WO2020235543A1 - 組換えａａｖビリオンの製造に用いる核酸分子 - Google Patents

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WO2020235543A1
WO2020235543A1 PCT/JP2020/019724 JP2020019724W WO2020235543A1 WO 2020235543 A1 WO2020235543 A1 WO 2020235543A1 JP 2020019724 W JP2020019724 W JP 2020019724W WO 2020235543 A1 WO2020235543 A1 WO 2020235543A1
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nucleic acid
acid molecule
protein
region
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PCT/JP2020/019724
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ガリナ，ゴロビナ
春奈 高木
啓之 薗田
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Ｊｃｒファーマ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to the field of recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions that can be used for gene therapy, and more specifically, uses nucleic acid molecules that can be used to produce rAAV virions and the nucleic acid molecules. Regarding the manufacturing method of the rAAV virion that was there.
  • rAAV adeno-associated virus
  • Adeno-associated virus belongs to the Parvovirus family, which is the smallest class of linear single-stranded DNA virus in nature, and its viral genome is about 4.7 kb. AAV has no envelope and forms icosahedron particles with a diameter of about 22 nm. AAV is also classified into the dependent virus genus, which is a deficient virus that cannot propagate by single infection, and is co-infected with a helper virus that assists AAV replication in order for efficient replication in animal cells. is required. Helper viruses that assist in AAV replication include, for example, adenovirus or herpesvirus. In the absence of helper virus, no replication of AAV is observed and the AAV genome is integrated into the host genome.
  • the viral genome When wild-type AAV infects human cells as host cells alone, the viral genome is site-specifically integrated into chromosome 19 via reverse terminal repeats (ITRs) present at both ends of the viral genome.
  • ITRs reverse terminal repeats
  • the genes of the viral genome incorporated into the host cell genome are rarely expressed, but when the cell is infected with a helper virus, AAV is excised from the host genome and replication of the infectious virus is initiated.
  • the helper virus is adenovirus
  • the genes responsible for the helper action are E1A, E1B, E2A, VA1 and E4.
  • the host cell is HEK293 cell, which is a cell derived from human fetal kidney tissue transformed by adenovirus E1A and E1B, the E1A and E1B genes are originally expressed in the host cell.
  • the AAV genome contains two genes, rep and cap.
  • the rep proteins (rep78, rep68, rep52 and rep40) produced by the rep gene are essential for capsid formation and intervene in the integration of the viral genome into chromosomes.
  • the cap gene is responsible for the production of three capsid proteins (VP1, VP2 and VP3).
  • rAAV virions are capsids in which the region containing the rep gene and cap gene is replaced with a gene encoding a foreign protein.
  • the rAAV virion is used as a vector for delivering exogenous genes to cells in gene therapy and has the ability to provide treatment options for previously incurable diseases.
  • plasmids Three types of plasmids are generally used to produce rAAV virions. That is, a plasmid containing a gene encoding a foreign protein sandwiched between ITRs (Patent Document 1), a plasmid containing a gene encoding a Rep protein and a gene encoding a Cap protein (Patent Document 2), and an adenovirus-derived E2A. , E4, and a plasmid containing a gene encoding VA1 RNA (Patent Document 3).
  • a plasmid containing a gene encoding a foreign protein sandwiched between ITRs Patent Document 1
  • a plasmid containing a gene encoding a Rep protein and a gene encoding a Cap protein Patent Document 2
  • E4 an adenovirus-derived E2A.
  • plasmid containing a gene encoding VA1 RNA Patent Document 3
  • Non-Patent Document 1 rAAV virions are synthesized in host cells into which three plasmids have been introduced. At this time, in addition to the rAAV virion, empty particles that do not contain DNA are generated in the host cell. It has also been reported that in the transient expression system of plasmid DNA, nearly 80% are empty particles that do not contain DNA. (Non-Patent Document 1)
  • An object of the present invention is to efficiently produce rAAV virions in which a nucleic acid sequence containing a base sequence encoding a foreign protein, which can be used for gene therapy or the like, is packaged in an AAV capsid in one embodiment thereof.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule and a method for producing such rAAV virion.
  • the nucleotide sequence encoding the Rep protein of the adeno-associated virus includes a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the virus, a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus, a base sequence containing the E2A region of the adenovirus, and the E4 region of the adenovirus.
  • a nucleic acid molecule containing a base sequence, a base sequence containing the VA1 RNA region of adenovirus, and a base sequence encoding a foreign protein between the first and second ITRs of the nucleic acid molecule is introduced into a host cell.
  • rAAV virions could be produced efficiently, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following. 1. 1.
  • Nucleic acid molecule containing at least the following base sequence (A) Nucleotide sequence encoding the Rep protein of adeno-associated virus or its functional equivalent, (B) Nucleotide sequence encoding cap protein of adeno-associated virus or its functional equivalent, (C) Nucleotide sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or its functional equivalent, (D) Nucleotide sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus or its functional equivalent, (E) A base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein and / and a base sequence encoding a foreign protein located between the first ITR and the second ITR, (F) Nucleotide sequence containing the E2A region of adenovirus or its functional equivalent, (G) A base sequence containing the E4 region of adenovirus or its functional equivalent, and (h) a base sequence containing the VA1 RNA region of aden
  • a base sequence containing a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein The nucleic acid of 1 above, further comprising a base sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein, and a base sequence containing a third gene expression control site that controls the expression of the foreign protein. molecule. 3. 3. The nucleic acid molecule of 1 or 2 above, which further comprises a base sequence containing a drug resistance gene. 4. The base sequence encoding the Rep protein is encoded downstream of the base sequence containing the first gene expression control site, the base sequence containing the second gene expression control site is further downstream, and the Cap protein is further downstream. The nucleic acid molecule of the above 2 or 3 which contains the base sequence. 5.
  • the base sequence of the E2A region of the adenovirus or its functional equivalent Downstream of the base sequence of the E2A region of the adenovirus or its functional equivalent, the base sequence of the E4 region of the adenovirus or its functional equivalent, and further downstream of the base sequence of the adenovirus VA1 RNA region or its functional equivalent
  • Downstream of the base sequence encoding the Cap protein is a base sequence containing the first reverse terminal repeat (ITR), further downstream is a base sequence containing the third gene expression control site, and further downstream is the foreign substance.
  • ITR first reverse terminal repeat
  • It contains a base sequence for inserting a base sequence encoding a protein and / and a base sequence encoding the foreign protein, and a base sequence further downstream containing the second reverse terminal repeat (ITR). 4 nucleic acid molecules.
  • Downstream of the base sequence containing the second reverse terminal repeat (ITR) is the base sequence of the E2A region of the adenovirus or its functional equivalent, and further downstream is the E4 region of the adenovirus or its functional equivalent.
  • the nucleic acid molecule of 7 above which further contains the nucleotide sequence of the adenovirus VA1 RNA region or its functional equivalent.
  • the nucleic acid molecule according to 9 above which comprises a base sequence containing a drug resistance gene downstream of the base sequence encoding the Cap protein and upstream of the base sequence containing the first ITR. 11.
  • the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 10 above which contains a base sequence having an enhancer function for increasing the expression level of Rep protein and Cap protein downstream of the base sequence encoding the Cap protein.
  • the Rep protein is selected from the group consisting of adeno-associated viruses of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11, any of the above 1 to 11. Nucleic acid molecule.
  • the above 12 nucleic acid molecules, wherein the Rep protein comprises Rep68 and / and Rep78. 14.
  • the Cap protein is selected from the group consisting of adeno-associated viruses of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11, any of the above 1 to 13. Nucleic acid molecule. 15. The above 14 nucleic acid molecules, wherein the Cap protein contains VP1. 16. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 15 above, wherein the first gene expression control site is controlled by the E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof. 17. The above 16 nucleic acid molecules whose first gene expression control site is the p5 promoter of adeno-associated virus. 18.
  • the adeno-associated virus serotypes of the first and second ITRs are selected from the group consisting of 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 and 11.
  • the serotypes of the adenovirus are 2,1,5,6,19,3,11,7,14,16,21,12,18,31,8,9,10,13,15,17,19, 20, 22, 23, 24 to 30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdHu50, AdC6
  • the functional equivalent of the E2A region of the adenovirus is derived from any of the groups selected from the group consisting of herpes simplex virus, vaccinia virus, cytomegalovirus, and pseudorabies virus, any of the above 1 to 23.
  • the functional equivalent of the VA1 RNA region of the adenovirus is derived from one selected from the group consisting of herpes simplex virus, vaccinia virus, cytomegalovirus, and pseudorabies virus, 1 to 25 above. Any nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule according to any one of 9 to 28 above, wherein the drug resistance gene imparts resistance to a drug corresponding to the drug resistance gene to prokaryotic cells.
  • the third gene expression control site is represented by a promoter derived from cytomegalovirus, an SV40 early promoter, a human elongation factor-1alpha (EF-1 ⁇ ) promoter, a human ubiquitin C promoter, a ⁇ -actin promoter, and SEQ ID NO: 47. Any of the above 2 to 29, which is selected from the group consisting of a promoter containing a base sequence and a promoter containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 downstream of the promoter containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • nucleic acid molecule 31.
  • the base sequence having the enhancer function is a p5 promoter of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof.
  • the foreign protein is of human origin.
  • the foreign protein is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody. 34.
  • the foreign proteins are growth hormone, lysosome enzyme, somatomedin, insulin, glucagon, lysosome enzyme, cytokine, phosphokine, blood coagulation factor, antibody, fusion protein of antibody and other proteins, granulocyte macrophage colony stimulator (GM- CSF), granulocyte colony stimulator (G-CSF), macrophage colony stimulator (M-CSF), erythropoetin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicular stimulator (FSH), gonads Stimulant hormone releasing hormone (GnRH), gonadotropin, DNasel, thyroid stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), hairy neurotrophic factor (CNTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3 , Neurotrophin 4/5, Neurotrophin 6, Neurotrophin 6, Neurogulin 1, Activin, Basic fibroblast growth factor (bFGF),
  • the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 32 above, which is selected from the group consisting of an enzyme, etanercept, pegbisomant, metrereptin, avatacept, ashotase, and a GLP-1 receptor agonist. 35.
  • the foreign protein is a lysosomal enzyme, and the lysosomal enzyme is ⁇ -L-isronidase, isulonic acid-2-sulfatase, glucocerebrosidase, ⁇ -galactosidase, GM2 activated protein, ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ .
  • -Hexosaminidase B N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, ⁇ -L-fucosidase, aspartyl glucosaminidase, ⁇ -N- Acetylgalactosaminidase, acidic sphingomyelinase, ⁇ -galactosidase A, ⁇ -glucuronidase, heparan N-sulfatase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, acetylCoA ⁇ -glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, Any of 1 to 32 above, which is selected from the group consisting of acidic ceramidase, amy
  • the nucleic acid molecule 36.
  • the foreign proteins are anti-IL-6 antibody, anti-beta amyloid antibody, anti-BACE antibody, anti-EGFR antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-HER2 antibody, anti-PCSK9 antibody, anti-TNF- ⁇ antibody.
  • the proteins present on the surface of the vascular endothelial cells are transferase receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transport carrier 1, A group consisting of organic anion transporters, monocarboxylic acid transporters, low-density lipoprotein receptor-related proteins 1, low-density lipoprotein receptor-related proteins 8, and membrane-bound precursors of heparin-binding epithelial growth factor-like growth factors. 36 nucleic acid molecules above, which are selected from. 38.
  • the foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein, and the antibody is selected from the group consisting of mouse antibody, humanized antibody, human-mouse chimeric antibody, and human antibody, and ,
  • the other proteins are growth hormone, lysosome enzyme, cytokine, neurophocaine, blood coagulation factor, antibody, fusion protein of antibody and other protein, granulocyte macrophage colony stimulator (GM-CSF), granulocyte colony stimulator (G-CSF), macrophage colony stimulator (M-CSF), erythropoetin, dalbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicular stimulator, DNasel, thyroid stimulator (TSH), neurogrowth factor (NGF), hairy neurotrophic factor (CNTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fiber Sprout growth factor (b
  • the foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein, and the antibody is selected from the group consisting of mouse antibody, humanized antibody, human-mouse chimeric antibody, and human antibody, and
  • the other protein is a lysosome enzyme, which is ⁇ -L-isronidase, isulonic acid-2-sulfatase, glucocerebrosidase, ⁇ -galactosidase, GM2 activating protein, ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ - Hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, ⁇ -L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, ⁇ -N-acetyl Galactosaminidase, acid
  • Nucleic acid molecule. 40 The nucleic acid molecule of 38 or 39 above, wherein the other protein is of human origin. 41. The nucleic acid molecule according to any one of 38 to 40 above, wherein the antibody has an affinity for a protein present on the surface of vascular endothelial cells. 42.
  • the proteins present on the surface of the vascular endothelial cells are transferase receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transport carrier 1, A group consisting of organic anion transporters, monocarboxylic acid transporters, low-density lipoprotein receptor-related proteins 1, low-density lipoprotein receptor-related proteins 8, and membrane-bound precursors of heparin-binding epithelial growth factor-like growth factors.
  • a method for producing a recombinant AAV virion which comprises the step of introducing the nucleic acid molecule according to any one of 1 to 43 into a host cell.
  • rAAV virions in which a nucleic acid sequence containing a base sequence encoding a foreign protein, which can be used for gene therapy or the like, is packaged can be efficiently produced, so that rAAV virions can be inexpensively produced. It will be possible to supply it, and the medical expenses required for gene therapy can be reduced.
  • Schematic diagram showing the structure of the pHelper (mod) vector Schematic diagram showing the structure of the pHelper (mod) vector. Schematic diagram showing the structure of the pAAV-CMV-GFP (mod) vector. Schematic diagram showing the structure of the pR2 (mod) C6 vector. Schematic diagram showing the structure of the pR2 (mod) C9 vector. Schematic diagram showing the structure of the pHelper-ITR / CMV / GFP vector. Schematic diagram showing the structure of the pHelper-R2 (mod) C6 vector. Schematic diagram showing the structure of the pHelper-R2 (mod) C9 vector. Schematic diagram showing the structure of the pR2 (mod) C6-ITR / CMV / GFP vector.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measurement of the amount of rAAV genome and the total amount of capsid contained in the culture supernatant obtained in Example 16. The vertical axis shows the amount of rAAV genome (x10 11 ) or the total amount of capsid (x10 11 ).
  • the black bar indicates the amount of rAAV genome
  • the white bar indicates the total amount of capsid. From left to right, (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, are introduced, (2): pHelper-R2 (mod) C9 vector and pAAV-CMV- When two types of GFP vector plasmids are introduced, (3): pR2 (mod) C9-ITR / CMV / When two types of vectors, GFP vector and pHelper vector, are introduced (4): pHelper-ITR / CMV Measurement results for each of the / GFP-R2 (mod) C9 vector introduced and (5): pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector introduced.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measurement of the amount of rAAV genome and the total amount of capsid contained in the purified cell lysate solution obtained in Example 18.
  • the vertical axis shows the amount of rAAV genome (x10 11 ) or the total amount of capsid (x10 11 ).
  • the black bar indicates the amount of rAAV genome, and the white bar indicates the total amount of capsid.
