of the present invention also include scFv, which is a single-chain antibody obtained by binding a light chain variable region and a heavy chain variable region via a linker.
  • scFv a linker sequence may be attached to the C-terminal side of the variable region of the light chain, and the variable region of the heavy chain may be attached to the C-terminal side of the linker sequence.
  • a linker sequence may be attached to the terminal side, and the variable region of the light chain may be attached to the C-terminal side.
  • antibody as used herein includes full-length antibodies, in addition to those shown in (1) to (8) above, a broader concept including (1) to (8), complete Also included are any forms in which a portion of the long antibody is deleted.
  • antibody fragment refers to a fragment of an antibody that retains at least part of its specific antigen-binding activity.
  • binding fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , variable region (Fv), heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) linked with an appropriate linker single-chain antibody (scFv), a diabody that is a dimer of polypeptides containing a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L );
  • minibodies which are dimers of which part of the domain (C H 3) binds, and other low-molecular-weight antibodies.
  • Antigen-binding fragments include heavy chain antibodies, light chain antibodies, VHHs, VNARs, and partial deletions thereof. However, it is not limited to these molecules as long as they have the ability to bind to antigens.
  • a linker sequence is bound to the C-terminal side of an amino acid sequence containing all or part of the variable region of an immunoglobulin light chain, and an immunoglobulin heavy chain is attached to the C-terminal side. It refers to a protein that is formed by combining amino acid sequences that include all or part of the chain variable region and that can specifically bind to a specific antigen.
  • a linker sequence is bound to the C-terminal side of the amino acid sequence containing all or part of the immunoglobulin heavy chain variable region, and further amino acids containing all or part of the immunoglobulin light chain variable region on the C-terminal side
  • a protein formed by binding sequences and capable of specifically binding to a particular antigen is also a "single-chain antibody" in the context of the present invention.
  • single-chain antibody those shown in (2) and (3) above are included in single-chain antibodies.
  • the immunoglobulin heavy chain usually lacks the Fc region.
  • variable region of an immunoglobulin light chain has three complementarity determining regions (CDRs) that are responsible for the antigen specificity of an antibody.
  • variable region of immunoglobulin heavy chains also has three CDRs. These CDRs are the main regions that determine the antigen specificity of an antibody.
  • a single chain antibody preferably contains all three CDRs of an immunoglobulin heavy chain and all three CDRs of an immunoglobulin light chain.
  • the antigen-specific affinity of the anti-transferrin receptor antibody it can be a single-chain antibody with one or more CDRs deleted.
  • the linkers placed between the immunoglobulin light chain and heavy chain are preferably 2 to 50, more preferably 8 to 50, still more preferably 10 to 30, still more preferably It is a peptide chain composed of 12-18 or 15-25, eg 15 or 25 amino acid residues.
  • the amino acid sequence of such a linker is not limited as long as the anti-transferrin receptor antibody formed by linking both chains thereof retains the affinity for the transferrin receptor, but preferably glycine alone or glycine and serine.
  • the amino acid sequence Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Gly, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or these has a sequence in which the amino acid sequence of is repeated 2 to 10 times, or 2 to 5 times.
  • the linker having the sequence of SEQ ID NO: 4 is preferably used.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is an antibody derived from camelids (including alpacas). Some camelid antibodies consist of two heavy chains linked by disulfide bonds. An antibody consisting of these two heavy chains is called a heavy chain antibody.
  • a VHH is an antibody consisting of a single heavy chain containing a heavy chain variable region that constitutes a heavy chain antibody, or an antibody consisting of a single heavy chain lacking a constant region (CH) that constitutes a heavy chain antibody.
  • VHH is also one of the antibodies in the embodiments of the present invention.
  • camelid-derived antibodies with amino acid sequence mutations are also included in antibodies according to an embodiment of the present invention. is.
  • an antibody consisting of two light chains linked by disulfide bonds is also one of the antibodies in the embodiments of the present invention.
  • An antibody consisting of these two light chains is called a light chain antibody.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is a shark-derived antibody.
  • Shark antibodies consist of two heavy chains linked by disulfide bonds. An antibody consisting of these two heavy chains is called a heavy chain antibody.
  • VNAR is an antibody consisting of one heavy chain containing the variable region of the heavy chain constituting the heavy chain antibody, or an antibody consisting of one heavy chain lacking the constant region (CH) constituting the heavy chain antibody. VNAR is also one of the antibodies in embodiments of the present invention.
  • Shark-derived antibodies (including VNAR) with amino acid sequence mutations added to reduce antigenicity when administered to humans are also antibodies in one embodiment of the present invention. When mutations are made to the amino acids of the shark antibody, the same mutations that can be made to the antibodies described herein can be made.
  • a humanized shark antibody is also one of the antibodies in the embodiments of the present invention.
  • a single domain antibody refers to an antibody that has the property of specifically binding to an antigen with a single variable region.
  • Single domain antibodies include antibodies whose variable regions consist only of heavy chain variable regions (heavy chain single domain antibodies) and antibodies whose variable regions consist only of light chain variable regions (light chain single domain antibodies).
  • VHH and VNAR are types of single domain antibodies.
  • the anti-TfR antibody has a specific affinity for TfR, so it can bind to TfR present on the surface of cerebrovascular endothelial cells.
  • Anti-TfR antibodies bound to TfR can cross the blood-brain barrier (BBB). Therefore, by forming a fusion protein in which a protein having a desired physiological activity is bound to TfR, the fusion protein can pass through the blood-brain barrier (BBB) and exert its physiological activity in the brain. can. In other words, such a fusion protein can be used as a drug that should exert its efficacy in the brain.
  • human transferrin receptor or “hTfR” refers to a membrane protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the portion from the 89th cysteine residue from the N-terminal side to the C-terminal phenylalanine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 (hTfR extracellular region) It specifically binds to, but is not limited to.
  • the light chain of the anti-hTfR antibody that is Fab in one embodiment has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 or 41 as the amino acid sequence of the light chain CDR1 of the anti-hTfR antibody, and the amino acid sequence of the light chain CDR2 of the hTfR antibody has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42 or 43, and the amino acid sequence of the light chain CDR3 of the hTfR antibody has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 44.
  • the heavy chain of the anti-hTfR antibody that is Fab in one embodiment has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 or 46 as the amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of the anti-hTfR antibody, and the amino acid sequence of the heavy chain CDR2 of the hTfR antibody has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 47 or 48, and the amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of the hTfR antibody has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 49 or 50.
  • the anti-hTfR antibody that is Fab in one embodiment comprises a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the following (a) to (h) can be exemplified as binding modes of the anti-TfR antibody and the physiologically active protein in the fusion protein of the anti-TfR antibody and the physiologically active protein;
  • the anti-TfR antibody is a single-chain antibody in which the light chain of the antibody is bound to the C-terminal side of the heavy chain of the antibody, and directly or via a linker to the N-terminal side of the single-chain antibody conjugated with a protein having physiological activity
  • the anti-TfR antibody is a single-chain antibody in which the light chain of the antibody is bound to the C-terminal side of the heavy chain of the antibody, and directly or via a linker to the C-terminal side of the single-chain antibody conjugated with a protein having physiological activity
  • the anti-TfR antibody is a single-chain antibody in which the heavy chain of the antibody is bound to the C-terminal side of the light chain of the antibody, and directly or via a linker to the N-terminal
  • an anti-TfR antibody comprising at least one light chain and at least one heavy chain, and a physiologically active protein bound directly or via a linker to the N-terminal side of the light chain of the antibody
  • an anti-TfR antibody comprising at least one light chain and at least one heavy chain, and a physiologically active protein bound directly or via a linker to the C-terminal side of the heavy chain of the antibody
  • an anti-TfR antibody comprising at least one light chain and at least one heavy chain, and a physiologically active protein bound directly or via a linker to the N-terminal side of the heavy chain of the antibody .
  • the light chain can be read as the variable region of the light chain
  • the heavy chain can be read as the variable region of the heavy chain.
  • the sequence when a linker sequence is arranged between the anti-TfR antibody and the fusion protein of a protein having physiological activity, is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 17 , more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5 amino acids. 2, 3, 1-17, 1-10, 10-40, 20-34, 23-31, 25-29, etc.
  • the amino acid sequence of such a linker sequence is such that the anti-TfR antibody linked thereby retains affinity for TfR, and the protein linked by the linker sequence exhibits the biological activity of the protein under physiological conditions. It is not particularly limited as long as it can be exhibited.
  • the amino acid sequence is preferably composed of glycine and serine.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or a sequence consisting of 1 to 50 amino acids consisting of 1 to 10 or 2 to 5 of these amino acid sequences, 2 to 17, 2 It has a sequence of ⁇ 10, 10-40, 20-34, 23-31, 25-29 amino acids.
  • Gly-Ser one having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and one consisting of 17 amino acids with Gly-Ser added to the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 , can be suitably used as a linker sequence.
  • the linker sequence (linker) that binds the light chain or heavy chain of the anti-TfR antibody and the physiologically active protein is referred to as the linker sequence (linker) or the first linker sequence (first linker).
  • the linker sequence (linker) that connects the light chain and heavy chain is referred to as the second linker sequence (second linker).
  • the nucleic acid molecule in one embodiment of the present invention encodes a fusion protein of an anti-TfR antibody and a bioactive protein between a first inverted terminal repeat (ITR) and a second inverted terminal repeat (ITR). It contains genes that The following (1)-(4) are examples of such nucleic acid molecules: (1) A fusion protein comprising a conjugate in which a physiologically active protein is bound directly or via a linker to the C-terminal side or N-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody, and the light chain of the anti-TfR antibody.
  • a fusion protein comprising a conjugate in which a physiologically active protein is bound directly or via a linker to the C-terminal side or N-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody, and the light chain of the anti-TfR antibody.
  • a fusion protein comprising a conjugate in which a physiologically active protein is bound directly or via a linker to the C-terminal side or N-terminal side of the anti-TfR antibody light chain, and the anti-TfR antibody heavy chain comprising a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream of the gene encoding the heavy chain and a nucleotide sequence encoding the conjugate downstream thereof;
  • a fusion protein comprising a conjugate in which a physiologically active protein is bound directly or via a linker to the C-terminal side or N-terminal side of the anti-TfR antibody light chain, and the anti-TfR antibody heavy chain comprising a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream of the gene encoding the conjugate, and a nucleotide sequence encoding a light chain downstream thereof;
  • the nucleic acid molecule may contain a nucleotide sequence containing a gene expression control site between the first inverted terminal repeat (ITR) and the gene encoding the fusion protein. good.
  • the nucleotide sequence encoding the internal ribosome binding site may be replaced with a nucleotide sequence containing the gene expression control site.
  • the first gene expression control site and the first gene expression control site are arranged in order from the first inverted terminal repeat (ITR) side. part.
  • the nucleotide sequence encoding the internal ribosome binding site may be replaced with the nucleotide sequence encoding the 2A self-cleavage peptide.
  • the 2A peptide derived from porcine tessho virus is a suitable example of a 2A self-cleaving peptide.
  • the light chain can be read as the variable region of the light chain, and the heavy chain can be read as the variable region of the heavy chain.
  • the nucleic acid molecule in one embodiment of the invention has a single It contains a gene encoding a fusion protein of a main-chain anti-TfR antibody and a protein having physiological activity.
  • the following (1)-(4) are examples of such nucleic acid molecules: (1) A light chain was bound via a second linker to the C-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody, and a bioactive protein was further bound directly or via a linker to the C-terminal side of the light chain.
  • a gene encoding a fusion protein which is (2) A heavy chain was bound via a second linker to the C-terminal side of the light chain of the anti-TfR antibody, and a bioactive protein was further bound directly or via a linker to the C-terminal side of the light chain.
  • a gene encoding a fusion protein which is (3) Encodes a fusion protein in which a heavy chain of an anti-TfR antibody is bound directly or via a linker to the C-terminal side of a protein having physiological activity, and a light chain is further bound to the C-terminal side of the heavy chain.
  • the nucleic acid molecule may contain a nucleotide sequence containing a gene expression control site between the first inverted terminal repeat (ITR) and the gene encoding the fusion protein. good.
  • the light chain can be read as the variable region of the light chain
  • the heavy chain can be read as the variable region of the heavy chain, as appropriate.
  • the fusion protein comprises human iduronate-2-sulfatase (hI2S) bound via a linker downstream of the Fab region of the heavy chain of the anti-TfR antibody, and the light chain of the anti-TfR antibody.
  • hI2S human iduronate-2-sulfatase
  • the Fab region of the heavy chain of the anti-TfR antibody contains the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13
  • the linker contains the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4
  • hI2S is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14
  • the light chain of the anti-TfR antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the conjugate herein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:51 in its entirety.
  • the nucleic acid molecule in one embodiment of the present invention is a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein between a first long terminal repeat (LTR) and a second long terminal repeat (LTR). includes.
  • the following (1)-(4) are examples of such nucleic acid molecules: (1) The fusion protein contains a conjugate in which a protein having physiological activity is bound to the C-terminal side or N-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody and the light chain of the anti-TfR antibody, wherein the light chain is containing a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream of the encoding gene and a nucleotide sequence encoding the conjugate downstream thereof; (2) The fusion protein comprises a conjugate in which a protein having physiological activity is bound to the C-terminal side or N-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody and the light chain of the anti-TfR antibody, and the conjugate containing a nucleotide sequence encoding an internal ribosome binding site downstream of the gene encoding the, and a nucleotide sequence encoding the light chain downstream thereof, (3) The fusion protein contains a conjugate in which a protein having physiological activity is
  • the nucleic acid molecule may contain a nucleotide sequence containing a gene expression control site between the first inverted terminal repeat (LTR) and the gene encoding the fusion protein. good.
  • the nucleotide sequence encoding the internal ribosome binding site may be replaced with a nucleotide sequence containing the gene expression control site.
  • the first gene expression control site and the first gene expression control site are referred to in order from the first inverted terminal repeat (LTR) side.
  • the nucleotide sequence encoding the internal ribosome binding site may be replaced with the nucleotide sequence encoding the 2A self-cleavage peptide.
  • the 2A peptide derived from porcine tessho virus is a suitable example of a 2A self-cleaving peptide.
  • the light chain can be read as the variable region of the light chain, and the heavy chain can be read as the variable region of the heavy chain, as appropriate.
  • the nucleic acid molecule in one embodiment of the invention has a single strand It contains a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein.
  • the following (1)-(4) are examples of such nucleic acid molecules: (1) A light chain was bound via a second linker to the C-terminal side of the heavy chain of the anti-TfR antibody, and a bioactive protein was further bound directly or via a linker to the C-terminal side of the light chain.
  • a gene encoding a fusion protein which is (2) A heavy chain was bound via a second linker to the C-terminal side of the light chain of the anti-TfR antibody, and a bioactive protein was further bound directly or via a linker to the C-terminal side of the light chain.
  • a gene encoding a fusion protein which is (3) Encodes a fusion protein in which a heavy chain of an anti-TfR antibody is bound directly or via a linker to the C-terminal side of a protein having physiological activity, and a light chain is further bound to the C-terminal side of the heavy chain.
  • the nucleic acid molecule may contain a nucleotide sequence containing a gene expression control site between the first long terminal repeat (LTR) and the gene encoding the fusion protein.
  • LTR first long terminal repeat
  • the light chain can be read as the variable region of the light chain
  • the heavy chain can be read as the variable region of the heavy chain, as appropriate.
  • a fusion protein between an anti-TfR antibody and a physiologically active protein is obtained by appropriately selecting the amino acid sequence of the anti-TfR antibody portion that constitutes the fusion protein, or / and an anti-TfR antibody and The affinity (binding activity) of the fusion protein for TfR can be adjusted by appropriately selecting the form of binding to the protein having physiological activity.
  • appropriately selecting the binding form of the anti-TfR antibody and the physiologically active protein means that, for example, (1) the original fusion protein is bound to the heavy chain of the anti-TfR antibody with the physiologically active protein.
  • the original fusion protein is the light chain of the anti-TfR antibody. If it is bound, it is to bind a protein having physiological activity to the heavy chain instead of the light chain of the anti-TfR antibody; When a protein having activity is bound, binding a protein having physiological activity to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the anti-TfR antibody, (4) C of the heavy chain or light chain of the anti-TfR antibody When a physiologically active protein is bound to the terminus, binding a physiologically active protein to the N-terminus of the heavy chain or light chain of the anti-TfR antibody, (5) the heavy chain of the anti-transferrin receptor antibody Alternatively, when a protein having physiological activity is bound to the light chain via a linker, the amino acid sequence of the linker is altered (including alteration of the linker length), or the linker is deleted.
  • connection format by combining these (1) to (5).
  • These alterations in binding form for example, create steric hindrance and inhibit the binding of the anti-TfR antibody portion of the fusion protein to TfR, resulting in a decrease in the affinity (binding activity) of the fusion protein for TfR as a whole.
  • a fusion protein that has been adjusted to show a certain level of affinity (binding activity) for TfR as a whole fusion protein, it is caused by the fusion protein binding to reticulocytes that express a large amount of TfR on the cell surface. , the reticulocyte-impairing effect is suppressed.
  • reticulocyte function is impaired, the number of erythrocytes in the blood decreases, resulting in symptoms of anemia.
  • a fusion protein that exhibits a certain level of affinity for TfR suppresses symptoms of anemia when administered in vivo.
  • the severity of anemia symptoms can be objectively judged by comparing blood hemoglobin levels with those of normal individuals. There is an inverse correlation between the hemoglobin concentration and the severity of anemia symptoms; the lower the hemoglobin concentration, the higher the severity of the symptoms of anemia.
  • the affinity (binding activity) of the fusion protein for TfR as a whole of the fusion protein of anti-TfR antibody and physiologically active protein is very high, the binding of endogenous transferrin to TfR is strongly inhibited.
  • TfR-mediated transport of transferrin into the cell may be inhibited, rendering the cell iron deficient.
  • the fusion protein of one embodiment of the present invention can reduce the risk of cells becoming iron-deficient when an anti-TfR antibody is administered in vivo.
  • a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein is administered as a drug by means of subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, etc.
  • administration should be discontinued if anemic symptoms are observed as a side reaction. Just do it.
  • the fusion protein is continuously released into the body over a long period of time from the administered gene. Therefore, even if a side reaction occurs, its expression cannot be interrupted.
  • One embodiment of the present invention suppresses the occurrence of side reactions expected to occur due to the sustained expression of the fusion protein in the patient's body by appropriately adjusting the affinity (binding activity) for TfR. It is something to do.
  • the affinity (binding activity) of the fusion protein as a whole for TfR becomes a problem. Therefore, by mutating the anti-TfR antibody portion constituting the fusion protein, etc., by appropriately adjusting the binding form of the amino acid sequence and / and the protein having physiological activity with TfR, the affinity for TfR as a whole fusion protein Genes encoding fusion proteins with adjusted sex (binding activity) are used.
  • genes encoding such fusion proteins can be used as part of safe gene therapy drugs.
  • the gene encoding the fusion protein is highly safe. It can be used as part of a medicament for gene therapy against disorders in the brain and central nervous system.
  • the binding activity of an anti-TfR antibody or a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein to TfR is, for example, , can be assessed by the 50% effective concentration (EC 50 ) based on determination using the ELISA method.
  • the 50% effective concentration can be measured, for example, by the method described in Example 15.
  • the binding activity between the fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein and TfR is 50% effective concentration, preferably 3 nM to 10 ⁇ M, when measured by the measurement method.
  • 3 nM to 5 ⁇ M is preferably 3 nM to 5 ⁇ M, for example, 3 nM to 2 ⁇ M, 3 nM to 1 ⁇ M, 3 nM to 500 nM, 3 nM to 200 nM, 3 nM to 100 nM, 3.5 nM to 2 ⁇ M, 3.5 nM to 1 ⁇ M, 3.5 nM to 500 nM, 3.5 nM to 200 nM, 3.5 nM to 100 n, 4 nM to 2 ⁇ M, 4 nM to 1 ⁇ M, 4 nM to 500 nM, 4 nM to 200 nM, 4 nM-100 nM, 5 nM-5 ⁇ M, 5 nM-1 ⁇ M, 5 nM-500 nM, 5 nM-200 nM, 5 nM-100 nM, 10 nM-5 ⁇ M, 10 nM to 1 ⁇ M, 5 nM to 500 n
  • the anti-TfR antibody is anti-human TfR
  • the 87th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 A 50% effective concentration (EC 50 ) may be determined using the human transferrin receptor extracellular domain having the amino acid sequence from 1 to 763.
  • a nucleic acid molecule in one embodiment of the present invention can be used as a component of a therapeutic agent for gene therapy using AAV.
  • AAV inverted terminal repeats
  • the viral genome is site-specifically integrated into chromosome 19 via inverted terminal repeats (ITRs) that flank the viral genome.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • Genes of the viral genome incorporated into the host cell genome are rarely expressed, but when the cell is infected with a helper virus, AAV is excised from the host genome and replication of the infectious virus begins.
  • the helper virus is adenovirus, the genes responsible for helper action are E1A, E1B, E2A, VA1, and E4.
  • the AAV vector is a base sequence containing a first inverted terminal repeat (ITR) derived from the AAV genome and a second It refers to a vector that has a base sequence containing terminal repeats (ITRs) and can incorporate foreign genes.
  • ITR inverted terminal repeat
  • the site where the foreign gene can be integrated in the AAV vector can be located between the first and second inverted terminal repeats (ITRs).
  • An AAV vector into which a foreign gene is integrated is also an AAV vector.
  • the wild-type AAV genome contains two genes, rep and cap.
  • the rep proteins (rep78, rep68, rep52 and rep40) produced from the rep gene are essential for encapsidation and mediate the integration of the viral genome into the chromosome.
  • the cap gene is responsible for the production of three capsid proteins (VP1, VP2 and VP3).
  • a recombinant AAV virion is obtained by replacing a region containing the rep gene and the cap gene of the wild-type AAV genome with a gene encoding a foreign protein, resulting in a capsid encoded by the cap gene. It is contained in However, not limited to this, a recombinant AAV virion (rAAV virion) is a capsid containing a part of the wild-type AAV genome replaced with a gene encoding a foreign protein.
  • rAAV virions can be used for therapeutic purposes as vectors to deliver foreign genes to cells.
  • pharmaceutical compositions are provided comprising rAAV virions and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a virus such as AAV
  • a plasmid (plasmid 1), (2 ) A plasmid containing the AAV Rep gene, which has the necessary functions to integrate the nucleotide sequence of the region flanked by the ITR sequences (including the ITR sequences) into the genome of the host cell, and the gene encoding the AAV capsid protein (plasmid 2), and (3) a plasmid containing the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region of adenovirus (plasmid 3).
  • ITR inverted terminal repeat
  • the present invention is not limited to this, and two types of plasmids can be used: one plasmid formed by ligating two of the plasmids 1 to 3, and the remaining one plasmid. Furthermore, one plasmid obtained by ligating the plasmids 1 to 3 can also be used.
  • a desired protein in the present invention is a fusion protein of a ligand and a physiologically active protein.
  • these three types of plasmids are first introduced into host cells such as HEK293 cells in which the adenovirus E1a and E1b genes are integrated into the genome by a general transfection method. be done. Then, a sequence comprising a first inverted terminal repeat (ITR) and a sequence comprising a second inverted terminal repeat (ITR) and a gene encoding a desired protein located between these two ITRs. The containing region is replicated in the host cell and the resulting single-stranded DNA is packaged into the AAV capsid proteins to form recombinant AAV virions.
  • ITR inverted terminal repeat
  • ITR second inverted terminal repeat
  • the recombinant AAV virions are infective and can be used to introduce foreign genes into cells, tissues or organisms.
  • the exogenous gene in one embodiment of the present invention is a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein.
  • the fusion protein comes to be expressed from this gene in the cells into which it is introduced.
  • the adeno-associated virus (AAV) Rep protein is encoded by the AAV rep gene.
  • the Rep protein has the functions necessary to integrate, for example, the AAV genome into the genome of the host cell via the ITRs present in the genome.
  • Rep68 and Rep78 are required for integration of the AAV genome into the genome of the host cell.
  • Rep68 and Rep78 are translation products of two types of mRNA transcribed from the same gene by alternative splicing.
  • the AAV Rep protein includes at least two types of proteins, Rep68 and Rep78.
  • the nucleotide sequence encoding the Rep protein of adeno-associated virus refers to nucleotide sequences encoding at least Rep68 and Rep78, or nucleotide sequences obtained by adding mutations thereto.
  • the Rep protein is preferably, but not limited to, serotype 2 AAV, serotype 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 Any of the above may be used.
  • a preferred example of the nucleotide sequence encoding the wild-type serotype 2 AAV Rep protein has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:32.
  • Rep68 is substituted with the wild-type Rep68 amino acid sequence of any AAV of serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exhibits its function. , deletions, additions, and other modifications may be used. In the present invention, Rep68 with these mutations is also included in Rep68.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3. .
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1-10, more preferably 1-5, still more preferably 1-3.
  • Rep68 with a mutation that combines these amino acid substitutions and deletions is also Rep68.
  • amino acids are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of wild-type Rep68 or to the N-terminus or C-terminus.
  • Rep68 mutated by combining addition, substitution and deletion of these amino acids is also included in Rep68.
  • the mutated Rep68 amino acid sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and still more preferably 90% or more identity with the wild-type Rep68 amino acid sequence. more preferably 95% or more identity, more preferably 98% or more identity.
  • Rep78 is substituted with the wild-type Rep78 amino acid sequence of any AAV of serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exhibits its function. , deletions, additions, and other modifications may be used. In the present invention, Rep78 with these mutations is also included in Rep78.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3. .
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1-10, more preferably 1-5, still more preferably 1-3.
  • Rep78 with a mutation that combines these amino acid substitutions and deletions is also Rep78.
  • amino acids are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of wild-type Rep78 or to the N-terminus or C-terminus.
  • Rep78 mutated by combining addition, substitution and deletion of these amino acids is also included in Rep78.
  • the mutated Rep78 amino acid sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and still more preferably 90% or more identity with the wild-type Rep78 amino acid sequence. more preferably 95% or more identity, more preferably 98% or more identity.
  • a functional equivalent of the Rep protein of AAV refers to one that can be functionally substituted for Rep68 for Rep68, and for Rep78, it can be functionally substituted for Rep78. say something A functional equivalent of Rep protein may be a mutant of the wild-type Rep protein.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 can be modified by substitution, deletion, addition, etc., as long as it encodes functional Rep68 and Rep78.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 3. be.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3.
  • mutations obtained by combining substitution and deletion of these bases can also be used as the base sequence encoding the Rep protein.
  • a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 3 bases in the base sequence shown by SEQ ID NO: 32 or at the 5' end or 3' end Append. Mutations obtained by combining additions, substitutions and deletions of these bases can also be used as nucleic acid molecules encoding Rep proteins.
  • the mutated nucleotide sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 , more preferably 95% or more identity, more preferably 98% or more identity.
  • the nucleotide sequence encoding the Cap protein of adeno-associated virus refers to at least the nucleotide sequence encoding VP1, which is one of the proteins constituting the capsid of AAV. It refers to a base sequence containing a base sequence with mutations added.
  • VP1 is preferably of, but not limited to, serotype 8 AAV, serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or Any one of 11 may be used.
  • a preferred example of the nucleotide sequence of the Cap region of serotype 8 includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:31.
  • VP1 is substituted with the amino acid sequence of wild-type VP1 of AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exerts its function. , deletions, additions, and other modifications may be made. In one embodiment of the present invention, VP1 with these mutations is also included in VP1.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 3. be.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 3.
  • a mutation obtained by combining substitution and deletion of these bases can also be used as a base sequence encoding the Cap protein.
  • a mutation obtained by combining addition, substitution and deletion of these bases can also be used as a nucleic acid molecule encoding the Cap protein.
  • the mutated nucleotide sequence preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 , more preferably 95% or more identity, still more preferably 98% or more identity.
  • an AAV vector can be used to obtain a recombinant AAV virion packaged with a nucleic acid molecule containing a foreign gene between a first ITR and a second ITR.
  • Recombinant AAV virions are infectious and can be used to introduce foreign genes into cells, tissues, or organisms.
  • a foreign gene in the present invention is a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and a protein having physiological activity. A fusion protein is expressed from this gene in cells or the like into which the gene has been introduced.
  • AAV is defined as a recombinant virion packaged with a nucleic acid molecule containing a foreign gene between a first ITR and a second ITR, and which can be used to introduce genes into cells.
  • AAV vector system there is the application of adenovirus (adenovirus vector system).
  • adenovirus vector system adenovirus vector system
  • adenoviral vector system a recombinant adenoviral virion is obtained in which a nucleic acid molecule containing a foreign gene is packaged between the first ITR and the second ITR.
  • Recombinant adenoviral virions are infectious and can be used to introduce foreign genes into cells, tissues, or organisms.
  • the binding activity between the fusion protein and TfR is preferable. Aspects are described in detail below. These embodiments can also be applied to adenovirus, lentivirus, and retrovirus applications.
  • the binding activity of the fusion protein to TfR is, for example, the 50% effective concentration (EC 50 ) value measured by the ELISA method described in Example 15 is preferably 0.5 nM to 10 ⁇ M, and more Preferably 3 nM to 5 ⁇ M, for example, 0.5 nM to 5 ⁇ M, 0.5 nM to 1 ⁇ M, 1 nM to 2 ⁇ M, 1 nM to 1 ⁇ M, 3 nM to 2 ⁇ M, 3 nM to 1 ⁇ M, 3 to 500 nM, 3-200 nM, 3-100 nM, 3.5 nM-2 ⁇ M, 3.5 nM-1 ⁇ M, 3.5-500 nM, 3.5-200 nM, 3.5-100 n, 4 nM-2 ⁇ M, 4 nM to 1 ⁇ M, 4 to 500 nM, 4 to 200 nM, 4 to 100 nM; Yes, 10 nM to 5 ⁇ M, 10 nM to 1 ⁇
  • EC 50 values are particularly favorable when the fusion protein is an anti-TfR antibody and lysosomal enzyme fusion protein, such as a TfR antibody and human I2S fusion protein or a TfR antibody and human GAA fusion protein.
  • the anti-TfR antibody is anti-human TfR
  • the 87th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 A 50% effective concentration (EC 50 ) may be determined using the human transferrin receptor extracellular domain having the amino acid sequence from 1 to 763.
  • a rAAV virion packaged with a DNA fragment containing a gene encoding a fusion protein is one aspect of a drug for gene therapy using the AAV virus.
  • the dose of the drug should be adjusted appropriately according to the patient's symptoms, etc., but the fusion protein of anti-TfR antibody and physiologically active protein with the EC 50 value described in the previous paragraph
  • the dose can be safely increased or decreased over a wide range without inducing anemia symptoms.
  • the administration interval of the drug there is no particular limitation on the administration interval of the drug, and for example, when the concentration of the fusion protein in the blood falls below a predetermined level, the drug can be administered again.
  • the concentration below a predetermined level means that the concentration of the fusion protein is 5% or less compared to the blood concentration measured on any day after 1 week to 10 years after administration, for example, 3 to 6 weeks after administration. , 10% or less, 20% or less, or 50% or less.
  • the administration frequency can be limited to one time.
  • the binding activity of the fusion protein to TfR is By limiting the dose per dose, in addition to the above-mentioned anti-TfR antibody and physiologically active protein fusion protein in general, the 50% effect measured by the ELISA method described in Example 15 Concentration ( EC50 ) values of less than 3 nM, such as 0.5-3 nM, 0.8-3 nM, or 1-3 nM, are also possible.
  • the dose per dose should not exceed 1.0 x 10 13 vg/kg, preferably 7.5 x 10 12 vg/kg or less, more preferably 6.0 x 10 12 vg/kg or less, and even more preferably is adjusted to 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg or less, 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg or less, or 2.5 ⁇ 10 12 vg/kg or less.
  • the dose per dose is 1.0 ⁇ 10 10 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg 10 10 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 x 10 11 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 5.0 x 10 11 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 x 10 10 - 5.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 10 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 10 to 2.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0
  • the TfR-binding activity of the fusion protein is, in addition to the above, an EC 50 value of less than 3 nM as measured by the ELISA method described in Example 15, e.g. It can also be 0.5-3 nM, 0.8-3 nM, or 1-3 nM (0.5-4 nM, 0.8-4 nM, or 1-4 nM).
  • the dose per dose should not exceed 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg, preferably 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg or less, more preferably 6.0 ⁇ 10 12 vg/kg or less, More preferably 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg or less, still more preferably 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg or less, or 2.5 ⁇ 10 12 vg/kg or less.
  • the dose per dose is 1.0 ⁇ 10 10 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg 10 10 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 x 10 11 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 5.0 x 10 11 - 6.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 x 10 10 - 5.0 x 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 5.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 10 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 11 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg kg, 5.0 ⁇ 10 11 to 3.0 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 10 to 2.5 ⁇ 10 12 vg/kg, 1.0
  • the dosage per dose is preferably 7.5 ⁇ 10 12 vg / kg or less, more preferably 6.0 ⁇ 10 12 vg / kg or less, more preferably 5.0 ⁇ 10 12 vg / kg or less, still more preferably 3.0 ⁇ 10 12 vg / kg or less, 2.5 ⁇ 10 12 vg / kg or less, etc.
  • EC50 values for proteins with TfR of 0.5 nM or greater, 0.8 nM or greater, or 1 nM or greater can also be used.