  • FIG. 14 is a diagram showing the result of calculation of the abundance ratio of the rAAV virion obtained in Example 19 in the total capsid.
  • the vertical axis shows the abundance ratio (%).
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of infectivity measurement of rAAV6 virion purified from the cell lysate solution obtained in Example 20.
  • the vertical axis shows the proportion of GFP-positive cells, that is, the infection efficiency (%) of rAAV6 virions.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of infectivity measurement of rAAV9 virion purified from the cell lysate solution obtained in Example 21.
  • the vertical axis shows the proportion of GFP-positive cells, that is, the infection efficiency (%) of rAAV9 virions.
  • FIG. 17 is a diagram showing the calculation result of the Transducing Unit of the rAAV6 virion obtained in Example 22.
  • the vertical axis shows the value of Transducing Unit (x10 5 ).
  • FIG. 18 is a diagram showing the calculation result of the Transducing Unit of the rAAV9 virion obtained in Example 22.
  • the vertical axis shows the value of Transducing Unit (x10 5 ). From left to right, (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, are introduced, (2): pHelper-R2 (mod) C9 vector and pAAV-CMV- When two types of GFP vector are introduced, (3): When two types of plasmids, pR2 (mod) C9-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector, are introduced, (4): Integrated rAAV plasmid (pHelper) -ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector) is introduced, and (5): pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector are introduced
  • the value of the Transducing Unit is shown for each.
  • adeno-associated virus used to introduce foreign genes into cells, tissues, or organisms usually involves (1) the first reverse end derived from a virus such as AAV.
  • a plasmid (plasmid) having a structure containing a base sequence containing a repeat (ITR), a base sequence containing a second reverse terminal repeat (ITR), and a gene encoding a desired protein placed between these two ITRs. 1), (2) Encodes the AAV Rep gene having the function necessary for integrating the base sequence of the region (including the ITR sequence) sandwiched between the ITR sequences into the genome of the host cell, and the AAV plasmid protein.
  • Three types of plasmids are used: a plasmid containing a gene (plasmid 2) and (3) a plasmid containing the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region of adenovirus.
  • adeno-associated virus adeno-associated virus
  • these three types of plasmids are first introduced into host cells such as HEK293 cells in which the adenovirus E1a and E1b genes have been integrated into the genome. .. Then, the base sequence containing the first reverse terminal repeat (ITR), the base sequence containing the second reverse terminal repeat (ITR), and the gene encoding the desired protein placed between these two ITRs are obtained. The region containing is integrated into the genome of the host cell. Single-stranded DNA is replicated from this region and packaged into the capsid protein of AAV to form recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions.
  • This recombinant adeno-associated virus (rAAV) virion is infectious and can be used to introduce foreign genes into cells, tissues, or living organisms.
  • the components of the three types of plasmids 1 to 3 described above, which are necessary for the production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions that is, (a) Rep protein of adeno-associated virus. Or a base sequence encoding its functional equivalent, (b) a base sequence encoding the Cap protein of adeno-associated virus or its functional equivalent, (c) a base sequence containing the first reverse terminal repeat (ITR). , (D) A base sequence containing the second reverse terminal repeat (ITR), (e) To insert a base sequence encoding a foreign protein located between the first ITR and the second ITR.
  • rAAV adeno-associated virus
  • Nucleotide sequence and / and the base sequence encoding the foreign protein (f) the base sequence encoding the E2A protein of adenovirus or its functional equivalent, (g) the E4 protein of adenovirus or its functional equivalent. It relates to a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding and (h) a base sequence encoding VA1RNA of adenovirus or a functional equivalent thereof.
  • the integrated rAAV plasmid means a plasmid containing the above components (a) to (h).
  • the integrated rAAV plasmid may be linear or circular.
  • a base sequence containing a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein and a base containing a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein relates to a sequence and a nucleic acid molecule further containing a base sequence containing a base sequence containing a third gene expression control site that controls the expression of the foreign protein.
  • the Rep protein of adeno-associated virus is encoded by the rep gene of AAV.
  • the Rep protein has a function necessary for integrating the AAV genome into the genome of a host cell, for example, via the ITR existing in the genome.
  • Rep68 and Rep78 are translations of two types of mRNA that are transcribed from the same gene by alternative splicing.
  • the AAV Rep protein includes at least two types of proteins, Rep68 and Rep78.
  • the base sequence encoding the Rep protein of adeno-associated virus means at least the base sequence encoding Rep68 and Rep78, or the base sequence obtained by adding a mutation to the base sequence.
  • the Rep protein is preferably of AAV of serotype 2, but is not limited to this, and is of serotype 1,3,4,5,6,7,8,9,10 or 11. It may be any of the above.
  • the nucleotide sequence encoding the AAV Rep protein of wild-type serotype 2 has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Wild-type serotype 2 AAV Rep68 and Rep78 have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • Rep68 is replaced with the amino acid sequence of the wild-type Rep68 of AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exerts its function. , Deletion, addition, etc. may be modified. In the present invention, Rep68 to which these mutations are added is also included in Rep68.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. .
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Rep68 with a mutation that combines substitutions and deletions of these amino acids is also Rep68.
  • adding amino acids preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the wild-type Rep68 or to the N-terminal or C-terminal.
  • Rep68 with mutations that combine additions, substitutions and deletions of these amino acids is also included in Rep68.
  • the mutated Rep68 amino acid sequence preferably exhibits 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95% or more homology to the wild-type Rep68 amino acid sequence. It shows homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • Rep78 is replaced with the amino acid sequence of the wild-type Rep78 of AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exerts its function. , Deletion, addition, etc. may be modified. In the present invention, Rep78 to which these mutations are added is also included in Rep78.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. .
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Rep78 with mutations that combine substitutions and deletions of these amino acids is also Rep78.
  • adding amino acids preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the wild-type Rep78 or to the N-terminal or C-terminal.
  • Rep78 with mutations that combine additions, substitutions and deletions of these amino acids is also included in Rep78.
  • the mutated Rep78 amino acid sequence preferably exhibits 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95% or more homology to the wild-type Rep78 amino acid sequence. It shows homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • AAV Rep proteins are those that can be functionally used in place of Rep68 in Rep68 and can be functionally used in place of Rep78 in Rep78. Say something.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be modified by substitution, deletion, addition, etc. as long as it encodes functional Rep68 and Rep78.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a mutation that combines these base substitutions and deletions can also be used as the base sequence encoding the Rep protein.
  • a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or at the 5'end or 3'end.
  • Add. Mutations that combine additions, substitutions, and deletions of these bases can also be used as nucleic acid molecules encoding Rep proteins.
  • the mutated base sequence shows preferably 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It shows sex, and even more preferably 98% or more homology.
  • the start codon of the gene encoding Rep68 and Rep78 of the Rep protein is ACG.
  • nucleic acid molecule encoding the Rep protein in the preferred embodiment of the present invention examples include those containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • This nucleic acid molecule encodes Rep68, a Rep protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and Rep78, a Rep protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the start codon of the gene encoding Rep68 and Rep78 of the Rep protein is ACG. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to this base sequence are also nucleic acid molecules that encode the Rep protein as long as they encode the Rep protein.
  • the base sequence encoding the Cap protein of adeno-associated virus is at least the base sequence encoding VP1, which is one of the proteins constituting the capsid of AAV, or the base sequence obtained by adding a mutation to the base sequence.
  • VP1 is preferably of AAV of serotype 9, but is not limited to that of serotype 1,2,3,4,5,6,7,8,10 or 11. It may be any of them.
  • the nucleotide sequence encoding VP1 of AAV of wild-type serotype 6 has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5. Wild-type serotype 6 AAV VP1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • nucleotide sequence encoding VP1 of AAV of wild-type serotype 9 has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • Wild-type serotype 9 AAV VP1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • VP1 is replaced with the amino acid sequence of wild-type VP1 of AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 as long as it exerts its function. , Deletion, addition, etc. may be modified. In one embodiment of the present invention, VP1 to which these mutations are added is also included in VP1.
  • the amino acid of is replaced with another amino acid
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • VP1 with a mutation that combines substitutions and deletions of these amino acids is also VP1.
  • VP1 When adding amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of wild-type VP1 or to the N-terminal or C-terminal. VP1 with mutations that combine additions, substitutions and deletions of these amino acids is also included in VP1.
  • the mutated VP1 amino acid sequence preferably exhibits 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95% or more homology to the wild-type VP1 amino acid sequence. It shows homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • AAV VP1 The functional equivalent of AAV VP1 is one that can be functionally used in place of VP1.
  • nucleic acid molecule encoding the Cap protein in a preferred embodiment of the present invention include those containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7. These nucleic acid molecules are the base sequence encoding VP1 of wild-type serotype 6 AAV and the base sequence encoding wild-type serotype 9 AAV VP1, respectively. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to these base sequences are also nucleic acid molecules encoding the Cap protein as long as they encode functional VP1.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. It is an individual.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • a mutation that combines these base substitutions and deletions can also be used as the base sequence encoding the Cap protein.
  • a base is added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7 or at the 5'end or 3'end. Add a base.
  • Mutations that combine additions, substitutions and deletions of these bases can also be used as nucleic acid molecules encoding Cap proteins.
  • the mutated base sequence shows preferably 85% or more homology with the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 or 7, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more. It shows the homology of 98% or more, and more preferably 98% or more.
  • the term "reverse end repeat (ITR) of adeno-associated virus” refers to a base sequence essential for the gene of adeno-associated virus to be integrated into the genome sequence of a host cell by illegitimate recombination. Say that.
  • ITR adeno-associated virus reverse end repeats
  • the ITR located on the 5'side is called the reverse end repeat (ITR) of the first adeno-associated virus, 3'.
  • the ITR located on the side is called the reverse terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus.
  • Reverse end repeats are preferably, but not limited to, those of serotype 2 AAV, with serotypes 1,3,4,5,6,7,8, It may be any of 9, 10 or 11.
  • the first ITR contains the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and the second ITR contains the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • reverse end repeat is a wild-type AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11, as long as it exerts its function.
  • the ITR base sequence may be modified by substitution, deletion, addition, or the like. ITRs with these mutations are also included in ITRs.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. .
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • ITRs with mutations that combine substitutions and deletions of these bases are also ITRs.
  • adding bases preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence of the wild-type ITR or to the 5'end or 3'end. To do. Mutations that combine the addition, substitution, and deletion of these bases are also included in the ITR.
  • the mutated ITR nucleotide sequence preferably exhibits 85% or more homology with the wild-type ITR nucleotide sequence, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95% or more. It shows homology, and even more preferably 98% or more.
  • AAV's ITR The functional equivalent of AAV's ITR is one that can be functionally used in place of AAV's ITR. Also, an ITR artificially constructed based on the AAV ITR is a functional equivalent of the AAV ITR as long as it can replace the AAV ITR.
  • first ITR first reverse terminal repeat
  • SEQ ID NO: 11 The base sequence represented by SEQ ID NO: 11 with substitutions, deletions, and mutations is also a functional equivalent of AAV ITR as long as it can be functionally used in place of AAV ITR. included.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the ITR with mutations that combine substitutions and deletions of these bases is also the first ITR.
  • a base is added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 11, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 in the base sequence or at the 5'end or 3'end.
  • the base sequence of the mutated ITR shows preferably 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more. It shows the homology of 98% or more, and more preferably 98% or more.
  • second ITR an artificially constructed second reverse terminal repeat
  • SEQ ID NO: 12 The base sequence represented by SEQ ID NO: 12 with substitutions, deletions, and mutations is also a functional equivalent of AAV ITR as long as it can be functionally used in place of AAV ITR. included.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the ITR with mutations that combine the substitutions and deletions of these bases is also the second ITR.
  • a base is added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 12, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 to 3 are added to the base sequence or at the 5'end or 3'end. Add a number of bases. Mutations that combine the addition, substitution, and deletion of these bases are also included in the second ITR.
  • the base sequence of the mutated ITR shows preferably 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more. It shows the homology of 98% or more, and more preferably 98% or more.
  • a foreign protein is encoded between the reverse adeno-associated virus reverse end repeat (ITR) and the second adeno-associated virus reverse end repeat (ITR).
  • ITR reverse adeno-associated virus reverse end repeat
  • ITR second adeno-associated virus reverse end repeat
  • the base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein means a base sequence containing a base sequence that can be specifically cleaved with a restriction enzyme. This includes so-called multi-cloning sites. This base sequence can be cleaved with a restriction enzyme, and a nucleic acid molecule encoding a desired foreign protein can be inserted at this cleavage site.
  • the foreign protein that can be encoded in the nucleic acid molecule.
  • the species is not particularly limited and may be either a prokaryotic cell or a protein encoded in the genome of a eukaryotic cell.
  • eukaryotic cells are, for example, fungi, yeasts, insects, protozoans, amphibians, reptiles, birds, mammals, and plants.
  • the species is a mammal, for example, it is a human, a primate other than a human, a domestic animal such as a cow, a horse, a pig, or a sheep, or a pet animal such as a cat or a dog.
  • the foreign protein may be a wild-type protein derived from a specific species with mutations such as substitution, deletion, or addition added to the amino acid sequence.
  • the foreign protein may be an artificial protein containing an amino acid sequence that does not exist in nature.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1. ⁇ 3 pieces.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. Mutations that combine substitutions and deletions of these amino acids can also be added.
  • adding amino acids preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the wild-type protein or to the N-terminal or C-terminal.
  • the amino acid sequence of the mutated protein preferably exhibits 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95%, with the amino acid sequence of the corresponding wild-type protein. It shows a homology of% or more, and even more preferably 98% or more.
  • the foreign protein is not particularly limited, and examples thereof include proteins that are partially or wholly functionally deficient in a genetic disease.
  • genetic diseases include lysosome disease, cystic fibrosis, and hemophilia.
  • Other foreign proteins include growth hormone, somatomedin, insulin, glucagon, lysosome enzyme, cytokine, phosphokine, blood coagulation factor, antibody, fusion protein of antibody and other proteins, granulocyte macrophage colony stimulator (GM-CSF) , Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoetin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicular stimulating hormone (FSH), gonad stimulating hormone Release hormone (GnRH), gonadotropin, DNasel, thyroid stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), hairy neurotrophic factor (CNTF),
  • GM-CSF
  • foreign proteins examples include mouse antibodies, humanized antibodies, human-mouse chimeric antibodies, and human antibodies. Furthermore, as foreign proteins, anti-IL-6 antibody, anti-beta amyloid antibody, anti-BACE antibody, anti-EGFR antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-HER2 antibody, anti-PCSK9 antibody, and anti-TNF- An ⁇ antibody can be exemplified.
  • the genes of the foreign protein include ⁇ -L-isuronidase, isulonic acid-2-sulfatase, glucocerebrosidase, ⁇ -galactosidase, GM2 activated protein, and ⁇ -hex.
  • the foreign protein may be a fusion protein of an antibody and another protein.
  • fusion proteins include the antibody being either a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, or a human antibody, and other proteins are growth hormones, lysosome enzymes, cytokines, neurophokines, blood coagulation factors.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulator
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • M-CSF macrophage colony stimulator
  • erythropoetin darbepoetin
  • Tissue plasminogen activator t-PA
  • thrombomodulin follicular stimulating hormone, DNasel, thyroid stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), hairy neurotrophic factor (CNTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin 3, Neurotrophin 4/5, Neurotrophin 6, Neurotrophin 6, Neurogulin 1, Actibin, Basic fibroblast growth factor (bFGF), Fibroblast growth factor 2 (FGF2), Epithelial cells Growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor
  • the foreign protein may be a fusion protein of an antibody and a lysosomal enzyme.