  • the EC50 value is preferably 0.5 nM to 1 ⁇ M, more preferably 0.5 to 100 nM, even more preferably 0.5 to 10 nM, even more preferably 0.5 to 5 nM, for example 0.5 to 4 nM, 0.5-3 nM, 0.8-1 ⁇ M, 0.8-500 nM, 0.8-100 nM, 0.8-10 nM, 0.8-5 nM, 0.8-4 nM, 0.8-3 nM, 1.0 nM-1 ⁇ M, 1.0 ⁇ 500 nM, 1.0-100 nM, 1.0-10 nM, 1.0-5 nM, 1.0-4 nM, 1.0-3 nM, 1 nM-5 ⁇ M, 1 nM-1 ⁇ M, 1-500 nM, 1-5 nM 200 nM, 1-100 nM, 1 nM-5 ⁇ M, 1 nM-1 ⁇ M, 1-500 nM, 1-200 nM, or 1-100 nM,
  • the concentration below a predetermined level means that the concentration of the fusion protein is 5% or less compared to the blood concentration measured on any day after 1 week to 10 years after administration, for example, 3 to 6 weeks after administration. , 10% or less, 20% or less, or 50% or less.
  • the administration frequency can be limited to one time.
  • the above dosage when using the gene encoding the anti-TfR antibody and human I2S fusion protein is the fusion protein of the anti-TfR antibody and other physiologically active substances, such as the anti-TfR antibody and other lysosomal enzymes It can also be applied to fusion proteins.
  • a lentivirus is a virus belonging to the genus Lentivirus in the subfamily Orthoretrovirinae, one of the subfamilies of the Retroviridae family, and has a single-stranded (+)-strand RNA genome (ssRNA).
  • the lentivirus genome consists of essential genes gag (regions encoding structural proteins including capsid proteins), pol (regions encoding enzymes including reverse transcriptase), and env (envelope proteins necessary for binding to host cells). coding region), which are flanked by two LTRs (5'LTR and 3'LTR).
  • the lentiviral genome contains an auxiliary gene, Rev (a region encoding a protein that binds to the RRE (rev responsive element) present in the viral RNA and transports the viral RNA from the nucleus to the cytoplasm). ), tat (a region encoding a protein that binds to TAR in the 5′ LTR and increases the promoter activity of LTR), and vif, vpr, vpu, nef, and the like.
  • Rev a region encoding a protein that binds to the RRE (rev responsive element) present in the viral RNA and transports the viral RNA from the nucleus to the cytoplasm.
  • tat a region encoding a protein that binds to TAR in the 5′ LTR and increases the promoter activity of LTR
  • vif, vpr, vpu, nef and the like.
  • a lentivirus is an enveloped virus that infects cells by fusing the envelope with the cell membrane.
  • lentivirus is an RNA virus, and reverse transcriptase is present in virions. After lentivirus infection, single-stranded plus-stranded DNA is replicated from the (+)-strand RNA genome by reverse transcriptase, and double-stranded DNA is further synthesized. From this double-stranded DNA, proteins that are the constituents of virions are expressed, and (+)-strand RNA genomes are packaged into them, resulting in proliferation of virions.
  • lentiviral vector systems include, but are not limited to, those developed based on the genome of HIV-1, a type of lentivirus.
  • the first-generation lentiviral vector system consists of three types of plasmids: packaging plasmid, Env plasmid, and introduction plasmid.
  • the packaging plasmid has the gag and pol genes under the control of the CMV promoter and the like.
  • the Env plasmid carries the env gene under control of the CMV promoter.
  • the introduction plasmid has a 5'LTR, an RRE, a gene encoding a desired protein under the control of the CMV promoter, and a 3'LTR.
  • a recombinant virion is produced in which a nucleic acid molecule containing a foreign gene is packaged in a capsid protein between the first ITR and the second ITR.
  • the packaging plasmid of the first generation lentiviral vector system also contains the virus-derived rev, tat, vif, vpr, vpu, and nef auxiliary genes.
  • the desired protein in the present invention is a fusion protein of an anti-TfR antibody and a physiologically active protein.
  • a promoter other than the CMV promoter such as the SV40 early promoter, the human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, the human ubiquitin C promoter, the retrovirus Rous sarcoma virus LTR promoter, can be used to control the gene encoding the desired protein. , dihydrofolate reductase promoter, beta-actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse albumin promoter, human albumin promoter, and human alpha-1 antitrypsin promoter.
  • EF-1 ⁇ human elongation factor-1 ⁇
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • a synthetic promoter (mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 containing a mouse albumin promoter downstream of the mouse ⁇ -fetoprotein enhancer can be used.
  • the second-generation lentiviral vector system like the first-generation, consists of three types of plasmids: packaging plasmid, Env plasmid (envelope plasmid), and introduction plasmid.
  • packaging plasmid plasmid
  • Env plasmid envelope plasmid
  • introduction plasmid plasmid
  • the auxiliary genes vif, vpr, vpu, and nef which are not essential genes, have been deleted from the packaging plasmid.
  • the third-generation lentiviral vector system consists of four types of plasmids: packaging plasmid, Env plasmid (envelope plasmid), Rev plasmid, and introduction plasmid.
  • packaging plasmid envelope plasmid
  • Env plasmid envelope plasmid
  • Rev plasmid Rev plasmid
  • introduction plasmid introduction plasmid.
  • the rev that was in the packaging plasmid in the second generation was made independent and used as the Rev plasmid.
  • tat has been deleted from the packaging plasmid.
  • the TAR within the 5'LTR of the introduced plasmid has been replaced with the CMV promoter.
  • recombinant lentiviral virions are infectious, they can be used to introduce foreign genes into cells, tissues, or living organisms.
  • the exogenous gene in the present invention is a gene encoding a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody and a physiologically active protein. A fusion protein is expressed from this gene in cells or the like into which the gene has been introduced.
  • a retrovirus has a single-stranded (+)-strand RNA genome (ssRNA).
  • the viral genome contains gag (encodes structural proteins including capsid proteins), pol (encodes enzymes including reverse transcriptase), env (encodes envelope proteins necessary for binding to host cells), and packaging signals ( ⁇ ) genes are flanked by two long terminal repeats (LTR, 5'LTR and 3'LTR).
  • LTR long terminal repeats
  • 5'LTR and 3'LTR 3'LTR
  • Retroviral vector systems have been developed mainly based on the murine leukemia virus, and the viral genome is divided in order to lose the self-replicating ability while maintaining its infectivity for the purpose of eliminating pathogenicity and increasing safety.
  • the first generation retroviral vector system consists of a packaging plasmid (viral genome excluding the packaging signal) and an introduction plasmid (packaging signal, part of gag, both ends of the foreign gene flanked by 5'LTR and 3'LTR things). Therefore, when homologous recombination occurs at the gag sequence portion that is common to both the packaging plasmid and the transfer plasmid, a retrovirus capable of self-replication, that is, a replication competent (RC) virus emerges.
  • RC replication competent
  • the 3' LTR of the first-generation packaging plasmid is replaced with a poly(A) addition signal.
  • the third generation consists of three plasmids, and the second generation packaging plasmid is further divided into a gag/pol-encoding plasmid and an env-encoding plasmid.
  • homologous recombination must occur simultaneously at three sites in order to generate an RC virus, and the probability of occurrence is extremely low, further enhancing safety.
  • these packaging plasmids and introduction plasmids are first introduced into host cells by a general transfection method. Then, the 5'LTR and 3'LTR, and the region containing the gene encoding the desired protein placed between these two LTRs are replicated in the host cell, and the resulting single-stranded (+)-strand RNA is retroposited. Packaged into viral capsid proteins to form recombinant retroviral virions.
  • This recombinant retroviral virion is infectious and can be used to introduce foreign genes into a cell, tissue, or organism.
  • the exogenous gene in the present invention is a gene encoding a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody and a physiologically active protein. A fusion protein is expressed from this gene in cells into which the gene has been introduced.
  • the nucleic acid molecule can be encapsulated in a liposome, Lipid Nanoparticle (LNP), or the like.
  • Liposomes are spherical vesicles with a lipid bilayer, and are mainly composed of phospholipids, especially phosphatidylcholine.
  • the liposomes are not limited to this, and may contain other lipids such as egg yolk phosphatidylethanolamine as long as they form a lipid bilayer. Since cell membranes are mainly composed of phospholipid bilayer membranes, liposomes have the advantage of excellent biocompatibility.
  • Lipid nanoparticles are lipid-based particles with a diameter of 10 nm to 1000 nm, typically less than about 200 nm, capable of encapsulating hydrophobic (lipophilic) molecules, triglycerides, diglycerides, Biocompatible lipids such as monoglycerides, fatty acids, and steroids are the main constituents.
  • Liposomes, lipid nanoparticles, etc. encapsulating the nucleic acid molecule of the present invention can be used to introduce a fusion protein gene of a ligand and a physiologically active protein into cells, tissues, or the body. A fusion protein is expressed from this gene in cells into which the gene has been introduced.
  • DDS drug delivery systems
  • nucleic acid molecules introduced into cells, tissues, or living organisms in the form of plasmids, in the form of encapsulation in recombinant virus virions, or in the form of encapsulation in liposomes, lipid nanoparticles, etc. is described below. Examples are given in (1) to (6). However, the behavior of nucleic acid molecules is not limited to these.
  • a nucleic acid molecule is a single (+) strand RNA, and when introduced into a cell, a gene encoding a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody contained in the nucleic acid molecule and a physiologically active protein is generated. Translated to express the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule is a single-stranded (+)-strand RNA, and when introduced into a cell, the nucleic acid molecule is reverse transcribed to become a single-stranded (+)-strand DNA, and then this DNA is transcribed. , is translated to express the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule is single-stranded (+)-strand RNA or (-)-strand RNA, and when introduced into a cell, the nucleic acid molecule is reverse transcribed into double-stranded DNA, and then this DNA is It is transcribed and translated to express the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule is single-stranded (+)-strand or (-) RNA, and when introduced into a cell, the nucleic acid molecule is reverse transcribed into double-stranded DNA, which is then transformed into host cells. It is integrated into the genome by random recombination or homologous recombination with the genome, and the integrated DNA is transcribed and translated to express the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule is single-stranded (+)-strand DNA, and when introduced into a cell, the nucleic acid molecule is transcribed and translated to express the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule is double-stranded DNA, and when introduced into a cell, the nucleic acid molecule is transcribed and translated to express the fusion protein.
  • Nucleic acid molecules in the form of plasmids, encapsulated in recombinant virus virions, or encapsulated in liposomes, lipid nanoparticles, etc. can be introduced into cells, tissues, or living organisms.
  • the nucleic acid molecule When the nucleic acid molecule is introduced into a living body, the nucleic acid molecule is pharmaceutically acceptable in the form of a plasmid, a form encapsulated in a recombinant virus virion, or a form encapsulated in a liposome, lipid nanoparticle, etc. It is administered with excipients, ie, as a pharmaceutical composition, by parenteral means such as subcutaneous injection, intramuscular injection, and intravenous injection.
  • Such pharmaceutical compositions are provided to medical institutions, for example, as aqueous solutions in vials, or as pre-filled syringes or cartridges of aqueous solutions prefilled in syringes.
  • Nucleic acid molecules in the form of plasmids, encapsulated in recombinant virus virions, or encapsulated in liposomes, lipid nanoparticles, etc. can be used as various medicines.
  • Use of the nucleic acid molecule when the fusion protein encoded by the nucleic acid molecule specifically recognizes the transferrin receptor and the physiologically active protein is a human lysosomal enzyme will be described in detail below.
  • the human lysosomal enzyme is ⁇ -L-iduronidase, acid ⁇ as a therapeutic agent for central nervous system disorders in Hurler syndrome or Hurler-Scheie syndrome, and when it is iduronic acid-2-sulfatase, as a therapeutic agent for central nervous system disorders in Hunter syndrome - Glucosidase as a therapeutic agent for central nervous system disorders in Pompe disease, glucocerebrosidase as a central nervous system therapeutic agent for Gaucher disease, and ⁇ -galactosidase in GM1-gangliosidosis types 1-3
  • GM2-activating protein as a therapeutic agent in GM2-gangliosidosis AB variant, in the case of ⁇ -hexosaminidase A
  • the central nervous system in Sandhoff's disease and Tissach's disease As a therapeutic agent for disorders, as a therapeutic agent for central nervous system disorders in Sandhoff's disease in the case of ⁇
  • aspartylglucosaminuria as a central nervous disorder therapeutic agent, in the case of palmitoyl protein thioesterase-1 (PPT-1), as a central nervous disorder therapeutic agent in neuronal ceroid lipofuscinosis or Santavuori-Haltia disease
  • CLN1 as a therapeutic agent for central nervous system disorders in neuronal ceroid lipofuscinosis or Jansky-Bielschowsky disease in the case of peptidyl peptidase-1 (TPP-1)
  • TPP-1 peptidyl peptidase-1
  • CLN2 as a therapeutic agent for central nervous system disorders in hyaluronidase deficiency in the case of hyaluronidase-1 and CLN2
  • TPP-1 peptidyl peptidase-1
  • CLN2 can be used as a therapeutic agent for central nervous system disorders in Batten's disease.
  • the type of cell is not particularly limited. , pancreatic stem cells, neural stem cells, and iPS cells.
  • Cells into which nucleic acid molecules have been introduced express the fusion protein, which can be transplanted into patients for therapeutic purposes.
  • cells introduced with a nucleic acid molecule in which the physiologically active protein is a human lysosomal enzyme can be used for the above-mentioned uses.
  • Example 1 Construction of pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S vector From the 5' side, ClaI site, mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, mouse anti-mouse transferrin receptor single chain A conjugate in which human iduronate-2-sulfatase (hI2S) is bound to the C-terminal side of an antibody (mouse anti-mTfRscFv antibody) via a linker sequence shown in SEQ ID NO: 4, and has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19
  • SEQ ID NO: 18 A DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, which includes the gene encoding the compound (mscFv-GS3-hI2S), the bovine growth hormone poly A sequence, and the BglII site, was synthesized.
  • This DNA fragment was digested with ClaI and BglII.
  • a pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with ClaI and BglII, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the vector.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S vector (Fig. 1).
  • the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S vector consists of functional equivalents of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin /MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), gene encoding mscFv-GS3-hI2S (SEQ ID NO: 20), bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), functional equivalent of a second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8).
  • the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S vector contains an ampicillin resistance gene and an origin of replication (ColE1 ori).
  • the mouse anti-mTfR scFv antibody is obtained by binding the mouse anti-mTfR light chain variable region via a linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 to the C-terminus of the mouse anti-mTfR heavy chain variable region.
  • Example 2 Construction of pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2S vector From the 5' side, ClaI site, mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, two CDRs of mscFv heavy chain mouse anti-mouse transferrin receptor single-chain antibody (mouse anti-mTfRscFv antibody 2) in which amino acid substitutions were introduced at two positions in the CDR of the light chain and hI2S via the linker sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the C-terminal side A gene encoding a conjugate having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 (mscFv2-GS3-hI2S), a bovine growth hormone poly A sequence, and a base shown in SEQ ID NO: 21 containing a BglII site A DNA fragment containing the sequence was synthesized.
  • SEQ ID NO: 22 mscFv2-
  • This DNA fragment was digested with ClaI and BglII.
  • a pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with ClaI and BglII, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the vector.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2S vector (Fig. 2).
  • the pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2S vector consists of functional equivalents of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin /MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), gene encoding mscFv2-GS3-hI2S (SEQ ID NO: 23), bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), functional equivalent of a second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8). Additionally, the pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2S vector contains an ampicillin resistance gene and an origin of replication (ColE1 ori).
  • Example 3 Construction of pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector From the 5' side, ClaI site, mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, mouse anti-mTfRscFv antibody 2 at the C-terminus of hI2S A gene encoding a bound conjugate (hI2S-mscFv2) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, a bovine growth hormone poly A sequence, and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 containing a BglII site A DNA fragment containing was synthesized.
  • hI2S-mscFv2 vector From the 5' side, ClaI site, mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, mouse anti-mTfRscFv antibody 2 at the C-terminus of
  • This DNA fragment was digested with ClaI and BglII.
  • a pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with ClaI and BglII, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the vector.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector (Fig. 3).
  • the pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector consists of functional equivalents of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin/MVM Chimeric intron (SEQ ID NO: 10), gene encoding hI2S-mscFv2 (SEQ ID NO: 26), bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), functional equivalent of second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8) have a structure.
  • the pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector contains an ampicillin resistance gene and an origin of replication (ColE1 ori).
  • Example 4 Construction of pAAV-mMAP-hI2S vector From the 5' side, ClaI site, mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, hI2S having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14
  • a DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 containing the encoding gene, bovine growth hormone poly A sequence, and BglII site was synthesized. This DNA fragment was digested with ClaI and BglII.
  • a pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with ClaI and BglII, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the vector.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-hI2S vector (Fig. 4).
  • the pAAV-mMAP-hI2S vector consists of, in order from upstream, the functional equivalent of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), a gene encoding hI2S (SEQ ID NO: 28), a bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), and a second AAV-ITR functional equivalent (SEQ ID NO: 8).
  • the pAAV-mMAP-hI2S vector contains an ampicillin resistance gene and an origin of replication (ColE1 ori).
  • pR2(mod)C6 vector From the 5' side, AfeI site, RsrII site, BsrGI site, AvrII site, ampicillin resistance gene, replication origin (ColE1 ori), RsrII site, AAV2 Rep region.
  • a DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 containing the ' portion (including the p5 promoter) and the SacII site was synthesized. This DNA fragment was digested with AfeI and SacII.
  • a pRC6 vector (Takara Bio Inc.) was digested with AfeI and SacII, and the above-mentioned restricted synthetic gene was inserted therein. The resulting plasmid was designated as pR2(mod)C6 vector.
  • pR2(mod)C8 vector From the 5' side, it is represented by SEQ ID NO: 30 containing the HindIII site, the 3' portion of the AAV2 Rep region, the AAV8 Cap region, the p5 promoter, the RsrII site, and the BsrGI site.
  • a DNA fragment containing the base sequence was synthesized. This DNA fragment was digested with HindIII and BsrGI.
  • the pR2(mod)C6 vector was digested with HindIII and BsrGI, and the synthetic gene treated with the above restriction enzymes was inserted into it. The obtained plasmid was used as the pR2(mod)C8 vector (Fig. 5).
  • HEK293 cells a cell line derived from human embryonic kidney cells, were used as host cells.
  • HEK293 cells were seeded in 10-layer cell stack chambers (Corning) at 1.59 x 10 8 per cell stack chamber and incubated in DMEM medium containing 10% FBS (Thermo Fisher Scientific) at 37°C in the presence of 5% CO 2 for 3 hours. cultured for days.
  • pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S vector
  • pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2S vector
  • pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector
  • pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 vector
  • pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-hI2S vector.
  • Each solution contained equimolar concentrations of the three plasmids, had a total DNA concentration of 1.0 mg/mL, and was adjusted to a total volume of 2.2 mL.
  • After 3 days of culture remove all the culture supernatant from the 10-layer cell stack chamber, add 1.0 L of the total transfection solution, and culture for 3 days at 37°C in the presence of 5% CO 2 to generate rAAV virions. was produced.
  • rAAV-mscFv-GS3-hI2S Part of the rAAV virions produced in the host cells is released into the culture supernatant and part remains inside the host cells.
  • the resulting rAAV virions were named rAAV-mscFv-GS3-hI2S, rAAV-mscFv2-GS3-hI2S, rAAV-hI2S-mscFv2, and rAAV-hI2S, respectively.
  • rAAV-mscFv-GS3-hI2S is expected to express mscFv-GS3-hI2S when cells are infected, and rAAV-mscFv2-GS3-hI2S is expected to express It is expected to express mscFv2-GS3-hI2S, rAAV-hI2S-mscFv2 is expected to express hI2S-mscFv2 when cells are infected, and rAAV-hI2S is expected to infect cells It is expected to express hI2S when induced.
  • Example 8 Cell thawing and removal of free nucleic acids After completion of the culture in Example 7, 0.5 M HEPES, 20 mM MgCl 2 , 10% (w/v) polysorbate in a one-ninth volume of each cell culture medium was added. An aqueous solution containing 20 was added, and benzonase (Merck), an endonuclease, was added to a concentration of 50 U/mL and mixed to uniformly disperse the solution in the cell stack. Let stand for 30 minutes. After that, the solution was transferred from the cell stack to a bottle and stirred at room temperature for 3 hours with a stirrer and stirrer. Then, a 5M NaCl aqueous solution containing 10% (w/v) sucrose, which is 1/9 of the liquid volume, was added and stirred to obtain a cell lysate.
  • benzonase benzonase
  • Example 9 Preparation of affinity step loading solution
  • Each cell lysate obtained in Example 8 was equally divided into 1000 mL flat-bottom centrifuge containers, and centrifuged at 3000 in a Sorvall LYNX 6000 large-capacity high-speed refrigerated centrifuge (Thermo Fisher Scientific). xg, 4°C, and centrifuged for 20 minutes. The centrifugation supernatant was filtered using a Nalgene Rapid-Flow PES filter unit (Thermo Fisher Scientific) with a pore size of 0.2 ⁇ m to obtain a rAAV virion-containing cell lysate.
  • a 20 mmol/L Tris buffer solution (pH 7.5) containing 2 mmol/L MgCl 2 and 2000 mmol/L arginine in a quarter volume was added to this, and this was used as the affinity step loading solution.
  • Example 10 Chromatographic purification step using affinity resin for rAAV virions Using 20 mmol/L Tris buffer (pH 7.5) containing 2 mmol/L MgCl 2 and 150 mmol/L NaCl, POROS Capture Select A column (diameter: 1.6 cm, height: 10 cm (column volume: about 20 mL)) packed with AAVX resin (Thermo Fisher Scientific) was equilibrated. Each affinity step loading solution obtained in Example 9 was passed through the column at a flow rate of 5 mL/min to adsorb rAAV virions to the resin.
  • Tris buffer pH 7.5
  • AAVX resin Thermo Fisher Scientific
  • Example 11 Concentration process of rAAV virions by ultrafiltration membrane Spectrum MicroKros Hollow fiber Modules 100 kDa equilibrated with 20 mmol/L Tris buffer (pH 7.5) containing 2 mmol/L MgCl 2 and 150 mmol/L NaCl , 75 cm 2 (Repligen), each affinity step elution fraction obtained in Example 10 was concentrated and recovered to about 8 mL by circulating at a flux of 7 L/min/m 2 or less. Next, wash the ultrafiltration membrane twice with 2 mL of 20 mmol/L Tris buffer (pH 7.5) containing 2 mmol/L MgCl 2 and 150 mmol/L NaCl, and add this washing solution to the previously recovered solution. Together, a total of about 12 mL of concentrate was obtained.
  • Example 12 Purification step of rAAV virions by ultracentrifugation using iodixanol PBS-MK buffer (136.9 mmol/L sodium chloride, 28.2 A 20 mmol/L sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing mmol/L potassium chloride and 1 mmol/L magnesium chloride was added to prepare a 45% iodixanol solution. Also, PBS-MK buffer was added to 60% iodixanol to prepare a 25% iodixanol solution. Furthermore, 1M NaCl/PBS-MK buffer (PBS-MK buffer containing 1 mol/L sodium chloride) was added to 60% iodixanol to prepare a 15% iodixanol solution.
  • PBS-MK buffer 136.9 mmol/L sodium chloride, 28.2 A 20 mmol/L sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing mmol/L potassium chloride and 1
  • the inlet of the tube was closed with a cordless tube topper sealer kit (Beckman Coulter), placed in the 70Ti rotor of the Optima XPN ultracentrifuge (Beckman Coulter), and centrifuged at a rotation speed of 63000 rpm (408500 ⁇ g) for 2 hours. Centrifuged for hours. Connect a Tygon E-LFL tube with a needle to the bottom of the tube after centrifugation using a fraction recovery system (Beckman Coulter), insert an 18 G syringe needle into the top of the tube to make an air hole, and then apply a peristaltic pump. 0.5 mL of the solvent was fractionated from the bottom of the tube by . The 9th to 13th or 10th to 14th fractions were collected to obtain fractions containing purified rAAV virions.
  • Example 13 Concentration of rAAV virions by ultrafiltration membrane and buffer exchange step and 20 mmol/L sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 2.7 mmol/L potassium chloride and 0.001% F-68) and equilibrated with 350 mmol/L NaCl/PBS buffer. It was concentrated to about 15 mL by circulating it through Spectrum MicroKros Hollow fiber Modules 100 kDa, 75 cm 2 (Repligen) at a flow rate of 7 L/min/m 2 or less. 10 DV buffer exchanges were then performed with 350 mmol/L NaCl/PBS buffer.
  • Example 14 Measurement of rAAV genome content in rAAV virion solution
  • the viral genome content in the rAAV virion solution obtained in Example 13 was measured by the droplet digital PCR method. The measurement method will be described in detail below.
  • each DNaseI-treated rAAV virion solution appropriately with DNA suspension buffer (10 mM Tris buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 100 ⁇ g/mL polyA, and 0.001% F-68). bottom.
  • DNA suspension buffer 10 mM Tris buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 100 ⁇ g/mL polyA, and 0.001% F-68).
  • DNA suspension buffer 10 mM Tris buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 100 ⁇ g/mL polyA, and 0.001% F-68). bottom.
  • the rAAV virion diluted solution was incubated at 95° C. for 10 minutes to thermally decay the rAAV virions to prepare a sample solution for droplet digital PCR.
  • 1.0 ⁇ M forward primer (primer SI-3, SEQ ID NO: 36), 1.0 ⁇ M reverse primer (primer SI-4, SEQ ID NO: 37), and 0.25 ⁇ M probe (probe SI-2, 5' of SEQ ID NO: 38
  • primer SI-3 SEQ ID NO: 36
  • reverse primer primer SI-4
  • 0.25 ⁇ M probe probe SI-2, 5' of SEQ ID NO: 38
  • This droplet was subjected to a QX200 Droplet Digital PCR system (BioRad). PCR conditions are denaturation reaction (95 ° C, 10 minutes), 40 cycles of 3-step PCR (95 ° C, 30 seconds ⁇ 60 ° C, 60 seconds ⁇ 72 ° C, 15 seconds), PCR enzyme inactivation treatment (98 ° C , 10 minutes). Both FAM/HEX-positive droplets were defined as rAAV-positive droplets, and the amount of rAAV genome (vg: viral genome) was determined using QuantaSoft Version 1.7 (BioRad). The DNA regions amplified in this PCR are bovine growth hormone polyA and internal regions of ITR.
  • Example 15 Evaluation of mouse TfR binding activity of conjugates of mouse anti-mTfRscFv antibodies and hI2S Binding of three types of mouse anti-mTfRscFv antibodies, mscFv-GS3-hI2S, mscFv2-GS3-hI2S, and hI2S-mscFv2, to hI2S
  • Each gene encoding the body was inserted into an expression vector.
  • the resulting expression vectors were introduced into CHO cells to obtain cells for expression of the three types of conjugates.
  • Each of the obtained expression cells was cultured to express the conjugate as a recombinant protein, and each recombinant protein was recovered from the culture supernatant.
  • the ELISA method was generally performed by the following method. Into each well of a 96-well microtiter plate (Nunc), 0.05 ⁇ g/mL of mouse transferrin receptor extracellular domain having the amino acid sequence from 87th to 763rd of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 was added.
  • TBS-T Tween20
  • TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase (Promega) was added to each well, and the wells were allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes. After adding 100 ⁇ L of stop solution (1N hydrochloric acid) to each well, the absorbance of each well at 450 nm was measured using a plate reader (SpectraMax iD3, MOLECULAR DEVICES). EC50 was calculated from the measured values obtained, and the binding activity of each protein to mTfR was evaluated.
  • the EC50s of mscFv-GS3-hI2S, mscFv2-GS3-hI2S, and hI2S-mscFv2 against mouse TfR were 2.4 nM, 13.2 nM, and 96.7 nM, respectively.
  • Example 16 Efficacy evaluation of each rAAV virion using I2S-KO mice Efficacy evaluation of each rAAV administered to a living body was performed using I2S gene knockout mice (I2S-KO mice). I2S-KO mice used were 14- to 15-week-old male mice (at the start of administration).
  • rAAV-mscFv-GS3-hI2S As rAAV virions, rAAV-mscFv-GS3-hI2S, rAAV-mscFv2-GS3-hI2S, rAAV-hI2S-mscFv2, and rAAV-hI2S were added to male I2S-KO mice at 1.0 ⁇ 10 11 vg/kg and 1.0 ⁇ 10 vg/kg, respectively.
  • Physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) was administered to the normal control group and the disease control group.
  • cardiac blood sampling was performed by thoracotomy under triple anesthesia of Betorfal (Meiji Seika Pharma), Midazolam (Sandoz), and Domitol (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
  • the blood was collected in an EDTA-2K-coated blood collection tube (Capiject, Terumo), treated as anticoagulated blood, and then subjected to hemoglobin concentration measurement.
  • the rest of the anticoagulated blood was left on ice and then centrifuged (2000 ⁇ g, 20 minutes, 4°C) to collect plasma.
  • the mouse was perfused with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), and the brain was excised.
  • a portion of the brain tissue was taken for determination of heparan sulfate in the brain tissue, quickly immersed in liquid nitrogen, and rapidly frozen. Separately, after measuring the wet weight of a part of the brain tissue, it was quickly immersed in liquid nitrogen and rapidly frozen, and the frozen brain tissue was treated with RIPA Buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 0.025% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich). company) and centrifuged to collect the supernatant.
  • Example 17 Measurement of rAAV-derived protein concentration in plasma and brain tissue rAAV-mscFv-GS3-hI2S and rAAV contained in the plasma prepared in Example 16 and the supernatant obtained by homogenizing brain tissue Each rAAV-derived protein of -mscFv2-GS3-hI2S, rAAV-hI2S-mscFv2, and rAAV-hI2S was quantified. Quantification was generally carried out by the following method. 150 ⁇ L of Superblock Blocking Buffer in PBS (Thermo Fisher Scientific) was added to each well of a Streptavidin Gold plate (Meso Scale Diagnostics) and shaken for 1 hour or more to block the plate.
  • PBS Thermo Fisher Scientific
  • each calibration containing known concentrations of mscFv-GS3-hI2S, hI2S-mscFv2, or hI2S obtained by expressing in CHO cells by a conventional method in a mixed solution of biotinylated anti-hI2S monoclonal antibody and SULFO-conjugated anti-hI2S monoclonal antibody A linear standard sample and each test sample were added and shaken for 1 hour to prepare an antibody reaction solution.
  • the anti-hI2S monoclonal antibody was obtained by culturing an anti-hI2S-producing hybridoma prepared by a conventional method using splenocytes obtained from a mouse immunized with hI2S having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:14.
  • One of the obtained monoclonal antibodies was modified using Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo Laboratories) according to the attached protocol to obtain a biotinylated anti-hI2S monoclonal antibody.
  • Another one of the obtained monoclonal antibodies was modified using MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester (Mesoscale Diagnostics) according to the attached protocol to obtain a SULFO-modified anti-hI2S monoclonal antibody.
  • MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester Mesoscale Diagnostics
  • 25 ⁇ L of the antibody reaction solution was added to each well and shaken for 1 hour or more.
  • the antibody reaction solution was removed, and after washing with PBST, 150 ⁇ L of 4X Read Buffer (Meso Scale Diagnostics) diluted with water for injection (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) was added .
  • Fig. 6 shows the measurement results of the above rAAV-derived protein concentration in plasma.
  • the concentration of each rAAV-derived protein in plasma increased dose-dependently in all rAAV virion-administered groups. In both groups, it was confirmed that the expression level was maintained at the same level or increased slightly at 1 week and 6 weeks after administration.
  • the above results indicate that the rAAV virions injected intravenously into mice were taken up into cells, and at least the rAAV-derived proteins that were expressed by transcribing and translating the genes encoded by rAAV in the cells were released into the blood. indicates that
  • FIG. 7 shows the measurement results of rAAV-derived protein concentrations in brain tissue.
  • Expression protein levels in brain tissue increased dose-dependently in all rAAV virion-administered groups.
  • the brain tissue expression levels of mscFv-GS3-hI2S in the rAAV-mscFv-GS3-hI2S administration group were significantly higher than those of the same dose groups of rAAV-mscFv2-GS3-hI2S, rAAV-hI2S-mscFv2, and rAAV-hI2S. , and its concentration did not change significantly between 1 and 6 weeks after administration.
  • brain tissue concentrations increased by approximately 3.4 times and approximately 2.1 times, respectively, from 1 week to 6 weeks after administration.
  • the brain tissue concentration of the rAAV-hI2S group administered 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg did not change significantly between 1 and 6 weeks after administration, and was less than half the brain tissue concentration of the other groups between the same doses. Met.
  • Example 18 Quantification of heparan sulfate in brain tissue Quantification of heparan sulfate (HS) in the brain was generally performed by the following method. Heparan sulfate is a substrate for enzyme I2S.
  • Solutions (a) to (l) used for the test were prepared by the following procedure.
  • MeCN/water 2 mL of water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) and 18 mL of acetonitrile (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed to obtain MeCN/water.
  • deuterated labeled solvent Under an ice bath, 240 ⁇ L of acetyl chloride (Sigma-Aldrich) was added dropwise to 1.5 mL of methanol-d 4 (Sigma-Aldrich), which was used as a deuterium-labeled solvent.
  • mobile phase A Mobile phase A was a mixture of 475 mL of water for injection and 25 mL of 1 M ammonium formate aqueous solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • mobile phase B A mobile phase B was prepared by mixing acetonitrile and mobile phase A at a ratio of 93:7 (v/v).
  • Heparan sulfate standard stock solution HS standard stock solution
  • heparan sulfate internal standard solution (f) heparan sulfate internal standard solution (HS internal standard solution): 40 ⁇ L of the HS standard stock solution was weighed into a borosilicate screw cap test tube, and the solvent was distilled off under a stream of nitrogen. After adding 400 ⁇ L of deuterium-labeled solvent to the dry matter and stirring, the mixture was allowed to react at 65° C. for 75 minutes to perform deuterated methanol decomposition (methanolysis). After the reaction, the solvent was distilled off under a stream of nitrogen. 500 ⁇ L of MeCN/water was added to the dry matter, and ultrasonication was performed for 30 minutes. This solution was used as a heparan sulfate internal standard solution (HS internal standard solution).
  • This solution was serially diluted with water for injection to prepare solutions containing heparan sulfate at concentrations of 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500 and 5000 ng/mL. 20 ⁇ L of this was weighed out and dispensed into borosilicate screw top test tubes. This solution was used as a calibration curve sample.
  • Tissue Extraction Solution 1 mL of polyoxyethylene (10) octylphenyl ether was added to physiological saline to bring the total volume to 500 mL. This solution was used as a tissue extraction solution.
  • 10% ammonium carbonate solution 5 g of ammonium carbonate was dissolved in 50 mL of water for injection. This solution was used as a 10% ammonium carbonate solution.
  • Example 16 The brain tissue collected in Example 16 was freeze-dried and the dry weight was measured. The freeze-dried tissue was disrupted in a tissue extraction solution, and the supernatant was centrifuged. 20 ⁇ L of this was weighed out and dispensed into a borosilicate screw cap test tube. This was used as a sample solution.
  • LC/MS/MS analysis was performed using a combination of hydrophilic interaction ultra-performance liquid chromatography and a tandem quadrupole mass spectrometer.
  • mass spectrometer MS/MS device
  • QTRAP5500 AB SCIEX
  • Nexera X2 Shimadzu Corporation
  • HPLC device As an LC column, Acquity UPLC TM BEH Amide 1.7 ⁇ m (2.1 ⁇ 150 mm, Waters) was used.
  • Mobile phase A and mobile phase B were used as mobile phases.
  • the column temperature was set at 60°C.
  • the ion source parameters of the MS/MS instrument were set as shown in Table 2 according to the QTRAP5500 (AB SciX) instruction manual.
  • Table 3 shows the MS internal parameters.
  • the calibration curve sample was analyzed by LC/MS/MS, and the peak area (HS detection peak area) on the chromatogram chart corresponding to the product ions derived from heparan sulfate in the calibration curve sample was determined. In addition, the area of the detection peak corresponding to the product ions derived from the HS internal standard solution (HS-IS detection peak area) was obtained.
  • the brain tissue sample solution was analyzed by LC/MS/MS, and the heparan sulfate contained in the sample solution was quantified by interpolating it into the regression equation.
  • FIG. 8 shows the measurement results of HS concentration ( ⁇ g/mg dry weight) in brain tissue.
  • HS concentrations in brain tissue decreased in a dose-dependent manner in all rAAV virion-administered groups.
  • the HS concentration in the groups administered 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg of rAAV-mscFv-GS3-hI2S, rAAV-mscFv2-GS3-hI2S, and rAAV-hI2S-mscFv2 significantly decreased, It showed almost the same value as the normal control group.
  • the HS-reducing effect was also higher in the 1.0 ⁇ 10 12 vg/kg and 1.0 ⁇ 10 11 vg/kg administration groups compared with other rAAV virion dose groups.
  • the above results suggest that following intravenous administration of rAAV virions, the conjugate of the anti-mTfR antibody scFv expressed in the liver and hI2S was distributed in the brain, and the HS that had accumulated in the brain tissue was reduced by the activity of I2S. indicates that the It also indicates that the effect of reducing HS accumulated in the brain tissue persists for at least 6 weeks.
  • Example 19 Measurement of Hemoglobin Concentration in Blood Using the anticoagulated blood obtained in Example 16, the hemoglobin concentration was measured. Hemoglobin concentration was measured by the SLS hemoglobin method using an automatic blood cell counter for research (Procyte Dx Research, Sysmex). Blood hemoglobin concentration is a commonly used index of anemia. The results are shown in FIG.
  • a rAAV virion containing a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and hI2S with an anti-TfR-mediated TfR binding activity (EC 50 ) adjusted to 10 nM or more, for example, 10 to 100 nM is produced. Therefore, a safe therapeutic rAAV virion that does not cause anemia is produced while maintaining a high blood expression level of the fusion protein and reducing HS accumulated in the central nervous system by the enzymatic activity of hI2S. It shows what we can provide.
  • anti-TfR-mediated TfR binding activity is adjusted to 10 nM or more, for example, 10 to 100 nM, encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody and a desired physiologically active protein Safe therapeutic rAAV that does not cause anemia while maintaining a high blood expression level of the fusion protein and exerting the activity of the physiologically active protein in the central nervous system by producing rAAV virions containing the gene for It shows that it can provide virions.
  • the anti-TfR-mediated TfR-binding activity (EC 50 ) is adjusted to 10 nM or less, for example, 0.5-4 nM.
  • EC 50 the anti-TfR-mediated TfR-binding activity
  • rAAV virions containing protein-encoding genes can induce anemia at doses less than 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg, such as 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg This indicates that it can be used as a safe therapeutic rAAV virion that does not cause cancer.
  • Example 21 Construction of pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2S vector
  • ClaI site mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, mouse anti-mouse transferrin receptor single-chain antibody with two amino acid substitutions introduced in the heavy chain CDR of mscFv
  • This DNA fragment was digested with ClaI and BglII.
  • a pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with ClaI and BglII, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the vector.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2S vector.
  • the pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2S vector consists of functional equivalents of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin /MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), gene encoding mscFv3-GS3-hI2S, bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), functional equivalent of second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8) have
  • the pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2S vector generally has a structure in which the gene encoding I2S in the vector map shown in FIG. 4 is replaced with the gene encoding mscFv3-GS3-hI2S.
  • HEK293 cells a cell line derived from human embryonic kidney cells, were used as host cells.
  • HEK293 cells were seeded in 10-layer cell stack chambers (Corning) at 1.59 x 10 8 per cell stack chamber and incubated in DMEM medium containing 10% FBS (Thermo Fisher Scientific) at 37°C in the presence of 5% CO 2 for 3 hours. cultured for days.
  • a solution containing the following plasmids was prepared as a DNA solution for transfection; pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector constructed in Example 6, and pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2S vector constructed in Example 21.
  • the solution contains the three plasmids at equimolar concentrations, the total DNA concentration is 1.0 mg/mL, and the total volume is adjusted to 2.2 mL.
  • After 3 days of culture remove all the culture supernatant from the 10-layer cell stack chamber, add 1.0 L of the total transfection solution, and culture for 3 days at 37°C in the presence of 5% CO 2 to generate rAAV virions. was produced. Part of the rAAV virions produced in the host cells is released into the culture supernatant and part remains inside the host cells.
  • rAAV-mscFv3-GS3-hI2S The resulting rAAV virion was named rAAV-mscFv3-GS3-hI2S.
  • rAAV-mscFv3-GS3-hI2S is expected to express mscFv3-GS3-hI2S when cells are infected.
  • Example 23 Preparation of rAAV virion solution containing rAAV-mscFv3-GS3-hI2S and measurement of rAAV genome amount After completion of the culture in Example 22, the rAAV- A rAAV virion solution containing mscFv3-GS3-hI2S (rAAV-mscFv3-GS3-hI2S solution) was prepared. In addition, the amount of rAAV genome contained in the rAAV virion solution was measured by the method described in Example 14.
  • Example 24 Evaluation of mTfR binding activity of mscFv3-GS3-hI2S
  • the binding activity to mouse transferrin receptor was measured by ELISA.
  • the ELISA method was generally performed by the following method. Into each well of a 96-well microtiter plate (Nunc), 0.05 ⁇ g/mL of mouse transferrin receptor extracellular domain having the amino acid sequence from 87th to 763rd of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 was added.
  • TBS-T After washing three times with TBS-T, add 100 ⁇ L of HRP-labeled anti-mouse IgG polyclonal antibody (Bethyl) diluted to 50 ng/mL with TBS containing 0.1% BSA and 0.05% Tween20 to each well. , the plate was allowed to stand at room temperature for at least 1 hour. After washing each well three times with TBS-T, 50 ⁇ L of a substrate solution for color development, TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase (Promega) was added to each well, and the wells were allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG polyclonal antibody Bethyl
  • TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase Promega
  • Example 25 Efficacy evaluation of rAAV-mscFv3-GS3-hI2S using I2S-KO mice. Efficacy evaluation when each rAAV was administered to the living body was performed using I2S gene knockout mice (I2S-KO mice). . I2S-KO mice used were 14- to 15-week-old male mice (at the start of administration). As rAAV virions, rAAV-mscFv3-GS3-hI2S was administered to male I2S-KO mice in single tail vein doses at doses of 1.0 ⁇ 10 11 vg/kg, 1.0 ⁇ 10 12 vg/kg, and 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg.
  • N 5 or 6 in each group.
  • Physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) was administered to the normal control group and the disease control group.
  • cerebrospinal fluid was collected from the cisterna magna of the mice under triple anesthesia with betorfal (Meiji Seika Pharma), midazolam (Sandoz), and domitol (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
  • a thoracotomy was performed and cardiac blood sampling was performed.
  • the blood was collected in an EDTA-2K-coated blood collection tube (Capiject, Terumo), treated as anticoagulated blood, and then subjected to hemoglobin concentration measurement.
  • the hemoglobin concentration was measured by the SLS hemoglobin method described in Example 19.
  • mice were whole-body perfused with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), and the brain was excised. A portion of the brain tissue was taken for determination of heparan sulfate in the brain tissue, quickly immersed in liquid nitrogen, and rapidly frozen. Separately, after measuring the wet weight of a part of the brain tissue, it was quickly immersed in liquid nitrogen and rapidly frozen, and the frozen brain tissue was treated with RIPA Buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 0.025% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich). company) and centrifuged to collect the supernatant.
  • Example 26 Measurement of concentration of rAAV-derived protein in CSF, plasma and brain tissue rAAV-mscFv3-GS3-hI2S contained in the supernatant obtained by homogenizing the plasma and brain tissue prepared in Example 25 The amount of mscFv3-GS3-hI2S derived from was measured by the method described in Example 17.
  • FIG. 10 shows the measurement results of mscFv3-GS3-hI2S contained in plasma.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the concentration of mscFv3-GS3-hI2S contained in brain tissue.
  • the concentration of mscFv3-GS3-hI2S in plasma increased in a dose-dependent manner, indicating that mscFv3-GS3-hI2S expressed in mouse cells was released into the blood, and at least part of it was associated with mouse TfR. It can be seen that by binding to , it passed through the BBB and reached the tissues of the central nervous system.
  • Example 27 Quantitative determination of heparan sulfate in brain tissue and CSF
  • the brain tissue frozen in Example 25 was freeze-dried, and then the dry weight was measured.
  • the freeze-dried tissue was disrupted in a tissue extraction solution, and the supernatant was centrifuged. 20 ⁇ L of this was weighed out and dispensed into a borosilicate screw top test tube. This was used as a sample solution.
  • 20 ⁇ L of CSF was weighed out and dispensed into a borosilicate screw cap test tube, which was used as a sample solution.
  • HS heparan sulfate
  • FIGS. 12 and 13 The measurement results of HS concentration in brain tissue ( ⁇ g/mg dry weight) and HS concentration in CSF ( ⁇ g/mL) are shown in FIGS. 12 and 13, respectively. Both HS concentrations in brain tissue and CSF decreased in a dose-dependent manner. Even in the 1.0 ⁇ 10 11 vg/kg administration group, both HS concentrations in brain tissue and CSF were significantly decreased.
  • hI2S can pass through the BBB and reach the tissues of the central nervous system, and can exhibit the enzymatic activity of hI2S to reduce the HS concentration in the central nervous system. It also indicates that the effect of reducing HS accumulated in the brain tissue persists for at least 6 weeks.
  • Example 28 Measurement of hemoglobin concentration in blood Using the anticoagulated blood obtained in Example 25, hemoglobin concentration was measured. The hemoglobin concentration was measured by the SLS hemoglobin method described in Example 19. Blood hemoglobin concentration is a commonly used index of anemia. The results are shown in FIG.
  • hI2S encodes a fusion protein of an anti-TfR antibody and a desired physiologically active protein whose binding activity (EC 50 ) to TfR via anti-TfR is adjusted to 3 nM or more, for example, 3 to 100 nM
  • a safe therapeutic rAAV that does not cause anemia while maintaining a high blood expression level of the fusion protein and exerting the activity of the physiologically active protein in the central nervous system by producing rAAV virions containing the gene for It shows that it can provide virions.
  • the binding activity (EC 50 ) to TfR via anti-TfR is 4 nM or less, for example, 0.5 to 4 nM Anti-TfR antibody-hI2S fusion
  • Even rAAV virions containing protein-encoding genes can induce anemia at doses less than 1.0 ⁇ 10 13 vg/kg, such as 7.5 ⁇ 10 12 vg/kg This indicates that it can be used as a safe therapeutic rAAV virion that does not cause cancer.
  • Example 30 Construction of pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA vector From the 5' side, a DNA fragment containing the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO:59 containing the BamHI site, the hGAA-encoding gene having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:58, and the NotI site was synthesized. This DNA fragment was digested with BamHI and NotI.
  • the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2S constructed in Example 1 was digested with BamHI and NotI, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the digest.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA vector.
  • the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA vector consists of functional equivalents of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin /MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), a conjugate (mscFv-GS3- hGAA) with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60, a bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), a functional equivalent of a second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8).
  • the pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA vector generally has a structure in which the I2S-encoding gene in the vector map shown in FIG. 4 is replaced with the mscFv-GS3-hGAA-encoding gene.
  • Example 31 Construction of pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 vector From the 5' side, the sequence containing the MluI site, the gene encoding hGAA(Pro) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61, the gene encoding the GS linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the Bsu36I site A DNA fragment containing the nucleotide sequence shown by number 62 was synthesized. This DNA fragment was digested with MluI, ScaI and Bsu36I.
  • the pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 constructed in Example 3 was digested with MluI and Bsu36I, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the digest.
  • the obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 vector.
  • the pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 vector comprises, in order from upstream, the first AAV-ITR functional equivalent (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), Chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), a conjugate represented by SEQ ID NO: 63, in which mouse anti-mTfRscFv antibody 2 is bound to the C-terminus of hGAA(Pro) via a linker represented by SEQ ID NO: 1
  • a construct containing a gene encoding an amino acid sequence (hGAA(Pro)-GS-mscFv2), a bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), a functional equivalent of a second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8) have The pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 vector generally
  • Example 32 Construction of pAAV-mMAP-hGAA vector A DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64 containing the MluI site, the gene encoding hGAA, and the Not1 site from the 5' side was synthesized. This DNA fragment was digested with MluI and NotI. The pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2 constructed in Example 3 was digested with MluI and NotI, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into the digest. The obtained plasmid was used as the pAAV-mMAP-hGAA vector.
  • the pAAV-mMAP-hGAA vector consists of, in order from upstream, the functional equivalent of the first AAV-ITR (SEQ ID NO: 7), mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter (SEQ ID NO: 9), chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron (SEQ ID NO: 10), the gene encoding hGAA, the bovine growth hormone polyA signal (SEQ ID NO: 17), the functional equivalent of a second AAV-ITR (SEQ ID NO: 8).
  • the pAAV-mMAP-hGAA vector generally has a structure in which the I2S-encoding gene in the vector map shown in FIG. 4 is replaced with the hGAA-encoding gene.
  • HEK293 cells a cell line derived from human embryonic kidney cells, were used as host cells.
  • HEK293 cells were seeded in 10-layer cell stack chambers (Corning) at 1.59 x 10 8 per cell stack chamber and incubated in DMEM medium containing 10% FBS (Thermo Fisher Scientific) at 37°C in the presence of 5% CO 2 for 3 hours. cultured for days.
  • a solution containing the following combinations of plasmids (1) to (3) was prepared; (1) pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA, (2) pHelper vector (Takara Bio), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2, (3) pHelper vector (Takara Bio Inc.), pR2(mod)C8 vector and pAAV-mMAP-hGAA vector.
  • the above solutions (1) to (3) each contain the three types of plasmids at equimolar concentrations, the total DNA concentration is 1.0 mg/mL, and the total volume is adjusted to 2.2 mL. .
  • rAAV-mscFv-GS3-hGAA Part of the rAAV virions produced in the host cells is released into the culture supernatant and part remains inside the host cells.
  • the obtained rAAV virions were named rAAV-mscFv-GS3-hGAA, rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 and rAAV-hGAA, respectively.
  • rAAV-mscFv-GS3-hGAA is expected to express mscFv-GS3-hGAA when infected into cells.
  • Example 34 Preparation of rAAV virion solution and measurement of rAAV genome amount rAAV virion solutions containing (Pro)-GS-mscFv2 and rAAV-hGAA (rAAV-mscFv-GS3-hGAA solution, rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 solution, rAAV-hGAA solution) were prepared. In addition, the amount of rAAV genome contained in the rAAV virion solution was measured by the method described in Example 14.
  • Example 35 Evaluation of mTfR binding activity of conjugate of mouse anti-mTfRscFv and hGAA
  • Two types of recombinant proteins, mscFv-GS3-hGAA and hGAA(Pro)-GS-mscFv2 obtained by a conventional method using CHO cells
  • the binding activity to mouse transferrin receptor was measured by ELISA.
  • the ELISA method was generally performed by the following method. In each well of a 96-well microtiter plate (Nunc), 10 ⁇ g/mouse transferrin receptor extracellular domain represented by the amino acid sequence from the 87th to 763rd amino acid sequence from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39.
  • hGAA(Pro)-GS-mscFv2 was diluted to 200, 66.7, 133.33, 22.2, 7.41, 2.47, 0.82, and 0.27 nM. Plates were left at room temperature for at least 1 hour. After washing the plate three times with TBS-T, 100 ⁇ L of anti-hGAA monoclonal antibody diluted to 0.5 ⁇ g/mL in TBS containing 0.1% BSA and 0.05% Tween20 was added to each well, and the plate was incubated at room temperature for at least 1 hour. Let it stand for a while.
  • TBS-T After washing three times with TBS-T, add 100 ⁇ L of HRP-labeled anti-mouse IgG polyclonal antibody (Bethyl) diluted to 50 ng/mL with TBS containing 0.1% BSA and 0.05% Tween20 to each well. , the plate was allowed to stand at room temperature for at least 1 hour. After washing each well three times with TBS-T, 50 ⁇ L of a substrate solution for color development, TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase (Promega) was added to each well, and the wells were allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG polyclonal antibody Bethyl
  • TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase Promega
  • the EC50 for the binding affinities of mscFv-GS3-hGAA and hGAA(Pro)-GS-mscFv2 to mouse TfR were 0.173 nM and 83.7 nM, respectively.
  • GAA KO mice are homozygous mice lacking the acid ⁇ -glucosidase gene (Gaa gene).
  • GAA KO mice were generally produced by the following method. Using ES cell genomic DNA as a template, After amplifying two fragments of the 5' homologous region and the 3' homologous region by PCR, construct Exon 6 of the Gaa gene with a stop codon inserted together with the loxP sequence and PGK-neo region, and insert the fragment into Gaa by a conventional method. A homologous recombination vector for the gene was constructed.
  • This targeting vector was introduced into C57NBL/6N strain ES cells by electroporation, and primary screening-positive ES cells were obtained after drug selection. Homologous recombinants were selected from the obtained primary screening-positive ES cells to obtain homologous recombinant ES cell clones. Using the obtained homologous recombinant ES cell clones and 8-cell stage embryos (host embryos) of ICR mice, chimeric embryos were produced by the aggregation method. The resulting chimeric embryo was transplanted into a pseudopregnant mouse (recipient mouse) obtained by mating with a vasectomized mouse.
  • pseudopregnant mouse recipient mouse
  • the obtained offspring (chimeric mice) were evaluated for coat color, and individuals in which ES cells contributed to the formation of the organism with high efficiency, that is, individuals with a high ratio of white hair to the total hair, were selected.
  • This chimeric mouse individual was crossed with an ICR mouse to obtain an F1 mouse.
  • White F1 mice were selected, DNA extracted from tail tissue was analyzed, and mice heterozygous for the mouse Gaa gene on the chromosome were defined as Gaa heterozygous mice. Based on this mouse, a Gaa gene-deficient mouse (GAA KO mouse) was generated.
  • Example 37 Efficacy evaluation of rAAV virions using GAA KO mice
  • the GAA KO mice prepared in Example 36 were used to evaluate the efficacy of each rAAV administered to a living body.
  • GAA KO mice used were male mice aged 10 to 11 weeks (at the start of administration).
  • the rAAV-mscFv-GS3-hGAA solution, rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 solution, and rAAV-hGAA solution obtained in Example 34 are each administered to male GAA KO mice at a dose of 1.0 ⁇ 10 vg/kg.
  • Physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) was administered to the normal control group and the disease control group.
  • mice Four weeks after administration, under isoflurane inhalation anesthesia, thoracotomy was performed and cardiac blood sampling was performed.
  • the blood was collected in an EDTA-2K-coated blood collection tube (Capiject, Terumo), treated as anticoagulated blood, and then subjected to hemoglobin concentration measurement. After standing on ice, the remaining anticoagulated blood was centrifuged (2000 ⁇ g, 20 minutes) to collect plasma.
  • the mice were whole body perfused with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory), and the brain and tibialis anterior muscle were isolated. The brain was immersed in liquid nitrogen 3 minutes after the start of perfusion. After measuring the wet weight of the skeletal muscle, it was quickly immersed in liquid nitrogen and rapidly frozen.
  • Example 38 Measurement of rAAV-derived protein concentration in plasma and tissue rAAV-mscFv-GS3-hGAA, rAAV- Each rAAV-derived protein of hGAA(Pro)-GS-mscFv2 and rAAV-hGAA was quantified. Quantification was generally carried out by the following method. 150 ⁇ L of Superblock Blocking Buffer in PBS (Thermo Fisher Scientific) was added to each well of a Streptavidin Gold plate (Meso Scale Diagnostics) and shaken for 1 hour or more to block the plate.
  • PBS Thermo Fisher Scientific
  • a standard sample for calibration curve containing known concentrations of mscFv-GS3-hGAA, hGAA(Pro)-GS-mscFv2, and hGAA in a mixed solution of biotinylated anti-hGAA polyclonal antibody and SULFO-conjugated anti-hGAA polyclonal antibody (GAA A standard sample for calibration curve) and each sample were added and shaken for 1 hour or more to prepare an antibody reaction solution.
  • the anti-hGAA polyclonal antibody was obtained by obtaining antiserum from rabbit whole blood that had been immunized multiple times with human acid ⁇ -glucosidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58, followed by affinity purification.
  • One of the obtained polyclonal antibodies was modified using Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo Laboratories) according to the attached protocol to obtain a biotinylated anti-hGAA polyclonal antibody.
  • Another one of the obtained polyclonal antibodies was modified using MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester (Mesoscale Diagnostics) according to the attached protocol to obtain a SULFO-modified anti-hGAA polyclonal antibody. After removing the blocking solution from each well and washing with 0.05% Tween 20-containing PBS (PBST, Sigma Aldrich), 25 ⁇ L of the antibody reaction solution was added to each well and shaken for 1 hour or more.
  • mscFv-GS3-hGAA and hGAA(Pro)-GS-mscFv2 contained in the standard sample for the standard curve were obtained by using CHO cells introduced with an expression vector incorporating the gene encoding each protein by a conventional method. It was obtained by expressing
  • Fig. 15 shows the measurement results of the rAAV-derived protein concentration in plasma. Plasma concentrations of each rAAV-derived protein increased by 4 weeks after administration in all rAAV virion-administered groups. The above results indicate that the rAAV virions injected intravenously into mice were taken up into cells, and at least the rAAV-derived proteins that were expressed by transcribing and translating the genes encoded by rAAV in the cells were released into the blood. indicates that
  • Fig. 16 shows the measurement results of the rAAV-derived protein concentration in brain tissue. It was shown that the fusion protein encoded by each rAAV virion was detected in the brain tissue 4 weeks after administration in any rAAV virion-administered group. The expression level in brain tissue was extremely high, especially in the rAAV-mscFv-GS3-hGAA administration group.
  • glycogen concentration contained in the supernatant obtained by homogenizing the brain and tibialis anterior muscle was generally measured by the following method. Measurement was performed using a Glycogen assay kit (Biovision) according to the attached protocol. 50 ⁇ L each of a standard sample for calibration curve containing known concentrations of glycogen and tissue homogenate supernatant was added to 96F Nontreated Black microwells (Thermo Scientific). Next, 1 ⁇ L of Hydrolysis Enzyme Mix, which is a hydrolysis reaction reagent, was added to each well, mixed, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Glycogen assay kit Biovision
  • Reduction ratio (%) which expresses glycogen reduction in each tissue, was used as an index of drug efficacy. Reduction ratio (%) was defined as ⁇ ([KO]-[WT])-([Testarticle]-[WT]) ⁇ 100/([KO]-[WT]).
  • [WT] represents the average glycogen concentration of the normal control group
  • [KO] represents the average glycogen concentration of the disease control group
  • [Test article] represents the average glycogen concentration of each test substance administration group.
  • Table 4 shows the measurement results of brain glycogen concentration ( ⁇ g/g wet weight) and Reduction ratio (%).
  • Brain glycogen concentration decreased in both the rAAV-mscFv-GS3-hGAA and rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 administration groups compared with the disease control group (reduction ratio (%) was 101% and 23.9%).
  • the reduction ratio (%) remained at 5.47%, although the glycogen concentration in the brain decreased.
  • Table 5 shows the measurement results of the glycogen concentration ( ⁇ g/g wet weight) and reduction ratio (%) in the tibialis anterior muscle. Glycogen concentration in the tibialis anterior muscle decreased significantly in all treatment groups compared to the disease control group.
  • the above results include a gene encoding a fusion protein of an anti-TfR antibody with an anti-TfR-mediated binding activity (EC 50 ) to TfR adjusted to 0.5 nM, for example, 3 to 100 nM, and a desired physiologically active protein.
  • rAAV virion can be provided as a safe rAAV virion for treatment that does not induce anemia while maintaining a high blood expression level of the fusion protein and exerting the activity of the physiologically active protein in the central nervous system. This agrees with the description in Summary 1 of Example 20 and Summary 2 of Example 29 that there is.
  • the symptoms of anemia can be alleviated by appropriately adjusting the affinity or binding activity with the transferrin receptor. It is possible to provide a viral vector incorporating a transferrin receptor antibody with a reduced possibility of causing viral infection, a physiologically active protein, and a gene encoding such a fusion protein.