  • fusion proteins include the antibody being either a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, or a human antibody, and lysosomal enzymes such as ⁇ -L-isulonidase, sulfatase, gluco.
  • the antibody has a specific affinity for, for example, a protein present on the surface of vascular endothelial cells. It is an antibody.
  • proteins include transferase receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transport carrier 1, organic anion transporter, monocarboxylic. Examples thereof include acid transporters, low-density lipoprotein receptor-related proteins 1, low-density lipoprotein receptor-related proteins 8, and membrane-bound precursors of heparin-binding epithelial growth factor-like growth factors.
  • OATP-F can be exemplified as an organic anion transporter
  • MCT-8 can be exemplified as a monocarboxylic acid transporter.
  • Adenovirus provides the functions required for the AAV genome to be replicated in the host cell and packaged in capsids to form viral virions. This function is exerted by the E1 region, E2A region, E4 region, and VA1 RNA region of the adenovirus genome.
  • the term recombinant AAV virion refers to a nucleic acid molecule in which the AAV capsid protein (including its functional equivalent) is modified in the wild-type AAV genome.
  • a packaged rAAV genome refers to a nucleic acid molecule in which the wild-type AAV genome has been modified.
  • the rAAV genome packaged in the rAAV virion is a single-stranded DNA.
  • nucleic acid molecules include, from the 5'end side, a base sequence containing the reverse end repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or its functional equivalent, and a region containing a base sequence encoding a foreign protein. And there is single-stranded DNA containing the reverse terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus.
  • the nucleic acid molecule that is not packaged in the rAAV virion can also be called the rAAV genome. Therefore, the rAAV genome may be single-stranded DNA or double-stranded DNA.
  • the amount of rAAV genome means the number of rAAV genomes, and the unit thereof is vg.
  • an empty capsid is a particle composed of a capsid protein in which the rAAV genome is not packaged.
  • the total capsid is a general term for empty capsids and rAAV virions, and the total capsid amount is the sum of the numbers of empty capsids and rAAV virions.
  • recombinant AAV virions when the capsid protein is derived from serum type 6 AAV, it can be called recombinant AAV6 virion (rAAV6 virion), and when the capsid protein is derived from serum type 9 AAV. It can be called a recombinant AAV9 virion (rAAV9 virion). The same applies to AAV of other serotypes.
  • nucleic acid molecules include a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus from the 5'end to the side or its functional equivalent, and gene expression that controls the expression of the foreign protein.
  • ITR reverse terminal repeat
  • nucleic acid molecules include a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus from the 5'end side or its functional equivalent, and gene expression that controls the expression of the foreign protein.
  • ITR reverse terminal repeat
  • the base sequence that can be used as the intron sequence is not particularly limited, but a synthetic human ⁇ -globin intron in which a mutation is introduced into the human ⁇ -globin gene, for example, an intron containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 is preferably used.
  • the base sequence that can be used as the polyadenylation signal sequence is not particularly limited, but the base sequence of the synthetic polyadenylation signal sequence (synthetic poly A sequence) including the base sequence shown by SEQ ID NO: 26. There is.
  • HEK293 cells are known.
  • the genome of HEK293 cells contains at least the E1A and E1B coding regions.
  • the regions of the adenovirus genome required for the AAV genome to replicate and be packaged in capsids to form viral virions are the E2A region, E4.
  • the E4 34kD protein encoded by the open reading frame 6 (ORF6) of the E4 region is required for AAV replication.
  • the E2A region has a serotype of 2,1,5,6,19,3,11,7 as long as it exerts the original function required for AAV replication. , 14,16,21,12,18,31,8,9,10,13,15,17,19,20,22,23,24-30,37,40,41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24 , AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad3, dog Ad2, sheep Ad, or porcine adenovirus. May be good.
  • the E2A region of adenovirus, which is serotype 2 is one of the preferred ones in the present invention.
  • the E2A region of adenovirus of serotype 2 contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the E2A region As long as the region exerts its original function, the E2A region of the wild-type adenovirus that has been modified such as substitution, deletion, or addition can be used. In one embodiment of the present invention, the E2A region to which these mutations have been added is also included in the E2A region.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the E2A region to which mutations that combine substitutions and deletions of these bases have been added is also the E2A region.
  • adding bases preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence of the wild-type E2A region or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the E2A region is also included in the E2A region, which is mutated by combining additions, substitutions and deletions of these bases.
  • the nucleotide sequence of the mutated E2A region preferably shows 85% or more homology with the wild-type E2A nucleotide sequence, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more. It shows the homology of 98% or more, and more preferably 98% or more.
  • the E4 region has a serotype of 2,1,5,6,19,3,11,7 as long as it exerts the original function required for AAV replication. , 14,16,21,12,18,31,8,9,10,13,15,17,19,20,22,23,24-30,37,40,41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24 , AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad3, canine Ad2, sheep Ad, or porcine adenovirus. May be good.
  • the E4 region of adenovirus, which is serotype 2 is one of the preferred ones in the present invention.
  • the E4 region of adenovirus, which is serotype 2 contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the E4 region As long as the region exerts its original function, the E4 region of the wild-type adenovirus that has been modified such as substitution, deletion, or addition can be used. In one embodiment of the present invention, the E4 region to which these mutations have been added is also included in the E4 region.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the E4 region to which mutations that combine substitutions and deletions of these bases have been added is also the E4 region.
  • E4 with mutations that combine additions, substitutions and deletions of these bases is also included in E4.
  • the mutated E4 base sequence shows preferably 85% or more homology with the wild type E4 base sequence, more preferably 90% or more homology, and even more preferably 95% or more. It shows homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • E4 region there is one containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 15.
  • a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 that has been modified by substitution, deletion, addition, or the like can also be used as the E4 region as long as it exhibits the function originally possessed by the region.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Mutations that combine substitutions and deletions of these bases can also be added.
  • adding bases preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 15 or at the 5'end or 3'end. Add. Mutations that combine additions, substitutions and deletions of these bases can also be added.
  • the mutated base sequence shows preferably 85% or more homology, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95% or more homology with the base sequence shown by SEQ ID NO: 15. It shows sex, and even more preferably 98% or more homology.
  • the E4 region is also the one to which these mutations are added.
  • the VA1 RNA region has a serotype of 2,1,5,6,19,3,11, as long as it exerts the original function required for AAV replication. 7,14,16,21,12,18,31,8,9,10,13,15,17,19,20,22,23,24-30,37,40,41, AdHu2, AdHu3, AdHu4 AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Bovine Ad3, Dog Ad2, Sheep Ad3, Dog Ad3, Sheep Ad3, You may.
  • the VA1 RNA region of adenovirus, which is serotype 2 is one of the suitable ones in the present invention.
  • the VA1 RNA region of adenovirus of serotype 2 contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the VA1 RNA region of the wild-type adenovirus may be modified by substitution, deletion, addition, etc. it can.
  • the VA1 RNA region to which these mutations have been added is also included in the VA1 RNA region.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Is.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the VA1 RNA region to which mutations that combine substitutions and deletions of these bases have been added is also the VA1 RNA region.
  • the VA1 RNA region to which mutations combining additions, substitutions and deletions of these bases have been added is also included in the VA1 RNA region.
  • the nucleotide sequence of the mutated VA1 RNA region preferably shows 85% or more homology with the wild-type VA1 RNA region base sequence, more preferably 90% or more homology, and even more preferably. It shows 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region may be located in any order.
  • the base sequence containing the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region is called the helper region.
  • helper region is one containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 17, in which the E4 region is located downstream of the E2A region and the VA1 RNA region is located further downstream. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to this base sequence can also be used as helper regions as long as each region of the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region exerts its original function.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and further.
  • the number is preferably 1 to 10.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and even more preferably. 1 to 10 pieces.
  • mutations that combine substitutions and deletions of these bases can also be used as helper regions.
  • nucleotide sequence of the mutated helper region preferably shows 85% or more homology with the nucleotide sequence of the helper region containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17, and more preferably 90% or more homology. More preferably, it exhibits 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • a base sequence that can be used as a base sequence containing a first gene expression control site that controls the expression of Rep protein includes a region containing an E2A region, an E4 region, and a VA1 RNA region.
  • it is not particularly limited, but is preferably the p5 promoter of AAV.
  • the first gene expression control site is the p5 promoter of AAV, it is preferable that it is the p5 promoter of AAV which is serotype 2, but it is not limited to this, and serotypes 1, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 or 11 may be used.
  • the p5 promoter of serotype 2 AAV contains the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the p5 promoter of AAV is a wild-type AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11, as long as it exerts its function.
  • the base sequence of the p5 promoter may be modified by substitution, deletion, addition, or the like.
  • the p5 promoter to which these mutations are added is also included in the p5 promoter.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably. Is 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the p5 promoter with mutations that combine substitutions and deletions of these bases is also a p5 promoter.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 18 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated p5 promoter preferably shows 85% or more homology with the wild-type p5 promoter nucleotide sequence, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • An example of a p5 promoter modified from the p5 promoter of AAV, which is serotype 2, is one containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • a modification such as substitution, deletion, or addition to the base sequence of the p5 promoter may be a p5 promoter or a functional equivalent thereof as long as it exhibits the original function of the p5 promoter.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further.
  • the number is preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a p5 promoter or a functional equivalent thereof can also be used by adding a mutation that combines substitutions and deletions of these bases.
  • bases preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 or at the 5'end or 3'end.
  • Add. Mutations that combine additions, substitutions and deletions of these bases can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent.
  • the base sequence of the mutated p5 promoter preferably shows 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 19, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • the p5 promoter or its functional equivalent is usually located upstream of the nucleotide sequence encoding the adeno-associated virus Rep protein or its functional equivalent.
  • the region containing the p5 promoter or its functional equivalent and the base sequence encoding the adeno-associated virus Rep protein or its functional equivalent is called the Rep region.
  • a preferred embodiment of the Rep region includes one containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 20 includes the base sequence shown by SEQ ID NO: 4 downstream of the base sequence shown by SEQ ID NO: 19. That is, the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 20 includes Rep68 of AAV of serotype 2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 and Rep78 of AAV of serotype 2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3. To code.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 that has been modified by substitution, deletion, addition, etc. can also be used as the Rep region as long as it exhibits the original function of the Rep region.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further.
  • the number is preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a mutation that combines substitutions and deletions of these bases can also be used as the Rep region.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 20 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated Rep region preferably shows 85% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • a base sequence that can be used as a base sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of Cap protein includes a region containing an E2A region, an E4 region, and a VA1 RNA region.
  • it is not particularly limited, but is preferably the p40 promoter of AAV.
  • it is preferable that it is the p40 promoter of AAV which is serotype 2, but it is not limited to this, and serotypes 1,3,4,5,6,7,8,9 , 10 or 11.
  • the p40 promoter of AAV is a wild-type AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11, as long as it exerts its function.
  • the base sequence of the p40 promoter may be modified by substitution, deletion, addition, or the like.
  • the p40 promoter to which these mutations are added is also included in the p40 promoter.
  • the number of bases to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. is there.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the p40 promoter with mutations that combine substitutions and deletions of these bases is also a p40 promoter.
  • adding bases preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence of the wild-type p40 promoter or at the 5'end or 3'end. Add. Mutations that combine the addition, substitution and deletion of these bases are also included in the p40 promoter.
  • the nucleotide sequence of the mutated p40 promoter preferably shows 85% or more homology with the wild-type p40 promoter nucleotide sequence, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • the p40 promoter or its functional equivalent is usually located upstream of the nucleotide sequence encoding the adeno-associated virus Cap protein or its functional equivalent.
  • Cap region The region containing the p40 promoter or its functional equivalent and the base sequence encoding the adeno-associated virus Cap protein or its functional equivalent is called the Cap region.
  • a preferred embodiment of the Cap region includes one containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • This Cap region contains a base sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9 having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and encodes VP1 of AAV of serotype 9 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8. ..
  • This Cap region encodes VP1 of AAV of serotype 6 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 instead of the nucleotide sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. It is also possible to include a base sequence to be used. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to these base sequences can also be used as the Cap region as long as they exhibit the original function of the Cap region.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably. Is 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a mutation that combines substitutions and deletions of these bases can also be used as the Cap region.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 21 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated Cap region preferably exhibits 85% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more. The same applies to the case where the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 is replaced with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the Rep region may be located upstream or downstream of the Cap region.
  • the area including the Rep area and Cap area is called the Rep-Cap area.
  • a preferred embodiment of the Rep-Cap region is one in which the Rep region is located upstream of the Cap region and contains the base sequence shown by SEQ ID NO: 22.
  • This Rep-Cap region contains the base sequence shown by SEQ ID NO: 20 downstream of the base sequence shown by SEQ ID NO: 19, and the base sequence shown by SEQ ID NO: 21 further downstream.
  • This Rep-Cap region contains a base sequence encoding VP1 of serotype 9 AAV having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and VP1 of serotype 9 AAV having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8.
  • This Rep-Cap region is replaced with the base sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9 having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and VP1 of AAV of serotype 6 having the base sequence shown by SEQ ID NO: 5. It can also contain a base sequence encoding. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to these base sequences can also be used as the Rep-Cap region as long as they exhibit the original functions of the Rep-Cap region.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10. , More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a mutation that combines substitutions and deletions of these bases can also be used as the Rep-Cap region.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 22 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated Rep-Cap region preferably exhibits 85% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22, more preferably 90% or more homology, and even more preferably. It shows 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • an enhancer sequence having a function of increasing the expression level of Rep protein and / and Cap protein can be arranged downstream of the Rep-Cap region.
  • the enhancer sequence is not particularly limited, but the p5 promoter of AAV or its functional equivalent can be used as the enhancer.
  • the AAV serotype of the p5 promoter used here is not particularly limited, and is any AAV p5 promoter of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. It may be, but preferably a serotype 2 AAV p5 promoter.
  • the p5 promoter of serotype 2 AAV contains the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the P5 promoter of AAV located downstream of the Rep-Cap region is a wild-type AAV of any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11.
  • the base sequence of the p5 promoter may be modified by substitution, deletion, addition, or the like.
  • the p5 promoter with these mutations is also included in the P5 promoter.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 1. There are three.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • the p5 promoter with mutations that combine substitutions and deletions of these bases is also a P5 promoter.
  • adding bases preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence of the wild-type P5 promoter or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated p5 promoter preferably shows 85% or more homology with the wild-type P5 promoter nucleotide sequence, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • An example of a p5 promoter modified from the p5 promoter of serotype 2 AAV includes one containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to the base sequence of this p5 promoter are also included in the p5 promoter.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further.
  • the number is preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Mutations that combine these base substitutions and deletions can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent.
  • adding bases preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the base sequence of the mutated p5 promoter preferably shows 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 19, more preferably 90% or more homology, and further preferably 95%. It shows the above homology, and even more preferably 98% or more.
  • a preferred embodiment of such a Rep-Cap region includes one containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 20 is downstream of the base sequence shown by SEQ ID NO: 19
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 21 is further downstream
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 19 is further downstream. including. Even if this base sequence is modified by substitution, deletion, addition, etc., it can be regarded as a Rep-Cap region as long as it exhibits the original function of the Rep-Cap region.
  • the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10. , More preferably 1 to 3.
  • the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3.
  • a mutation that combines substitutions and deletions of these bases can also be used as the Rep-Cap region.
  • adding a base preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown by SEQ ID NO: 23 or at the 5'end or 3'end. Add.
  • the nucleotide sequence of the mutated Rep-Cap region preferably shows 85% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23, more preferably 90% or more homology, and even more preferably. It shows 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.
  • a gene encoding this foreign protein is introduced into a base sequence that can be used as a base sequence containing a third gene expression control site that controls the expression of the foreign protein.
  • a promoter derived from cytomegalovirus including an enhancer optionally
  • an SV40 initial promoter Preferably those containing human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoter, retrovirus Laus sarcoma virus LTR promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter Is.
  • EF-1 ⁇ human elongation factor-1 ⁇
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • the chicken ⁇ -actin promoter having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38 is suitable.
  • a promoter having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 47 to which the chicken ⁇ -actin promoter is bound downstream of the human CMV enhancer can be suitably used as a third gene expression control site.
  • the intron sequence is located between the base sequence containing the third gene expression control site and the base sequence encoding the foreign protein, or downstream of the base sequence encoding the foreign protein.
  • a chicken ⁇ -actin promoter downstream of a human CMV enhancer and a chicken ⁇ -actin / MVM chimeric intron having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 39 bound downstream thereof are suitable as a third gene expression control site.
  • MVM is an abbreviation for Minute virus of mice.
  • a polyadenylation sequence (polyA sequence) is placed downstream of the foreign protein.
  • the base sequence that can be used as a polyA sequence is not particularly limited as long as it can exert its original function in the cell, tissue, or living body into which the gene encoding the foreign protein is introduced.
  • a growth hormone polyA sequence having a human growth hormone polyA sequence and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 can be preferably used.
  • the nucleic acid molecule according to the embodiment of the present invention can be a circular plasmid.
  • the Rep-Cap region, transfer region, and helper region may be located in any order.
  • the transfer region is located downstream of the Rep-Cap region, and the helper region is located downstream thereof.
  • the Cap region is located downstream of the Rep region
  • the transfer region is located downstream of it
  • the E2A region is located downstream of it
  • the E4 region is located downstream of it
  • the VA1 RNA region is located downstream of it.
  • nucleotide sequence encoding the Rep protein of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof a nucleotide sequence encoding a Cap protein of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a first adenocon.
  • the base sequence encoding the substance and the base sequence encoding the VA1 RNA region of adenovirus or its functional equivalent may be located in any order. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a drug resistance gene can also be incorporated at any position on this nucleic acid molecule.
  • the replication origin required for the plasmid to replicate in the host cell can be incorporated at any position of this nucleic acid molecule.
  • Coli E1 can be preferably used as the replication origin in the case of a host cell. Downstream of the base sequence encoding a foreign protein is usually the polyA sequence. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • the nucleotide sequence encoding the Rep protein of the adeno-associated virus or its functional equivalent is preferably located on the 5'side of the nucleotide sequence encoding the Cap protein of the adeno-associated virus or its functional equivalent.
  • the base sequence of the E2A region of adenovirus or its functional equivalent is preferably located on the 5'side of the base sequence of the E4 region of adenovirus or its functional equivalent.
  • the base sequence of the E4 region of adenovirus or its functional equivalent is preferably located on the 5'side of the base sequence of the VA1 RNA region of adenovirus or its functional equivalent.
  • the base sequence of the E2A region of adenovirus or its functional equivalent is on the 3'side of the base sequence of the E4 region of adenovirus or its functional equivalent, and the VA1 RNA region of adenovirus or its downstream is further downstream. It is preferable that the base sequence of the functional equivalent is located.
  • the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a drug resistance gene can also be incorporated at any position on this nucleic acid molecule.
  • the replication origin required for the plasmid to replicate in the host cell can be incorporated at any position of this nucleic acid molecule.
  • Coli E1 can be preferably used as the replication origin in the case of a host cell. Downstream of the base sequence encoding a foreign protein is usually the polyA sequence. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a base sequence encoding the Cap protein of the adeno-associated virus or its functional equivalent is downstream of the base sequence encoding the Rep protein of the adeno-associated virus or its functional equivalent. Further downstream, a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or its functional equivalent, and further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein and / and a foreign base.
  • ITR reverse terminal repeat
  • Nucleotide sequence encoding the nucleotide sequence, the nucleotide sequence encoding the E4 region of adenovirus or its functional equivalent further downstream, and the nucleotide sequence encoding the VA1 RNA region of adenovirus or its functional equivalent further downstream. Includes molecules. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid. A drug resistance gene can also be incorporated at any position on this nucleic acid molecule.
  • the replication origin required for the plasmid to replicate in the host cell can be incorporated at any position of this nucleic acid molecule.
  • Coli E1 can be preferably used as the replication origin in the case of a host cell. Downstream of the base sequence encoding a foreign protein is usually the polyA sequence. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof is downstream of the base sequence containing the first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus.
  • Nucleotide sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of Cap protein of adeno-associated virus downstream of it Nucleotide sequence encoding Cap protein of Adeno-associated virus or its functional equivalent further downstream
  • a base sequence containing the reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or its functional equivalent and a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream and / or a foreign protein.
  • Nucleotide sequence that encodes the E4 region of adenovirus or its functional equivalent further downstream, and the nucleic acid molecule that encodes the VA1 RNA region of adenovirus or its functional equivalent further downstream. can be mentioned. It may further include a replication origin and may optionally incorporate a drug resistance gene. Downstream of the base sequence encoding a foreign protein is usually the polyA sequence. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof is downstream of the base sequence containing the first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus.
  • ITR reverse terminal repeat
  • the base sequence encoding the E2A region of adenovirus or its functional equivalent is downstream, the base sequence encoding the E4 region of adenovirus or its functional equivalent is further downstream, and the VA1 RNA region of adenovirus or its functional equivalent is further downstream.
  • Examples thereof include nucleic acid molecules in which a base sequence encoding a functional equivalent is located. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a drug resistance gene can also be incorporated at any position on this nucleic acid molecule.
  • the replication origin required for the plasmid to replicate in the host cell can be incorporated at any position of this nucleic acid molecule.
  • Coli E1 can be preferably used as the replication origin in the case of a host cell. Downstream of the base sequence encoding a foreign protein is usually the polyA sequence. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof is downstream of the base sequence containing the first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus.
  • Nucleotide sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of Cap protein of adeno-associated virus downstream of it Nucleotide sequence encoding Cap protein of Adeno-associated virus or its functional equivalent further downstream Nucleotide sequence of AAV p5 promoter or its equivalent, replication initiation site further downstream, drug resistance gene further downstream, reverse terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or its functional equivalent further downstream
  • ITR reverse terminal repeat
  • Nucleic acid molecules in which the VA1 RNA region of adenovirus is located downstream can be mentioned. It may also include a replication origin, in which case the replication origin is preferably located downstream of the p5 promoter.
  • a drug resistance gene may be incorporated incidentally, in which case the drug resistance gene is preferably located upstream of the first ITR. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a Cap region containing a base sequence encoding the AAV Rep protein of serum type 2 and a Cap containing a base sequence encoding the Cap protein of AAV of serum type 6 or 9 downstream thereof Region, p5 promoter as enhancer further downstream, first ITR further downstream, human CMV enhancer further downstream, chicken ⁇ -actin promoter further downstream, chicken ⁇ -actin / MVM chimeric intron further downstream, foreign protein further downstream.
  • a drug resistance gene may be incorporated incidentally, in which case the drug resistance gene is preferably located upstream of the first ITR. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.
  • a method for producing a recombinant adeno-associated virus virion using the nucleic acid molecule of one embodiment of the present invention will be described below by taking a nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 as an example.
  • the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 24 is the Rep region containing the nucleotide sequence encoding the AAV Rep protein of serum type 2, the Cap region containing the nucleotide sequence encoding the AAV Cap protein of serum type 9 downstream thereof, and further.
  • the p5 promoter as an enhancer downstream, the replication initiation site further downstream, the ampicillin resistance gene further downstream, the first ITR further downstream, the cytomegalovirus-derived promoter further downstream, the synthetic human ⁇ -globin intron further downstream, and further downstream.
  • Nucleotide sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein a synthetic polyA sequence further downstream, a second ITR further downstream, an adenovirus E2A region further downstream, and an adenovirus E4 region further downstream. It is a nucleic acid molecule in which the VA1 RNA region of adenovirus is located further downstream.
  • a nucleotide sequence for inserting a nucleotide sequence encoding a foreign protein any of the restriction enzyme sites present at 8116 bp to 8147 bp in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24). It is assumed that the base sequence encoding the desired protein has been introduced into.
  • the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 24 is a suitable example of a nucleic acid molecule that can be used to generate recombinant AAV virions.
  • the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 24 has a structure corresponding to the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector shown in FIG. 11 excluding the GFP gene.
  • the nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 can be synthesized as a cyclic plasmid using a general genetic engineering technique.
  • the drug resistance gene is encoded in this circular plasmid. It also has a replication origin for replication in E. coli. Therefore, this circular plasmid can be amplified by introduction into Escherichia coli and can be easily prepared in large quantities.
  • the prepared circular plasmid is introduced into a host cell in which the E1A and E1B regions of adenovirus have been integrated into the genome.
  • host cells HEK293 cells, which are cells derived from human fetal kidney tissue transformed with the E1A gene and E1B gene of adenovirus, can be preferably used.
  • the region from the first ITR to the second ITR is integrated into the host cell by illegitimate recombination.
  • Single-stranded DNA is then replicated from the region integrated into this host cell and packaged in capsids to form recombinant AAV virions.
  • Recombinant AAV virions are released into the culture medium or accumulate in the host cell. Therefore, recombinant AAV virions can be recovered by recovering the culture supernatant of the host cell or by recovering and destroying the host cell.
  • a plasmid containing a base sequence encoding a desired protein sandwiched between ITRs a plasmid containing a base sequence encoding a Rep protein, and a plasmid containing a base sequence encoding a Cap protein
  • the proportion of cells into which the three plasmids are introduced is low, which reduces the efficiency of recombinant AAV virions.
  • the host cell in which the plasmid containing the nucleotide sequence encoding the desired protein sandwiched between the ITRs was not introduced and only the other two types of plasmids were introduced contained the rAAV genome. Since no empty virus particles (empty capsids) will be produced, the production efficiency will be further reduced.
  • the cyclic plasmid having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 24, which is one of the preferred examples of the present invention, has all the functions of these three types of plasmids. Therefore, by transforming the host cell with this cyclic plasmid, all the elements necessary for the intracellular production of rAAV virion are simultaneously introduced into the cell, and the production amount of rAAV virion is increased. Not only can it be caused, but the generation of empty capsids can also be suppressed. The higher the ratio of empty capsids to the total capsids, the lower the quality of rAAV virions.
  • pHelper (mod) vector From the 5'side, at SEQ ID NO: 27 including SalI site, RsrII site, origin of replication (ColE1 ori), ampicillin resistance gene, BsiWI site, BstZ17I site, and BsrGI site. A DNA fragment containing the indicated base sequence was synthesized. This DNA fragment was digested with SalI and BsrGI.
  • the pHelper vector (Takara Bio Inc.) was digested with SalI and BsrGI, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into this. The obtained plasmid was used as a pHelper (mod) vector (Fig. 1).
  • Example 2 Construction of pAAV-CMV-GFP vector and pAAV-CMV-GFP (mod) vector From the 5'side, the EcoRI site, MluI site, GFP gene (green fluorescent protein gene), NotI site, and BamHI site are visited. A DNA fragment containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 was synthesized. This DNA fragment was digested with EcoRI and BamHI. The pAAV-CMV vector (Takara Bio Inc.) was digested with EcoRI and BamHI, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into this vector. The obtained plasmid was used as a pAAV-CMV-GFP vector.
  • the multicloning site 1 containing the BsiWI site and the AvrII site, which has the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 29, is inserted into the PciI site of the pAAV-CMV-GFP vector, and further, the SfoI site and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 30 are inserted.
  • a multi-cloning site 2 containing the BsrGI site, AgeI site, and BstZ17I site was inserted.
  • the obtained plasmid was used as a pAAV-CMV-GFP (mod) vector (Fig. 2).
  • pR2 (mod) C9 vector From the 5'side, it is shown by SEQ ID NO: 32 including the HindIII site, the 3'part of the AAV2 Rep region, the AAV9 Cap region, the p5 promoter, the RsrII site, and the BsrGI site.
  • a DNA fragment containing a base sequence was synthesized. This DNA fragment was digested with HindIII and BsrGI.
  • the pR2 (mod) C6 vector was digested with HindIII and BsrGI, and the above restriction enzyme-treated synthetic gene was inserted into this. The obtained plasmid was used as a pR2 (mod) C9 vector (Fig. 4).
  • Example 5 Construction of pHelper-ITR / CMV / GFP vector
  • the pAAV-CMV-GFP (mod) vector was digested with BsiWI and BstZ17I, and the ITR-CMV promoter, human ⁇ -globin intron, GFP gene, synthetic poly A sequence, And a DNA fragment containing ITR was excised.
  • the pHelper (mod) vector was digested with BsiWI and BstZ17I, and the excised DNA fragment was inserted into it.
  • the obtained plasmid was used as a pHelper-ITR / CMV / GFP vector (Fig. 5).
  • pHelper-R2 (mod) C6 vector Construction of pHelper-R2 (mod) C6 vector
  • the pR2 (mod) C6 vector was digested with RsrII, and sequences containing the AAV2 Rep region (including the p5 promoter) and the AAV6 Cap region-p5 promoter were excised. Separately, the pHelper (mod) vector was digested with RsrII. The excised DNA fragment was inserted into this and used as a pHelper-R2 (mod) C6 vector (Fig. 6).
  • Example 7 Construction of pHelper-R2 (mod) C9 vector
  • the pR2 (mod) C9 vector was digested with RsrII, and a sequence containing the p5 promoter-Rep2-AAV9 VP1-p5 promoter was excised.
  • the pHelper (mod) vector was digested with RsrII.
  • the excised DNA fragment was inserted into this and used as a pHelper-R2 (mod) C9 vector (Fig. 7).
  • Example 8 Construction of pR2 (mod) C6-ITR / CMV / GFP vector
  • the pAAV-CMV-GFP (mod) vector was digested with AvrII and BsrGI, and the ITR-CMV promoter-human ⁇ -globin intron-GFP-synthetic poly A sequence-A sequence containing ITR was cut out.
  • the pR2 (mod) C6 vector was digested with AvrII and BsrGI. The excised DNA fragment was inserted into this to prepare a pR2 (mod) C6-ITR / CMV / GFP vector (Fig. 8).
  • Example 10 Construction of pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector
  • the pR2 (mod) C6 vector is digested with RsrII to serve as an AAV2 Rep region (including the p5 promoter), an AAV6 Cap region, and an enhancer.