  • SEQ ID NO: 1 Example 1 of amino acid sequence of linker SEQ ID NO: 2: Example 2 of amino acid sequence of linker SEQ ID NO: 3: Example 3 of amino acid sequence of linker SEQ ID NO: 4: Example 4 of amino acid sequence of linker SEQ ID NO: 5: base sequence of the first inverted terminal repeat (first ITR) of serotype 2 AAV, wild type SEQ ID NO: 6: first inverted terminal repeat (second ITR) of serotype 2 AAV ITR) base sequence, wild-type SEQ ID NO: 7: a preferred example of the base sequence of the first inverted terminal repeat (first ITR), synthetic sequence SEQ ID NO: 8: second inverted terminal repeat (second ITR), synthetic sequence SEQ ID NO: 9: nucleotide sequence of mouse ⁇ -fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, synthetic sequence SEQ ID NO: 10: nucleotide sequence of chicken ⁇ -actin/MVM chimeric intron, synthetic sequence SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12:

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Abstract

本発明の目的は，例えば，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子が遺伝子治療に用いられる場合に，抗TfR抗体がトランスフェリン受容体に結合することに起因して生じる貧血症状等の副反応を低減させることのできる，TfRに対する結合活性が調節された，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子が組み込まれた核酸分子又は当該核酸分子を含むウイルスビリオンを提供することである。

Description

安全な遺伝子治療のための抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質
　本発明は，抗トランスフェリン受容体抗体をコードする遺伝子に関し，詳しくは，例えば，ＡＡＶベクター系にいて，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質をコードする核酸分子が組み込まれたベクターを作製する際に用いられる，抗トランスフェリン受容体抗体をコードする遺伝子に関する。
　医薬として用いられている組換え蛋白質の多くは，皮下注射，筋肉内注射，静脈内注射等の非経口的手段により患者に投与されている。患者が慢性疾患である場合，医薬の投与は長期に亘って繰り返し行われることが必要であるので，投与が非経口的手段によるものである場合，患者が強いられる負担は大きい。
　組換え蛋白質の中には，抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質であるものがある。かかる融合蛋白質として，例えば，抗体とリソソーム酵素の融合蛋白質が挙げられる（特許文献１～５，非特許文献１）。
　リソソーム病は，リソソームに存在すべきリソソソーム酵素をコードする遺伝子の異常により，リソソソーム酵素の活性が減少するか又は欠失することを原因とする遺伝子疾患である。リソソーム病の患者には，組換え体リソソーム酵素を静脈内注射により投与し，減少又は欠失しているリソソーム酵素を補充する，いわゆる酵素補充療法が行われている。遺伝子疾患であるリソソーム病の患者は，この酵素補充療法を生涯に渡って受ける必要がある。
　リソソーム病の中には脳に障害が及ぶものがある。脳の障害を治療するためには，脳内にリソソーム酵素を補充する必要があるが，静脈内注射により投与されたリソソーム酵素は血液脳関門（ＢＢＢ）をほとんど通過することがないので，脳内にリソソーム酵素を補充することはできない。
　リソソーム酵素を脳内に補充するための方法として，リソソーム酵素を血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原として認識する抗体と結合させた融合蛋白質とし，これを静脈内注射により投与する方法が報告されている（非特許文献２）。かかる融合蛋白質は，抗体部分を介して血管内皮細胞の表面に結合し，更にＢＢＢを通過して脳内に到達することができる。よって，かかる融合蛋白質により，脳内にリソソーム酵素を補充することができる。リソソーム酵素をこのような融合蛋白質とした場合であっても，遺伝子疾患であるリソソーム病の患者は，この融合蛋白質による酵素補充療法を生涯に渡って受ける必要がある。
　血管内皮細胞の表面に存在する分子としてヒトトランスフェリン受容体（hTfR）がある。近年，このhTfRとリソソーム酵素の一種であるヒトイズロン酸-2-スルファターゼとの融合蛋白質であるパビナフスプアルファがハンター症候群に伴う中枢神経系の障害に効果を有する治療剤として販売が開始されている。患者は，このパビナフスプアルファを，週1回，点滴静注により投与を続ける必要がある（非特許文献３）。なお，抗TfR抗体を動物に投与した場合，TfRを多く発現する網状赤血球に作用することにより網状赤血球の数が減少するという報告がある（非特許文献４）。
ＷＯ２０１６／２０８６９５ ＷＯ２０１８／１２４１２１ ＵＳ２００７００８２３８０ ＵＳ２００９００５３２１９ ＵＳ２０１１０１１０９３５
Sonoda H. et al.， Mol Ther. 26. 1366-74 (2018) Okuyama T. et al.， Mol Ther. 26. 27. 456-64 (2019) イズカーゴTM点滴静注10mg添付文書.第1版．2021年3月作成 Couch JA. Sci Transl Med.5.183ra57(2013)
　本発明の目的は，例えば，抗トランスフェリン受容体抗体（抗TfR抗体）と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子が遺伝子治療に用いられる場合に，抗TfR抗体がトランスフェリン受容体（TfR）に結合することに起因して生じる貧血症状等の副反応を低減させることのできる，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質との，ある定められたTfRに対する結合活性を有する融合蛋白質をコードする遺伝子が組み込まれた核酸分子を提供することである。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質との，ある一定値のTfRとの結合活性（親和性）を有する融合蛋白質をコードする遺伝子を含む核酸分子を用いることにより，遺伝子治療に用いることのできる安全性の高いウイルスビリオンを作製することができることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．以下の（１）～（６）の何れかの塩基配列を含む核酸分子であって，該核酸分子がコードする抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質が，トランスフェリン受容体に対して０．５ｎＭ～１μＭの結合活性（ＥＣ５０）を有するもの：
　（１）第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
　（２）第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
　（３）第一の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
　（４）第一の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
　（５）リーダー又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にトレイラー又はその機能的等価物を含む塩基配列；又は
　（６）リーダー又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にトレイラー又はその機能的等価物を含む塩基配列。
２．以下の（１）～（４）から選択されるものである，上記１に記載の核酸分子：
　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；
　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；
　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；又は
　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの。
３．以下の（１）～（４）から選択されるものである，上記１に記載の核酸分子：
　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；
　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；
　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの；又は
　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列とを含むもの。
４．該リンカーが，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記３に記載の核酸分子。
５．該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，上記４に記載の核酸分子。
６．以下の（１）～（４）から選択されるものである，上記１に記載の核酸分子：
　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）が結合し，更にそのＣ末端に生理活性を有する蛋白質が直接又はリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；
　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）が結合し，更にそのＣ末端に生理活性を有する蛋白質が直接又はリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；
　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，生理活性を有する蛋白質のＣ末端に直接又はリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）が結合し，更にそのＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）が結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；又は
　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，生理活性を有する蛋白質のＣ末端に直接又はリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）が結合し，更にそのＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）が結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの。
７．該リンカーが，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記６に記載の核酸分子。
８．該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，上記７に記載の核酸分子。
９．該第二のリンカーが，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記８に記載の核酸分子。
１０．該第二のリンカーが，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly，配列番号１，配列番号２，配列番号３の各アミノ酸配列，配列番号１のアミノ酸配列の３個が連続してなるアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるものである，上記９に記載の核酸分子。
１１．以下の（１）～（４）から選択されるものである，上記２に記載の核酸分子：
　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；
　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；
　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；又は
　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの。
１２．以下の（１）～（４）から選択されるものである，上記３～５の何れかに記載の核酸分子：
　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；
　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；
　（３）該該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの；又は
　（４）該該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖（その可変領域であってもよい）のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖（その可変領域であってもよい）をコードする塩基配列を含むもの。
１３．該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものである，上記１１又は１２に記載の核酸分子。
１４．該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルスの５’非翻訳領域に由来するものである，上記１１又は１２に記載の核酸分子。
１５．該遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，β-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター，マウスアルブミンプロモーター，ヒトアルブミンプロモーター，ヒトα－１アンチトリプシンプロモーター，及びマウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーターからなる群から選択されるものである，上記１～１４の何れかに記載の核酸分子。
１６．該抗トランスフェリン受容体抗体が，抗原結合性断片である，上記１～１５の何れかに記載の核酸分子。
１７．該抗トランスフェリン受容体抗体が，Ｆａｂである，上記１～１５の何れかに記載の核酸分子。
１８．該生理活性を有する蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗トランスフェリン受容体抗体，抗トランスフェリン受容体抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，ＧＬＰ－１受容体アゴニスト，及び抗体医薬からなる群から選択されるものである，上記１～１７の何れかに記載の核酸分子。
１９．該生理活性を有する蛋白質が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，酸性α-グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼＡ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１～１７の何れかに記載の核酸分子。
２０．該第一の逆方向末端反復及び該第二の逆方向末端反復が，アデノ随伴ウイルスに由来するもの，アデノウイルスに由来するもの，又はそれらの変異体であるものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２１．該第一の逆方向末端反復が配列番号５で示される塩基配列を含み，該第二の逆方向末端反復が配列番号６で示される塩基配列を含むものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２２．該第一の逆方向末端反復が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該第二の逆方向末端反復が以下の（４）～（６）から選択されるものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子：
　（１）配列番号５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（２）配列番号５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（３）配列番号５で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
　（４）配列番号６で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（５）配列番号６で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（６）配列番号６で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
２３．該第一の逆方向末端反復の機能的等価物が配列番号７で示される塩基配列を含み，該第二の逆方向末端反復の機能的等価物が配列番号８で示される塩基配列を含むものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２４．該第一の逆方向末端反復の機能的等価物が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び
該第二の逆方向末端反復の機能的等価物が以下の（４）～（６）から選択されるものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子：
　（１）配列番号７で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（２）配列番号７で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（３）配列番号７で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
　（４）配列番号８で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（５）配列番号８で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（６）配列番号８で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
２５．該第一の長い末端反復及び該第二の長い末端反復が，レンチウイルス又はレトロウイルスに由来するもの又はその変異体である，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２６．該第一の長い末端反復が配列番号５２で示される塩基配列を含み，該第二の長い末端反復が配列番号５３で示される塩基配列を含むものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２７．該第一の長い末端反復が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該第二の長い末端反復が以下の（４）～（６）から選択されるものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子：
　（１）配列番号５２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（２）配列番号５２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（３）配列番号５２で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
　（４）配列番号５３で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（５）配列番号５３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（６）配列番号５３で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
２８．該リーダー及び該トレイラーが，センダイウイルスに由来するもの又はその変異体である，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
２９．該リーダーが配列番号５４で示される塩基配列を含み，該トレイラーが配列番号５５で示される塩基配列を含むものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子。
３０．該リーダーが以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該トレイラーが以下の（４）～（６）から選択されるものである，上記１～１９の何れかに記載の核酸分子：
　（１）配列番号５４で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（２）配列番号５４で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（３）配列番号５４で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
　（４）配列番号５５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
　（５）配列番号５５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
　（６）配列番号５５で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
３１．該結合活性（ＥＣ５０）が０．５～３ｎＭ，０．８～３ｎＭ，又は１ｎＭ～３ｎＭである，請求項１～３０の何れかに記載の核酸分子。
３２．該結合活性（ＥＣ５０）が３～５００ｎＭ，３～１００ｎＭ，４ｎＭ～１μＭ，４～５００ｎＭ，４～１００ｎＭ，５ｎＭ～１μＭ，５～５００ｎＭ，又は５～１００ｎＭである，請求項１～３０の何れかに記載の核酸分子。
３３．上記１～３２の何れかに記載の核酸分子が導入された細胞，組織又は動物。
３４．上記１～３２の何れかに記載の核酸分子が導入された幹細胞。
３５．間葉系幹細胞，歯髄由来幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，内皮幹細胞，乳腺幹細胞，腸幹細胞，肝幹細胞，膵幹細胞，神経幹細胞，及びｉＰＳ細胞からなる群から選択されるものである，上記３４に記載の幹細胞。
３６．上記１～３２の何れかに記載の核酸分子を含む，プラスミド。
３７．上記１～３２の何れかに記載の核酸分子を含むウイルスビリオン。
３８．上記３７のウイルスビリオンと担体とを含む，医薬組成物。
３９．上記３１に記載の核酸分子を含むウイルスビリオン。
４０．上記３９に記載のウイルスビリオンを含む，医薬組成物。
４１．1回当たりの投与量が，1.0×1010～7.5×1012 vg/kgである，上記４０に記載の医薬組成物。
　本発明によれば，貧血症状を惹起する可能性を低減させた抗ＴｆＲ抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質，又はこれを細胞，組織，又は生体内において発現させるために用いることのできる，かかる融合蛋白質をコードする遺伝子を含む安全な核酸分子を提供ことができる。
pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクター（プラスミド）の構造を示す模式図 pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクター（プラスミド）の構造を示す模式図 pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクター（プラスミド）の構造を示す模式図 pAAV-mMAP-hI2Sベクター（プラスミド）の構造を示す模式図 pR2(mod)C8ベクターの構造を示す模式図 血漿中rAAV由来蛋白質濃度測定の結果を示す図（実施例１７）。棒グラフの縦軸は血漿中rAAV由来蛋白質濃度（μg/mL）の対数表示を示す。黒棒は各rAAVビリオン投与1週間後，白棒は各rAAVビリオン投与6週間後の血漿中rAAV由来蛋白質の濃度の測定値を，それぞれ示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(5)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(6)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(7)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(8)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(9)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(10)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1012 vg/kg投与群，(11)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1011 vg/kg投与群，(12)はrAAV-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(13)はrAAV-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，及び(14)はrAAV-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。なお(1)の正常対照群，及び(2)の病態対照群は蛋白質発現が無いため測定を実施しておらず，参考としてゼロ値を示している。 脳組織中rAAV由来蛋白質濃度測定の結果を示す図（実施例１７）。棒グラフの縦軸は脳組織中のrAAV由来蛋白質の濃度（μg/g）を示す。黒棒は各rAAVビリオン投与1週間後，白棒は各rAAVビリオン投与6週間後の脳組織中rAAV由来蛋白質の濃度の測定値を，それぞれ示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(5)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(6)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(7)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(8)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(9)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(10)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1012 vg/kg投与群，(11)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1011 vg/kg投与群，(12)はrAAV-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(13)はrAAV-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，及び(14)はrAAV-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。なお(1)の正常対照群，及び(2)の病態対照群は蛋白質発現が無いため測定を実施しておらず，参考としてゼロ値を示している。 脳組織中ヘパラン硫酸濃度測定の結果を示す図（実施例１８）。棒グラフの縦軸は脳組織中ヘパラン硫酸濃度（μg/mg組織重量）を示す。黒棒は各rAAVビリオン投与1週間後，白棒は各rAAVビリオン投与6週間後の脳組織中ヘパラン硫酸の濃度の測定値を，それぞれ示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(5)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(6)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(7)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(8)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(9)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(10)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1012 vg/kg投与群，(11)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1011 vg/kg投与群，(12)はrAAV-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(13)はrAAV-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，及び(14)はrAAV-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。 血液中ヘモグロビン濃度測定の結果を示す図（実施例１９）。棒グラフの縦軸は血液中ヘモグロビン濃度（g/dL）を示す。黒棒は各rAAVビリオン投与1週間後，白棒は各rAAVビリオン投与6週間後の血液中ヘモグロビンの濃度の測定値を，それぞれ示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(5)はrAAV-mscFv-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(6)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(7)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，(8)はrAAV-mscFv2-GS3-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群，(9)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(10)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1012 vg/kg投与群，(11)はrAAV-hI2S-mscFv2 1.0×1011 vg/kg投与群，(12)はrAAV-hI2S 1.0×1013 vg/kg投与群，(13)はrAAV-hI2S 1.0×1012 vg/kg投与群，及び(14)はrAAV-hI2S 1.0×1011 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。 血漿中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度測定の結果を示す図（実施例２６）。棒グラフの縦軸は血漿中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度（μg/mL）を示す。縦棒はrAAV-mscFv3-GS3-hI2S投与から6週間後に採取した血漿中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度を示す。(1)は1.0×1011 vg/kg投与群，(2)は1.0×1012 vg/kg投与群，(3)は1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 脳中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度測定の結果を示す図（実施例２６）。棒グラフの縦軸は脳中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度（μg/g湿重量）を示す。縦棒はrAAV-mscFv3-GS3-hI2S投与から6週間後に採取した脳中のrAAV由来蛋白質の濃度を示す。(1)は1.0×1011 vg/kg投与群，(2)は1.0×1012 vg/kg投与群，(3)は1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 脳組織中のヘパラン硫酸の濃度測定の結果を示す図（実施例２７）。棒グラフの縦軸はヘパラン硫酸の濃度（μg/mg湿重量）を示す。縦棒はrAAV-mscFv3-GS3-hI2S投与から6週間後に採取した脳中のヘパラン硫酸の濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)は1.0×1011 vg/kg投与群，(4)は1.0×1012 vg/kg投与群，(5)は1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 CSF中のヘパラン硫酸の濃度測定の結果を示す図（実施例２７）。棒グラフの縦軸はヘパラン硫酸の濃度（μg/mg）を示す。縦棒はrAAV-mscFv3-GS3-hI2S投与から6週間後に採取したCSF中のヘパラン硫酸の濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)は1.0×1011 vg/kg投与群，(4)は1.0×1012 vg/kg投与群，(5)は1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 血液中のヘモグロビンの濃度測定の結果を示す図（実施例２８）。棒グラフの縦軸はヘモグロビンの濃度（g/dL）を示す。縦棒はrAAV-mscFv3-GS3-hI2S投与から6週間後に採取した血液のヘモグロビンの濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)は1.0×1011 vg/kg投与群，(4)は1.0×1012 vg/kg投与群，(5)は1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 血漿中のrAAV由来蛋白質の濃度測定の結果を示す図（実施例３８）。棒グラフの縦軸は血漿中のrAAV由来蛋白質の濃度（μg/mL）を示す。縦棒は各rAAVビリオン投与から4週間後に採取した血漿中のrAAV由来蛋白質の濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群，(5)はrAAV-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 脳中のrAAV由来蛋白質の濃度測定の結果を示す図（実施例３８）。棒グラフの縦軸は濃度（μg/g湿重量）を示す。縦棒は各rAAVビリオン投与から4週間後に採取した脳中のrAAV由来蛋白質の濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群，(5)はrAAV-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。 血液中のヘモグロビンの濃度測定の結果を示す図（実施例４０）。棒グラフの縦軸は濃度（g/dL）を示す。縦棒は各rAAVビリオン投与から4週間後に採取した血液中のヘモグロビン濃度を示す。(1)は正常対照群，(2)は病態対照群，(3)はrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2 1.0×1013 vg/kg投与群，(4)はrAAV-mscFv-GS3-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群，(5)はrAAV-hGAA 1.0×1013 vg/kg投与群の結果をそれぞれ示す。値は平均値であり，エラーバーは標準偏差を示す。
　本発明において「核酸分子」というときは，主に，デオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により重合したものであるDNA，リボヌクレオチドがホスホジエステル結合により重合したものであるRNAの何れかのことをいう。
　「核酸分子」がDNAである場合のDNAは一重鎖（一本鎖）でもよく，又，相補鎖を伴う二重鎖であってもよい。DNAが一重鎖である場合のＤＮＡは，（+）鎖であっても（-）鎖であってもよい。DNAを構成する個々のデオキシリボヌクレオチドは，DNAに含まれる蛋白質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内でmRNAに翻訳されることができる限り，天然に存在する型のものであってもよく，天然型に修飾を加えたものであってもよい。本発明の一実施形態において，DNAを構成する個々のデオキシリボヌクレオチドは，哺乳動物（特にヒト）の細胞内で，DNAに含まれる蛋白質をコードする遺伝子がmRNAに翻訳され，且つ，DNAの全部又は一部が複製されることができるものである限り，天然に存在する型のものであってもよく，天然型に修飾を加えたものであってもよい。
　また，「核酸分子」がRNAである場合のRNAは一重鎖（一本鎖）でもよく，相補鎖を伴う二重鎖であってもよい。RNAが一本鎖である場合のRNAは，（+）鎖であっても（-）鎖であってもよい。本発明の一実施形態において，RNAを構成する個々のリボヌクレオチドは，RNAに含まれる蛋白質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内でDNAに逆転写されることができる限り，天然に存在する型のものであってもよく，修飾されたものであってもよい。また，本発明の一実施形態において，RNAを構成する個々のリボヌクレオチドは，RNAに含まれる蛋白質をコードする遺伝子が哺乳動物（特にヒト）の細胞内で蛋白質に翻訳されることができる限り，天然に存在する型のものであってもよく，修飾されたものであってもよい。リボヌクレオチドの修飾は，例えば，RNAのRNaseによる分解を抑制し，RNAの細胞内における安定性を高めるために行われる。
　本発明の一実施形態において，逆方向末端反復（ITR）というときは，ウイルスゲノムの末端に存在する，同じ配列が反復して存在する塩基配列のことをいう。ITRとして，アデノ随伴ウイルスに由来するもの，及びアデノウイルスに由来するものは好適に用いることができる。例えば，アデノ随伴ウイルスのITRは，おおよそ145塩基の鎖長の領域であり，複製開始点等として機能する。本発明の一実施形態において，核酸分子中には，逆方向末端反復（ITR）が2つ存在し，それぞれ第一の逆方向末端反復（ITR），第二の逆方向末端反復（ITR）という。ここで，2つのITRの間に，融合蛋白質をコードする遺伝子を配置したときに，その5’側に位置するITRを第一の逆方向末端反復（ITR）といい，3’側に位置するITRを第二の逆方向末端反復（ITR）という。本発明において，逆方向末端反復（ITR）は，複製開始点としての機能，宿主細胞への遺伝子挿入等の，本来のITRの機能の少なくも一つを有するものである限り，何れのウイルス由来のものであってもよく，アデノ随伴ウイルスのITRは好適なものの一つである。
　ITRがアデノ随伴ウイルスである場合の，AAVの血清型に特に限定はなく，血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れのものであってもよい。例えば，血清型2のAAVの逆方向末端反復（ITR）は，第一のITRが配列番号５で示される塩基配列を含み，第二のITRが配列番号６で示される塩基配列を含む。
　また，ITRは，野生型のITRに限らず，野生型のITRの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変を加えたものであってもよい。野生型のITRの塩基配列の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。野生型のITRの塩基配列を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。野生型のITRに塩基を付加する場合，ITRの塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基が付加される。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えたITRの塩基配列は，野生型のITRの塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更に好ましくは98%以上の同一性を示す。
　ITRの機能的等価物とは，機能的にITRに代えて用いることができるものをいう。また， ITRに基づいて人工的に構築されたITRも，ITRを代替することができるものである限り， ITRの機能的等価物である。
　AAVのITRの機能的等価物とは，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものをいう。また，AAVのITRに基づいて人工的に構築されたITRも，AAVのITRを代替することができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物である。
　人工的に構築された第１のAAVの逆方向末端反復（第一のAAV-ITR）の機能的等価物として，配列番号７で示される塩基配列を有するものが挙げられる（第一のAAV-ITRの機能的等価物）。この配列番号７で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的に第一のAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，第一のAAV-ITRの機能的等価物に含まれる。配列番号７で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。配列番号７で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のAAV-ITRの機能的等価物である。配列番号７で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のAAV-ITRの機能的等価物に含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号７で示される塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　また，人工的に構築された第２の逆方向末端反復（第二のAAV-ITR）の機能的等価物として，配列番号８で示される塩基配列を有するものが挙げられる（第二のAAV-ITRの機能的等価物）。この配列番号８で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的に第二のAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，第二のAAVのITRの機能的等価物に含まれる。配列番号８で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。配列番号８で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のAAVのITRの機能的等価物である。配列番号８で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のAAVのITRの機能的等価物に含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号８で示される塩基配列と，好ましくは85%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，長い末端反復（LTR）というときは，例えば，真核生物のレトロトランスポゾン，又はレトロウイルスゲノム，レンチウイルスゲノム等の末端に存在する，同じ配列が数百から数千回反復して存在する塩基配列のことをいう。本発明の一実施形態において，核酸分子中には，長い末端反復（LTR）が2つ存在し，それぞれ第一の長い末端反復（LTR），第二の長い末端反復（LTR）という。ここで，2つのLTRの間に，融合蛋白質をコードする遺伝子を配置したときに，5’側に位置するLTRを第一の長い末端反復（LTR）といい，3’側に位置するLTRを第二の長い末端反復（LTR）という。本発明において，長い末端反復（LTR）は，複製開始点としての機能，宿主細胞への遺伝子挿入等の，本来のLTRの機能の少なくも一つを有するものである限り，何れのウイルス由来のものであってもよく，好適なものとしてはレトロウイルスゲノム及びレンチウイルスが挙げられる。またLTRは野生型のLTRに限らず，野生型のLTRの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変を加えたものであってもよい。
　野生型のLTRの塩基配列の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。野生型のLTRの塩基配列を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。野生型のLTRに塩基を付加する場合，LTRの塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基が付加される。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えたLTRの塩基配列は，野生型のLTRの塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　LTRの機能的等価物とは，機能的にLTRに代えて用いることができるものをいう。また，LTRに基づいて人工的に構築されたLTRも，LTRを代替することができるものである限り， LTRの機能的等価物である。
　レンチウイルスのLTRの機能的等価物とは，機能的にレンチウイルスのLTRに代えて用いることができるものをいう。また，レンチウイルスのLTRに基づいて人工的に構築されたLTRも，レンチウイルスのLTRを代替することができるものである限り，レンチウイルスのLTRの機能的等価物である。
　レトロウイルスのLTRの機能的等価物とは，機能的にレトロウイルスのLTRに代えて用いることができるものをいう。また，レトロウイルスのLTRに基づいて人工的に構築されたLTRも，レトロウイルスのLTRを代替することができるものである限り，レトロウイルスのLTRの機能的等価物である。
　第一のLTRの機能的等価物として，配列番号５２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号５２で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的に第一のLTRとして用いることができるものである限り，第一のLTRの機能的等価物に含まれる。配列番号５２で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～20個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。配列番号５２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたLTRも，第一のLTRの機能的等価物である。配列番号５２で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたLTRも，第一のLTRの機能的等価物に含まれる。変異を加えたLTRの塩基配列は，配列番号５２で示される塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　また，第二のLTRの機能的等価物として，配列番号５３で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号５３で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的に第二のLTRとして用いることができるものである限り，第二のLTRの機能的等価物に含まれる。配列番号５３で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。配列番号５３で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたLTRも，第二のLTRの機能的等価物である。配列番号５３で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたLTRも，第二のLTRの機能的等価物に含まれる。変異を加えたLTRの塩基配列は，配列番号５３で示される塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90％以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，リーダー及びトレイラーというときは，ウイルスゲノムの末端に存在する，互いに部分的に相補な塩基配列のことをいう。リーダー及びトレイラーとして，センダイウイルスに由来するものは好適に用いることができる。センダイウイルスのリーダー及びトレイラーは，何れも約50塩基の鎖長の領域である。通常，5’側にリーダー，3’側にトレイラーが位置する。
　本発明の一実施形態において好適に用いられるものとして，配列番号５４で示される塩基配列を有するセンダイウイスル由来のリーダーと，配列番号５５で示される塩基配列を有するセンダイウイスル由来のトレイラーが挙げられる。
　野生型のセンダイウイスル由来のリーダー及びトレイラーに変異を加えたものも，本発明において好適に使用できる。塩基配列の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。野生型のリーダー又は／及びトレイラーの塩基配列を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。塩基を付加する場合，リーダー又は／及びトレイラーの塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基が付加される。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた塩基配列は，野生型の塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，融合蛋白質の遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それが融合蛋白質をコードする遺伝子が導入される先の哺乳動物（特にヒト）の細胞，組織又は生体内で，この融合蛋白質を発現させることができるものである限り，特に制限はないが，サイトメガロウイルス由来のプロモーター（任意選択でエンハンサーを含む），SV40初期プロモーター，ヒト伸長因子-1α（EF-1α）プロモーター，ヒトユビキチンCプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，及びβ-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター，マウスアルブミンプロモーター，ヒトアルブミンプロモーター，及びヒトα-1アンチトリプシンプロモーターを含むものが好適である。例えば，マウスαフェトプロテインエンハンサーの下流にマウスアルブミンプロモーターを含む配列番号９で示される塩基配列を有する合成プロモーター（マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター）は遺伝子発現制御部位として好適に利用できる。マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーターの下流に配列番号１０で示される塩基配列を有するニワトリβアクチン/MVMキメライントロンをその下流に配置させてもよい。かかるイントロンを配置することにより，遺伝子発現制御部位で制御される蛋白質の発現量を増加させることができる。なお，配列番号９で示される塩基配列において，1～219番目の塩基配列がマウスαフェトプロテインエンハンサーであり，241～549番目の塩基配列がマウスアルブミンプロモーターである。
　遺伝子制御部位は，臓器特異的又は細胞種特異的に発現する遺伝子のプロモーターであってもよい。臓器特異的発現プロモーター又は細胞種特異的発現プロモーターを用いることにより，核酸分子に組込んだ融合蛋白質をコードする遺伝子を，所望の臓器又は細胞で特異的に発現させることができる。