  • a sequence containing a functional p5 promoter was excised.
  • the pHelper-ITR / CMV / GFP vector was digested with RsrII. The sequence cut out above was inserted into this and used as a pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector. (Fig. 10)
  • Example 11 Construction of pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector
  • the pR2 (mod) C9 vector is digested with RsrII to serve as an AAV2 Rep region (including the p5 promoter), an AAV9 Cap region, and an enhancer.
  • a DNA fragment containing a functional p5 promoter was excised.
  • the pHelper-ITR / CMV / GFP vector was digested with RsrII. The excised DNA fragment was inserted into this to prepare a pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector (Fig. 11).
  • HEK293T cells which are cell lines derived from human fetal kidney cells expressing the large T antigen gene of SV40 virus, were used as host cells.
  • HEK293T cells were seeded in a 15 cm dish at a concentration of 1.65 ⁇ 10 7 cells / dish and cultured in DMEM / High Glucose medium containing 10% FBS (Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 16 hours. ..
  • a solution containing the plasmid of the combination of (1) and (2) below was prepared; (1) pHelper vector (Takara Bio Inc.), pAAV-CMV-GFP vector and pRC6 vector (Takara Bio Inc.), (2) pHelper vector (Takara Bio Inc.), pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector.
  • Each solution was prepared so that the DNA concentration was 4 ⁇ g / mL, which contained three types of plasmids at equimolar concentrations.
  • Example 13 Production of rAAV virion by transient expression of two types of plasmids HEK293T cells were seeded in a 15 cm dish at a concentration of 1.65 ⁇ 10 7 cells / dish, and in DMEM / High Glucose medium containing 10% FBS at 37 ° C. , Incubated for 16 hours in the presence of 5% CO 2 .
  • a solution containing the plasmid of the combination of (1) to (6) below was prepared; (1) pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pRC6 vector (Takara Bio Inc.), (2) pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, (3) pHelper-R2 (mod) C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, (4) pHelper-R2 (mod) C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, (5) pR2 (mod) C6-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector (Takara Bio Inc.), (6) pR2 (mod) C9-ITR / CMV / GFP vector and pHelper (Takara Bio Inc.) vector.
  • Each solution was prepared so that the DNA concentration was 3.5 to 3.6 ⁇ g / mL, which contained two types of plasmids at equimolar concentrations. Polyethylenimine and FBS were added to this solution so that the concentrations were 12 ⁇ g / mL and 1.3% (v / v), respectively, and DMEM / High Glucose medium was added to adjust the liquid volume to 30 mL.
  • DMEM / High Glucose medium was added to adjust the liquid volume to 30 mL.
  • After removing all the culture supernatants of the cells seeded on the 15 cm dish add the entire amount of 30 mL of the transfection solution and incubate for 3 days at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 to produce rAAV virions. It was.
  • Example 14 Production of rAAV virion by transient expression of integrated rAAV plasmid HEK293T cells were seeded in a 15 cm dish at a concentration of 1.65 ⁇ 10 7 cells / dish, and were seeded in DMEM / High Glucose medium containing 10% FBS at 37 ° C. Incubated for 16 hours in the presence of 5% CO 2 . Prepare a solution containing pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector or pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector at a concentration of 3.2 ⁇ g / mL as a DNA solution for transfection. did.
  • Example 15 Recovery of culture supernatant After completion of the culture of Examples 12 to 14, the cell culture solution was transferred to a 50 mL centrifuge tube and centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes to recover the culture supernatant. The cells precipitated by centrifugation were used for preparing the cell lysate solution of Example 17.
  • Example 16 Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in culture supernatant
  • the virus genome content in the culture supernatant is a kit using AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara Bio). According to the protocol attached to, the measurement was performed by the following method. To 2 ⁇ L of the culture supernatant collected in Example 15, 2 ⁇ L of 10 ⁇ DNase I Buffer, 1 ⁇ L of DNase I, and 15 ⁇ L of pure water were added, mixed, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The DNase I was inactivated by heat treatment at 95 ° C.
  • the total amount of capsid in the culture supernatant was measured by the following method using the AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) according to the protocol attached to the kit.
  • 100 ⁇ L of the culture supernatant (sample sample) collected in Example 15 diluted with 1 ⁇ Assay Buffer was added to a plate on which the mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Kit Control diluted with 1 ⁇ Assay Buffer to a concentration of 1.3 ⁇ 10 9 to 1.0 ⁇ 10 7 capsids / mL was added to a plate as a standard solution in the same manner as the sample sample and allowed to stand.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody or mouse anti-AAV6 antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP substrate was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then sulfuric acid was added to stop the reaction.
  • the measured value of the sample was inserted into the calibration curve obtained from the measured value of the absorbance of the standard solution, and the total amount (number) of capsids contained in the sample was determined.
  • Example 17 Preparation of cell lysate solution
  • a citrate buffer (32 mM sodium citrate) containing Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) was added, and the cells were allowed to stand at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • Example 18 Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in cell lysate solution
  • the virus genome content in the purified cell lysate solution is AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara Bio). According to the protocol attached to the kit, the measurement was performed by the following method. To the 2 ⁇ L cell lysate solution sample prepared in Example 17, 2 ⁇ L of 10 ⁇ DNase I Buffer, 1 ⁇ L of DNase I, and 15 ⁇ L of pure water were added, mixed, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The DNase I was inactivated by heat treatment at 95 ° C.
  • vg is a unit indicating the number of AAV virus genomes.
  • the region replicated in this PCR is the internal region of the ITR.
  • the total amount of capsid in the cell lysate solution was measured using the AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) by the following method according to the protocol attached to the kit.
  • 100 ⁇ L of the cell lysate solution (sample sample) prepared in Example 17 diluted with 1 ⁇ Assay Buffer was added to a plate on which the mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Kit Control diluted with 1 ⁇ Assay Buffer to a concentration of 1.3 ⁇ 10 9 to 1.0 ⁇ 10 7 capsids / mL was added to a plate as a standard solution in the same manner as the sample sample and allowed to stand.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody or mouse anti-AAV6 antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP substrate was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then sulfuric acid was added to stop the reaction.
  • the measured value of the sample was inserted into the calibration curve obtained from the measured value of the absorbance of the standard solution, and the total amount (number) of capsids contained in the sample was determined.
  • Example 19 Calculation of abundance ratio of rAAV virion in total capsid From the measurement result of the amount of rAAV genome contained in the cell lysate solution measured in Example 18 and the measurement result of the total amount of capsid, recombination containing the rAAV genome The amounts of AAV virion (rAAV virion) and empty capsid were calculated respectively. The amount of rAAV virions was taken as the amount of rAAV genomes (vg) as the amount (number) of rAAV virions, assuming that the entire rAAV genome was packaged in capsids to form virions.
  • Amount of rAAV virions / total amount of capsids was calculated as the abundance ratio of rAAV virions in the total capsids.
  • the empty capsid amount (number) is calculated by subtracting the amount (number) of rAAV virions from the measured value of the total capsid amount (number).
  • Example 20 Measurement of infectivity of rAAV6 virion contained in cell lysate solution HEK293T cells were seeded in a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / well, and were seeded in a DMEM / High Glucose medium containing 10% FBS at 37 ° C. , Incubated for 16 hours in the presence of 8% CO 2 .
  • the cell lysate solution containing rAAV6 virion prepared in Example 18 was added to 1 mL of DMEM / High Glucose medium containing 2% FBS to prepare a transduction solution.
  • the transduction solution was prepared containing 2x10 8 and 2x10 9 rAAV6 virions, respectively. After removing all the culture supernatant of the 24-well plate, a transduction solution was added, and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 8% CO 2 for 3 days.
  • Example 21 Measurement of infectivity of rAAV9 virion contained in cell lysate solution HEK293T cells were seeded in a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / well, and were seeded in a DMEM / High Glucose medium containing 10% FBS at 37 ° C. , Incubated for 16 hours in the presence of 8% CO 2 .
  • the cell lysate solution containing rAAV9 virion prepared in Example 18 was added to 1 mL of DMEM / High Glucose medium containing 2% FBS to prepare a transduction solution.
  • the transduction solution was prepared containing 2x10 8 and 2x10 9 rAAV6 virions, respectively. After removing all the culture supernatant of the 24-well plate, a transduction solution was added, and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 8% CO 2 for 3 days.
  • the Transducing Unit means the number of GFP-positive cells (the number of cells infected with rAAV virion) obtained when host cells are infected with the total amount of the cell lysate solution. ([Total number of cells in well] x [Percentage of GFP-positive cells (%)] / 100) x ([Total amount of rAAV virion sample (mL)] / [Amount of rAAV virion sample put into each well (mL)])
  • Example 23 Results (Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in culture supernatant) The measurement results of the amount of rAAV genome contained in the culture supernatant obtained in Example 15 are shown by black bars in FIG.
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, were introduced, and the amount of rAAV genome was 15.6 ⁇ 10 11 vg.
  • (4) shows the result when the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector was introduced, and the amount of rAAV genome was 35.0 ⁇ 10 11 vg.
  • the measurement results of the total capsid amount are shown by white bars in FIG.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, were introduced, and the total capsid amount was 3.6 ⁇ 10 12 capsids.
  • (4)% showed the results when the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector was introduced, and the total capsid amount was 6.6 ⁇ 10 12 capsids.
  • Both the rAAV genome amount and the total capsid amount showed the highest expression level when the integrated rAAV plasmid, that is, the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector was introduced (Fig. 12).
  • Example 24 Result (Measurement of amount of rAAV contained in cell lysate solution)
  • the measurement results of the amount of rAAV genome contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 are shown by black bars in FIG.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • the measurement results of the total capsid amount are shown by white bars in FIG.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, were introduced, and the amount of rAAV genome was 3.8 ⁇ 10 12 capsids.
  • (4) shows the result when the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector was introduced, and the amount of rAAV genome was 6.1 ⁇ 10 12 caps ids.
  • Example 25 Results (Ratio of rAAV virions in total capsid)
  • the rAAV genome amount and total capsid amount obtained from the rAAV genome amount and total capsid amount of the cell lysate solution calculated in Example 17
  • the abundance ratio of the amount of capsid is 1: 1.
  • the abundance ratio of rAAV virions (rAAV virions) in the total capsid is shown in FIG.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • the results when two types of plasmids, C9-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector, were introduced were shown, and the abundance ratios were 7.5%, 43.5%, and 41.5%, respectively.
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector and pR2 (mod) C9 vector, were introduced, and the abundance ratio was 17.8%.
  • Example 26 Results (Measurement of infectivity of rAAV6 virion contained in cell lysate solution)
  • the infectivity measurement result of rAAV6 virion contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 is shown in FIG. Black bars in the figure show the results when 2 ⁇ 10 8 rAAV6 virions were infected.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pRC6 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C6 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • the white bar shows the result when 2 ⁇ 10 9 rAAV6 virions were infected.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pRC6 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod) C6-ITR /.
  • the results when two types of plasmids, CMV / GFP vector and pHelper vector, were introduced were shown, and the proportions of GFP-positive cells were 23.2%, 70.5%, and 53.6%, respectively.
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced.
  • the ratio of GFP-positive cells was 12.6%, and (4) was pHelper-ITR / CMV.
  • the results when the / GFP-R2 (mod) C6 vector was introduced were shown, and the proportion of GFP-positive cells was 71.1%.
  • pHelper-R2 (mod) C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector or pR2 (mod) C6-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector, two types of plasmids, or pHelper-
  • ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector a highly infectious rAAV6 virion solution can be obtained.
  • Example 27 Results (Measurement of infectivity of rAAV9 virion contained in cell lysate solution)
  • the infectivity measurement result of rAAV9 virion contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 is shown in FIG. Black bars in the figure show the results when 2 ⁇ 10 8 rAAV9 virions were infected.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • the white bar shows the result when 2 ⁇ 10 9 rAAV9 virions were infected.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and the pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C9 vector and the pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod).
  • the results when two types of plasmids, C9-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector, were introduced were shown, and the proportions of GFP-positive cells were 4.6%, 1%, and 11.4%, respectively.
  • (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2 (mod) C9 vector, were introduced.
  • the proportion of GFP-positive cells was 21.7%, and (4) was pHelper.
  • the results when the -ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector was introduced were shown, and the proportion of GFP-positive cells was 50.3%.
  • Example 28 Result (Calculation of Transducing Unit) The infectivity measurement result of rAAV6 virion contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 is shown in FIG.
  • (1) is the pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pRC6 vector
  • (2) is the pHelper-R2 (mod) C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) is the pR2 (mod) C6-ITR.
  • the results when two types of plasmids, the / CMV / GFP vector and the pHelper vector, are introduced are shown.
  • (5) shows the results when three types of plasmids, the pHelper vector, the pAAV-CMV-GFP vector, and the pRC6 vector, were introduced.
  • (4) shows the results when the pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector was introduced.
  • FIG. 18 shows the measurement results of the infectivity of rAAV9 virion contained in the cell lysate solution prepared in Example 17.
  • (1) is pHelper-ITR / CMV / GFP vector and pR2 (mod) C9 vector
  • (2) is pHelper-R2 (mod) C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector
  • (3) Shows the results when two types of plasmids, pR2 (mod) C9-ITR / CMV / GFP vector and pHelper vector, are introduced.
  • Example 29 Construction of pAAV-CBA (BAM) -I2S vector pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C6 vector or pHelper-ITR / CMV / GFP-R2 (mod) C9 vector up to Example 28 From the experimental results of these two types of vectors, it was found that highly infectious rAAV6 virion or rAAV9 virion can be produced by using the integrated rAAV plasmid. The high infectivity of this integrated rAAV plasmid is considered to be due to the high abundance ratio of rAAV virions in the total capsid. Therefore, in order to further verify the results, an integrated rAAV plasmid having a different structure was constructed, and the abundance ratio of rAAV virions in the total capsid was confirmed by the following experiment.
  • the pAAV-CMV-GFP (mod) vector constructed in Example 2 was digested with a restriction enzyme (HindIII / BglII), and the DNA fragment obtained by the above PCR reaction was mixed with this, and both were infusion HD cloning Kit (in fusion HD cloning Kit ( It was fused using Takara Bio).
  • the obtained plasmid was used as a pAAV-CBA (BAM) -I2S vector (Fig. 19).
  • the human I2S gene encodes a human IDS containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36 (same as in Example 30).
  • the human CMV enhancer has the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 37
  • the chicken ⁇ -actin promoter has the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 38
  • the chicken ⁇ -actin / MVM chimeric intron has the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 39
  • bovine growth hormone The polyA sequence contains the base sequence shown by SEQ ID NO: 40.
  • Example 30 Construction of pHelper-ITR / CBA (BAM) / I2S-R2 (mod) C9 vector From the 5'side, ITR, human CMV enhancer, chicken ⁇ -actin promoter, chicken ⁇ -actin / MVM chimeric intron, bovine growth A DNA fragment having the hormone poly A sequence and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 50 containing ITR was synthesized. This DNA fragment was digested with BsiWI and BstZ17I and inserted between the BsiWI site and the BstZ17I site of the pHelper (mod) constructed in Example 1. The obtained plasmid was used as a pHelper-ITR / CBA (BAM) vector.
  • BAM pHelper-ITR / CBA
  • the pHelper-ITR / CBA (BAM) vector was digested with RsrII, and the DNA fragment containing the AAV9Cap region obtained by digesting the pR2 (mod) C9 constructed in Example 4 with RsrII was inserted into this.
  • the obtained plasmid was used as a pHelper-ITR / CBA (BAM) /-R2 (mod) C9 vector.
  • a DNA fragment having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 51 containing the human IDS gene was synthesized. This DNA fragment was digested with PacI and NotI and inserted into the pHelper-ITR / CBA (BAM) /-R2 (mod) C9 vector digested with PacI and NotI. The obtained plasmid was used as a pHelper-ITR / CBA (BAM) / I2S-R2 (mod) C9 vector (Fig. 20).
  • Example 31 Production of rAAV virions by transient expression of three types of plasmids (2) HEK293T cells were seeded in T-25 flasks at a concentration of 2.5 ⁇ 10 6 cells / flask and cultured in MEM medium containing 10% FBS (Sigma) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 16 hours.
  • a solution containing pHelper vector (Takara Bio Inc.), pAAV-CBA (BAM) -I2S vector, and pR2 (mod) C9 vector was prepared.
  • This solution was prepared so that the DNA concentration was 2.9 to 3.9 ⁇ g / mL, which contained three types of plasmids at equimolar concentrations.
  • Example 32 Production of rAAV virions by transient expression of integrated plasmid (2) HEK293T cells were seeded in T-25 flasks at a concentration of 2.5 ⁇ 10 6 cells / flask and cultured in MEM medium containing 10% FBS (Sigma) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 16 hours. A solution containing 2.9 to 3.9 ⁇ g / mL of the pHelper-ITR / CBA (BAM) / I2S-R2 (mod) C9 vector was prepared as DNA for transfection.
  • BAM pHelper-ITR / CBA
  • I2S-R2 (mod) C9 vector was prepared as DNA for transfection.
  • Example 33 Recovery of culture supernatant After completion of the culture of Examples 31 and 32, the cell culture solution was transferred to a 15 mL centrifuge tube and centrifuged at 4 ° C. and 5800 ⁇ g for 5 minutes to recover the culture supernatant.
  • the solution containing rAAV virion was eluted through 0.5 mL elution buffer (containing 0.1 M citric acid, pH 2.06).
  • the resulting eluate was passed through PD MiniTrap TM G-25 (GE Healthcare) pre-equilibrium with PBS containing 150 mM NaCl and 0.001% F68 to bind rAAV virions to the column.
  • the rAAV virion was then eluted with 1 mL PBS containing 150 mM NaCl and 0.001% F68. This was concentrated by centrifugation at 4 ° C. and 2000 ⁇ g for 3 minutes using a Vivaspin TM turbo 15 (100K MWCO, PES, Sartorius). The obtained solution was used as a rAAV virion solution.
  • Example 35 Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in rAAV virion solution AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara) is used to measure the virus genome content in the rAAV virion solution obtained in Example 34. Using Bio (Bio), real-time PCR measurement was performed by the following method according to the protocol attached to the kit. To 2 ⁇ L of rAAV virion solution prepared in Example 34, 2 ⁇ L of 10 ⁇ DNase I Buffer, 1 ⁇ L of DNase I, and 15 ⁇ L of pure water were added and mixed, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The DNase I was inactivated by heat treatment at 95 ° C.
  • the viral genome content in the rAAV virion solution was also measured by the droplet digital PCR method.
  • To 2 ⁇ L of rAAV virion solution add 1 ⁇ L of DNase I (Takara Bio), 2 ⁇ L of 10 ⁇ DNase I Buffer (Takara Bio), and 15 ⁇ L of 0.05% F-68-containing water, and incubate at 37 ° C for 30 minutes. , RAAV DNA outside the virion was digested.
  • the DNase I-treated rAAV virion solution was appropriately diluted with a TE buffer containing 0.05% F-68 to prepare a sample solution for droplet digital PCR.
  • 1.0 ⁇ M forward primer (primer 3, SEQ ID NO: 41), 1.0 ⁇ M reverse primer (primer 4, SEQ ID NO: 42), and 0.25 ⁇ M probe (probe 1, SEQ ID NO: 43 with FAM as a reporter dye at the 5'end.
  • a FAM-labeled 20 ⁇ primer / probe mix containing BHQ1 as a quencher dye at the 3'end (each modified) was prepared.
  • 1.0 ⁇ M forward primer (primer 5, SEQ ID NO: 44), 1.0 ⁇ M reverse primer (primer 6, SEQ ID NO: 45), and 0.25 ⁇ M probe (probe 2, HEX as a reporter dye at the 5'end of SEQ ID NO: 46).
  • probe 2 HEX as a reporter dye at the 5'end of SEQ ID NO: 46.
  • a HEX-labeled 20 ⁇ primer / probe mix containing BHQ1 as a quencher dye at the 3'end was prepared.
  • the PCR reaction is a 40-cycle 3-step PCR (95 ° C, 30 seconds ⁇ 60 ° C, 1 minute ⁇ 72 ° C, 15 seconds) after denaturation conditions (95 ° C, 10 minutes), followed by inactivation treatment of the PCR enzyme (95 ° C, 10 minutes) 98 ° C, 10 minutes).
  • the droplet analysis was performed using the QX200 Droplet Digital PCR system (BioRad), and the rAAV genome amount (number) was determined based on the FAM / HEX double positive droplet.
  • the regions replicated in this PCR are the bovine growth hormone polyA and the internal region of ITR.
  • the total amount of capsid in the culture supernatant was measured by the following method using the AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) according to the protocol attached to the kit.
  • 100 ⁇ L of the rAAV virion solution prepared in Example 34 diluted with 1 ⁇ Assay Buffer was added to a plate on which the mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • a known amount of AAV9 empty capsid diluted with 1 ⁇ Assay Buffer to a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 to 1.3 ⁇ 10 9 capsids / mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the sample sample and allowed to stand.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 1 ⁇ Assay Buffer, HRP substrate was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then sulfuric acid was added to stop the reaction.
  • the measured value of the sample was inserted into the calibration curve obtained from the measured value of the absorbance of the standard solution, and the total amount (number) of capsids contained in the sample was determined.
  • Example 36 Results (Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in rAAV virion solution) Table 1 shows the measurement results of the amount of rAAV genome contained in the rAAV virion solution prepared in Example 34.
  • the abundance ratio of the rAAV genome amount to the total capsid amount is 1: 1.
  • the amount of rAAV genome (vg) was defined as the amount (number) of rAAV virions, assuming that all rAAV genomes were packaged in capsids to form virions.
  • (Amount (number) of rAAV virions / total capsid amount (number)) X100 (%) is used as the abundance ratio of rAAV virions in the total capsids, and the abundance ratio is calculated using the amount of rAAV genome obtained by real-time PCR.
  • the amount of rAAV virions (vg) is the amount (number) of rAAV virions
  • using the integrated rAAV plasmid can obtain 8 times or more of the rAAV virions compared to the case of using three types of plasmids. Therefore, by using the integrated rAAV plasmid for the production of rAAV virions, the production efficiency of rAAV virions can be significantly increased. Similar conclusions can be obtained from the results of quantification of the amount of rAAV genome by the supplementary droplet digital PCR method.
  • an rAAV virion in which a nucleic acid sequence containing a base sequence encoding a foreign protein, which can be used for gene therapy or the like, is packaged. It can be stably supplied to the engine.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence encoding Rep protein of AAV of serum type 2
  • Wild type SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of Rep68 of AAV of serum type 2
  • Wild type SEQ ID NO: 3 Amino acid of Rep78 of AAV of serum type 2
  • wild type SEQ ID NO: 4 A preferable example of the base sequence encoding the Rep protein of AAV of serum type 2, synthetic sequence No.
  • Nucleotide sequence of Primer 6 Nucleotide sequence No. 46: Nucleotide sequence of probe 2, Nucleotide sequence No. 47: Contains human CMV enhancer and chicken ⁇ -actin promoter.
  • Nucleotide sequence containing the bovine growth hormone poly A sequence Nucleotide sequence SEQ ID NO: 51: Nucleotide sequence containing the human IDS gene, Nucleotide sequence

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Abstract

組換えＡＡＶ粒子の生産効率を高めるための方法を提供することを目的とする。（ａ）ＡＡＶのＲｅｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｂ）ＡＡＶのＣａｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｃ）第一のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，（ｄ）第二のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，（ｅ）第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，（ｆ）アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，（ｇ）アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１　ＲＮＡ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列を含む核酸分子。

Description

組換えＡＡＶビリオンの製造に用いる核酸分子
　本発明は，その一実施形態において，遺伝子治療に用いることのできる組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの分野に関し，詳しくは，rAAVビリオンを製造するために用い得る核酸分子及び当該核酸分子を用いたrAAVビリオンの製造方法に関する。
　アデノ随伴ウイルス（AAV: adeno-associated virus）は，自然界に存在するウイルスの中で最も小さい部類の直鎖一本鎖DNAウイルスであるパルボウイルス科に属し，そのウイルスゲノムは約4.7 kbである。AAVはエンベロープを持たず，直径約22 nmの正二十面体粒子を形成する。AAVはまた，単独感染では増殖することのできない欠損ウイルスであるディペンドウイルス属に分類され，動物細胞内で効率的に複製が行われるためには，AAVの複製を補助するヘルパーウイルスとの同時感染が必要である。AAVの複製を補助するヘルパーウイルスには，例えばアデノウイルス，又はヘルペスウイルスがある。ヘルパーウイルスの非存在下では，AAVの複製は認められず，AAVゲノムは宿主ゲノムに組込まれる。
　野生型のAAVが宿主細胞のヒト細胞に単独で感染すると，ウイルスゲノムは，ウイルスゲノムの両端に存在する逆方向末端反復（ITR）を介して，第１９番染色体に部位特異的に組み込まれる。宿主細胞のゲノム中に取り込まれたウイルスゲノムの遺伝子はほとんど発現しないが，細胞がヘルパーウイルスに感染するとAAVは宿主ゲノムから切り出され，感染性ウイルスの複製が開始される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスの場合，ヘルパー作用を担う遺伝子はE1A，E1B，E2A，VA1，及びE4である。ここで，宿主細胞が，アデノウイルスのE1A，E1Bでトランスフォームしたヒト胎児腎組織由来細胞であるHEK293細胞の場合にあっては，E1A及びE1B遺伝子は，宿主細胞において元々発現している。
　また，AAVゲノムは2つの遺伝子rep及びcapを含む。rep遺伝子から産生されるrep蛋白質（rep78，rep68，rep52及びrep40）は，カプシド形成に必須であるとともに，ウイルスゲノムの染色体への組み込みに介在する。cap遺伝子は3つのカプシド蛋白質（VP1，VP2及びVP3）の産生を担う。
　野生型AAVのゲノムでは，両端にITRが存在し，ITRの間にrep遺伝子及びcap遺伝子が存在する。組換AAVビリオン（rAAVビリオン）は，rep遺伝子及びcap遺伝子を含む領域を，外来の蛋白質をコードする遺伝子で置換したものが，カプシドに内包されたものである。
　rAAVビリオンは，遺伝子治療において外因性の遺伝子を細胞に送達するためのベクターとして用いられ，これまで治癒することのできなかった疾患に治療選択肢を与える能力がある。
　rAAVビリオンを生産するためには，一般に3種類のプラスミドが用いられる。すなわち，ITRに挟まれた外来の蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献１），Rep蛋白質をコードする遺伝子とCap蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献２），及びアデノウイルス由来E2A，E4，及びVA1 RNAをコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献３），である。遺伝子導入した細胞内で目的遺伝子を内包したrAAVビリオンを生産させるためには，これら3種類のプラスミドをHEK293細胞等の宿主細胞に導入する必要がある。rAAVビリオンは3種類のプラスミドが導入された宿主細胞内で合成される。このとき，宿主細胞内ではrAAVビリオンに加えて，DNAを内包しない空の粒子が発生する。プラスミドDNAの一過性発現系では80%近くがDNAを内包しない空の粒子であるとの報告もある。(非特許文献１)
国際公開第９５／３４６７０号 国際公開第９７／０６２７２号 国際公開第９７／１７４５８号
Maria S. et al., HUMAN GENE THERAPY METHODS, 28, 101-108 (2017)
　本発明の目的は，その一実施形態において，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がAAVのカプシドにパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産するために用いられる核酸分子及び，かかるrAAVビリオンの製造方法に関する。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質をコードする塩基配列，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質をコードする塩基配列，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，アデノウイルスのＥ２Ａ領域を含む塩基配列，アデノウイルスのＥ４領域を含む塩基配列，及びアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域を含む塩基配列，及び，核酸分子の第一と第二のITRとの間に外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸分子を，宿主細胞に導入することにより，rAAVビリオンを効率よく製造できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．少なくとも以下の塩基配列を含む核酸分子；
　（ａ）アデノ随伴ウイルスのＲｅｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
　（ｂ）アデノ随伴ウイルスのＣａｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
　（ｃ）第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
　（ｄ）第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
　（ｅ）第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，
　（ｆ）アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，
　（ｇ）アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び
　（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列。
２．該Ｒｅｐ蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，
　該Ｃａｐ蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び
　該外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，を更に含むものである上記１の核酸分子。
３．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，上記１又は２の核酸分子。
４．該第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，該Ｒｅｐ蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び更に下流に該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列，を含むものである，上記２又は３の核酸分子。
５．該第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列の下流に，該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，を含むものである，上記２～４の何れかの核酸分子。
６．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列の下流に，該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，上記２～５の何れかの核酸分子。
７．該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，該第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，更に下流に該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，を含むものである，上記４の核酸分子。
８．該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列の下流に，該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，上記７の核酸分子。
９．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，上記１～８の何れかの核酸分子。
１０．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を，該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流であって，該第一のＩＴＲを含む塩基配列の上流に含むものである，上記９の核酸分子。
１１．該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，Ｒｅｐ蛋白質及びＣａｐ蛋白質の発現量を高めるエンハンサー機能を有する塩基配列を含むものである，上記１～１０の何れかの核酸分子。
１２．該Ｒｅｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，上記１～１１の何れかの核酸分子。
１３．該Ｒｅｐ蛋白質が，Ｒｅｐ６８又は／及びＲｅｐ７８を含むものである，上記１２の核酸分子。
１４．該Ｃａｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，上記１～１３の何れかの核酸分子。
１５．該Ｃａｐ蛋白質が，ＶＰ１を含むものである，上記１４の核酸分子。
１６．該第１の遺伝子発現制御部位が，該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～１５の何れかの核酸分子。
１７．該第１の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーターである，上記１６の核酸分子。
１８．該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～１７の何れかの核酸分子。
１９．該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのｐ４０プロモーターである，上記１８の核酸分子。
２０．該第一及び第二のＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１からなる群から選択されるものである，上記１～１９の何れかの核酸分子。
２１．該ＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が２である，上記１～１９の何れかの核酸分子。
２２．該外来の蛋白質をコードするための塩基配列が，マルチクローニングサイトを含むものである，上記１～２１の何れかの核酸分子。
２３．該アデノウイルスの血清型が，２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，及びブタＡｄ３型からなる群から選択されるものである，上記１～２２の何れかの核酸分子。
２４．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２３の何れかの核酸分子。
２５．該アデノウイルスのＥ４領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病からなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２４の何れかの核酸分子。
２６．該アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２５の何れかの核酸分子。
２７．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～２６の何れかの核酸分子。
２８．該アデノウイルスのＥ４領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～２７の何れかの核酸分子。
２９．該薬剤耐性遺伝子が，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤への耐性を，原核細胞に付与するものである，上記９～２８の何れかの核酸分子。
３０．該第３の遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，β-アクチンプロモーター，配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーター，及び配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーターの下流に配列番号３９で示される塩基配列を含むもの，からなる群から選択されるものである，上記２～２９の何れかの核酸分子。