　本発明の一実施形態において，「内部リボソーム結合部位」とは，mRNA鎖の内部に存在する，リボソームが直接結合し且つキャップ構造非依存性に翻訳を開始し得る領域（構造），又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。また，本発明において，「内部リボソーム結合部位をコードする遺伝子」とは，転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。内部リボソーム結合部位は，一般に，IRES（internal ribosome entry site）と称され，ピコルナウイルス科のウイルス（ポリオウイルス，ライノウイルス，マウス脳心筋炎ウイルスなど），口蹄疫ウイルス，A型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス等のウイルスの5'非翻訳領域，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質，ショウジョウバエアンテナペディア，ショウジョウバエウルトラビトラックス等の遺伝子の5'非翻訳領域に見出されている。ピコルナウイルスの場合，そのIRESは，mRNAの5'非翻訳領域に存在する約450bpからなる領域である。ここで「ウイルスの5'非翻訳領域」とは，ウイルスのmRNAの5'非翻訳領域，又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域（構造）である。
　一実施形態において，内部リボソーム結合部位は，哺乳動物（特にヒト）の細胞，組織又は生体内で，内部リボソーム結合部位として機能するものである限り特に限定はなく，何れのものをも使用することができる。それらのうち，好ましくはウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，より好ましくはピコルナウイルス科のウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，更に好ましくはマウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が挙げられる。マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の一実施形態として，配列番号１１で示される塩基配列を有するものが挙げられる。
　一実施形態において，内部リボソーム結合部位は，野生型の塩基配列を有するものをそのまま使用することができる。また，これら野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に，1又は2以上の変異（例えば，置換，欠損，又は／及び挿入などをいう。）を加えた変異型の内部リボソーム結合部位も，哺乳動物（特にヒト）の細胞，組織又は生体内で，内部リボソーム結合部位として機能するものである限り，何れのものをも使用することができる。また，2以上の内部リボソーム結合部位を融合させたキメラ型の内部リボソーム結合部位も，使用することができる。
　本発明の一実施形態において，抗トランスフェリン受容体抗体と結合して融合蛋白質を構成する生理活性を有する蛋白質は，生体内で生理活性を示すものである限り，特に限定はない。かかる生理活性を有する蛋白質の好適なものとして，医薬として長期に亘って患者に投与されるべきものが挙げられる。かかる医薬としては，例えば，成長ホルモン，リソソーム酵素，神経栄養因子，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF），顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（FSH），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH），ゴナドトロピン，DNasel，甲状腺刺激ホルモン（TSH），脳由来神経栄養因子（BDNF），神経成長因子（NGF），毛様体神経栄養因子（CNTF），グリア細胞株神経栄養因子（GDNF），ニューロトロフィン3，ニューロトロフィン4/5，ニューロトロフィン6，ニューレグリン1，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF），線維芽細胞成長因子2（FGF2），上皮細胞増殖因子（EGF），血管内皮増殖因子（VEGF），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン6，PD-1，PD-1リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（TNF-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びGLP-1受容体アゴニスト，何れかの抗体医薬の一つ，が挙げられる。
　生理活性を有する蛋白質がリソソーム酵素である場合の好適例として，α-L-イズロニダーゼ，イズロン酸-2-スルファターゼ，酸性α-グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，β-ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β-ヘキソサミニダーゼＡ，β-ヘキソサミニダーゼB，N-アセチルグルコサミン-1-フォスフォトランスフェラーゼ，α-マンノシダーゼ，β-マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンC，アリールスルファターゼA，α-L-フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α-ガラクトシダーゼA，β-グルクロニダーゼ，ヘパランN-スルファターゼ，α-N-アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルCoAα-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ，N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ-1，6-グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ-1，トリペプチジルペプチダーゼ-1，ヒアルロニダーゼ-1，CLN1及びCLN2が挙げられる。
　本発明の一実施形態において，生理活性を有する蛋白質はヒトの蛋白質である。ここで，蛋白質は野生型のものであってもよく，その蛋白質が有する本来の生理活性を有する限り，変異を加えたものであってもよい。ここで，ある蛋白質が本来の生理活性を有するとは，当該蛋白質が，その蛋白質の野生型蛋白質の生理活性に対して10％以上の生理活性を有することを意味する。野生型蛋白質の生理活性に対する当該生理活性は，20％以上であることがより好ましく，40％以上であることが更に好ましく，50％以上であることが更に好ましく，80％以上であることが更に好ましく，90％以上であることがなおも更に好ましい。
　野生型の生理活性を有する蛋白質の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。野生型の当該蛋白質の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。野生型の当該蛋白質に塩基を付加する場合，当該蛋白質の塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基が付加される。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた当該蛋白質の塩基配列は，野生型の当該蛋白質の塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，好ましくは85%以上の同一性を示し，より好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　なお，本発明において，野生型蛋白質と比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失，置換，付加）は，野生型及び変異型蛋白質のアミノ酸配列のアラインメントにより，容易に確認することができる。なお，本発明において，野生型蛋白質のアミノ酸配列と変異型蛋白質のアミノ酸配列との同一性は，周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10， (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
　上記の蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換は，例えば，アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は，蛋白質の機能に大きな変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては，例えば以下のものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
　本発明における，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質を構成する抗トランスフェリン受容体抗体について以下，詳述する。
　抗トランスフェリン受容体抗体（抗TfR抗体）は，抗原であるトランスフェリン受容体（TfR）に特異的に結合する性質を有するものである限り，抗TfR抗体の動物種等に特に制限はないが，特にヒト抗TfR抗体又はヒト化抗TfR抗体である。例えば，抗TfR抗体は，ヒト以外の哺乳動物の抗TfR抗体であってもよく，またヒト抗TfR抗体とヒト以外の他の哺乳動物の抗TfR抗体とのキメラ抗TfR抗体であってもよい。
　なお，本発明の一実施形態において，単に「抗TfR抗体」というときは，何れかの動物種のトランスフェリン受容体（TfR）に特異的に結合する性質を有する抗体の包括的概念である。従って，後述する抗原結合性断片も，トランスフェリン受容体（TfR）に特異的に結合する性質を有する限り，抗TfR抗体に含まれる。
　ヒト抗トランスフェリン受容体抗体（ヒト抗TfR抗体）は，その全体がヒト由来の遺伝子にコードされる抗TfR抗体のことをいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に変異を加えた遺伝子にコードされる抗TfR抗体も，ヒト抗TfR抗体である。また，ヒト抗TfR抗体をコードする2つ以上の遺伝子を組み合わせて，ある一つのヒト抗TfR抗体の一部を，他のヒト抗TfR抗体の一部に置き換えた抗TfR抗体も，ヒト抗TfR抗体である。ヒト抗TfR抗体は，通常，免疫グロブリン軽鎖の3箇所の相補性決定領域（CDR）と免疫グロブリン重鎖の3箇所の相補性決定領域（CDR）を有する。免疫グロブリン軽鎖の3箇所のCDRは，N末端側にあるものから順にCDR1，CDR2及びCDR3という。免疫グロブリン重鎖の3箇所のCDRは，N末端側にあるものから順にCDR1，CDR2及びCDR3という。ある一つのヒト抗TfR抗体のCDRを，他のヒト抗TfR抗体のCDRに置き換えることにより，ヒト抗TfR抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗TfR抗体も，ヒト抗TfR抗体である。
　本発明において，元のヒト抗TfR抗体の遺伝子を改変することにより，元のヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，ヒト抗TfR抗体という。元のヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは1～20個であり，より好ましくは1～10個であり，更に好ましくは1～5個であり，更により好ましくは1～3個である。元のヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは1～20個であり，より好ましくは1～10個であり，更に好ましくは1～5個であり，更よりに好ましくは1～3個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗TfR抗体である。アミノ酸を付加させる場合，元のヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはC末端側に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～5個，更により好ましくは1～3個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗TfR抗体である。変異を加えたヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列は，元のヒト抗TfR抗体のアミノ酸配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示すものである。つまり，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，ヒト由来の元の遺伝子に改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
　本発明において，「ヒト化抗TfR抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にCDRの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗TfR抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗TfR抗体として，ヒト抗TfR抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の3箇所の相補性決定領域（CDR）と免疫グロブリン重鎖の3箇所の相補性決定領域（CDR）を，他の哺乳動物のCDRによって置き換えることにより作製された抗TfR抗体が挙げられる。ヒト抗TfR抗体の適切な位置に移植されるCDRの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，例えばマウスである。
　本発明において，抗TfR抗体がヒト抗TfR抗体又はヒト化抗TfR抗体である場合につき，以下詳述する。ヒト抗TfR抗体及びヒト化抗TfR抗体の軽鎖には，λ鎖とκ鎖がある。抗TfR抗体を構成する軽鎖は，λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また，ヒト抗TfR抗体及びヒト化抗TfR抗体の重鎖には，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖があり，それぞれ，IgG，IgM，IgA，IgD及びIgEに対応している。抗TfR抗体を構成する重鎖は，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが，好ましくはγ鎖である。更に，抗TfR抗体の重鎖のγ鎖には，γ1鎖，γ2鎖，γ3鎖及びγ4鎖があり，それぞれ，IgG1，IgG2，IgG3及びIgG4に対応している。抗TfR抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合，そのγ鎖は，γ1鎖，γ2鎖，γ3鎖及びγ4鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ1鎖又はγ4鎖である。抗TfR抗体が，ヒト化抗TfR抗体又はヒト抗TfR抗体であり，且つＩｇＧである場合，その抗TfR抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく，その抗TfR抗体の重鎖は，γ1鎖，γ2鎖，γ3鎖及びγ4鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ1鎖又はγ4鎖である。例えば，好ましい抗TfR抗体の一つの態様として，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ1鎖であるものが挙げられる。
　本発明において，「キメラ抗TfR抗体」の語は，2つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗TfR抗体の断片が連結されてなる抗TfR抗体のことをいう。
　ヒト抗TfR抗体と他の哺乳動物の抗TfR抗体とのキメラ抗TfR抗体とは，ヒト抗TfR抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗TfR抗体の一部によって置き換えられた抗TfR抗体である。抗TfR抗体は，以下に説明するFc領域，Fab領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗TfR抗体の具体例として，Fc領域がヒト抗TfR抗体に由来する一方でFab領域が他の哺乳動物の抗TfR抗体に由来するキメラ抗TfR抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗TfR抗体又は他の哺乳動物の抗TfR抗体のいずれかに由来する。逆に，Fc領域が他の哺乳動物に由来する一方でFab領域がヒト抗TfR抗体に由来するキメラ抗TfR抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗TfR抗体又は他の哺乳動物の抗TfR抗体のいずれに由来してもよい。ヒト化抗TfR抗体についても同様のことがいえる。
　また，抗TfR抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗TfR抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（CH）と軽鎖の定常領域（CL）がヒト抗TfR抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（VH）及び軽鎖の可変領域（VL）が他の哺乳動物の抗TfR抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（CH）と軽鎖の定常領域（CL）が他の哺乳動物の抗TfR抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（VH）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗TfR抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウスである。ヒト化抗TfR抗体についても同様のことがいえる。なお，本発明の一実施形態において，単に重鎖というときは，これを適宜，重鎖の可変領域を含む部分と置き換えることができ，また，単に軽鎖というときは，これを適宜，軽鎖の可変領域を含む部分と置き換えることができる。
　ヒト抗TfR抗体とマウス抗TfR抗体のキメラ抗TfR抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗TfR抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗TfR抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗TfR抗体に由来する一方でFab領域がマウス抗TfR抗体に由来するキメラ抗TfR抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗TfR抗体に由来する一方でFab領域がヒト抗TfR抗体に由来するキメラ抗TfR抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗TfR抗体又はマウス抗TfR抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗TfR抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（CH）と軽鎖の定常領域（CL）がヒト抗TfR抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（VH）及び軽鎖の可変領域（VL）がマウス抗TfR抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（CH）と軽鎖の定常領域（CL）がマウス抗TfR抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（VH）及び軽鎖の可変領域（VL）がヒト抗TfR抗体に由来するものも挙げられる。ヒト化抗TfR抗体についても同様のことがいえる。
　抗TfR抗体は，本来，2本の免疫グロブリン軽鎖と2本の免疫グロブリン重鎖の計4本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗TfR抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）1本の免疫グロブリン軽鎖と1本の免疫グロブリン重鎖の計2本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のC末端側にリンカーを，そして更にそのC末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，
（３）免疫グロブリン重鎖のC末端側にリンカーを，そして更にそのC末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，
（４）免疫グロブリン重鎖の可変領域のC末端側にリンカーを，そして更にそのC末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させてなるものである一本鎖抗体（scFv），及び
（５）免疫グロブリン軽鎖の可変領域のC末端側にリンカーを，そして更にそのC末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域を結合させてなるものである一本鎖抗体（scFv），も含まれる。また，
（６）本来の意味での抗体の基本構造からFc領域が欠失したものであるFab領域からなるもの及びFab領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Fab，F(ab’)及びF(ab’)2を含む），及び
（７）単一ドメイン抗体も，本発明における「抗体」に含まれる。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカーを介して結合させて一本鎖抗体としたscFvも，本発明における抗体に含まれる。更には，TfRに対する親和性を有するようにアミノ酸配列が改変されたFc領域の全部又はその一部を含むものも，本発明における抗体に含まれる。
　なお，本発明において「リンカー」というときは，例えば，複数のアミノ酸がペプチド結合により結合したペプチド鎖からなるものをいう。かかるペプチド鎖からなるリンカーは「ペプチドリンカー」ということもできる。「リンカー」は本明細書の文脈において「リンカー配列」と言い換えることもできる。このリンカーのN末端とある蛋白質のC末端がペプチド結合で結合し，当該リンカーのC末端に更に他の蛋白質のN末端が結合することにより，2つの蛋白質がリンカーを介して結合体を形成する。
　2本の軽鎖と2本の重鎖の計4本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する抗体は，軽鎖の可変領域（VL）に3箇所の相補性決定領域（CDR）と重鎖の可変領域（VH）に3箇所の相補性決定領域（CDR）を有する。軽鎖の3箇所のCDRは，N末端側にあるものから順にCDR1，CDR2及びCDR3という。重鎖の3箇所のCDRも，N末端側にあるものから順にCDR1，CDR2及びCDR3という。ただし，これらCDRの一部又は全部が不完全であるか，又は存在しないものであっても，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，抗体に含まれる。軽鎖及び重鎖の可変領域（VL及びVH）のCDR以外の領域は，フレームワーク領域（FR）という。FRは，N末端側にあるものから順にFR1，FR2，FR3及びFR4という。通常，CDRとFRはN末端側から順に，FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4の順で存在する。
　本発明の一実施形態において，Fabとは，可変領域とCL領域（軽鎖の定常領域）を含む1本の軽鎖と，可変領域とCH1領域（重鎖の定常領域の部分1）を含む1本の重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Fabにおいて，重鎖は，可変領域とCH1領域（重鎖の定常領域の部分1）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Fabにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（CL領域）に存在するシステイン残基と，重鎖の定常領域（CH1領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Fabを形成する重鎖のことをFab重鎖という。Fabは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いているので，1本の軽鎖と1本の重鎖とからなる。Fabを構成する軽鎖は，可変領域とCL領域を含む。Fabを構成する重鎖は，可変領域とCＨ1領域からなるものであってもよく，可変領域，CH1領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。但しこの場合，ヒンジ部で2本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように，ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。F(ab’)においては，その重鎖は可変領域とCH1領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。F(ab’)2は２つのF(ab’)が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基どうしでジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。F(ab’)又はF(ab’)2を形成する重鎖のことをFab’重鎖という。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなるニ量体，三量体等の重合体も，抗体である。更に，これらに限らず，抗体分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において軽鎖というときは，軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，重鎖というときは，重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Fc領域が欠失したものも，重鎖である。
　また，ここでFc又はFc領域とは，抗体分子中の，CH2領域（重鎖の定常領域の部分2），及びCH3領域（重鎖の定常領域の部分3）からなる断片を含む領域のことをいう。
　更には，本発明の一実施形態における抗体は，
　（８）上記（６）で示したFab，F(ab’)又はF(ab’)2を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたscFab，scF(ab’)，及びscF(ab’)2も含まれる。ここで，scFab，scF(ab’)，及びscF(ab’)2にあっては，軽鎖のC末端側にリンカー配列を，そして更にそのC末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のC末端側にリンカーを，そして更にそのC末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とをリンカーを介して結合させて一本鎖抗体としたscFvも，本発明における抗体に含まれる。scFvにあっては，軽鎖の可変領域のC末端側にリンカー配列を，そして更にそのC末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のC末端側にリンカー配列を，そして更にそのC末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
　更には，本明細書でいう「抗体」には，完全長抗体，上記（１）～（８）に示されるものに加えて，（１）～（８）を含むより広い概念である，完全長抗体の一部が欠損したものいずれの形態も含まれる。
　「抗原結合性断片（抗体フラグメント）」の語は，抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいう。結合性断片の例としては，Fab，Fab’，F(ab’)2，可変領域（Fv），重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（scFv），重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ，scFvの重鎖（H鎖）に定常領域の一部（CH3）が結合したものの二量体であるミニボディ，その他の低分子化抗体等が挙げられる。抗原結合性断片には，重鎖抗体，軽鎖抗体，VHH，VNAR，及びこれらの一部が欠損したものも含まれる。但し，抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。
　本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のC末端側にリンカー配列が結合し，更にそのC末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のC末端側にリンカー配列が結合し，更にそのC末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。例えば，上記（２）及び（３）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Fc領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（CDR）を3つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，CDRを3つ有している。これらのCDRは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の3つのCDRが全てと，免疫グロブリン軽鎖の3つのCDRの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗トランスフェリン受容体抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，CDRの1個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。
　一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカーは，好ましくは2～50個，より好ましくは8～50個，更に好ましくは10～30個，更により好ましくは12～18個又は15～25個，例えば15個若しくは25個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカーは，これにより両鎖が連結されてなる抗トランスフェリン受容体抗体がトランスフェリン受容体に対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，又はこれらのアミノ酸配列が２～１０回，あるいは２～５回繰り返された配列を有するものである。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のC末端側に，リンカーを介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させてScFVとする場合，配列番号４の配列を有するリンカーが好適に用いられる。
　本発明の一実施形態における抗体は，ラクダ科動物（アルパカを含む）由来の抗体である。ラクダ科動物の抗体には，ジスルフィド結合により連結された2本の重鎖からなるものがある。この2本の重鎖からなる抗体を重鎖抗体という。VHHは，重鎖抗体を構成する重鎖の可変領域を含む1本の重鎖からなる抗体，又は重鎖抗体を構成する定常領域（CH）を欠く１本の重鎖からなる抗体である。VHHも本発明の実施形態における抗体の一つである。ラクダ科動物由来の抗体（VHHを含む）をヒトに投与したときの抗原性を低減させるために，ラクダ科動物の抗体のアミノ酸配列に変異を加えたものも，本発明の一実施形態における抗体である。ラクダ科動物の抗体のアミノ酸に変異を加える場合，本明細書に記載の抗体に加えることのできる変異と同様の変異を加えることができる。その他，ジスルフィド結合により連結された2本の軽鎖からなる抗体も本発明の実施形態における抗体の一つである。この2本の軽鎖からなる抗体を軽鎖抗体という。
　本発明の一実施形態における抗体は，サメ由来の抗体である。サメの抗体は，ジスルフィド結合により連結された2本の重鎖からなる。この2本の重鎖からなる抗体を重鎖抗体という。VNARは，重鎖抗体を構成する重鎖の可変領域を含む１本の重鎖からなる抗体，又は重鎖抗体を構成する定常領域（CH）を欠く1本の重鎖からなる抗体である。VNARも本発明の実施形態における抗体の一つである。サメ由来の抗体（VNARを含む）をヒトに投与したときの抗原性を低減させるために，サメの抗体のアミノ酸配列に変異を加えたものも，本発明の一実施形態における抗体である。サメの抗体のアミノ酸に変異を加える場合，本明細書に記載の抗体に加えることのできる変異と同様の変異を加えることができる。サメの抗体をヒト化したものも本発明の実施形態における抗体の一つである。
　本発明の一実施形態において，単一ドメイン抗体とは，単一の可変領域で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体のことをいう。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体），可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。VHH，VNARは単一ドメイン抗体の一種である。
　本発明の一実施形態において，抗TfR抗体は，TfRに対して特異的な親和性を有するので，脳血管内皮細胞の表面に存在するTfRに結合することができる。TfRに結合した抗TfR抗体は血液脳関門（BBB）を通過することができる。従って，所望の生理活性を有する蛋白質をTfRと結合させた融合蛋白質とすることにより，当該融合蛋白質を血液脳関門（BBB）を通過させて，当該蛋白質の生理活性を脳内で発揮させることができる。つまり，かかる融合蛋白質は，脳内で薬効を発揮させるべき医薬として使用し得る。
　本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「hTfR」の語は，配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質をいう。本発明の抗トランスフェリン受容体抗体は，その一実施態様において，配列番号１２で示されるアミノ酸配列中N末端側から89番目のシステイン残基からC末端のフェニルアラニンまでの部分（hTfRの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。
　一実施形態におけるFabである抗hTfR抗体の軽鎖は，抗hTfR抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列として，配列番号４０又は４１で示されるアミノ酸配列を有し，hTfR抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列として，配列番号４２又は４３で示されるアミノ酸配列を有し，hTfR抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列として，配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有するものである。一実施形態におけるFabである抗hTfR抗体の重鎖は，抗hTfR抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列として，配列番号４５又は４６で示されるアミノ酸配列を有し，hTfR抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列として，配列番号４７又は４８で示されるアミノ酸配列を有し，hTfR抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列として，配列番号４９又は５０で示されるアミノ酸配列を有するものである。
　一実施形態におけるFabである抗hTfR抗体は，配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と，配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含むものである。
　抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質における，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の結合様式として以下の（ａ）～（ｈ）が例示できる；
（ａ）抗TfR抗体が，抗体の重鎖のC末端側に抗体の軽鎖が結合したものである一本鎖抗体であり，その一本鎖抗体のN末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｂ）抗TfR抗体が，抗体の重鎖のC末端側に抗体の軽鎖が結合したものである一本鎖抗体であり，その一本鎖抗体のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｃ）抗TfR抗体が，抗体の軽鎖のC末端側に抗体の重鎖が結合したものである一本鎖抗体であり，その一本鎖抗体のN末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｄ）抗TfR抗体が，抗体の軽鎖のC末端側に抗体の重鎖が結合したものである一本鎖抗体であり，その一本鎖抗体のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｅ）抗TfR抗体が少なくとも一つの軽鎖と少なくとも一つの重鎖とを含む抗体であり，その抗体の軽鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｆ）抗TfR抗体が少なくとも一つの軽鎖と少なくとも一つの重鎖とを含む抗体であり，その抗体の軽鎖のN末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｇ）抗TfR抗体が少なくとも一つの軽鎖と少なくとも一つの重鎖とを含む抗体であり，その抗体の重鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの，
（ｈ）抗TfR抗体が少なくとも一つの軽鎖と少なくとも一つの重鎖とを含む抗体であり，その抗体の重鎖のN末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質が結合したもの。
　なお，上記（ａ）～（ｈ）において，軽鎖は軽鎖の可変領域，重鎖は重鎖の可変領域と適宜読み替えることができる。
　上記（ａ）～（ｈ）において，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質との間にリンカー配列を配置する場合，その配列は，好ましくは1～50個，より好ましくは1～17個，更に好ましくは1～10個，更により好ましくは1～5個のアミノ酸から構成されるものであるが，抗TfR抗体に結合させるべき蛋白質によって，リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，1個，2個，3個，1～17個，1～10個，10～40個，20～34個，23～31個，25～29個等と適宜調整できる。そのようなリンカー配列のアミノ酸配列は，これにより連結された抗TfR抗体がTfRとの親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結された蛋白質が，生理的条件下で当該蛋白質の生理活性を発揮できる限り，特に限定されない。そのアミノ酸配列は好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，又はこれらのアミノ酸配列が1～10個，あるいは2～5個連続してなる1～50個のアミノ酸からなる配列，2～17個，2～10個，10～40個，20～34個，23～31個，25～29個のアミノ酸からなる配列等を有するものである。例えば，アミノ酸配列Gly-Serを有するもの，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するもの，及び配列番号４で示されるアミノ酸配列のC末端にGly-Serが付加した17個のアミノ酸からなるものは，リンカー配列として好適に用いることができる。
　なお，便宜上，本発明において，抗TfR抗体の軽鎖又は重鎖と生理活性を有する蛋白質とを結合するリンカー配列（リンカー）をリンカー配列（リンカー）又は第一のリンカー配列（第一のリンカー）といい，一本鎖抗体である抗TfR抗体において軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列（リンカー）を第二のリンカー配列（第二のリンカー）とする。
　本発明の一実施形態における核酸分子は，第一の逆方向末端反復（ITR）と第二の逆方向末端反復（ITR）の間に，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むものである。以下の（１）～（４）は当該核酸分子の例示である：
（１）融合蛋白質が，抗TfR抗体の重鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を直接又はリンカーを介して結合させた結合体と抗TfR抗体の軽鎖とを含むものであり，軽鎖をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に当該結合体をコードする塩基配列を含むもの；
（２）融合蛋白質が，抗TfR抗体の重鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を直接又はリンカーを介して結合させた結合体と抗TfR抗体の軽鎖とを含むものであり，当該結合体をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に軽鎖をコードする塩基配列を含むもの；
（３）融合蛋白質が，抗TfR抗体の軽鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を直接又はリンカーを介して結合させた結合体と抗TfR抗体の重鎖とを含むものであり，重鎖をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に当該結合体をコードする塩基配列を含むもの；
（４）融合蛋白質が，抗TfR抗体の軽鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を直接又はリンカーを介して結合させた結合体と抗TfR抗体の重鎖とを含むものであり，当該結合体をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に重鎖をコードする塩基配列を含むもの。
　上記（１）～（４）において，核酸分子は，第一の逆方向末端反復（ITR）と融合蛋白質をコードする遺伝子の間に，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列が含むものであってもよい。また，上記（１）～（４）において，内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列を，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列に代えてもよい。なお，これに限らず，核酸分子が2つの遺伝子発現制御部位を有する場合，便宜上，第一の逆方向末端反復（ITR）側から順に，第一の遺伝子発現制御部位及び第一の遺伝子発現制御部位とする。また，上記（１）～（４）において，内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列を，2A自己切断ペプチドをコードする塩基配列に代えてもよい。豚テッショウウイルス由来2Aペプチドは，2A自己切断ペプチドの好適な一例である。また，上記（１）～（４）において，軽鎖は軽鎖の可変領域，重鎖は重鎖の可変領域と適宜読み替えることができる。
　抗TfR抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明の一実施形態における核酸分子は，第一の逆方向末端反復（ITR）と第二の逆方向末端反復（ITR）の間に，一本鎖抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むものである。以下の（１）～（４）は当該核酸分子の例示である：
（１）抗TfR抗体の重鎖のC末端側に第二のリンカーを介して軽鎖を結合させ，更に軽鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（２）抗TfR抗体の軽鎖のC末端側に第二のリンカーを介して重鎖を結合させ，更に軽鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（３）生理活性を有する蛋白質のC末端側に直接又はリンカーを介して抗TfR抗体の重鎖を結合させ，更に重鎖のC末端側に軽鎖を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（４）生理活性を有する蛋白質のC末端側に直接又はリンカーを介して抗TfR抗体の軽鎖を結合させ，更に重鎖のC末端側に重鎖を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの。
　上記（１）～（４）において，核酸分子は，第一の逆方向末端反復（ITR）と融合蛋白質をコードする遺伝子の間に，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列が含むものであってもよい。また，上記（１）～（４）において，軽鎖は軽鎖の可変領域，重鎖は重鎖の可変領域と適宜読み替えることができる。
　本発明の一実施形態として，当該融合蛋白質が，抗TfR抗体の重鎖のFab領域の下流にリンカーを介してヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（hI2S）が結合したものと，抗TfR抗体の軽鎖を含むものが挙げられる。その具体的例として，抗TfR抗体の重鎖のFab領域が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み，リンカーが配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み，hI2Sが配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むものであり，抗TfR抗体の軽鎖が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むものがある。ここで結合体は，全体として配列番号５１で示されるアミノ酸配列を含む。
　本発明の一実施形態における核酸分子は，第一の長い末端反復（LTR）と第二の長い末端反復（LTR）の間に，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むものである。以下の（１）～（４）は当該核酸分子の例示である：
（１）融合蛋白質が，抗TfR抗体の重鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を結合させた結合体と抗TfR抗体の軽鎖とを含むものであり，軽鎖をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に当該結合体をコードする塩基配列を含むもの，
（２）融合蛋白質が，抗TfR抗体の重鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を結合させた結合体と抗TfR抗体の軽鎖とを含むものであり，当該結合体をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に軽鎖をコードする塩基配列を含むもの，
（３）融合蛋白質が，抗TfR抗体の軽鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を結合させた結合体と抗TfR抗体の重鎖とを含むものであり，重鎖をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に当該結合体をコードする塩基配列を含むもの，
（４）融合蛋白質が，抗TfR抗体の軽鎖のC末端側又はN末端側に生理活性を有する蛋白質を結合させた結合体と抗TfR抗体の重鎖とを含むものであり，当該結合体をコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，その下流に重鎖をコードする塩基配列を含むもの。
　上記（１）～（４）において，核酸分子は，第一の逆方向末端反復（LTR）と融合蛋白質をコードする遺伝子の間に，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列が含むものであってもよい。また，上記（１）～（４）において，内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列を，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列に代えてもよい。核酸分子が2つの遺伝子発現制御部位を有する場合，便宜上，第一の逆方向末端反復（LTR）側から順に，第一の遺伝子発現制御部位及び第一の遺伝子発現制御部位とする。また，上記（１）～（４）において，内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列を，2A自己切断ペプチドをコードする塩基配列に代えてもよい。豚テッショウウイルス由来2Aペプチドは，2A自己切断ペプチドの好適な一例である。また，上記（１）～（４）において，軽鎖は軽鎖の可変領域，重鎖は重鎖の可変領域と適宜読み替えることができる。
　抗TfR抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明の一実施形態における核酸分子は，第一の長い末端反復（LTR）と第二の長い末端反復（LTR）の間に，一本鎖抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むものである。以下の（１）～（４）は当該核酸分子の例示である：
（１）抗TfR抗体の重鎖のC末端側に第二のリンカーを介して軽鎖を結合させ，更に軽鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（２）抗TfR抗体の軽鎖のC末端側に第二のリンカーを介して重鎖を結合させ，更に軽鎖のC末端側に直接又はリンカーを介して生理活性を有する蛋白質を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（３）生理活性を有する蛋白質のC末端側に直接又はリンカーを介して抗TfR抗体の重鎖を結合させ，更に重鎖のC末端側に軽鎖を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの；
（４）生理活性を有する蛋白質のC末端側に直接又はリンカーを介して抗TfR抗体の軽鎖を結合させ，更に重鎖のC末端側に重鎖を結合させたものである融合蛋白質をコードする遺伝子を含むもの。
　上記（１）～（４）において，核酸分子は，第一の長い末端反復（LTR）と融合蛋白質をコードする遺伝子の間に，遺伝子発現制御部位を含む塩基配列が含むものであってもよい。また，上記（１）～（４）において，軽鎖は軽鎖の可変領域，重鎖は重鎖の可変領域と適宜読み替えることができる。
　上記内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列を含む核酸分子にあっては，遺伝子発現制御部位から融合蛋白質を構成する一方のペプチド鎖の，内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列から他方のペプチド鎖の発現が制御されることになる。両ペプチド鎖は，細胞内で対をなして抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質が形成される。
　本発明の一実施形態において，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質は，融合蛋白質を構成する抗TfR抗体部分のアミノ酸配列を適宜選択することにより，又は／及び，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質との結合形式を適宜選択することにより，融合蛋白質のTfRに対する親和性（結合活性）を，調整することができる。ここで，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の結合形式を適宜選択する，とは，例えば，（１）元の融合蛋白質が抗TfR抗体の重鎖に生理活性を有する蛋白質が結合しているものである場合，抗TfR抗体の重鎖に代えて軽鎖に生理活性を有する蛋白質を結合させることであり，（２）元の融合蛋白質が抗TfR抗体の軽鎖に生理活性を有する蛋白質が結合しているものである場合，抗TfR抗体の軽鎖に代えて重鎖に生理活性を有する蛋白質を結合させることであり，（３）抗TfR抗体の重鎖又は軽鎖のN末端に生理活性を有する蛋白質が結合している場合，抗TfR抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に生理活性を有する蛋白質を結合させることであり，（４）抗TfR抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に生理活性を有する蛋白質が結合している場合，抗TfR抗体の重鎖又は軽鎖のN末端に生理活性を有する蛋白質を結合させることであり，（５）抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖又は軽鎖に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合している場合，そのリンカーのアミノ酸配列を変更（リンカーの長さを変更することを含む），又はリンカーを欠失させることである。これら（１）～（５）を組み合わせた結合形式の変更とすることもできる。これらの結合形式の変更により，例えば，立体障害が生まれ，融合蛋白質の抗TfR抗体部分とTfRとの結合が阻害され，結果として融合蛋白質全体としてのTfRに対する親和性（結合活性）が低下する。
　融合蛋白質全体としてのTfRに対する親和性（結合活性）をある一定の値を示すように調整された融合蛋白質では，細胞表面にTfRを多く発現している網状赤血球に融合蛋白質が結合することに起因する，網状赤血球の機能を障害する効果が抑制される。網状赤血球の機能が障害されると，血中の赤血球数が減少し貧血症状を呈する。TfRへの親和性がある一定の値を示す融合蛋白質では，これを生体内に投与したときに生じる貧血症状が抑制される。貧血症状の重症度は，血中のヘモグロビン濃度を正常個体と比較することにより客観的に判断することができる。ヘモグロビン濃度と貧血症状の重症度は逆相関にあり，ヘモグロビン濃度が低いほど貧血症状の重症度は高い。
　また，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質の，融合蛋白質全体としてのTfRに対する親和性（結合活性）が非常に高い場合には，内因性のトランスフェリンのTfRへの結合を強く阻害し，TfRを介した細胞内へのトランスフェリンの輸送が阻害されて，細胞が鉄欠乏に陥るおそれがある。本発明の一実施形態の融合蛋白質では，抗TfR抗体を生体内に投与したときに細胞が鉄欠乏状態となる危険性を低減できる。
　薬剤として抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質を皮下注射，筋肉内注射，静脈内注射等の手段で投与する場合，副反応として貧血症状が認められた場合には，投与を中断すればよい。しかし，融合蛋白質をコードする遺伝子を用いて遺伝子治療を行う場合，投与された遺伝子から当該融合蛋白質が長期的に継続して生体内に放出されることになる。従って，副反応が生じた場合であっても，その発現を中断させることはできない。本発明の一実施形態は，TfRに対する親和性（結合活性）を適宜調整することにより，患者の体内で当該融合蛋白質が持続的に発現することにより生じることが予想される副反応の発生を抑制するものである。
　抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子が遺伝子治療に用いられる場合には特に，融合蛋白質全体としてのTfRに対する親和性（結合活性）が問題となる。従って，融合蛋白質を構成する抗TfR抗体部分に変異を加えること等によりアミノ酸配列，又は／及び，TfRと生理活性を有する蛋白質の結合形式を適宜調節することにより，融合蛋白質全体としてのTfRに対する親和性（結合活性）を調整した融合蛋白質をコードする遺伝子が用いられる。かかる遺伝子を用いることにより，生体内で融合蛋白質が発現することにより起因する貧血症状が抑制され，且つ当該融合蛋白質が，細胞上のTfRを介して細胞内へ移行して生理活性を発揮することができる，安全な遺伝子治療用の治療剤の開発が可能となる。すなわち，かかる融合蛋白質をコードする遺伝子は，安全な遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして用いることができる。特に，当該融合蛋白質が，脳血管内皮細胞の表面に存在するTfRに結合することにより血液脳関門（BBB）を通過させるべきものであれば，当該融合蛋白質をコードする遺伝子は，安全性の高い脳及び中枢神経系における障害に対する遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして用いることができる。
　遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして当該融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合，抗TfR抗体又は抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質とのTfRとの結合活性は，例えば，ELISA法を用いた測定に基づく50%効果濃度（EC50）によって評価できる。50%効果濃度は，例えば実施例１５に記載の方法で測定することができる。本発明の一実施形態において，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質とTfRとの結合活性は，当該測定方法により測定した場合に，50%効果濃度が，好ましくは3 nM～10 μMであり，好ましくは3 nM～5 μMであり，例えば，3 nM～2 μM，3 nM～1 μM，3 nM～500 nM，3 nM～200 nM，3 nM～100 nMであり， 3.5 nM～2 μM，3.5 nM～1 μM，3.5 nM～500 nM，3.5 nM～200 nM，3.5 nM～100 nであり，4 nM～2 μM，4 nM～1 μM， 4 nM～500 nM，4 nM～200 nM， 4 nM～100 nMであり，5 nM～5 μM，5 nM～1 μM， 5 nM～500 nM，5 nM～200 nM， 5 nM～100 nMであり，10 nM～5 μM，10 nM～1 μM， 5 nM～500 nM，5 nM～200 nM 5 nM～100 nM，10～100 nMである。なお，抗TfR抗体が抗ヒトTfRである場合にあっては，実施例１５に記載の方法において，マウストランスフェリン受容体細胞外ドメインに換えて，例えば，配列番号１２で示されるアミノ酸配列の87番目から763番目までのアミノ酸配列を有するヒトトランスフェリン受容体細胞外ドメインを用いて50%効果濃度（EC50）を求めてもよい。
　本発明の一実施形態における核酸分子は，AAVを応用した遺伝子治療用の治療剤の一部を構成するものとして用いることができる。野生型のAAVが宿主細胞のヒト細胞に単独で感染すると，ウイルスゲノムは，ウイルスゲノムの両端に存在する逆方向末端反復（ITR）を介して，第19番染色体に部位特異的に組み込まれる。宿主細胞のゲノム中に取り込まれたウイルスゲノムの遺伝子はほとんど発現しないが，細胞がヘルパーウイルスに感染するとAAVは宿主ゲノムから切り出され，感染性ウイルスの複製が開始される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスの場合，ヘルパー作用を担う遺伝子はE1A，E1B，E2A，VA1，及びE4である。ここで，宿主細胞が，アデノウイルスのE1A，E1Bでトランスフォームしたヒト胎児腎組織由来細胞であるHEK293細胞の場合にあっては，E1A及びE1B遺伝子は，宿主細胞において元々発現している。なお，本発明の一実施形態において，AAVベクターとは，rAAVビリオンを作製するために用いられる，AAVゲノムに由来する第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列を有し，且つ，外来の遺伝子を組み込むことができるベクターのことをいう。AAVベクターにおいて外来の遺伝子を組み込むことのできる箇所は，第一と第二の逆方向末端反復（ITR）の間に配置させることができる。外来の遺伝子が組み込まれたAAVベクターもまたAAVベクターである。
　野生型AAVゲノムは2つの遺伝子rep及びcapを含む。rep遺伝子から産生されるrep蛋白質（rep78，rep68，rep52及びrep40）は，カプシド形成に必須であるとともに，ウイルスゲノムの染色体への組み込みに介在する。cap遺伝子は3つのカプシド蛋白質（VP1，VP2及びVP3）の産生を担う。
　野生型AAVのゲノムでは，両端にITRが存在し，ITRの間にrep遺伝子及びcap遺伝子が存在する。このゲノムがカプシドに内包されてAAVビリオンが形成される。一実施形態において，組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）は，野生型AAVゲノムのrep遺伝子及びcap遺伝子を含む領域を，外来の蛋白質をコードする遺伝子で置換したものが，cap遺伝子にコードされるカプシドに内包されたものである。但し，これに限らず，野生型AAVゲノムの一部を，外来の蛋白質をコードする遺伝子で置換したものがカプシドに内包されたものは，組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）である。
　rAAVビリオンは，外来の遺伝子を細胞に送達するためのベクターとして治療目的に用いることができる。本発明の具体的態様において，rAAVビリオン及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
　外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いられる組換えAAVビリオンの生産には，通常，（１）AAV等のウイルスに由来する第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む構造を有するプラスミド（プラスミド1），（２）前記ITR配列に挟まれた領域（ITR配列を含む）の塩基配列を宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有するAAV Rep遺伝子と，AAVのカプシド蛋白質をコードする遺伝子とを含むプラスミド（プラスミド2），及び（３）アデノウイルスのE2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域を含むプラスミド（プラスミド3）の3種類のプラスミドが用いられる。但し，これに限らず，プラスミド1～3のうちの2つを連結させて一つのプラスミドとしたものと，残りの一つのプラスミドの2種類のプラスミドを用いることもできる。更に，プラスミド1～3を連結させて一つのプラスミドとしたものを用いることもできる。本発明における所望の蛋白質は，リガンドと生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質である。
　一般に，組換えAAVビリオンの生産には，まず，これら3種類のプラスミドが，アデノウイルスのE1a遺伝子とE1b遺伝子がゲノム中に組み込まれたHEK293細胞等の宿主細胞に一般的なトランスフェクション手法により導入される。そうすると第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む領域が宿主細胞で複製され，生じた一重鎖DNAがAAVのカプシド蛋白質にパッケージングされて，組換えAAVビリオンが形成される。この組換えAAVビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。本発明の一実施形態における外来の遺伝子は，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子である。導入先の細胞等ではこの遺伝子から該融合蛋白質が発現するようになる。
　アデノ随伴ウイルス（AAV）のRep蛋白質は，AAVのrep遺伝子にコードされる。Rep蛋白質は，例えばAAVゲノムを，当該ゲノム中に存在するITRを介して，宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有する。Rep蛋白質は複数のサブタイプが存在するが，AAVゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みには，Rep68とRep78の2種類が必要とされる。Rep68とRep78は，同一の遺伝子から選択的スプライシングにより転写される2種類のmRNAの翻訳産物である。本発明においてAAVのRep蛋白質というときは，少なくともRep68とRep78の2種類の蛋白質を含むものである。
　本発明の一実施形態において，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質をコードする塩基配列（Rep領域の塩基配列）というときは，少なくともRep68とRep78をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列のことをいう。Rep蛋白質は，好ましくは血清型2のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型1，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れのものであってもよい。野生型の血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列の好ましい一例として配列番号３２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。
　また，Rep68は，その機能を発揮する限り，血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れかのAAVの野生型のRep68のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされた変異体であってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。
　野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep68のアミノ酸配列中若しくはN末端又はC末端に，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。変異を加えたRep68のアミノ酸配列は，野生型のRep68のアミノ酸配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更に好ましくは98%以上の同一性を示す。
　また，Rep78は，その機能を発揮する限り，血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れかのAAVの野生型のRep78のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされた変異体であってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。
　野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep78のアミノ酸配列中若しくはN末端又はC末端に，好ましくは1～10個，より好ましくは1～5個，更に好ましくは1～3個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。変異を加えたRep78のアミノ酸配列は，野生型のRep78のアミノ酸配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更に好ましくは98%以上の同一性を示す。
　AAVのRep蛋白質の機能的等価物とは，Rep68にあっては，機能的にRep68に代えて用いることができるものをいい，Rep78にあっては，機能的にRep78に代えて用いることができるものをいう。Rep蛋白質の機能的等価物は，野生型のRep蛋白質の変異体であってもよい。
　配列番号３２で示される塩基配列は，機能的なRep68及びRep78をコードするものである限り，置換，欠失，付加等の改変を加えることができる。配列番号３２で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。配列番号３２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号３２で示される塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号３２で示される塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更に好ましくは98%以上の同一性を示す。但し，これら変異を加える場合において，Rep蛋白質のRep68とRep78とをコードする遺伝子の開始コドンをACGとすることが好ましい。
　本発明の一実施形態においてアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質をコードする塩基配列（Cap領域の塩基配列）というときは，少なくともAAVのカプシドを構成する蛋白質の一種であるVP1をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列を含む塩基配列のことをいう。VP1は，好ましくは血清型8のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れのものであってもよい。血清型8のCap領域の塩基配列の好適例として，配列番号３１で示される塩基配列を含むものが挙げられる。
　また，VP1は，その機能を発揮する限り，血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11の何れかのAAVの野生型のVP1のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたVP1も，VP1に含まれる。
　配列番号３１で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。配列番号３１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号３１で示される塩基配列中若しくは5’末端又は3’末端に，好ましくは1～20個，より好ましくは1～10個，更に好ましくは1～3個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号３１で示される塩基配列と，好ましくは80%以上の同一性を示し，より好ましくは85%以上の同一性を示し，更に好ましくは90%以上の同一性を示し，更に好ましくは，95%以上の同一性を示し，更により好ましくは98%以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，AAVベクターを用いて，第一のITRと第二のITRとの間に外来の遺伝子を含む核酸分子がパッケージングされた組換えAAVビリオンを得ることができる。組換えAAVビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。本発明における外来の遺伝子は，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子である。当該遺伝子が導入された細胞等ではこの遺伝子から融合蛋白質が発現するようになる。第一のITRと第二のITRとの間に外来の遺伝子を含む核酸分子がパッケージングされた組換えビリオンであって，細胞等に遺伝子を導入するために用いることができるものとして，AAVを応用したもの（AAVベクター系）以外に，アデノウイルスを応用したもの（アデノウイルスベクター系）がある。アデノウイルスベクター系においては，第一のITRと第二のITRとの間に外来の遺伝子を含む核酸分子がパッケージングされた組換えアデノウイルスビリオンが得られる。組換えアデノウイルスビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。
　AAVウイルスを応用した遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合の，当該融合蛋白質とTfRとの結合活性の好ましい態様について，以下に詳述する。なお，これらの態様は，アデノウイルスを応用したもの，レンチウイルスを応用したもの，レトロウイルスを応用したものにも適用できる。すなわち，当該融合蛋白質とのTfRとの結合活性は，例えば，実施例１５に記載のELISA法により測定した50%効果濃度（EC50）の値が，好ましくは0.5 nM～10 μMであり，より好ましくは3 nM～5 μMであり，例えば，0.5 nM～5 μM，0.5 nM～1 μM，1 nM～2 μM，1 nM～1 μM，3 nM～2 μM，3 nM～1 μM，3～500 nM，3～200 nM，3～100 nMであり，3.5 nM～2 μM，3.5 nM～1 μM，3.5～500 nM，3.5～200 nM，3.5～100 nであり，4 nM～2 μM，4 nM～1 μM，4～500 nM，4～200 nM，4～100 nMであり，5 nM～5 μM，5 nM～1 μM，5～500 nM，5～200 nM，5～100 nMであり，10 nM～5 μM，10 nM～1 μM，5～500 nM，5～200 nM，5～100 nM，10～100 nMである。これらのEC50の値は，融合蛋白質が抗TfR抗体とリソソーム酵素の融合蛋白質，例えば，TfR抗体とヒトI2Sの融合蛋白質，TfR抗体とヒトGAAの融合蛋白質である場合に，特に好ましいものである。なお，抗TfR抗体が抗ヒトTfRである場合にあっては，実施例１５に記載の方法において，マウストランスフェリン受容体細胞外ドメインに換えて，例えば，配列番号１２で示されるアミノ酸配列の87番目から763番目までのアミノ酸配列を有するヒトトランスフェリン受容体細胞外ドメインを用いて50%効果濃度（EC50）を求めてもよい。なお，融合蛋白質をコードする遺伝子を含むDNA断片がパッケージされたrAAVビリオンは，AAVウイルスを応用した遺伝子治療用の医薬の一態様である。
　当該医薬の投与量は，患者の症状等に応じて適宜調整されるべきものであるが，前の段落に記載されたEC50の値を有する，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子がパッケージされたrAAVビリオンにあっては，投与量は好ましくは1.0×1010～1.0×1014 vg/kgであり，例えば，1.0×1010～5.0×1013 vg/kg，1.0×1010～2.0×1013 vg/kg，1.0×1010～1.0×1013 vg/kg，1.0×1011～1.0×1013 vg/kg，1.0×1011 vg/kg，1.0×1012 vg/kg，2.0×1012 vg/kg，5.0×1012 vg/kg，6.0×1012 vg/kg，1.0×1013 vg/kg，である。つまり，貧血症状を惹起させることなく広い範囲で投与量を安全に増減させることができる。また，当該医薬の投与間隔には特に限定はなく，例えば，血中の該融合蛋白質の濃度が，所定の濃度以下になった場合に，再度投与することができる。ここで所定の濃度以下になるとは，投与1週～10年後，例えば投与3～6週後の何れかの日に測定した血中濃度と比較して，該融合蛋白質の濃度が5%以下，10%以下，20%以下，又は50%以下になることをいう。血中の該融合蛋白質の濃度が低下しない限り，投与回数は1回限りとすることができる。
　AAVウイルスを応用した遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合の，当該融合蛋白質のTfRとの結合活性は，1回当たりの投与量を制限することによって，上記の抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質全般に適用されるものに加えて，実施例１５に記載のELISA法により測定した50%効果濃度（EC50）の値が3 nM未満，例えば，0.5～3 nM，0.8～3 nM，又は1～3 nMとすることもできる。この場合の1回当たりの投与量は，1.0×1013 vg/kgを超えてはならず，好ましくは7.5×1012 vg/kg以下，より好ましくは6.0×1012 vg/kg以下，更に好ましくは5.0×1012 vg/kg以下，3.0×1012 vg/kg以下，又は2.5×1012 vg/kg以下等に調整される。例えば，1回当たりの投与量は1.0×1010～7.5×1012 vg/kg，1.0×1011～7.5×1012 vg/kg，5.0×1011～7.5×1012 vg/kg，1.0×1010～6.0×1012 vg/kg，1.0×1011～6.0×1012 vg/kg，5.0×1011～6.0×1012 vg/kg，1.0×1010～5.0×1012 vg/kg，1.0×1011～5.0×1012 vg/kg，5.0×1011～5.0×1012 vg/kg，1.0×1010～3.0×1012 vg/kg，1.0×1011～3.0×1012 vg/kg，5.0×1011～3.0×1012 vg/kg，1.0×1010～2.5×1012 vg/kg，1.0×1011～2.5×1012 vg/kg，5.0×1011～2.5×1012 vg/kg，1.0×1010～2.0×1012 vg/kg，1.0×1011～2.0×1012 vg/kg，又は5.0×1011～2.0×1012 vg/kgに調整される。但し，EC50の値が3 nM未満であるものの投与は，貧血症状を惹起する可能性があるので，投与後の患者の体調を慎重に観察する必要がある。その観点において，EC50の値が3 nM以上のものが，遺伝子治療用の医薬として優れているといえる。しかし，それでもなお，EC50の値が3 nM未満であるものの投与は，薬効をもたらす可能性があるので臨床的価値があるといえる。
　また，AAVウイルスを応用した遺伝子治療用の医薬の一部を構成するものとして抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合であって，当該生理活性を有する蛋白質がヒトI2Sである場合にあっては，当該融合蛋白質のTfRとの結合活性は，上記のものに加えて，実施例１５に記載のELISA法により測定したEC50の値が3 nM未満，例えば，0.5～3 nM，0.8～3 nM，又は1～3 nM（0.5～4 nM，0.8～4 nM，又は1～4 nM）とすることもできる。但し，この場合の1回当たりの投与量は，1.0×1013 vg/kgを超えてはならず，好ましくは7.5×1012 vg/kg以下，より好ましくは6.0×1012 vg/kg以下，更に好ましくは5.0×1012 vg/kg以下，より更に好ましくは3.0×1012 vg/kg以下，2.5×1012 vg/kg以下等に調整される。例えば，1回当たりの投与量は1.0×1010～7.5×1012 vg/kg，1.0×1011～7.5×1012 vg/kg，5.0×1011～7.5×1012 vg/kg，1.0×1010～6.0×1012 vg/kg，1.0×1011～6.0×1012 vg/kg，5.0×1011～6.0×1012 vg/kg，1.0×1010～5.0×1012 vg/kg，1.0×1011～5.0×1012 vg/kg，5.0×1011～5.0×1012 vg/kg，1.0×1010～3.0×1012 vg/kg，1.0×1011～3.0×1012 vg/kg，5.0×1011～3.0×1012 vg/kg，1.0×1010～2.5×1012 vg/kg，1.0×1011～2.5×1012 vg/kg，5.0×1011～2.5×1012 vg/kg，1.0×1010～2.0×1012 vg/kg，1.0×1011～2.0×1012 vg/kg，又は5.0×1011～2.0×1012 vg/kgに調整される。
　つまり，抗TfR抗体とヒトI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合にあっては，1回当たりの投与量が，好ましくは7.5×1012 vg/kg以下，より好ましくは6.0×1012 vg/kg以下，更に好ましくは5.0×1012 vg/kg以下，より更に好ましくは3.0×1012 vg/kg以下，2.5×1012 vg/kg以下等に調整されることを条件にして，当該融合蛋白質とのTfRとのEC50の値が，0.5 nM以上，0.8 nM以上，又は1 nM以上であるものも，使用することができる。例えば，EC50の値は，好ましくは0.5 nM～1 μM，より好ましくは0.5～100 nM，更に好ましくは0.5～10 nM，より更に好ましくは0.5～5 nMであり，例えば，0.5～4 nM，0.5～3 nM，0.8 nM～1 μM，0.8～500 nM，0.8～100 nM，0.8～10 nM，0.8～5 nM，0.8～4 nM，0.8～3 nMであり，1.0 nM～1 μM，1.0～500 nM，1.0～100 nM，1.0～10 nM，1.0～5 nM，1.0～4 nM，1.0～3 nMであり，1 nM～5 μM，1 nM～1 μM，1～500 nM，1～200 nM，1～100 nMであり，1 nM～5 μM，1 nM～1 μM，1～500 nM，1～200 nM，又は1～100 nMである。
　但し，抗TfR抗体とヒトI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合の，当該融合蛋白質とのTfRとのEC50の値が3 nM未満（4 nM未満）であるものの投与は，貧血症状を惹起する可能性があるので，投与量の設定が制限される欠点がある。また，投与後の患者の体調を慎重に観察する必要がある。その観点において，EC50の値が3 nM以上（又は4 nM以上）のものが，遺伝子治療用の医薬として優れているといえる。しかし，それでもなお，EC50の値が3 nM未満（4 nM未満）であるものの投与は，薬効をもたらす可能性があるので臨床的価値があるといえる。
　抗TfR抗体とヒトI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合にあっては，投与間隔には特に限定はなく，例えば，血中の該融合蛋白質の濃度が，所定の濃度以下になった場合に，再度投与することができる。ここで所定の濃度以下になるとは，投与1週～10年後，例えば投与3～6週後の何れかの日に測定した血中濃度と比較して，該融合蛋白質の濃度が5%以下，10%以下，20%以下，50%以下になることをいう。血中の該融合蛋白質の濃度が低下しない限り，投与回数は1回限りとすることができる。
　上記の，抗TfR抗体とヒトI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合の投与量は，抗TfR抗体と他の生理活性物質との融合蛋白質，例えば，抗TfR抗体と他のリソソーム酵素との融合蛋白質にも適用し得る。
　レンチウイルスはレトロウイルス科の亜科の一つであるオルトレトロウイルス亜科のうちレンチウイルス属に属するウイルスであり，一本鎖の（+）鎖RNAゲノム（ssRNA）を有する。レンチウイルスのゲノムは必須遺伝子としてgag（カプシド蛋白質を含む構造蛋白質をコードする領域），pol（逆転写酵素を含む酵素群をコードする領域），env（宿主細胞への結合に必要なエンベロープ蛋白質をコードする領域）を含み，これらが2つのLTR（5’LTR及び3’LTR）に挟まれている。またこれらに加え，レンチウイルスのゲノムは，補助遺伝子として，Rev（ウイルスRNA内に存在するRRE（rev responsive element）に結合してウイルスRNAを核から細胞質に輸送する機能を有する蛋白質をコードする領域），tat（5’LTR内にあるTARに結合してLTRのプロモーター活性を上昇させる機能を有する蛋白質をコードする領域），その他vif，vpr，vpu，nef等を含む。
　レンチウイルスはエンベロープウイルスであり，エンベロープが細胞膜と融合することで細胞に感染する。また，レンチウイルスはRNAウイルスであり，ビリオン中には逆転写酵素が存在する。レンチウイルスの感染後，逆転写酵素により，（+）鎖RNAゲノムから一本鎖のプラス鎖DNAが複製され，更に二重鎖DNAが合成される。この二重鎖DNAからビリオンの構成成分である蛋白質が発現し，これに（+）鎖RNAゲノムがパッケージングされることによりビリオンが増殖する。本発明の一実施形態において，レンチウイルスベクター系は，レンチウイルスの一種であるHIV-1のゲノムに基づき開発されたものがあるが，これに限られるものではない。
　第一世代レンチウイルスベクター系は，パッケージングプラスミド，Envプラスミド，及び導入プラスミドの3種のプラスミドからなる。パッケージングプラスミドはCMVプロモーター等の制御下にgag及びpolの各遺伝子を有する。EnvプラスミドはCMVプロモーター制御下にenv遺伝子を有する。導入プラスミドは，5’LTR，RRE，CMVプロモーター制御下に所望の蛋白質をコードする遺伝子，及び3’LTRを有する。これらを宿主細胞に一般的なトランスフェクション手法により導入することで，第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に外来の遺伝子を含む核酸分子がカプシド蛋白質中にパッケージングされた組換えビリオンが得られる。第一世代レンチウイルスベクター系のパッケージングプラスミドには，ウイルス由来のrev，tat，vif，vpr，vpu，及びnefの各補助遺伝子も含まれる。ここにおいて本発明における所望の蛋白質は，抗TfR抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質である。なお，所望の蛋白質をコードする遺伝子を制御するプロモーターをCMVプロモーター以外のプロモーター，例えばSV40初期プロモーター，ヒト伸長因子-1α（EF-1α）プロモーター，ヒトユビキチンCプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，β-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター，マウスアルブミンプロモーター，ヒトアルブミンプロモーター，及びヒトα-1アンチトリプシンプロモーターを含むものが好適である。例えば，マウスαフェトプロテインエンハンサーの下流にマウスアルブミンプロモーターを含む配列番号９で示される塩基配列を有する合成プロモーター（マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター）等とすることもできる。
　第二世代レンチウイルスベクター系も，第一世代と同じくパッケージングプラスミド，Envプラスミド（エンベローププラスミド），及び導入プラスミドの3種のプラスミドからなる。但し，パッケージングプラスミドから，必須遺伝子でないvif，vpr，vpu，及びnefの各補助遺伝子は削除されている。
　第三世代レンチウイルスベクター系は，パッケージングプラスミド，Envプラスミド（エンベローププラスミド），Revプラスミド，及び導入プラスミドの4種のプラスミドからなる。第三世代では，第二世代でパッケージングプラスミドにあったrevを独立させてRevプラスミドとしている。また，パッケージングプラスミドからtatが削除されている。更に，導入プラスミドの5’LTR内のTARがCMVプロモーターに置き換えられている。
　組換えレンチウイルスビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。本発明における外来の遺伝子は，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子である。当該遺伝子が導入された細胞等ではこの遺伝子から融合蛋白質が発現するようになる。
　レトロウイルスは，一本鎖の（+）鎖RNAゲノム（ssRNA）を有する。ウイルスゲノムには，gag（カプシド蛋白質を含む構造蛋白質をコード），pol（逆転写酵素を含む酵素群をコード），env（宿主細胞への結合に必要なエンベロープ蛋白質をコード）及びパッケージングシグナル（Ψ）の各遺伝子がコードされており，これらが2つの長い末端反復（LTR，5’LTR及び3’LTR）に挟まれている。レトロウイルスは宿主細胞に感染すると，（+）鎖RNA及び逆転写酵素が細胞内に移行し，2本鎖DNAへと逆転写される。
　レトロウイルスベクター系は主にマウス白血病ウイルスに基づき開発され，病原性を失わせ安全性を高めることを目的として，その感染力を保ちつつ自己複製能を欠損させるためにウイルスゲノムが分割されている。第1世代レトロウイルスベクター系は，パッケージングプラスミド（パッケージングシグナルを除いたウイルスゲノム）と導入プラスミド（パッケージングシグナル，gagの一部，外来遺伝子の両端を5’LTR及び3’LTRで挟んだもの）からなる。したがって，パッケージングプラスミドと導入プラスミドに共通して存在するgag配列部分で相同組み換えが起こると自己複製可能なレトロウイルス，すなわちRC（Replication competent）ウイルスが出現する。第2世代レトロウイルスベクター系では，第1世代のパッケージングプラスミドの3'側のLTRをポリA付加シグナルに置換している。これにより，RCウイルスが発生するためにはgag配列及びポリA付加シグナル上流の2か所で同時に相同組み換えが起こる必要があり，その発生確率は非常に低く，安全性が高められている。第3世代は3つのプラスミドから構成されており，第2世代のパッケージングプラスミドがさらにgag/polをコードするプラスミドとenvをコードするプラスミドに分割されている。これにより，RCウイルスが発生するためには3か所で同時に相同組み換えが生じる必要があり，その発生確率は極めて低く，さらに安全性が高められている。
　一般に，組換えレトロウイルスビリオンの生産には，まず，これらパッケージングプラスミドと導入プラスミドが，宿主細胞に一般的なトランスフェクション手法により導入される。そうすると5’LTR及び3’LTR，及びこれら2つのLTRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む領域が宿主細胞で複製され，生じた一本鎖の（+）鎖RNAがレトロウイルスのカプシド蛋白質にパッケージングされて，組換えレトロウイルスビリオンが形成される。この組換えレトロウイルスビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。本発明における外来の遺伝子は，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子である。当該遺伝子が導入された細胞等ではこの遺伝子から融合蛋白質が発現するようになる。
　本発明の一実施形態において，核酸分子は，これをリポソーム，脂質ナノ粒子（Lipid Nanoparticle；LNP）等に内包させた形態とすることもできる。リポソームとは，脂質二重層を持つ球状の小胞をいい，主にリン脂質，特にホスファチジルコリンから構成される。但しこれに限らず，脂質二重層を形成する限り，リポソームは卵黄ホスファチジルエタノールアミン等の他の脂質を加えられたものであっても良い。細胞膜は主にリン脂質二重膜から構成されているため，リポソームは生体適合性に優れるという利点がある。脂質ナノ粒子は，直径10 nm～1000 nm，典型的には約200 nm未満の，脂質を主成分とする粒子をいい，疎水性（親油性）分子を内包させることができ，トリグリセリド，ジグリセリド，モノグリセリド，脂肪酸，ステロイド等の生体適合性のある脂質を主な構成成分とする。リポソーム又は脂質ナノ粒子に内包させた遺伝子を生体内に投与すると，細胞の細胞膜と直接融合，又はエンドサイトーシス等により細胞に取り込まれ，その後核に移行して遺伝子が細胞に導入されると考えられている。リポソーム又は脂質ナノ粒子による遺伝子導入方法は，ウイルスベクターを用いた遺伝子導入と比較して，導入する遺伝子の大きさに制限が無い点や，安全性が高い点において優れている。本発明の核酸分子を内包させたリポソーム，脂質ナノ粒子等は，リガンドと生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。当該遺伝子が導入された細胞等ではこの遺伝子から融合蛋白質が発現するようになる。本明細において「リポソーム，脂質ナノ粒子等」というときは，上述のリポソーム及び脂質ナノ粒子に加え，ポリマーナノ粒子，ミセル，エマルジョン，ナノエマルジョン，マイクロスフェア，ナノスフェア，マイクロカプセル，ナノカプセル，デンドリマー，ナノゲル，金属ナノ粒子，その他薬物送達システム（DDS）として用いられることのできるあらゆるナノ・マイクロ粒子を含むものとする。
　本発明において，プラスミドの形態，組換ウイルスビリオンに内包された形態，又はリポソーム，脂質ナノ粒子等に内包された形態で細胞，組織，又は生体内に導入された核酸分子の挙動について，以下に（１）～（６）に例示する。但し，核酸分子の挙動はこれらに限られるものではない。
（１）核酸分子は一本鎖の（+）鎖RNAであり，細胞内に導入されると，核酸分子に含まれる抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子が翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
（２）核酸分子は一本鎖の（+）鎖RNAであり，細胞内に導入されると，該核酸分子が逆転写されて一本鎖の（+）鎖DNAとなり，次いでこのDNAが転写，翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
（３）核酸分子は一本鎖の（+）鎖RNA又は（-）鎖RNAであり，細胞内に導入されると，該核酸分子が逆転写されて二重鎖DNAとなり，次いでこのDNAが転写，翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
（４）核酸分子は一本鎖の（+）鎖又は（-）RNAであり，細胞内に導入されると，該核酸分子が逆転写されて二重鎖DNAとなり，次いでこのDNAが宿主細胞のゲノムとランダム組換え又は相同組換えを起こしてゲノム内に組込まれ，組み込まれたDNAが転写，翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
（５）核酸分子は一本鎖の（+）鎖DNAであり，細胞内に導入されると，該核酸分子が転写，翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
（６）核酸分子は二重鎖DNAであり，細胞内に導入されると，該核酸分子が転写，翻訳されて該融合蛋白質が発現する。
　プラスミドの形態，組換ウイルスビリオンに内包された形態，又はリポソーム，脂質ナノ粒子等に内包された形態の核酸分子は，細胞，組織，又は生体内に導入することができる。
　核酸分子の導入先が生体内である場合，核酸分子は，プラスミドの形態，組換ウイルスビリオンに内包された形態，又はリポソーム，脂質ナノ粒子等に内包された形態で，薬学的に許容される賦形剤とともに，すなわち医薬組成物として，皮下注射，筋肉内注射，静脈内注射等の非経口的手段により投与される。かかる医薬組成物は，例えば，バイアルに重点した水性液剤として，又は注射器に予め充填したものであるプレフィルドのシリンジ型又はカートリッジ型の水性液剤として，医療機関に提供される。
　プラスミドの形態，組換ウイルスビリオンに内包された形態，又はリポソーム，脂質ナノ粒子等に内包された形態の核酸分子は，種々の医薬として用いることができる。核酸分子にコードされる融合蛋白質がトランスフェリン受容体を特異的に認識するものであり，生理活性を有する蛋白質がヒトリソソーム酵素である場合の核酸分子の用途について，以下詳述する。
　ヒトリソソーム酵素がα－Ｌ－イズロニダーゼである場合はハーラー症候群又はハーラー・シャイエ症候群における中枢神経障害治療剤として，イズロン酸－２－スルファターゼである場合はハンター症候群における中枢神経障害治療剤として，酸性α-グルコシダーゼ，である場合はポンペ病における中枢神経障害治療剤として，グルコセレブロシダーゼである場合はゴーシェ病における中枢神経障害治療剤として，βガラクトシダーゼである場合はＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型における中枢神経障害治療剤として，ＧＭ２活性化蛋白質である場合はＧＭ２－ガングリオシドーシスＡＢ異型における中枢神経障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＡである場合はサンドホフ病及びティサックス病における中枢神経障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＢである場合はサンドホフ病における中枢神経障害治療剤として，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼである場合はＩ－細胞病における中枢神経障害治療剤として，α－マンノシダーゼである場合はα－マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，β－マンノシダーゼである場合はβ－マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，ガラクトシルセラミダーゼである場合はクラッベ病における中枢神経障害治療剤として，サポシンＣである場合はゴーシェ病様蓄積症における中枢神経障害治療剤として，アリールスルファターゼＡである場合は異染性白質変性症（異染性白質ジストロフィー）における中枢神経障害治療剤として，α－Ｌ－フコシダーゼである場合はフコシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼである場合はアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼである場合はシンドラー病及び川崎病における中枢神経障害治療剤として，酸性スフィンゴミエリナーゼである場合はニーマン・ピック病における中枢神経障害治療剤として，α－ガラクトシダーゼＡである場合はファブリー病における中枢神経障害治療剤として，β－グルクロニダーゼである場合はスライ症候群における中枢神経障害治療剤として，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼの何れか一つである場合はサンフィリッポ症候群における中枢神経障害治療剤として（特に，ヘパランＮ－スルファターゼである場合はサンフィリッポ症候群Ａ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである場合はサンフィリッポ症候群Ｂ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼである場合はサンフィリッポ症候群Ｃ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼである場合はサンフィリッポ症候群Ｄ），酸性セラミダーゼである場合はファーバー病における中枢神経障害治療剤として，アミロ－１，６－グルコシダーゼである場合はコリ病（フォーブス・コリ病）における中枢神経障害治療剤として，シアリダーゼである場合はシアリダーゼ欠損症における中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼである場合はアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１）である場合は神経セロイドリポフスチン症又はＳａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ病における中枢神経障害治療剤として，トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１）である場合は神経セロイドリポフスチン症又はＪａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病における中枢神経障害治療剤として，ヒアルロニダーゼ－１である場合はヒアルロニダーゼ欠損症における中枢神経障害治療剤として，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２の何れかである場合はバッテン病における中枢神経障害治療剤として使用できる。
　核酸分子の導入先が細胞である場合，細胞の種類に特に限定はないが，例えば，間葉系幹細胞，歯髄由来幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，内皮幹細胞，乳腺幹細胞，腸幹細胞，肝幹細胞，膵幹細胞，神経幹細胞，及びｉＰＳ細胞である。
　核酸分子が導入された細胞は，融合蛋白質を発現するようになるので，これを治療目的で患者に移植することができる。例えば，生理活性を有する蛋白質がヒトリソソーム酵素である核酸分子が導入された細胞は，上述の用途に用いることができる。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクターの構築
　5’側より，ClaIサイト，マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター，ニワトリβアクチン／MVMキメライントロン，マウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（マウス抗mTfRscFv抗体）のC末端側に配列番号４で示されるリンカー配列を介してヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（hI2S）が結合した結合体であって配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するもの（mscFv-GS3-hI2S）をコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びBglIIサイトを含む配列番号１８で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をClaIとBglIIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をClaIとBglIIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクターとした（図１）。pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），mscFv-GS3-hI2Sをコードする遺伝子（配列番号２０），ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。更に，pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクターは，アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点（ColE1 ori）を含む。なお，マウス抗mTfRscFv抗体は，マウス抗mTfRの重鎖可変領域のC末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，マウス抗mTfRの軽鎖可変領域が結合したものである。
〔実施例２〕pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクターの構築
　5’側より，ClaIサイト，マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター，ニワトリβアクチン／MVMキメライントロン，mscFvの重鎖のCDRの2か所及び軽鎖のCDRの2か所にアミノ酸置換を導入したマウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（マウス抗mTfRscFv抗体2）のC末端側に配列番号４で示されるリンカー配列を介してhI2Sが結合した結合体であって配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するもの（mscFv2-GS3-hI2S）をコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びBglIIサイトを含む配列番号２１で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をClaIとBglIIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をClaIとBglIIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクターとした（図２）。pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），mscFv2-GS3-hI2Sをコードする遺伝子（配列番号２３），ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。更に，pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクターは，アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点（ColE1 ori）を含む。
〔実施例３〕pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクターの構築
　5’側より，ClaIサイト，マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター，ニワトリβアクチン／MVMキメライントロン，hI2SのC末端にマウス抗mTfRscFv抗体2が結合した結合体（hI2S-mscFv2）であって配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するものをコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びBglIIサイトを含む配列番号２４で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をClaIとBglIIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をClaIとBglIIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクターとした（図３）。pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），hI2S-mscFv2（配列番号２６）をコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。更に，pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクターは，アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点（ColE1 ori）を含む。