３１．該エンハンサー機能を有する塩基配列が，アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーター又はその機能的等価物である，上記１１～３０の何れかの核酸分子。
３２．該外来の蛋白質がヒトのものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３３．該外来の蛋白質が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３４．該外来の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストからなる群から選択されるものである，上記１～３２の何れかの核酸分子。
３５．該外来の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１～３２の何れかの核酸分子。
３６．該外来の蛋白質が，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，抗ＴＮＦ-α抗体，及び血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有する抗体からなる群から選択されるものである，上記１～３３の何れかの核酸分子。
３７．該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，上記３６の核酸分子。
３８．該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び，該他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３９．該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び他の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
４０．該他の蛋白質が，ヒトのものである，上記３８又は３９の核酸分子。
４１．該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有するものである，上記３８～４０の何れかの核酸分子。
４２．該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，上記４１の核酸分子。
４３．環状プラスミドである，上記１～４２の何れかの核酸分子。
４４．上記１～４３の何れかの核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む，組換えＡＡＶビリオンの製造方法。
４５．該宿主細胞のゲノムが，アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域を含む塩基配列を含むものである，上記４４の製造法。
４６．該宿主細胞が，ＨＥＫ２９３細胞である，上記４５の製造法。
　本発明の一実施形態によれば，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産することができるので，rAAVビリオンが安価に供給できるようになり，遺伝子治療に必要な医療費を削減できる。
pHelper(mod)ベクターの構造を示す模式図。 pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターの構造を示す模式図。 pR2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。 pR2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。 pHelper-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。 pHelper-R2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。 pHelper-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。 pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。 pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。 pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。 pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。 図１２は，実施例１６で得られた，培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定の結果を表す図である。縦軸はrAAVゲノム量（x1011）又は総カプシド量（x1011）を示す。黒棒はrAAVゲノム量，白棒は総カプシド量を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての測定結果を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。 図１３は，実施例１８で得られた精製した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定の結果を表す図である。縦軸はrAAVゲノム量（x1011）又は総カプシド量（x1011）を示す。黒棒はrAAVゲノム量，白棒は総カプシド量を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての測定結果を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。 図１４は，実施例１９で得られたrAAVビリオンの総カプシド中における存在比率の算出の結果を表す図である。縦軸は存在比率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての値を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。 図１５は，実施例２０で得られた細胞溶解物溶液から精製したrAAV6ビリオンの感染能測定の結果を表す図である。縦軸はGFP陽性細胞の割合すなわちrAAV6ビリオンの感染効率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，黒棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x108 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x108個）の場合，白棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x109 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x109個）の場合を示す。 図１６は，実施例２１で得られた細胞溶解物溶液から精製したrAAV9ビリオンの感染能測定の結果を表す図である。縦軸はGFP陽性細胞の割合すなわちrAAV9ビリオンの感染効率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）:統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，黒棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x109 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x109個）の場合，白棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が1x1010 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x1010個）の場合を示す。 図１７は，実施例２２で得られたrAAV6ビリオンのTransducing Unitの算出の結果を表す図である。縦軸はTransducing Unitの値（x105）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: 統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，Transducing Unitの値を示す。 図１８は，実施例２２で得られたrAAV9ビリオンのTransducing Unitの算出の結果を表す図である。縦軸はTransducing Unitの値（x105）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: 統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，Transducing Unitの値を示す。 pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターの構造を示す模式図。 pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。
　外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いられる組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産には，通常，（１）AAV等のウイルスに由来する第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む構造を有するプラスミド（プラスミド１），（２）前記ITR配列に挟まれた領域（ITR配列を含む）の塩基配列を宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有するAAV Rep遺伝子と，AAVのカプシド蛋白質をコードする遺伝子とを含むプラスミド（プラスミド２），及び（３）アデノウイルスのE2A領域，E4領域，及びＶＡ１ ＲＮＡ領域を含むプラスミド（プラスミド３）の3種類のプラスミドが用いられる。
　一般に，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産には，まず，これら3種類のプラスミドが，アデノウイルスのE1a遺伝子とE1b遺伝子がゲノム中に組み込まれたHEK293細胞等の宿主細胞に導入される。そうすると第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む領域が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。この領域から1本鎖DNAが複製され，AAVのカプシド蛋白質にパッケージングされて，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンが形成される。この組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。
　本発明は，その一実施形態において，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産に必要な，上記のプラスミド１～３の３種類のプラスミドの構成要素，すなわち（ａ）アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｂ）アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｃ）第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，（ｄ）第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，（ｅ）第一のITRと第二のITRとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，（ｆ）アデノウイルスのE2A蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｇ）アデノウイルスのE4蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，及び（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ又はその機能的等価物をコードする塩基配列を含む核酸分子に関する。
　本発明の一実施形態において，統合rAAVプラスミドというときは，上記（ａ）～（ｈ）の構成要素を含むプラスミドのことをいう。統合rAAVプラスミドは直鎖状であってもよく，環状であってもよい。
　更に，本発明は，その一実施形態において，該Rep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，該Cap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び，該外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列を含む塩基配列を更に含む核酸分子に関する。
　アデノ随伴ウイルス（AAV）のRep蛋白質は，AAVのrep遺伝子にコードされる。Rep蛋白質は，例えばAAVゲノムを，当該ゲノム中に存在するITRを介して，宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有する。Rep蛋白質は複数のサブタイプが存在するが，AAVゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みには，Rep68とRep78の2種類が必要とされる。Rep68とRep78は，同一の遺伝子から選択的スプライシングにより転写される2種類のmRNAの翻訳産物である。本発明においてAAVのRep蛋白質というときは，少なくともRep68とRep78の2種類の蛋白質を含むものである。
　本発明の一実施形態において，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質をコードする塩基配列というときは，少なくともRep68とRep78をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列のことをいう。Rep蛋白質は，好ましくは血清型2のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。野生型の血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列は配列番号１で示される塩基配列を有する。野生型の血清型2のAAVのRep68及びRep78は，それぞれ配列番号２及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。
　また，Rep68は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のRep68のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。
　野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep68のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。変異を加えたRep68のアミノ酸配列は，野生型のRep68のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　また，Rep78は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のRep78のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。
　野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep78のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。変異を加えたRep78のアミノ酸配列は，野生型のRep78のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　AAVのRep蛋白質の機能的等価物とは，Rep68にあっては，機能的にRep68に代えて用いることができるものをいい，Rep78にあっては，機能的にRep78に代えて用いることができるものをいう。
　配列番号１で示される塩基配列は，機能的なRep68及びRep78をコードするものである限り，置換，欠失，付加等の改変を加えることができる。配列番号１で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。但し，これら変異を加える場合において，Rep蛋白質のRep68とRep78とをコードする遺伝子の開始コドンをACGとすることが好ましい。
　本発明の好ましい一実施形態における，Rep蛋白質をコードする核酸分子として，配列番号４で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この核酸分子は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するRep蛋白質のRep68と，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するRep蛋白質のRep78とをコードする。また，この核酸分子において，Rep蛋白質のRep68とRep78とをコードする遺伝子の開始コドンはACGである。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep蛋白質をコードするものである限り，Rep蛋白質をコードする核酸分子である。
　本発明の一実施形態においてアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質をコードする塩基配列というときは，少なくともAAVのカプシドを構成する蛋白質の一種であるVP1をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列を含む塩基配列のことをいう。VP1は，好ましくは血清型9のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，１０又は１１の何れのものであってもよい。野生型の血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列は配列番号５で示される塩基配列を有する。野生型の血清型6のAAVのVP1は，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する。野生型の血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列は配列番号７で示される塩基配列を有する。野生型の血清型9のAAVのVP1は，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する。
　また，VP1は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のVP1のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたVP1も，VP1に含まれる。
　野生型のVP1のアミノ酸配列中，例えば配列番号６で示される野生型の血清型6のAAVのVP1のアミノ酸配列又は配列番号９で示される野生型の血清型9のAAVのVP1のアミノ酸配列，のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のVP1のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたVP1も，VP1である。アミノ酸を付加する場合，野生型のVP1のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたVP1も，VP1に含まれる。変異を加えたVP1のアミノ酸配列は，野生型のVP1のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　AAVのVP1の機能的等価物とは，機能的にVP1に代えて用いることができるものをいう。
　本発明の好ましい一実施形態におけるCap蛋白質をコードする核酸分子として，配列番号５又は７で示される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの核酸分子は，それぞれ，野生型の血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列と野生型の血清型9型のAAVのVP1をコードする塩基配列である。これら塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，機能的なVP1をコードするものである限り，Cap蛋白質をコードする核酸分子である。
　配列番号５又は７で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号５又は７で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号５又は７で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号５又は７で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態において，アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）というときは，宿主細胞のゲノム配列中に非相同組換えによりアデノ随伴ウイルスの遺伝子が組み込まれるために必須の塩基配列のことをいう。本発明の一実施形態において，核酸分子中には，アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）が２つ存在し，それぞれ第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR），第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）という。ここで，２つのITRの間に，外来の蛋白質をコードする遺伝子を配置したときに，5’側に位置するITRを第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）といい，3’側に位置するITRを第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）という。
　逆方向末端反復（ITR）は，好ましくは血清型2のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。血清型2のAAVの逆方向末端反復（ITR）は，第一のITRが配列番号９で示される塩基配列を含み，第二のITRが配列番号１０で示される塩基配列を含む。
　また，逆方向末端反復（ITR）は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のITRの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。これら変異を加えたITRも，ITRに含まれる。
　野生型のITRの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。ITRの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，ITRである。塩基を付加する場合，野生型のITRの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，ITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，野生型のITRの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　AAVのITRの機能的等価物とは，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものをいう。また，AAVのITRに基づいて人工的に構築されたITRも，AAVのITRを代替することができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物である。
　かかる人工的に構築された第１の逆方向末端反復（第一のITR）として，配列番号１１で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号１１で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物に含まれる。配列番号１１で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のITRである。配列番号１１で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号１１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　また，かかる人工的に構築された第２の逆方向末端反復（第二のITR）として，配列番号１２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号１２で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物に含まれる。配列番号１２で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のITRである。配列番号１２で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号１２で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態において，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）と，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）との間には，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列が存在する。
　本発明の一実施形態において，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列というときは，制限酵素で特異的に切断することのできる塩基配列を含む塩基配列のことをいう。いわゆるマルチクローニングサイトもこれに含まれる。この塩基配列を制限酵素で切断し，この切断箇所に所望の外来の蛋白質をコードする核酸分子を挿入することができる。
　本発明の一実施形態において，核酸分子中にコードされることのできる外来の蛋白質に特に制限はない。外来の蛋白質が特定の生物種に由来するものである場合，その生物種に特に制限はなく，原核細胞，真核細胞のゲノムにコードされる蛋白質の何れであってもよい。ここで真核細胞は，例えば，真菌類，酵母，昆虫，原虫，両生類，爬虫類，鳥類，哺乳動物，植物である。また，生物種が哺乳動物である場合，例えば，ヒト，ヒト以外の霊長類，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ等の家畜，ネコ，イヌ等の愛玩動物である。また，外来の蛋白質は，特定の生物種に由来する野生型の蛋白質のアミノ酸配列に，置換，欠失，付加等の変異を加えたものであってもよい。また，外来の蛋白質は，天然には存在しないアミノ酸配列を含む，人工的な蛋白質であってもよい。
　外来の蛋白質が，野生型の蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型の蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，野生型の蛋白質のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異が加えられた蛋白質のアミノ酸配列は，対応する野生型の蛋白質のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態において，外来の蛋白質に特に制限はないが，例えば，遺伝子疾患において一部又は全部が機能的に欠損している蛋白質が挙げられる。かかる遺伝子疾患としては，ライソソーム病，嚢胞性繊維症，血友病が例示できる。その他，外来の蛋白質として，成長ホルモン，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストが例示できる。
　また，外来の蛋白質として，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体が例示できる。更に，外来の蛋白質として，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，及び抗ＴＮＦ-α抗体が例示できる。
　外来の蛋白質がリソソーム酵素である場合にあっては，外来の蛋白質の遺伝子として，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２が例示できる。
　外来の蛋白質は，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であってもよい。かかる融合蛋白質としては，抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体の何れかであり，そして他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素の何れかであるものが例示できる。
　外来の蛋白質は，抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質であってもよい。かかる融合蛋白質としては，抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体の何れかであり，そしてリソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２の何れかであるものが例示できる。
　外来の蛋白質が抗体と他の蛋白質との融合蛋白質又は抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質である場合の抗体は，例えば，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して特異的な親和性を有する抗体である。かかる蛋白質としては，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体が例示できる。更に，有機アニオントランスポーターとしてはＯＡＴＰ－Ｆが，モノカルボン酸トランスポーターとしてはＭＣＴ－８が例示できる。
　第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び第一のITRと第二のITRとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域をトランスファー領域という。
　アデノウイルスは，宿主細胞中でAAVのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされてウイルスビリオンを形成するために必要な機能を提供する。この機能は，アデノウイルスゲノムのＥ１領域，E2A領域，E4領域，及びＶＡ１ ＲＮＡ領域により発揮される。
　本発明の一実施形態において，組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）というときは，AAVのカプシド蛋白質（その機能的等価物を含む）に，野生型のAAVのゲノムに改変が加えられた核酸分子，例えばrAAVゲノムがパッケージングされたものをいう。ここで，rAAVゲノム（組換えAAVゲノム）というときは，野生型のAAVのゲノムに改変が加えられた核酸分子のことをいう。rAAVビリオンにパッケージングされるrAAVゲノムは１本鎖DNAである。かかる核酸分子としては，５’末端から側から，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，及び第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。但し，rAAVビリオンにパッケージングされていない当該核酸分子も，rAAVゲノムということができる。従って，rAAVゲノムは一本鎖DNAであっても二本鎖DNAであってもよい。
　本発明の一実施形態において，rAAVゲノム量とは，rAAVゲノムの個数のことを意味し，その単位はvgである。
　本発明の一実施形態において，空カプシドとは，rAAVゲノムがパッケージングされていないカプシド蛋白質で構成されている粒子のことをいう。また，総カプシドとは空カプシドとrAAVビリオンの総称であり，総カプシド量とは空カプシドとrAAVビリオンの個数を足しあわせた個数のことである。
　また，組換えAAVビリオンにおいて，そのカプシド蛋白質が血清型6のAAVに由来するものであるときは組み換えAAV6ビリオン（rAAV6ビリオン）ということができ，カプシド蛋白質が血清型9のAAVに由来するときは組み換えAAV9ビリオン（rAAV9ビリオン）ということができるものとする。その他の血清型のAAVについても同様とする。