〔実施例４〕pAAV-mMAP-hI2Sベクターの構築
　5’側より，ClaIサイト，マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター，ニワトリβアクチン／MVMキメライントロン，配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するhI2Sをコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びBglIIサイトを含む配列番号２７で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をClaIとBglIIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をClaIとBglIIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-hI2Sベクターとした（図４）。pAAV-mMAP-hI2Sベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），hI2Sをコードする遺伝子（配列番号２８），ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。更に，pAAV-mMAP-hI2Sベクターは，アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点（ColE1 ori）を含む。
〔実施例５〕pR2(mod)C6ベクターの構築
　5’側より，AfeIサイト，RsrIIサイト，BsrGIサイト，AvrIIサイト，アンピシリン耐性遺伝子，複製開始点（ColE1 ori），RsrIIサイト，AAV2 Rep領域の5’部分（p5プロモーターを含む），及びSacIIサイトを含む配列番号２９で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をAfeIとSacIIで消化した。pRC6ベクター（タカラバイオ社）をAfeIとSacIIで消化し，これに上記の制限処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C6ベクターとした。
〔実施例６〕pR2(mod)C8ベクターの構築
　5’側より，HindIIIサイト，AAV2 Rep領域の3’部分，AAV8 Cap領域，p5プロモーター，RsrIIサイト，及びBsrGIサイトを含む配列番号３０で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をHindIIIとBsrGIで消化した。pR2(mod)C6ベクターをHindIIIとBsrGIで消化し，これに上記の制限酵素処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C8ベクターとした（図５）。
〔実施例７〕rAAVビリオンの産生
　ヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株である，HEK293細胞を宿主細胞として用いた。10-layerセルスタックチャンバー（Corning社）に，HEK293細胞をセルスタックチャンバーあたり1.59x108個播種し，10% FBS含有DMEM培地（Thermo Fisher Scientific社）で37℃，5% CO2存在下で3日間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，下記の（１）～（４）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクター，
（２）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクター，
（３）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクター，
（４）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-hI2Sベクター。
　それぞれの溶液は，3種類のプラスミドを等モル濃度で含み，総DNA濃度が1.0 mg/mLであり，総液量が2.2 mLとなるように調整したものである。この溶液に，ポリエチレンイミンを，重量比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μg)＝1：2となるように添加し，更にDMEM培地を加えて液量を1.0 Lに調整したものをトランスフェクション溶液とした。培養開始3日後の10-layerセルスタックチャンバーから培養上清を全て除去した後，1.0 Lのトランスフェクション溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。得られたrAAVビリオンをそれぞれrAAV-mscFv-GS3-hI2S，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S，rAAV-hI2S-mscFv2，及びrAAV-hI2Sとした。rAAV-mscFv-GS3-hI2Sは，細胞に感染させたときに，mscFv-GS3-hI2Sを発現することが期待されるものであり，rAAV-mscFv2-GS3-hI2Sは，細胞に感染させたときにmscFv2-GS3-hI2Sを発現することが期待させるものであり，rAAV-hI2S-mscFv2は細胞に感染させたときにhI2S-mscFv2を発現することが期待させるものであり，rAAV-hI2Sは細胞に感染させたときにhI2Sを発現することが期待されるものである。
〔実施例８〕細胞融解及び遊離核酸除去工程
　実施例７の培養終了後，各細胞培養液に，その9分の1量の0.5 M HEPES， 20 mM MgCl2， 10% (w/v) ポリソルベート20を含有する水溶液を添加し，更にエンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼ（Merck社）を濃度が50 U/mLとなるように添加して混合しセルスタック内に均一に溶液を分散させた後，室温で30分間静置した。その後，セルスタックより溶液をボトルに移し，攪拌子及びスターラーにより室温で3時間攪拌した。その後，液量の9分の1量の10%（w/v） Sucroseを含む5M NaCl水溶液を添加し，攪拌して細胞融解液を得た。
〔実施例９〕アフィニティー工程負荷液の調製
　実施例８で得られた各細胞融解液を1000 mL平底遠心容器に等分し，Sorvall LYNX 6000大容量高速冷却遠心機（Thermo Fisher Scientific社）で3000×g，4℃，20分遠心分離した。遠心上清を孔径0.2 μmのNalgene Rapid-Flow PESフィルターユニット（Thermo Fisher Scientific社）を用いてろ過し，rAAVビリオン含有細胞融解液を得た。これに4分の1量の2 mmol/L MgCl2，2000 mmol/L アルギニンを含有する20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）を添加し，これをアフィニティー工程負荷液とした。
〔実施例１０〕rAAVビリオンのアフィニティー樹脂を用いたクロマトグラフィー精製工程
　2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaClを含有する20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）を用いて，POROS Capture Select AAVX樹脂（Thermo Fisher Scientific社）を充填したカラム（径1.6 cm，高さ10 cm（カラム容量約20 mL））を平衡化した。実施例９で得られた各アフィニティー工程負荷液を5 mL/分の流速でカラムに通液することにより樹脂にrAAVビリオンを吸着させた。次いで，カラム容量の5倍以上の2 mmol/L MgCl2，400 mmol/L アルギニンを含有する20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）を通液してカラムを洗浄してから，カラム容量の3倍以上の2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaClを含有する20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）を通液してカラムを洗浄した。次いで，カラム容量の3倍以上の2 mM MgCl2を含有する10 mMクエン酸緩衝液（pH 3.5）をカラムに通液することにより，樹脂に吸着したrAAVビリオンを溶離してrAAVビリオンを含む画分を得た。この画分に2mM MgCl2含有500 mmol/L Tris緩衝液（pH 8.5）を加えてpH 7.0に調整し，アフィニティー工程溶出画分とした。
〔実施例１１〕rAAVビリオンの限外ろ過膜による濃縮工程
　2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl含有20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）により平衡化したSpectrum MicroKros Hollow fiber Modules 100 kDa， 75 cm2（Repligen社）に，実施例１０で得られた各アフィニティー工程溶出画分を7 L/min/m2以下の流束で循環することにより約8 mLに濃縮し回収した。次いで，2 mLの2 mmol/L MgCl2及び150 mmol/L NaClを含む20 mmol/L Tris緩衝液（pH 7.5）で2回限外ろ過膜を洗浄し，この洗浄液を先に回収した溶液に合わせて，合計約12 mLの濃縮液を取得した。
〔実施例１２〕rAAVビリオンのイオジキサノールを用いた超遠心分離による精製工程
　60%イオジキサノール（多用途密度勾配遠心分離媒体OptiPrepTM，コスモバイオ社）にPBS-MKバッファー（136.9 mmol/L塩化ナトリウム，28.2 mmol/L塩化カリウム及び1 mmol/L塩化マグネシウムを含む20 mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4））を加えて45%イオジキサノール溶液を調製した。また，60%イオジキサノールにPBS-MKバッファーを加えて25%イオジキサノール溶液を調製した。更に，60%イオジキサノールに1M NaCl/PBS-MKバッファー（1 mol/L塩化ナトリウムを含むPBS-MKバッファー）を加えて15%イオジキサノール溶液を調製した。
　39 mL， Quick-SealTM Round-Top Polypropylene Tube，25 X 89 mm（ベックマンコールター社）の底部から，60%イオジキサノールにフェノールレッドを添加したもの，次いで45%イオジキサノール溶液，次いで25%イオジキサノール溶液にフェノールレッドを添加したもの，次いで15%イオジキサノール溶液の順にそれぞれ5 mL，8 mL，5 mL，8 mLを重層した。これに実施例１１で得られた約12 mLの濃縮液をそれぞれ添加した後，1M NaCl/PBS-MKバッファーでチューブ内を満たした。次いで，コードレス・チューブトッパシーラキット（ベックマンコールター社）によりチューブの注入口を閉じ，超遠心装置Optima XPN（ベックマンコールター社）の70Tiローターに設置し，63000 rpm（408500 ×g）の回転速度で2時間遠心した。遠心後のチューブ底部に，フラクションリカバリシステム（ベックマンコールター社）を用いて，針付きのタイゴンE-LFLチューブを接続し，18 Gシリンジ針をチューブ上部に刺し空気穴を開けた後，ペリスタルティックポンプによりチューブ下部より溶媒を0.5 mLずつ分画した。この9番目から13番目又は10番目から14番目の画分を回収し，精製されたrAAVビリオンを含む画分を得た。
〔実施例１３〕rAAVビリオンの限外ろ過膜による濃縮及び緩衝液交換工程
　実施例１２で得られた各rAAVビリオンを含む画分を，350 mmol/L NaCl/PBSバッファー（486.9 mmol/L 塩化ナトリウム及び2.7 mmol/L 塩化カリウム，0.001% F-68を含む20 mmol/L リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4））により50倍希釈し，これを350 mmol/L NaCl/PBSバッファーで平衡化したSpectrum MicroKros Hollow fiber Modules 100 kDa， 75 cm2（Repligen社）に， 7 L/min/m2以下の流速で循環することにより約15 mLに濃縮した。次いで，350 mmol/L NaCl/PBSバッファーで10 DVバッファー交換を実施した。さらに7 L/min/m2以下の流速で循環することにより約8 mLにまで濃縮し，この濃縮液を回収した。次いで，2 mLの350 mmol/L NaCl/PBSバッファーで2回限外ろ過膜を洗浄し，この洗浄液を先に回収した濃縮液に合わせて，合計約12 mLの濃縮液を取得した。この濃縮液をさらに，アミコンウルトラ 15 遠心式フィルターユニット 50 kDa（Merck社）を用いて，3200 rpm（2100 ×g）以下，20分以下の条件で遠心分離し濃縮することにより350 mmol/L NaCl/PBSバッファーへ溶媒が置換されたrAAVビリオン溶液を得た。得られた各rAAVビリオン溶液を，以下の実験に供した。
〔実施例１４〕rAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定
　実施例１３で得られたrAAVビリオン溶液中のウイルスゲノム量を，ドロップレットデジタルPCR法により測定した。以下に測定法を詳述する。
　8連チューブ（TOHO社）に，5 μLのrAAVビリオン溶液に2 μLのRecombinant DNaseI（タカラバイオ社），5 μLの10× DNaseI Buffer（Recombinant DNaseIに付属，タカラバイオ社），5 μLの10% F-68含有注射用水，及び33 μLの注射用水（大塚蒸留水，大塚製薬工場社）を加え，37℃で30分間インキュベートし，rAAVビリオンに内包されていないDNAを消化した。
　DNaseI処理を行った各rAAVビリオン溶液をDNAサスペンションバッファー（0.1 mM エチレンジアミン4酢酸， 100 μg/mL polyA，0.001%F-68を含有する10 mM トリス緩衝溶液（pH8.0））を用いて適宜希釈した。次に，rAAVビリオン希釈溶液を95℃で10分間インキュベートしてrAAVビリオンを熱崩壊させ，ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液を調製した。
　1.0 μMの順方向プライマー（プライマーSI-1，配列番号３３），1.0 μMの逆方向プライマー（プライマーSI-2，配列番号３４），及び0.25 μMのプローブ（プローブSI-1，配列番号３５の5’末端にレポーター色素としてFAMを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むFAM標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。また，1.0 μM 順方向プライマー（プライマーSI-3，配列番号３６），1.0 μM 逆方向プライマー（プライマーSI-4，配列番号３７），及び0.25 μMプローブ（プローブSI-2，配列番号３８の5’末端にレポーター色素としてHEXを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むHEX標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。
　ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液4 μLに，12 μLのddPCR Supermix for probes (no dUTP) （BioRad社），1.2 μLのFAM標識20×プライマー/プローブミックス，1.2 μLのHEX標識20×プライマー/プローブミックス，0.3 μLのMspI（NEB社），及び5.3 μLの注射用水を加え，PCR反応液を調製した。Droplet generator（BioRad社）を用いて，20 μLのPCR反応液と70 μLのDroplet Generator オイル for Probes（BioRad社）の懸濁液滴（ドロップレット）を調製した。このドロップレットをQX200 Droplet Digital PCRシステム（BioRad社）に供した。PCRの条件は，変性反応（95℃，10分），40サイクルの3ステップPCR（95℃，30秒→60℃，60秒→72℃，15秒），PCR酵素の不活化処理（98℃，10分）とした。FAM/HEX両陽性ドロップレットをrAAV陽性ドロップレットと定義し，QuantaSoft Version 1.7 (BioRad社)を用いてrAAVゲノム量（vg：ウイルスゲノム）を求めた。なお，このPCRにおいて増幅されるDNA領域は，ウシ成長ホルモンpolyA，及びITRの内部領域である。
〔実施例１５〕マウス抗mTfRscFv抗体とhI2Sとの結合体のマウスTfR結合活性評価
　mscFv-GS3-hI2S，mscFv2-GS3-hI2S，及びhI2S-mscFv2の3種類のマウス抗mTfRscFv抗体とhI2Sとの結合体をコードする遺伝子を，それぞれ発現ベクターに組み込んだ。得られた発現ベクターをCHO細胞に導入し，3種類の結合体の発現用細胞をそれぞれ取得した。得られた発現用細胞をそれぞれ培養して結合体を組換え蛋白質として発現させ，培養上清から各組換え蛋白質を回収した。
　得られたmscFv-GS3-hI2S，mscFv2-GS3-hI2S，及びhI2S-mscFv2の3種類の蛋白質について，マウスTfR受容体に対する結合活性を，ELISA法で測定した。ELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，配列番号３９で示されるアミノ酸配列の87番目から763番目までのアミノ酸配列を有するマウストランスフェリン受容体細胞外ドメインを10 μg/mLとなるよう0.05 M 重炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）で希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも1時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを各ウェルに300 μLずつ加えてプレートを室温で1時間静置した。各ウェルを0.05% Tween20を含むTBS（TBS-T）で3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを用いてmscFv-GS3-hI2Sについては300，100，33.33，11.11，3.70，1.23，0.41，及び0.14 nM，mscFv2-GS3-hI2Sについては600，200，66.67，22.22，7.41，2.47，0.82，及び0.27 nM，hI2S-mscFv2については1200，400，133.33，44.44，14.81，4.94，1.65，及び0.55 nMにそれぞれ希釈し，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。プレートをTBS-Tで3回洗浄した後，抗hI2Sモノクローナル抗体を0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで0.5 μg/mLに希釈し，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで50 ng/mLに希釈したHRP標識抗マウスIgGポリクロ－ナル抗体（Bethyl社）溶液を各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，各ウェルに50 μLの発色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase（プロメガ社）を添加し，室温で5～10分間静置した。次いで，各ウェルに100 μLの停止液（1N 塩酸）を添加した後，プレートリーダー（SpectraMax iD3，MOLECULAR DEVICES社）を用いて各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。得られた測定値よりEC50を算出し，各蛋白質のmTfRに対する結合活性を評価した。
　mscFv-GS3-hI2S，mscFv2-GS3-hI2S，及びhI2S-mscFv2のマウスTfRに対するEC50はそれぞれ2.4 nM， 13.2 nM， 96.7 nMであった。
〔実施例１６〕I2S-KOマウスを用いた各rAAVビリオンの薬効評価
　各rAAVを生体に投与したときの薬効評価を，I2S遺伝子ノックアウトマウス（I2S-KOマウス）を用いて行った。I2S-KOマウスは14～15週齢（投与開始時）の雄性マウスであるものを用いた。rAAVビリオンとして，rAAV-mscFv-GS3-hI2S，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S，rAAV-hI2S-mscFv2，及びrAAV-hI2Sをそれぞれ，雄性I2S-KOマウスに1.0×1011 vg/kg，1.0×1012 vg/kg，及び1.0×1013 vg/kgの用量で単回尾静脈内投与した（各群N=3）。また，雄性野生型マウスからなる正常対照群と雄性I2S-KOマウスからなる病態対照群）を置いた（各群N=3）。正常対照群及び病態対照群には生理食塩液（大塚製薬工場社）を投与した。
　投与から1及び6週間後にベトルファール（Meiji Seikaファルマ社），ミダゾラム（サンド社），ドミトール（日本全薬工業社）の3剤混合麻酔下，開胸して心採血を行った。血液はEDTA-2Kコート採血管（キャピジェクト，テルモ社）に採取し，抗凝固血とした後にヘモグロビン濃度測定に供した。残りの抗凝固血は氷上静置後，遠心（2000×g，20分間， 4℃）して血漿を回収した。また，心採血後のマウスを生理食塩液（大塚製薬工場社）で全身灌流し，脳を摘出した。脳組織の一部を脳組織中ヘパラン硫酸の定量用に分取し，素早く液体窒素に浸漬し急速凍結した。また別に，脳組織の一部について湿重量を測定した後，素早く液体窒素に浸漬し急速凍結し，凍結した脳組織を0.025% Protease Inhibitor Cocktail（Sigma-Aldrich社）含有RIPA Buffer（和光純薬工業社）中でホモジナイズし，これを遠心してその上清を回収した。
〔実施例１７〕血漿及び脳組織におけるrAAVに由来する蛋白質の濃度測定
　実施例１６で調製した血漿，及び脳組織をホモジナイズして得た上清中に含まれるrAAV-mscFv-GS3-hI2S，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S，rAAV-hI2S-mscFv2，及びrAAV-hI2Sの各rAAV由来蛋白質を定量した。定量は概ね下記の方法で実施した。Streptavidin Gold plate（Meso scale diagnostics社）の各ウェルにSuperblock Blocking Buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）を150 μLずつ添加し，1時間以上振盪してプレートをブロッキングした。次いで，ビオチン化抗hI2Sモノクローナル抗体並びにSULFO化抗hI2Sモノクローナル抗体の混合溶液に，それぞれ常法によりCHO細胞に発現させ取得した既知濃度のmscFv-GS3-hI2S，hI2S-mscFv2，又はhI2Sを含む各検量線用標準試料及び各検体をそれぞれ加えて1時間振盪し抗体反応液とした。なお，抗hI2Sモノクローナル抗体は，配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するhI2Sで免疫したマウスから取得した脾細胞を用いて常法で作製した抗hI2S産生ハイブリドーマを培養することにより取得した。得られたモノクロ―ナル抗体の一つをBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所社）を用いて添付のプロトコールに従って修飾しビオチン化抗hI2Sモノクローナル抗体を得た。また，得られたモノクロ―ナル抗体の他の一つをMSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester（Meso scale Diagnostics社）を用いて添付のプロトコールに従って修飾し，SULFO化抗hI2Sモノクローナル抗体を得た。各ウェルからブロッキング溶液を除去し，0.05% Tween 20含有PBS（PBST，Sigma Aldrich社）で洗浄後，各ウェルに抗体反応液を25 μL添加し，1時間以上振盪した。次いで抗体反応液を除去し，PBSTで洗浄後，注射用水（大塚製薬工場社）で等量混合希釈した4 X Read Buffer（Meso scale diagnostics社）を150 μL添加し，SectorTM Imager 6000（Meso scale diagnostics社）を用いて各ウェルからの発光量を測定した。各検量線用標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，検体1 mL当たりに含まれるrAAV由来蛋白質の量（各rAAV由来蛋白質濃度）を算出した。なお，mscFv2-GS3-hI2Sの測定に際しては，検量線用標準試料としてmscFv-GS3-hI2Sを用いた。
　血漿中の上記rAAV由来蛋白質濃度の測定結果を図６に示す。血漿中の各rAAV由来蛋白質濃度はいずれのrAAVビリオン投与群においても投与量依存的に上昇した。また，いずれの群も，投与後1週間と6週間で同程度の発現量を維持するか，やや発現量の上昇が確認された。以上の結果は，マウスに静脈内注射されたrAAVビリオンが細胞内に取り込まれ，少なくとも，細胞内でrAAVがコードする遺伝子が転写，翻訳されて発現したrAAV由来蛋白質が，血液中に放出されたことを示す。
　次いで，脳組織中のrAAV由来蛋白質濃度の測定結果を図７に示す。脳組織中の発現蛋白質濃度はいずれのrAAVビリオン投与群においても投与量依存的に上昇した。rAAV-mscFv-GS3-hI2S投与群におけるmscFv-GS3-hI2Sの脳組織中発現濃度は，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S，rAAV-hI2S-mscFv2，及びrAAV-hI2Sの同一用量群間において比較すると非常に高値を示し，且つ，その濃度は投与後1週間と6週間で大きく変動しなかった。rAAV-mscFv2-GS3-hI2S及びrAAV-hI2S-mscFv2の1.0×1013 vg/kg投与群において，投与後1週間から6週間にかけて，脳組織中濃度はそれぞれ約3.4倍及び約2.1倍上昇した。rAAV-hI2Sの1.0×1013 vg/kg投与群の脳組織中濃度は投与後1週間と6週間で大きく変動せず，同一用量間においては他群の脳組織中濃度の2分の1以下であった。
　以上の結果は，rAAV-mscFv-GS3-hI2S，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S及びrAAV-hI2S-mscFv2を投与することにより，マウス体内で発現することが期待された抗mTfR抗体scFvとhI2Sが結合した結合体が実際に期待通り発現したこと，また抗mTfR抗体scFvが，mTfRに結合することによりBBBを通過して中枢神経系の組織に到達したことを示すものである。
〔実施例１８〕脳組織中のヘパラン硫酸の定量
　脳中のヘパラン硫酸（HS）の定量は概ね下記の方法で実施した。なお，ヘパラン硫酸は，酵素I2Sに対する基質である。
　試験に用いる（ａ）～（ｌ）の溶液を以下の手順で調製した。
（ａ）MeCN/water：
　2 mLの注射用水(大塚製薬工業社)と18 mLのアセトニトリル(富士フイルム和光純薬社)を混合し，これをMeCN/waterとした。
（ｂ）重水素ラベル化溶媒：
　氷浴下で，1.5 mLのメタノール-d4（Sigma-Aldrich社）に240 μLのアセチルクロリド(Sigma-Aldrich社)を滴下し，これを重水素ラベル化溶媒とした。
（ｃ）移動相A：
　475 mLの注射用水と，25 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液（富士フイルム和光純薬社）を混合したものを移動相Aとした。
（ｄ）移動相B：
　アセトニトリルと移動相Aを93:7（v/v）で混合したものを移動相Bとした。
（ｅ）ヘパラン硫酸標準原液（HS標準原液）：
　Heparan sulphate（Iduron社）を注射用水で溶解し，5.0 mg/mLの溶液を調製した。この溶液をHS標準原液とした。
（ｆ）ヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）：
　ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのHS標準原液を計り取り，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し，撹拌した後，65℃で75分間反応させて，重水素化メタノール分解（メタノリシス）を行った。反応後，溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し，超音波処理を30分間行った。この溶液をヘパラン硫酸内部標準溶液（HS内部標準溶液）とした。
（ｉ）内標準溶液：
　1 mLのメタノールに，1 μLのHS内部標準溶液を添加して撹拌後，超音波処理を30分間行った。この溶液を内標準溶液とした。
（ｊ）検量線試料：
　980 μLの注射用水を計り取り，これにHS標準原液を10 μLずつ添加し，ヘパラン硫酸を50 μg/mL含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で希釈し，ヘパラン硫酸を5000 ng/mL含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で段階希釈し，ヘパラン硫酸を25，50，100，250，500，1000，2500及び5000 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。これを20 μL計り取り，それぞれホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。この溶液を検量線試料とした。
（ｋ）組織抽出用溶液
　1 mLのポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテルを生理食塩液に添加し，全量を500 mLとした。この溶液を組織抽出用溶液とした。
（ｌ）10%炭酸アンモニウム溶液
　5 gの炭酸アンモニウムを50 mLの注射用水に溶解した。この溶液を10%炭酸アンモニウム溶液とした。
　血漿を20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これを血液サンプル溶液とした。
　実施例１６で分取した脳組織を凍結乾燥し，乾燥重量を測定した。凍結乾燥した組織を，組織抽出用溶液中で破砕したのち，上清を遠心分離した。これを20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これをサンプル溶液とした。
　調製した各サンプル溶液及び検量線試料中の溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に，2，2-ジメトキシプロパン（東京化成工業社）20 μLと，塩酸の濃度が3 mol/Lである塩酸メタノール（Sigma-Aldrich社）200 μLとを添加して撹拌した後，反応温度70℃，反応時間90分間でメタノリシス反応を行った。反応後，氷冷して反応を停止し，200 μLの10%炭酸アンモニウム溶液及び50 μLの内標準溶液を添加した。溶媒を窒素気流下で留去した後，乾固物に250 μLの注射用水を添加した。これを，予めメタノール及び注射用水を通液してコンディショニングした固相カートリッジ（OASIS HLB（1 cc， 30 mg，Waters社））に負荷し，注射用水で洗浄した後，メタノール500 μLを添加し，遠心分離で溶出した。窒素気流下で溶媒を留去した後，注射用水2 mL及びアセトニトリル18 mLを添加し，超音波処理にて再溶解した。これを遠心分離した後，上清をLCバイアルに充填した。
　LC/MS/MS分析は，親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置（MS/MS装置）として，QTRAP5500（エービーサイエックス社）を用い，これにHPLC装置として，Nexera X2（島津製作所）をセットした。また，LCカラムとして，Acquity UPLCTM BEH Amide 1.7 μm (2.1 Ｘ 150 mm，Waters社)を用いた。移動相として，移動相A及び移動相Bを用いた。また，カラム温度は60℃に設定した。
　移動相Bでカラムを平衡化した後，5μLの試料を注入し，表１に示す移動相のグラジエント条件で，クロマトグラフィーを実施した。なお，移動相の流量は0.4 mL/分とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　MS/MS装置のイオン源パラメーターを，QTRAP5500（エービーサイエックス社）の使用説明書に従って，表２に示すように設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表３にMS内部パラメーターを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　検量線試料についてLC/MS/MS分析を行い，検量線試料中のヘパラン硫酸に由来するプロダクトイオンに対応するクロマトグラムチャート上のピークの面積（HS検出ピーク面積）を求めた。また， HS内部標準溶液に由来するプロダクトイオンに対応する検出ピークの面積（HS-IS検出ピーク面積）を求めた。
　各検量線試料における，HS内部標準溶液に由来する検出ピーク面積に対するヘパラン硫酸に由来する検出ピークの面積（HS検出ピーク面積／HS-IS検出ピーク面積）を縦軸に，各検量線試料のヘパラン硫酸濃度を横軸にとり，二次判別分析を用いて回帰式を得た。
　脳組織サンプル溶液についてLC/MS/MS分析を行い，サンプル溶液中に含まれるヘパラン硫酸を回帰式に内挿して定量した。
　脳組織中のHS濃度（μg/mg乾燥重量）測定結果を図８に示す。脳組織中のHS濃度はいずれのrAAVビリオン投与群においても投与量依存的に減少した。投与後6週間の結果において，rAAV-mscFv-GS3-hI2S，rAAV-mscFv2-GS3-hI2S，及びrAAV-hI2S-mscFv2の各1.0×1013 vg/kg投与群のHS濃度は顕著に減少し，正常対照群とほぼ同値を示した。rAAV-mscFv-GS3-hI2S投与群については，1.0×1012 vg/kg及び1.0×1011 vg/kg投与群においてもHS減少効果は他rAAVビリオンの同一用量群と比較しても高かった。以上の結果は，rAAVビリオンを静脈内投与して，肝臓で発現した抗mTfR抗体scFvとhI2Sとの結合体が脳に分布し，脳組織において蓄積していたHSをI2Sが活性を発揮し減少させたことを示す。また，当該脳組織に蓄積したHSを減少させる効果が，少なくとも6週間持続することを示すものである。
〔実施例１９〕血液中のヘモグロビン濃度測定
　実施例１６で得られた抗凝固血を用いて，ヘモグロビン濃度の測定を行った。ヘモグロビン濃度の測定は，研究用自動血球計算装置（Procyte Dxリサーチ，シスメックス社)を用いて，SLSヘモグロビン法により行った。血中ヘモグロビン濃度は，貧血の指標として通常用いられる項目である。結果を図９に示す。
　投与6週間後において，rAAV-mscFv-GS3-hI2Sの1.0×1013 vg/kg投与群のみ，血中ヘモグロビン濃度の減少が確認された。その他の群においては，投与後1週間と6週間で正常対照群並びに病態対照群に比べて明らかな差は認められなかった。以上の結果は，TfRに対する結合活性を，例えば10～100 nMに調節することにより，貧血を回避することが可能であることを示す。
〔実施例２０〕まとめ１
　以上の結果は，抗TfR抗体融合hI2SをコードするDNAを有するrAAVビリオンを静脈内に単回投与することにより，生体内で長期に亘り抗TfR抗体融合hI2Sを発現させることができ，且つ，発現した抗TfR抗体融合hI2Sが，病態モデルマウスの中枢神経系組織に分布して蓄積した基質を分解できることを示すものである。また，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）を，10 nM以上，例えば10～100 nMに調節させた抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンを製造することにより，当該融合蛋白質の高い血中発現量を維持させ，及びhI2Sの酵素活性により中枢神経系に蓄積したHSを減少させるという薬効を発揮させつつ，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンを提供できることを示すものである。更には，hI2Sに限らず，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）を，10 nM以上，例えば10～100 nMに調節させた抗TfR抗体と所望の生理活性蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンを製造することにより，当該融合蛋白質の高い血中発現量を維持させ，及び生理活性蛋白質の活性を中枢神経系において発揮させつつ，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンを提供できることを示すものである。更には，抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質の場合には，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）が10 nM以下，例えば0.5～4 nMに調節させた抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンであっても，その1回当たりの投与量を1.0×1013 vg/kgより少ない投与量，例えば7.5×1012 vg/kgとすることで，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンとして，使用できることを示すものである。
〔実施例２１〕pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクターの構築
　上記実施例１９及び２０に示された結論を検証するため，更に以下の実験を行った。5’側より，ClaIサイト，マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター，ニワトリβアクチン／MVMキメライントロン，mscFvの重鎖のCDRに2個のアミノ酸置換を導入したマウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（mscFv3）のC末端側に配列番号４で示されるリンカー配列を介してヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（hI2S）が結合した結合体であって，配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するもの（mscFv3-GS3-hI2S）をコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びBglIIサイトを含む配列番号５７で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をClaIとBglIIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をClaIとBglIIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクターとした。pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），mscFv3-GS3-hI2Sをコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクターは，概ね，図４に記載のベクターマップの中で，I2Sをコードする遺伝子をmscFv3-GS3-hI2Sをコードする遺伝子に置換した構造を有する。
〔実施例２２〕rAAVビリオンの産生
　ヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株である，HEK293細胞を宿主細胞として用いた。10-layerセルスタックチャンバー（Corning社）に，HEK293細胞をセルスタックチャンバーあたり1.59x108個播種し，10% FBS含有DMEM培地（Thermo Fisher Scientific社）で37℃，5% CO2存在下で3日間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，下記のプラスミドを含む溶液を作製した；
pHelperベクター（タカラバイオ社），実施例６で構築したpR2(mod)C8ベクター，及び実施例２１で構築したpAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクター。
　溶液は，3種類のプラスミドを等モル濃度で含み，総DNA濃度が1.0 mg/mLであり，総液量が2.2 mLとなるように調整したものである。この溶液に，ポリエチレンイミンを，重量比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μg)＝1：2となるように添加し，更にDMEM培地を加えて液量を1.0 Lに調整したものをトランスフェクション溶液とした。培養開始3日後の10-layerセルスタックチャンバーから培養上清を全て除去した後，1.0 Lのトランスフェクション溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。得られたrAAVビリオンをrAAV-mscFv3-GS3-hI2Sとした。rAAV-mscFv3-GS3-hI2Sは，細胞に感染させたときに，mscFv3-GS3-hI2Sを発現することが期待されるものである。
〔実施例２３〕rAAV-mscFv3-GS3-hI2Sを含むrAAVビリオン溶液の調製及びrAAVゲノム量の測定
　実施例２２の培養終了後，実施例８～１３に記載の方法により，培養上清からrAAV-mscFv3-GS3-hI2Sを含むrAAVビリオン溶液（rAAV-mscFv3-GS3-hI2S溶液）を調製した。また，当該rAAVビリオン溶液に含まれるrAAVゲノム量を，実施例１４に記載の方法により測定した。
〔実施例２４〕mscFv3-GS3-hI2SのmTfR結合活性評価
　CHO細胞を用いて常法により取得したmscFv3-GS3-hI2Sの組換え蛋白質について，マウストランスフェリン受容体に対する結合活性を，ELISA法で測定した。ELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，配列番号３９で示されるアミノ酸配列の87番目から763番目までのアミノ酸配列を有するマウストランスフェリン受容体細胞外ドメインを10 μg/mLとなるよう0.05 M 重炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）で希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを各ウェルに300 μLずつ加えてプレートを室温で1時間静置した。各ウェルを0.05% Tween20を含むTBS（TBS-T）で3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを用いて，mscFv3-GS3-hI2Sを含む溶液を，mscFv3-GS3-hI2Sの濃度が200，66.7，22.2，7.41，2.47，0.82，及び0.27 nMとなるように希釈したものを，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。プレートをTBS-Tで3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで0.5 μg/mLに希釈した抗I2Sモノクローナル抗体を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで50 ng/mLに希釈したHRP標識抗マウスIgGポリクロ－ナル抗体（Bethyl社）溶液を各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，各ウェルに50 μLの発色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase（プロメガ社）を添加し，室温で5～10分間静置した。次いで，各ウェルに100 μLの停止液（1 N 塩酸）を添加した後，プレートリーダー（MOLECULAR DEVICES社）を用いて各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。得られた測定値よりEC50を算出し，mscFv3-GS3-hI2SのmTfRに対する結合活性を評価した。mscFv3-GS3-hI2SのマウスTfRに対するEC50は4.4 nMであった。
〔実施例２５〕I2S-KOマウスを用いたrAAV-mscFv3-GS3-hI2Sの薬効評価
　各rAAVを生体に投与したときの薬効評価を，I2S遺伝子ノックアウトマウス（I2S-KOマウス）を用いて行った。I2S-KOマウスは14～15週齢（投与開始時）の雄性マウスであるものを用いた。rAAVビリオンとして，rAAV-mscFv3-GS3-hI2Sを，雄性I2S-KOマウスに1.0×1011 vg/kg，1.0×1012 vg/kg，及び1.0×1013 vg/kgの用量で単回尾静脈内投与した（各群N=5又は6）。また，雄性野生型マウスからなる正常対照群と雄性I2S-KOマウスからなる病態対照群）を置いた（各群N=2又は5）。正常対照群及び病態対照群には生理食塩液（大塚製薬工場社）を投与した。
　投与から6週間後にベトルファール（Meiji Seikaファルマ社）・ミダゾラム（サンド社）・ドミトール（日本全薬工業社）の3剤混合麻酔下，マウスの大槽より脳脊髄液（CSF）を採取し，更に開胸して心採血を行った。血液はEDTA-2Kコート採血管（キャピジェクト，テルモ社）に採取し，抗凝固血とした後にヘモグロビン濃度測定に供した。ヘモグロビン濃度の測定は，実施例１９に記載のSLSヘモグロビン法により行った。残りの抗凝固血は氷上静置後，遠心（2000 × g，20分間， 4℃）して血漿を回収した。また心採血後のマウスを，生理食塩液（大塚製薬工場社）で全身灌流し，脳を摘出した。脳組織の一部を脳組織中ヘパラン硫酸の定量用に分取し，素早く液体窒素に浸漬し急速凍結した。また別に，脳組織の一部について湿重量を測定した後，素早く液体窒素に浸漬し急速凍結し，凍結した脳組織を0.025% Protease Inhibitor Cocktail（Sigma-Aldrich社）含有RIPA Buffer（和光純薬工業社）中でホモジナイズし，これを遠心してその上清を回収した。
〔実施例２６〕CSF，血漿及び脳組織におけるrAAVに由来する蛋白質の濃度測定
　実施例２５で調製した血漿，及び脳組織をホモジナイズして得た上清中に含まれるrAAV-mscFv3-GS3-hI2Sに由来するmscFv3-GS3-hI2Sの量を，実施例１７に記載の方法により測定した。血漿中に含まれるmscFv3-GS3-hI2Sの測定結果を図１０に示す。血漿中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度は投与量依存的に上昇していることから，マウスに静脈内注射されたrAAVビリオンが細胞内に取り込まれ，少なくとも，細胞内でmscFv3-GS3-hI2Sをコードする遺伝子が転写，翻訳されて発現したmscFv3-GS3-hI2Sが，血液中に放出されたことがわかる。次いで，脳組織中に含まれるmscFv3-GS3-hI2Sの濃度の測定結果を図１１に示す。血漿中のmscFv3-GS3-hI2Sの濃度は投与量依存的に上昇していることから，マウスの細胞内で発現したmscFv3-GS3-hI2Sが，血液中に放出され，その少なくとも一部がマウスTfRに結合することによりBBBを通過して中枢神経系の組織に到達したことがわかる。
 
〔実施例２７〕脳組織及びCSF中のヘパラン硫酸の定量
　実施例２５で凍結させた脳組織を，凍結乾燥した後，乾燥重量を測定した。凍結乾燥した組織を，組織抽出用溶液中で破砕した後，上清を遠心分離した。これを20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これをサンプル溶液とした。また，CSFの測定にあっては，CSFを20 μL計り取り，ホウケイ酸ねじ口試験管に分取し，これをサンプル溶液とした。調製したサンプル溶液を用いて，脳組織及びCSF中のヘパラン硫酸（HS）を実施例１８に記載の方法により定量した。
　脳組織中のHS濃度（μg/mg乾燥重量）及びCSF中のHS濃度（μg/mL）の測定結果を，それぞれ図１２及び図１３に示す。脳組織及びCSF中のHS濃度は何れも投与量依存的に減少した。1.0×1011 vg/kg投与群であっても脳組織及びCSF中のHS濃度は何れも顕著に減少した。これらの結果は，rAAV-mscFv3-GS3-hI2Sを静脈内投与することにより，マウスの細胞内で発現したmscFv3-GS3-hI2Sが，血液中に放出され，その少なくとも一部がマウスTfRに結合することによりBBBを通過して中枢神経系の組織に到達し，更には中枢神経系において，HS濃度を減少させるというhI2Sの酵素活性を発揮できることを示す。また，当該脳組織に蓄積したHSを減少させる効果が，少なくとも6週間持続することを示すものである。
〔実施例２８〕血中のヘモグロビン濃度の測定
　実施例２５で得られた抗凝固血を用いてヘモグロビン濃度の測定を行った。ヘモグロビン濃度の測定は，実施例１９に記載のSLSヘモグロビン法により行った。血中ヘモグロビン濃度は，貧血の指標として通常用いられる項目である。結果を図１４に示す。
　投与6週間後において，rAAV-mscFv3-GS3-hI2Sの全ての投与群において，血中ヘモグロビン濃度の変動は正常対照群や病態対照群に比べて明らかな差は認められなかった。以上の結果は，抗TfR抗体と生理活性蛋白質の融合蛋白質の，抗TfR抗体を介するトランスフェリン受容体に対するEC50が凡そ4.4 nMである場合には，当該融合蛋白質をコードするrAAVビリオンを静脈投与することにより，血液中のヘモグロビン濃度を低下させることなく，すなわち貧血を回避しつつ，当該生理活性蛋白質の機能を中枢神経系で発揮させることができることを示す。
〔実施例２９〕まとめ２
　実施例２０のまとめ１の記載と合わせて考えると，以上の結果は，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）を，3 nM以上，例えば3～100 nMに調節させた抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンを製造することにより，当該融合蛋白質の高い血中発現量を長期間に亘って維持させ，またhI2Sの酵素活性により中枢神経系に蓄積したHSを減少させるという薬効を発揮させつつ，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンを提供できることを示すものである。更には，hI2Sに限らず，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）を，3 nM以上，例えば3～100 nMに調節させた抗TfR抗体と所望の生理活性蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンを製造することにより，当該融合蛋白質の高い血中発現量を維持させ，また生理活性蛋白質の活性を中枢神経系において発揮させつつ，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンを提供できることを示すものである。更には，抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質の場合には，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）が4 nM以下，例えば0.5～4 nMに調節させた抗TfR抗体とhI2Sの融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンであっても，その1回当たりの投与量を1.0×1013 vg/kgより少ない投与量，例えば7.5×1012 vg/kgとすることで，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンとして，使用できることを示すものである。
〔実施例３０〕pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAAベクターの構築
5’側より，BamHIサイト，配列番号５８で示されるアミノ酸配列を有するhGAAをコードする遺伝子，及びNotIサイトを含む配列番号５９で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をBamHI，及びNotIで消化した。実施例１で構築したpAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2SをBamHIとNotIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAAベクターとした。pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAAベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），マウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（マウス抗mTfRscFv抗体）のC末端に配列番号４で示されるリンカーを介してhGAAが結合した結合体（mscFv-GS3-hGAA）であって配列番号６０で示されるアミノ酸配列を有するものをコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAAベクターは，概ね，図４に記載のベクターマップの中で，I2Sコードする遺伝子をmscFv-GS3-hGAAをコードする遺伝子に置換した構造を有する。
〔実施例３１〕pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2ベクターの構築
5’側より，MluIサイト，配列番号６１で示されるアミノ酸配列を有するhGAA(Pro)をコードする遺伝子，配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するGSリンカーをコードする遺伝子，及びBsu36Iサイトを含む配列番号６２で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をMluI，ScaIとBsu36Iで消化した。実施例３で構築したpAAV-mMAP-hI2S-mscFv2をMluIとBsu36Iで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2ベクターとした。pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2ベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），hGAA(Pro)のC末端に配列番号１で示されるリンカーを介してマウス抗mTfRscFv抗体2が結合した結合体であって配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有するもの（hGAA(Pro)-GS-mscFv2）をコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2ベクターは，概ね，図４に記載のベクターマップの中で，I2Sコードする遺伝子をhGAA(Pro)-GS-mscFv2をコードする遺伝子に置換した構造を有する。
〔実施例３２〕pAAV-mMAP-hGAAベクターの構築
　5’側より，MluIサイト，hGAAをコードする遺伝子，及びNot1サイトを含む配列番号６４で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をMluI，NotIで消化した。実施例３で構築したpAAV-mMAP-hI2S-mscFv2をMluIとNotIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-mMAP-hGAAベクターとした。pAAV-mMAP-hGAAベクターは，上流から順に，第一のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号７），マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター（配列番号９），ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン（配列番号１０），hGAAをコードする遺伝子，ウシ成長ホルモンpolyAシグナル（配列番号１７），第二のAAV-ITRの機能的等価物（配列番号８）を含む構造を有する。pAAV-mMAP-hGAAベクターは，概ね，図４に記載のベクターマップの中で，I2Sコードする遺伝子を，hGAAをコードする遺伝子に置換した構造を有する。
〔実施例３３〕rAAVビリオンの産生
　ヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株である，HEK293細胞を宿主細胞として用いた。10-layerセルスタックチャンバー（Corning社）に，HEK293細胞をセルスタックチャンバーあたり1.59x108個播種し，10% FBS含有DMEM培地（Thermo Fisher Scientific社）で37℃，5% CO2存在下で3日間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，
下記の（１）～（３）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAA，
（２）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2，
（３）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpR2(mod)C8ベクターとpAAV-mMAP-hGAAベクター。
　上記（１）～（３）の溶液は，それぞれ3種類のプラスミドを等モル濃度で含み，総DNA濃度が1.0 mg/mLであり，総液量が2.2 mLとなるように調整したものである。この溶液に，ポリエチレンイミンを，重量比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μg)＝1：2となるように添加し，更にDMEM培地を加えて液量を1.0 Lに調整したものをトランスフェクション溶液とした。培養開始3日後の10-layerセルスタックチャンバーから培養上清を全て除去した後，1.0 Lのトランスフェクション溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。得られたrAAVビリオンをそれぞれrAAV-mscFv-GS3-hGAA，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2，rAAV-hGAAとした。例えば，rAAV-mscFv-GS3-hGAAは，細胞に感染させたときに，mscFv-GS3-hGAAを発現することが期待されるものである。
〔実施例３４〕rAAVビリオン溶液の調製及びrAAVゲノム量の測定
　実施例３３の培養終了後，実施例８～１３に記載の方法により，培養上清からrAAV-mscFv-GS3-hGAA，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2，rAAV-hGAAをそれぞれ含むrAAVビリオン溶液（rAAV-mscFv-GS3-hGAA溶液，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2溶液，rAAV-hGAA溶液）を調製した。また，当該rAAVビリオン溶液に含まれるrAAVゲノム量を，実施例１４に記載の方法により測定した。
〔実施例３５〕マウス抗mTfRscFvとhGAAとの結合体のmTfR結合活性評価
　CHO細胞を用いて常法により取得したmscFv-GS3-hGAA及びhGAA(Pro)-GS-mscFv2の2種類の組換え蛋白質について，マウストランスフェリン受容体に対する結合活性を，ELISA法で測定した。ELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，配列番号３９で示されるアミノ酸配列中N末端側から87番目から763番目までのアミノ酸配列で示されるマウストランスフェリン受容体細胞外ドメインを10 μg/mLとなるよう0.05 M 重炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）で希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを各ウェルに300 μLずつ加えてプレートを室温で1時間静置した。各ウェルを0.05% Tween20を含むTBS（TBS-T）で3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSを用いてmscFv-GS3-hGAAは33.33， 11.11， 3.70， 1.23， 0.41， 0.14， 0.046 nM，hGAA(Pro)-GS-mscFv2は200， 66.7， 133.33， 22.2， 7.41， 2.47， 0.82， 0.27 nMの濃度となるようにそれぞれ希釈したものを，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。プレートをTBS-Tで3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで0.5 μg/mLに希釈した抗hGAAモノクローナル抗体を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで3回洗浄した後，0.1% BSA及び0.05% Tween20を含むTBSで50 ng/mLに希釈したHRP標識抗マウスIgGポリクロ－ナル抗体（Bethyl社）溶液を各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。TBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，各ウェルに50 μLの発色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase（プロメガ社）を添加し，室温で5～10分間静置した。次いで，各ウェルに100 μLの停止液（1 N 塩酸）を添加した後，プレートリーダー（MOLECULAR DEVICES社）を用いて各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。得られた測定値よりEC50を算出し，各組換え蛋白質のmTfRに対する結合活性を評価した。
　mscFv-GS3-hGAA，及びhGAA(Pro)-GS-mscFv2のマウスTfRへの結合親和性におけるEC50は，それぞれ0.173nM，及び83.7nMであった。
〔実施例３６〕GAA KOマウスの作製
　GAA KOマウスは，酸性α-グルコシダーゼ遺伝子（Gaa遺伝子）をホモで欠損したマウスである。GAA KOマウスは概ね下記の方法で作製した。ES細胞のゲノムDNAを鋳型として，
5´相同領域，3´相同領域の2つのフラグメントをPCR法にて増幅後，loxP配列及びPGK-neo領域とともに終始コドンを挿入したGaa遺伝子のExon6を構築し，そのフラグメントを常法により組み込みGaa遺伝子に対する相同組み換えベクターを構築した。このターゲティングベクターを，エレクトロポレーション法によりC57NBL/6N系統のES細胞に導入し，薬剤選択後1次スクリーニング陽性ES細胞を得た。得られた1次スクリーニング陽性ES細胞の中から相同組み換え体を選別し，相同組換えES細胞クローンを得た。得られた相同組換えES細胞クローンと，ICRマウスの8細胞期胚（宿主胚）を用い，アグリゲーション法によりキメラ胚を作製した。得られたキメラ胚を，精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（レシピエントマウス）に移植した。得られた産仔（キメラマウス）について毛色判定を行い，ES細胞が生体の形成に高効率で寄与した個体，すなわち全体毛に対する白色毛の占める比率の高い個体を選別した。このキメラマウス個体をICRマウスと掛け合わせてF1マウスを得た。白色のF1マウスを選別し，尻尾の組織より抽出したDNAを解析し，染色体上でマウスGaa遺伝子がヘテロ接合体となっているマウスをGaaヘテロ接合体マウスとした。このマウスを元にして，Gaa遺伝子をホモで欠損したマウス（GAA KOマウス）を作製した。
〔実施例３７〕GAA KOマウスを用いた各rAAVビリオンの薬効評価
　各rAAVを生体に投与したときの薬効評価を実施例３６で作製したGAA KOマウスを用いて行った。GAA KOマウスは10～11週齢（投与開始時）の雄性マウスであるものを用いた。実施例３４で得たrAAV-mscFv-GS3-hGAA溶液，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2溶液及びrAAV-hGAA溶液を，それぞれ雄性GAA KOマウスに1.0×1013 vg/kgの用量となるように単回尾静脈内投与した（各群N=5）。また，雄性野生型マウスからなる正常対照群と雄性GAA KOマウスからなる病態対照群を置いた（各群N=5）。正常対照群及び病態対照群には生理食塩液（大塚製薬工場社）を投与した。
　投与から4週間後にイソフルラン吸入麻酔下，開胸して心採血を行った。血液はEDTA-2Kコート採血管（キャピジェクト，テルモ社）に採取し，抗凝固血とした後にヘモグロビン濃度測定に供した。残りの抗凝固血は，氷上静置後，遠心（2000 × g，20分間）して血漿を回収した。また，心採血後のマウスを生理食塩液（大塚製薬工場社）で全身灌流し，脳及び前脛骨筋をそれぞれ摘出した。脳は，灌流開始から3分後に液体窒素へ浸漬した。骨格筋は湿重量を測定した後，素早く液体窒素に浸漬し急速凍結した。
　〔実施例３８〕血漿及び組織におけるrAAVに由来する蛋白質の濃度測定
　実施例３７で調製した血漿，及び脳組織をホモジナイズして得た上清中に含まれるrAAV-mscFv-GS3-hGAA，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2，及びrAAV-hGAAの各rAAV由来蛋白質を定量した。定量は概ね下記の方法で実施した。Streptavidin Gold plate（Meso scale diagnostics社）の各ウェルにSuperblock Blocking Buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）を150 μLずつ添加し，1時間以上振盪してプレートをブロッキングした。次いで，ビオチン化抗hGAAポリクローナル抗体並びにSULFO化抗hGAAポリクローナル抗体の混合溶液に，既知濃度のmscFv-GS3-hGAA，hGAA(Pro)-GS-mscFv2，及びhGAAをそれぞれ含む検量線用標準試料（GAA検量線用標準試料）及び各検体をそれぞれ加えて1時間以上振盪し抗体反応液とした。なお，抗hGAAポリクローナル抗体は，配列番号５８で示されるアミノ酸配列を有するヒト酸性α-グルコシダーゼで複数回免疫したウサギ全血から抗血清を取得し，アフィニティー精製することにより取得した。得られたポリクロ―ナル抗体の一つをBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所社）を用いて添付のプロトコールに従って修飾しビオチン化抗hGAAポリクローナル抗体を得た。また，得られたポリクロ―ナル抗体の他の一つをMSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester（Meso scale Diagnostics社）を用いて添付のプロトコールに従って修飾し，SULFO化抗hGAAポリクローナル抗体を得た。各ウェルからブロッキング溶液を除去し，0.05% Tween 20含有PBS（PBST，Sigma Aldrich社）で洗浄後，各ウェルに抗体反応液を25 μL添加し，1時間以上振盪した。次いで抗体反応液を除去し，PBSTで洗浄後，注射用水（大塚製薬工場社）で1/2に希釈した4 X Read Buffer（Meso scale diagnostics社）を150 μL添加し，SectorTM Imager 6000（Meso scale diagnostics社）を用いて各ウェルからの発光量を測定した。GAA検量線用標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，検体1 mL当たりに含まれる各蛋白質の量を算出した。なお，検量線用標準試料に含まれるmscFv-GS3-hGAA及びhGAA(Pro)-GS-mscFv2は，常法よりそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを導入させたCHO細胞を用いて発現させ，取得したものである。
　血漿中の上記rAAV由来蛋白質濃度の測定結果を図１５に示す。血漿中の各rAAV由来蛋白質濃度はいずれのrAAVビリオン投与群においても投与後4週時点までに上昇した。以上の結果は，マウスに静脈内注射されたrAAVビリオンが細胞内に取り込まれ，少なくとも，細胞内でrAAVがコードする遺伝子が転写，翻訳されて発現したrAAV由来蛋白質が，血液中に放出されたことを示す。
　次いで，脳組織中のrAAV由来蛋白質濃度の測定結果を図１６に示す。いずれのrAAVビリオン投与群においても投与4週後に，各rAAVビリオンにコードされる融合蛋白質が，脳組織中に検出されることが示された。脳組織中発現濃度は，特にrAAV-mscFv-GS3-hGAA投与群において，非常に高い値を示した。rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2投与群における脳組織中発現濃度は低値であったものの，表４で示されるように，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2投与群の脳組織中のグリコーゲン濃度が劇的に低下しており，マウスに投与されたrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2がBBBを通過して脳組織中でhGAAとしての酵素活性を発揮し，グリコーゲンを分解したことがわかる。
　以上の結果は，rAAV-mscFv-GS3-hGAA，及びrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2を投与することにより，マウス体内で発現することが期待された抗mTfR抗体scFvとhGAAが結合した結合体が実際に期待通り発現したこと，及び，抗mTfR抗体scFvと結合させたGAAが，BBBを通過して中枢神経系の組織に到達したことを示すものである。
〔実施例３９〕組織中のグリコーゲン濃度測定
　脳及び前脛骨筋をホモジナイズして得た上清中に含まれるグリコーゲン濃度は，おおむね下記の方法で測定した。測定には，Glycogen assay kit（Biovision社）を用い，添付のプロトコールに従い測定した。96F Nontreated Black microwell（Thermo scientific社）に既知濃度のグリコーゲンを含む検量線用標準試料及び組織ホモジネート上清をそれぞれ50 μLずつ加えた。次いで，加水分解反応試薬であるHydrolysis Enzyme Mixを各ウェルに1 μLずつ添加して混合し，室温で30分反応させた。次いで，OxiRed Probeを含むDevelopment Enzyme Mixを各ウェルに50 μLずつ添加して混合し，遮光下，室温で30分反応させた。SpectraMax iD3（Molecular Devices社）を用いて，各ウェルからの蛍光強度を測定した（励起波長535 nm，検出波長587 nm）。各検量線用標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各検体中のグリコーゲン濃度を算出し，更に組織1 mg当たりに含まれるグリコーゲンの量（mg/g 組織）を算出した。
薬効の指標として，各組織におけるグリコーゲンの減少作用を表すReduction ratio（%）を用いた。Reduction ratio（%）は，{([KO]-[WT])-([Test article]-[WT])}×100/([KO]-[WT])と定義した。なお，[WT]は正常対照群の平均グリコーゲン濃度を，[KO]は病態対照群の平均グリコーゲン濃度を，[Test article]は各試験物質投与群の平均グリコーゲン濃度をそれぞれ表す。
　脳中のグリコーゲン濃度（μg/g 湿重量）及びReduction ratio(%)の測定結果を表４に示す。脳のグリコーゲン濃度は，rAAV-mscFv-GS3-hGAA及びrAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2投与群のどちらにおいても病態対照群と比較して低下した（Reduction ratio(%)は，それぞれ101%と23.9%）。一方，抗mTfR抗体scFvが融合していないhGAAを発現するrAAV-hGAA投与群では，脳中のグリコーゲン濃度は低下したものの，Reduction ratio（%）は5.47%に留まった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前脛骨筋中のグリコーゲン濃度（μg/g 湿重量）及びReduction ratio（%）の測定結果を表５に示す。前脛骨筋中のグリコーゲン濃度は，いずれの投与群においても病態対照群と比較して大きく低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これらの結果は，マウスにrAAV-mscFv-GS3-hGAA及びrAAV-hGAA-GS-mscFv2を静脈注射することにより生体内で発現したmscFv-GS3-hGAA及びhGAA-GS-mscFv2が，BBBを通過して中枢神経系の組織に到達し，中枢神経系の組織においてhGAAとしての酵素活性を発揮し，そうして中枢神経系に蓄積したグリコーゲン濃度を分解したことを示すものである。
〔実施例４０〕血液中のヘモグロビン濃度測定
　実施例３７で得られた抗凝固血を用いて，ヘモグロビン濃度測定を行った。ヘモグロビン濃度の測定は，実施例１９に記載のSLSヘモグロビン法により行った。血中ヘモグロビン濃度は，貧血の指標として通常用いられる項目である。結果を図１７に示す。
　投与4週間後において，rAAV-mscFv-GS3-hGAA投与群のみ，血中ヘモグロビン濃度の減少が確認された。rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2並びにrAAV-hGAA投与群においては，正常対照群並びに病態対照群に比べて明らかな差は認められなかった。以上の結果は，抗TfRを介したTfRに対する結合活性（EC50）を，0.5 nM，例えば3～100 nMに調節させた抗TfR抗体と所望の生理活性蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むrAAVビリオンは，当該融合蛋白質の高い血中発現量を維持させ，また生理活性蛋白質の活性を中枢神経系において発揮させつつ，貧血を惹起させない安全な治療用のrAAVビリオンとして提供できることを示すものである，とする実施例２０のまとめ１及び実施例２９のまとめ２の記載と合致するものである。
　また，以上の結果は，rAAV-hGAA(Pro)-GS-mscFv2を静脈注射することにより，生体内で少なくとも1か月に亘りhGAA(Pro)-GS-mscFv2を発現させることができ，且つ，発現したhGAA-GS(Pro)-mscFv2が，病態モデルマウスの中枢神経系及び筋組織においてhGAA活性を発揮し，そうして蓄積したグリコーゲンを分解できることを示すものである。また，抗TfR抗体の活性を調節することにより高い血中濃度を維持し薬効を発揮しつつ，貧血を惹起しない安全なポンペ症候群の治療剤として有効であることを示すものである。
　本発明によれば，抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質が遺伝子治療に用いられる場合に，トランスフェリン受容体との親和性又は結合活性を適宜調整することにより，貧血症状を惹起する可能性を低減させたトランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質，及びかかる融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込まれたウイルスベクターを提供することができる。
１　　第一のAAV-ITRの機能的等価物
２　　マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーター
３　　ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン
４　　マウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（マウス抗mTfRscFv抗体）のC末端側に配列番号１のアミノ酸配列を3回繰り返してなるリンカー配列を介してhI2Sが結合した結合体（mscFv-GS3-hI2S）をコードする遺伝子
５　　ウシ成長ホルモンpolyAシグナル
６　　第二のAAV-ITRの機能的等価物
７　　アンピシリン耐性遺伝子
８　　複製開始点（ColE1 ori）
９　　mscFvの重鎖のCDRの2か所及び軽鎖のCDRの2か所にアミノ酸変異を導入したマウス抗マウストランスフェリンレセプター一本鎖抗体（マウス抗mTfRscFv抗体2）のC末端側に配列番号１のアミノ酸配列を3回繰り返してなるリンカー配列を介してhI2Sが結合した結合体（mscFv2-GS3-hI2S）をコードする遺伝子
１０　hI2SのC末端にマウス抗mTfRscFv抗体2が結合した結合体（hI2S-mscFv2）をコードする遺伝子
１１　hI2Sをコードする遺伝子
１２　p5プロモーター
１３　AAV2のRep領域
１４　AAV8のCap領域
１５　エンハンサーとして機能するp5プロモーター
配列番号１：リンカーのアミノ酸配列の一例１
配列番号２：リンカーのアミノ酸配列の一例２
配列番号３：リンカーのアミノ酸配列の一例３
配列番号４：リンカーのアミノ酸配列の一例４
配列番号５：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第一のＩＴＲ）の塩基配列，野生型
配列番号６：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第二のＩＴＲ）の塩基配列，野生型
配列番号７：第一の逆方向末端反復（第一のＩＴＲ）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号８：第二の逆方向末端反復（第二のＩＴＲ）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号９：マウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーターの塩基配列，合成配列
配列番号１０：ニワトリβアクチン/MVMキメライントロンの塩基配列，合成配列
配列番号１１：マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の塩基配列の一例
配列番号１２：ヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸配列
配列番号１３：抗hTfR抗体の重鎖のFab領域のアミノ酸配列の一例
配列番号１４：ヒトI2Sのアミノ酸配列
配列番号１５：抗hTfR抗体の軽鎖のアミノ酸配列の一例
配列番号１６：抗hTfR抗体の重鎖のアミノ酸配列の一例
配列番号１７：ウシ成長ホルモンpolyAシグナルの塩基配列
配列番号１８：pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hI2Sベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号１９：mscFv-GS3-hI2Sのアミノ酸配列
配列番号２０：mscFv-GS3-hI2Sをコードする塩基配列，合成配列
配列番号２１：pAAV-mMAP-mscFv2-GS3-hI2Sベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号２２：mscFv2-GS3-hI2Sのアミノ酸配列
配列番号２３：mscFv2-GS3-hI2Sをコードする塩基配列，合成配列
配列番号２４：pAAV-mMAP-hI2S-mscFv2ベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号２５：hI2S-mscFv2のアミノ酸配列
配列番号２６：hI2S-mscFv2をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２７：pAAV-mMAP-hI2Sベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号２８：hI2Sをコードする塩基配列
配列番号２９：pR2(mod)C6ベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号３０：pR2(mod)C8ベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号３１：AAV8のCap領域の塩基配列
配列番号３２：AAV2のRep領域を含む塩基配列，合成配列
配列番号３３：プライマーSI-1の塩基配列，合成配列
配列番号３４：プライマーSI-2の塩基配列，合成配列
配列番号３５：プローブSI-1の塩基配列，合成配列
配列番号３６：プライマーSI-3の塩基配列，合成配列
配列番号３７：プライマーSI-4の塩基配列，合成配列
配列番号３８：プローブSI-2の塩基配列，合成配列
配列番号３９：マウストランスフェリン受容体のアミノ酸配列
配列番号４０：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４１：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４２：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４３：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４４：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号４５：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４６：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４７：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４８：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４９：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号５０：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号５１：抗hTfR抗体の重鎖のFab領域とヒトI2Sの結合体のアミノ酸配列
配列番号５２：第一の長い末端反復（第一のLTR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号５３：第二の長い末端反復（第二のLTR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号５４：センダイウイルスゲノムのリーダーの塩基配列
配列番号５５：センダイウイルスゲノムのトレイラーの塩基配列
配列番号５６：mscFv3-GS3-hI2Sのアミノ酸配列
配列番号５７：pAAV-mMAP-mscFv3-GS3-hI2Sベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号５８：hGAAのアミノ酸配列
配列番号５９：pAAV-mMAP-mscFv-GS3-hGAAベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号６０：mscFv-GS3-hGAAのアミノ酸配列
配列番号６１：hGAA(Pro)のアミノ酸配列
配列番号６２：pAAV-mMAP-hGAA(Pro)-GS-mscFv2ベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列
配列番号６３：hGAA(Pro)-GS-mscFv2のアミノ酸配列
配列番号６４：pAAV-mMAP-hGAAベクターを作製するために合成したDNA断片の塩基配列，合成配列

Claims (37)

  1. 　以下の（１）～（６）からなる群から選択される何れかの塩基配列を含む核酸分子であって，該核酸分子がコードする抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質が，トランスフェリン受容体に対して０．５ｎＭ～１μＭの結合活性（ＥＣ５０）を有するもの：
    　（１）第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
    　（２）第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
    　（３）第一の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
    　（４）第一の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列；
    　（５）リーダー又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にトレイラー又はその機能的等価物を含む塩基配列；及び
    　（６）リーダー又はその機能的等価物を含む塩基配列，その下流に遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にトレイラー又はその機能的等価物を含む塩基配列。
  2. 　以下の（１）～（４）からなる群から選択されるものである，請求項１に記載の核酸分子：
    　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列とを含むもの；
    　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列とを含むもの；
    　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列とを含むもの；及び
    　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端に生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列とを含むもの。
  3. 　以下の（１）～（４）からなる群から選択されるものである，請求項１に記載の核酸分子：
    　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列とを含むもの；
    　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列とを含むもの；
    　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列とを含むもの；及び
    　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端に生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列と，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列とを含むもの。
  4. 　該リンカーが，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，請求項３に記載の核酸分子。
  5. 　該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，請求項４に記載の核酸分子。
  6. 　以下の（１）～（４）からなる群から選択されるものである，請求項１に記載の核酸分子：
    　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖が結合し，更にそのＣ末端に生理活性を有する蛋白質が直接又はリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；
    　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖が結合し，更にそのＣ末端に生理活性を有する蛋白質が直接又はリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；
    　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，生理活性を有する蛋白質のＣ末端に直接又はリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖が結合し，更にそのＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖が結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの；及び
    　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，生理活性を有する蛋白質のＣ末端に直接又はリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖が結合し，更にそのＣ末端に第二のリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖が結合した結合体をコードする塩基配列を含むもの。
  7. 　該リンカーが，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，請求項６に記載の核酸分子。
  8. 　該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，請求項７に記載の核酸分子。
  9. 　該第二のリンカーが，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項８に記載の核酸分子。
  10. 　該第二のリンカーが，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly，配列番号１，配列番号２，配列番号３の各アミノ酸配列，配列番号１のアミノ酸配列の３個が連続してなるアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が２～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるものである，請求項９に記載の核酸分子。
  11. 　以下の（１）～（４）からなる群から選択されるものである，請求項２に記載の核酸分子：
    　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むもの；
    　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むもの；
    　（３）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むもの；及び
    　（４）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質が結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むもの。
  12. 　以下の（１）～（４）からなる群から選択されるものである，請求項３～５の何れかに記載の核酸分子：
    　（１）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むもの；
    　（２）該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むもの；
    　（３）該該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むもの；及び
    　（４）該該抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質の融合蛋白質をコードする塩基配列が，該抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端に該生理活性を有する蛋白質がリンカーを介して結合した結合体をコードする塩基配列，その下流に内部リボソーム結合部位をコードする塩基配列，更にその下流に該抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むもの。
  13. 　該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものである，請求項１１又は１２に記載の核酸分子。
  14. 　該内部リボソーム結合部位が，ピコルナウイルス科のウイルスの５’非翻訳領域に由来するものである，請求項１１又は１２に記載の核酸分子。
  15. 　該遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，β-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター，マウスアルブミンプロモーター，ヒトアルブミンプロモーター，ヒトα－１アンチトリプシンプロモーター，及びマウスαフェトプロテインエンハンサー／マウスアルブミンプロモーターからなる群から選択されるものである，請求項１～１４の何れかに記載の核酸分子。
  16. 　該抗トランスフェリン受容体抗体が，抗原結合性断片である，請求項１～１５の何れかに記載の核酸分子。
  17. 　該抗トランスフェリン受容体抗体が，Ｆａｂである，請求項１～１５の何れかに記載の核酸分子。
  18. 　該生理活性を有する蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗トランスフェリン受容体抗体，抗トランスフェリン受容体抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，ＧＬＰ－１受容体アゴニスト，及び抗体医薬からなる群から選択されるものである，請求項１～１７の何れかに記載の核酸分子。
  19. 　該生理活性を有する蛋白質が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，酸性α-グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼＡ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，請求項１～１７の何れかに記載の核酸分子。
  20. 　該第一の逆方向末端反復及び該第二の逆方向末端反復が，アデノ随伴ウイルスに由来するもの，アデノウイルスに由来するもの，又はそれらの変異体であるものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  21. 　該第一の逆方向末端反復が配列番号５で示される塩基配列を含み，該第二の逆方向末端反復が配列番号６で示される塩基配列を含むものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  22. 　該第一の逆方向末端反復が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該第二の逆方向末端反復が以下の（４）～（６）から選択されるものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子：
    　（１）配列番号５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（２）配列番号５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（３）配列番号５で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
    　（４）配列番号６で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（５）配列番号６で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（６）配列番号６で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
  23. 　該第一の逆方向末端反復の機能的等価物が配列番号７で示される塩基配列を含み，該第二の逆方向末端反復の機能的等価物が配列番号８で示される塩基配列を含むものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  24. 　該第一の逆方向末端反復の機能的等価物が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び
    該第二の逆方向末端反復の機能的等価物が以下の（４）～（６）から選択されるものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子：
    　（１）配列番号７で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（２）配列番号７で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（３）配列番号７で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
    　（４）配列番号８で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（５）配列番号８で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（６）配列番号８で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
  25. 　該第一の長い末端反復及び該第二の長い末端反復が，レンチウイルス又はレトロウイルスに由来するもの又はその変異体である，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  26. 　該第一の長い末端反復が配列番号５２で示される塩基配列を含み，該第二の長い末端反復が配列番号５３で示される塩基配列を含むものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  27. 　該第一の長い末端反復が以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該第二の長い末端反復が以下の（４）～（６）から選択されるものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子：
    　（１）配列番号５２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（２）配列番号５２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（３）配列番号５２で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
    　（４）配列番号５３で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（５）配列番号５３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（６）配列番号５３で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
  28. 　該リーダー及び該トレイラーが，センダイウイルスに由来するもの又はその変異体である，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  29. 　該リーダーが配列番号５４で示される塩基配列を含み，該トレイラーが配列番号５５で示される塩基配列を含むものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子。
  30. 　該リーダーが以下の（１）～（３）から選択されるものであり，及び該トレイラーが以下の（４）～（６）から選択されるものである，請求項１～１９の何れかに記載の核酸分子：
    　（１）配列番号５４で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（２）配列番号５４で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（３）配列番号５４で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの；及び
    　（４）配列番号５５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，
    　（５）配列番号５５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含むもの，又は
    　（６）配列番号５５で示される塩基配列に１～２０個の置換，欠失又は付加による改変が加えられたもの。
  31. 　該結合活性（ＥＣ５０）が３～５００ｎＭ，３～１００ｎＭ，４ｎＭ～１μＭ，４～５００ｎＭ，４～１００ｎＭ，５ｎＭ～１μＭ，５～５００ｎＭ，又は５～１００ｎＭである，請求項１～３０の何れかに記載の核酸分子。
  32. 　請求項１～３１の何れかに記載の核酸分子が導入された細胞，組織又は動物。
  33. 　請求項１～３１の何れかに記載の核酸分子が導入された幹細胞。
  34. 　間葉系幹細胞，歯髄由来幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，内皮幹細胞，乳腺幹細胞，腸幹細胞，肝幹細胞，膵幹細胞，神経幹細胞，及びｉＰＳ細胞からなる群から選択されるものである，請求項３３に記載の幹細胞。
  35. 　請求項１～３１の何れかに記載の核酸分子を含む，プラスミド。
  36. 　請求項１～３１の何れかに記載の核酸分子を含むウイルスビリオン。
  37. 　請求項３６に記載のウイルスビリオンと担体とを含む，医薬組成物。
PCT/JP2022/048203 2021-12-28 2022-12-27 安全な遺伝子治療のための抗トランスフェリン受容体抗体と生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質 WO2023127879A1 (ja)

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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008083931A1 (en) * 2007-01-08 2008-07-17 Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle Virologie und Immunologie an der Universität Hamburg Use of a tailored recombinases for the treatment of retroviral infections
JP2014516564A (ja) * 2011-06-08 2014-07-17 ヴィシュワス ジョシ 組換えタンパク質および組換えウイルスを作製するための単純な２プラスミド哺乳動物発現系
JP2015212242A (ja) * 2014-05-02 2015-11-26 国立研究開発法人国立がん研究センター 白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法
WO2016072446A1 (ja) * 2014-11-05 2016-05-12 国立大学法人九州大学 ウイルスベクター、細胞およびコンストラクト
WO2018038243A1 (ja) * 2016-08-25 2018-03-01 Ｊｃｒファーマ株式会社 抗体融合蛋白質の製造方法
WO2018124121A1 (ja) * 2016-12-26 2018-07-05 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
WO2020235543A1 (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えａａｖビリオンの製造に用いる核酸分子

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008083931A1 (en) * 2007-01-08 2008-07-17 Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle Virologie und Immunologie an der Universität Hamburg Use of a tailored recombinases for the treatment of retroviral infections
JP2014516564A (ja) * 2011-06-08 2014-07-17 ヴィシュワス ジョシ 組換えタンパク質および組換えウイルスを作製するための単純な２プラスミド哺乳動物発現系
JP2015212242A (ja) * 2014-05-02 2015-11-26 国立研究開発法人国立がん研究センター 白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法
WO2016072446A1 (ja) * 2014-11-05 2016-05-12 国立大学法人九州大学 ウイルスベクター、細胞およびコンストラクト
WO2018038243A1 (ja) * 2016-08-25 2018-03-01 Ｊｃｒファーマ株式会社 抗体融合蛋白質の製造方法
WO2018124121A1 (ja) * 2016-12-26 2018-07-05 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
WO2020235543A1 (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えａａｖビリオンの製造に用いる核酸分子

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