　更に，かかる核酸分子としては，５’末端から側から第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，該外来の蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，及び第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。
　更に，かかる核酸分子としては，５’末端から側から第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，該外来の蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，イントロン配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，ポリＡ配列，及び第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。ここで，イントロン配列として用い得る塩基配列に，特に制限はないが，ヒトβグロビン遺伝子に変異を導入した合成ヒトβグロビンイントロン，例えば，配列番号２５で示される塩基配列を含むイントロンが好適に使用し得る。また，ポリアデニレーションシグナル配列（ポリＡ配列）として用い得る塩基配列に，特に制限はないが，配列番号２６で示される塩基配列を含む合成ポリアデニレーションシグナル配列（合成ポリＡ配列）の塩基配列がある。
　宿主細胞中で，組換えAAVビリオンが形成されるためには，アデノウイルスのＥ１領域が有する機能が必要とされる。一般に，組換えAAVビリオンの作製は，E1領域の全部又はその一部を有する宿主細胞が用いられる。かかる細胞として，HEK293細胞が知られている。HEK293細胞のゲノム中には，E1A及びE1Bのコーディング領域が少なくとも含まれている。
　Ｅ１領域の全部又はその一部を有する宿主細胞を用いる場合に，AAVのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされてウイルスビリオンを形成するために必要なアデノウイルスゲノムの領域は，E2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域である。これらの領域は，AAV複製のために必要とされる蛋白質及びRNAをコードしている。E4領域によって提供される機能に関しては，E4領域のオープンリーディングフレーム６(ORF6)によってコードされるE4 34kD蛋白質がAAVの複製に必要とされる。
　本発明の一実施形態における，E2A領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのE2A領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのE2A領域は配列番号１３で示される塩基配列を含む。
　また，E2A領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのE2A領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたE2A領域も，E2A領域に含まれる。
　野生型のE2A領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E2A領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたE2A領域も，E2A領域である。塩基を付加する場合，野生型のE2A領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたE2A領域も，E2A領域に含まれる。変異を加えたE2A領域の塩基配列は，野生型のE2Aの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態における，E4領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのE4領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのE4領域は配列番号１４で示される塩基配列を含む。
　また，E4領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのE4領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたE4領域も，E4領域に含まれる。
　野生型のE4領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E4領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたE4領域も，E4領域である。塩基を付加する場合，野生型のE4の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたE4も，E4に含まれる。変異を加えたE4の塩基配列は，野生型のE4の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　E4領域の好適な一例として，配列番号１５で示される塩基配列を含むものがある。この配列番号１５で示される塩基配列に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，E4領域として使用できる。
　配列番号１５で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E4領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。塩基を付加する場合，配列番号１５で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた塩基配列は，配列番号１５で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。これらの変異を加えたものも，E4領域である。
　本発明の一実施形態における，VA1 RNA領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのVA1 RNA領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのVA1 RNA領域は配列番号１６で示される塩基配列を含む。
　また，VA1 RNA領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのVA1 RNA領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域に含まれる。
　野生型のVA1 RNA領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。VA1 RNA領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域である。塩基を付加する場合，野生型のVA1 RNA領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域に含まれる。変異を加えたVA1 RNA領域の塩基配列は，野生型のVA1 RNA領域の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の好ましい一実施形態において，E2A領域とE4領域とVA1 RNA領域は如何なる順で位置してもよい。E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域を含む塩基配列をヘルパー領域という。
　ヘルパー領域の好ましい一実施形態として，E2A領域の下流にE4領域，更に下流にVA1 RNA領域が位置する，配列番号１７で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域のそれぞれの領域が本来の機能を発揮するものである限り，ヘルパー領域として使用できる。
　配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個である。配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，ヘルパー領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，ヘルパー領域として使用できる。変異を加えたヘルパー領域の塩基配列は，配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　ヘルパー領域に含まれる，E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域のそれぞれにおける改変については，上記のルールが適用される。
　本発明の一実施形態において，Rep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがE2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域を含む領域にコードされる蛋白質及びＲＮＡによって制御されるものである限り，特に制限はないが，好ましくは，AAVのp5プロモーターである。第１の遺伝子発現制御部位がAAVのp5プロモーターである場合，血清型２であるAAVのp5プロモーターであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。血清型２のAAVのp5プロモーターは配列番号１８で示される塩基配列を含む。
　また，AAVのp5プロモーターは，その機能を発揮するものである限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターに含まれる。
　配列番号１８で示される野生型のp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１８で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターである。塩基を付加する場合，配列番号１８で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターに含まれる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，野生型のp5プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　血清型２であるAAVのp5プロモーターを改変したp5プロモーターの例として配列番号１９で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，p5プロモーターの本来の機能を発揮するものである限り，p5プロモーター又はその機能的等価物たり得る。
　配列番号１９で示される塩基配列を含むp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１９で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１９で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　p5プロモーター又はその機能的等価物は，通常，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の上流に位置する。
　p5プロモーター又はその機能的等価物とアデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列とを含む領域を，Rep領域という。Rep領域の好ましい一実施形態として，配列番号２０で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この配列番号２０で示される塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に，配列番号４で示される塩基配列を含むものである。すなわち，この配列番号２０で示される塩基配列は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する血清型2のAAVのRep68と，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する血清型2のAAVのRep78とをコードする。
　配列番号２０で示される塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Ｒｅｐ領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep領域として使用できる。
　配列番号２０で示される塩基配列を含むRep領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２０で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２０で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep領域として使用できる。変異を加えたRep領域の塩基配列は，配列番号２０で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態において，Cap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがE2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域を含む領域にコードされる蛋白質及びＲＮＡによって制御されるものである限り，特に制限はないが，好ましくは，AAVのp40プロモーターである。AAVのp40プロモーターである場合，血清型２であるAAVのp40プロモーターであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。
　また，AAVのp40プロモーターは，その機能を発揮するものである限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp40プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターに含まれる。野生型のp40プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。野生型のp40プロモーターの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターである。塩基を付加する場合，野生型のp40プロモーターの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターに含まれる。変異を加えたp40プロモーターの塩基配列は，野生型のp40プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　p40プロモーター又はその機能的等価物は，通常，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の上流に位置する。
　p40プロモーター又はその機能的等価物とアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列とを含む領域を，Cap領域という。
　Cap領域の好ましい一実施形態として，配列番号２１で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このCap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列を含み，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする。このCap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列に代えて，配列番号５で示される塩基配列を有する血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列を含むものとすることもできる。これら塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Cap領域として使用できる。
　Cap領域の塩基配列中の配列番号２１で示される塩基配列の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２１で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap領域として使用できる。変異を加えたCap領域の塩基配列は，配列番号２１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。配列番号７で示される塩基配列を配列番号５で示される塩基配列に代えたものについても同様である。
　本発明の好ましい一実施形態において，Rep領域はCap領域の上流に位置してもよく，又下流に位置してもよい。Rep領域とCap領域を含む領域をRep-Cap領域という。
　Rep-Cap領域の好ましい一実施形態として，Rep領域がCap領域の上流に位置する，配列番号２２で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このRep-Cap領域は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に配列番号２０で示される塩基配列，更に下流に配列番号２１で示される塩基配列を含む。このRep-Cap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列を含み，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する血清型9型のAAVのVP1をコードする。このRep-Cap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列に代えて，配列番号５で示される塩基配列を有する血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列を含むものとすることもできる。これらの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep-Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep-Cap領域として使用できる。
　配列番号２２で示される塩基配列を含むRep-Cap領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２２で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。変異を加えたRep-Cap領域の塩基配列は，配列番号２２で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　Rep-Cap領域の下流に，Rep蛋白質又は／及びCap蛋白質の発現量を高める機能を有するエンハンサー配列を配置することもできる。ここで，かかるエンハンサー配列に特に制限はないが，AAVのp5プロモーター又はその機能的等価物をエンハンサーとして使用することができる。ここで用いられるp5プロモーターのAAVの血清型に特に限定はなく，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのAAVのp5プロモーターであってもよいが，好ましくは血清型2であるAAV p5プロモーターである。血清型2のAAVのp5プロモーターは配列番号１８で示される塩基配列を含む。
　また，Rep-Cap領域の下流に配置されるAAVのP5プロモーターは，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。これら変異を加えたp5プロモーターも，P5プロモーターに含まれる。
　ここで，野生型のP5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。野生型のp5プロモーターの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，P5プロモーターである。塩基を付加する場合，野生型のP5プロモーターの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたP5プロモーターも，P5プロモーターに含まれる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，野生型のP5プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　血清型2のAAVのp5プロモーターを改変したp5プロモーターの例として配列番号１９で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，p5プロモーターに含まれる。
　配列番号１９で示される塩基配列を含むp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１９で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１９で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　Rep-Cap領域の下流にAAVのp5プロモーター又はその機能的等価物の塩基配列が配置される場合，このAAVのp5プロモーター又はその機能的等価物の塩基配列を含めた領域を，Rep-Cap領域ということもできる。かかるRep-Cap領域の好ましい一実施形態として，配列番号２３で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このRep-Cap領域は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に配列番号２０で示される塩基配列，更に下流に配列番号２１で示される塩基配列，更に下流に配列番号１９で示される塩基配列を含む。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep-Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep-Cap領域とすることができる。
　配列番号２３で示される塩基配列を含むRep-Cap領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２３で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２３で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。変異を加えたRep-Cap領域の塩基配列は，配列番号２３で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
　本発明の一実施形態において，外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがこの外来の蛋白質をコードする遺伝子が導入される先の細胞，組織又は生体内で，この外来の蛋白質を発現させることができるものである限り，特に制限はないが，サイトメガロウイルス由来のプロモーター（任意選択でエンハンサーを含む），ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，β-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターを含むものが好適である。β-アクチンプロモーターとしては配列番号３８で示される塩基配列を有するニワトリβ-アクチンプロモーターが好適である。この他，ヒトCMVエンハンサーの下流にニワトリβ-アクチンプロモーターが結合した配列番号４７で示される塩基配列を有するプロモーターが第３の遺伝子発現制御部位として好適に利用できる。
　外来の蛋白質の発現量を増加させるため，第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列と外来の蛋白質をコードする塩基配列との間，又は外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流に，イントロン配列が存在してもよい。例えば，ヒトCMVエンハンサーの下流にニワトリβ-アクチンプロモーター，その下流に配列番号３９で示される塩基配列を有するニワトリβアクチン/MVMキメライントロンが結合したものは，第３の遺伝子発現制御部位として好適に利用できる。ここでMVMはMinute virus of miceの略号である。
　外来の蛋白質の下流にはポリアデニレーション配列（polyA配列）が配置される。polyA配列として用いることのできる塩基配列に，それが外来の蛋白質をコードする遺伝子が導入される先の細胞，組織又は生体内で本来の機能を発揮できるものである限り，特に制限はないが，ヒト成長ホルモンpolyA配列，配列番号４０で示される塩基配列を有する成長ウシ成長ホルモンpolyA配列が好適に利用できる。
　本発明の一実施形態である核酸分子は，環状のプラスミドとすることができる。
　本発明の一実施形態において，核酸分子が環状のプラスミドであるとき，Rep-Cap領域，トランスファー領域，ヘルパー領域は，如何なる順で位置してもよい。
　本発明の好適な一実施形態において，Rep-Cap領域の下流にトランスファー領域，その下流にヘルパー領域が位置する。例えば，Rep領域の下流にCap領域，その下流にトランスファー領域，その下流にE2A領域，その下流にE4領域，その下流にVA1 RNA領域が位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる一実施形態において，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，及びアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列は，如何なる順で位置してもよい。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　但し，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列は，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物の塩基配列は，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また更に，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列は，アデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物の塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また更に，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物の塩基配列の３’側に，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列，更にその下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物の塩基配列が位置することが好ましい。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の下流に，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよい。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にAAVのp5プロモーター又はその等価物の塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にAAVのp5プロモーター又はその等価物の塩基配列，更に下流に複製開始点，更に下流に薬剤耐性遺伝子，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型6又は9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に第一のITR，更に下流にサイトメガロウイルス由来のプロモーター，更に下流に合成ヒトβグロビンイントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に合成polyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，その場合，複製開始点は好ましくはp5プロモーターの下流に位置する。付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよく，その場合，薬剤耐性遺伝子は好ましくは第一のITRの上流に位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の更なる好ましい一実施形態として，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型6又は9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に第一のITR，更に下流にヒトCMVエンハンサー，更に下流にニワトリβアクチンプロモーター，更に下流にニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にウシ又はヒト成長ホルモンpolyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，その場合，複製開始点は好ましくはp5プロモーターの下流に位置する。付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよく，その場合，薬剤耐性遺伝子は好ましくは第一のITRの上流に位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。
　本発明の一実施形態の核酸分子を用いた，組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの製造法について，配列番号２４で示される塩基配列を含む核酸分子を例にとって以下に説明する。
　配列番号２４で示される核酸分子は，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に複製開始点，更に下流にアンピシリン耐性遺伝子，更に下流に第一のITR，更に下流にサイトメガロウイルス由来のプロモーター，更に下流に合成ヒトβグロビンイントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列，更に下流に合成polyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子である。配列番号２４には示されていないが，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列（配列番号２４で示される塩基配列中の8116bp～8147bpに存在する制限酵素サイトの何れか）には，所望の蛋白質をコードする塩基配列が導入されているものとする。この配列番号２４で示される核酸分子は，組換えAAVビリオンを作製するために用い得る核酸分子の好適な一例である。配列番号２４で示される核酸分子は，図１１で示されるpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターから，GFP遺伝子を除いたものに相当する構造を有する。
　配列番号２４で示される塩基配列を有する核酸分子は，環状プラスミドとして一般的な遺伝子工学的手法を用いて合成することができる。この環状プラスミドには，薬剤耐性遺伝子がコードされている。また，大腸菌で複製されるための複製開始点を有する。従って，この環状プラスミドは大腸菌に導入することによって増幅させることができ，容易に大量に調製することができる。
　調製した環状プラスミドは，アデノウイルスのE1A領域及びE1B領域がゲノムに組み込まれた宿主細胞に導入される。かかる宿主細胞として，アデノウイルスのE1A遺伝子，及びE1B遺伝子でトランスフォームしたヒト胎児腎組織由来細胞であるHEK293細胞が好適に使用できる。
　宿主細胞に環状プラスミドが導入されると，第一のITRから第二のITRに至る領域が宿主細胞に非相同組換えによって組み込まれる。ついで，この宿主細胞に組み込まれた領域から，１本鎖DNAが複製されて，これがカプシドにパッケージングされて組換えAAVビリオンが形成される。組換えAAVビリオンは，培養液中に放出されるか，又は宿主細胞内に蓄積する。従って，宿主細胞の培養上清を回収することにより，又は宿主細胞を回収しこれを破壊することにより，組換えAAVビリオンを回収することができる。
　通常，組換えAAVビリオンを製造するためには，ITRに挟まれた所望の蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミド，Rep蛋白質をコードする塩基配列及びCap蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミド，及びアデノウイルス由来E2A，E4，及びVA1 RNA配列を含むプラスミドの３種類のプラスミドを同時に宿主細胞に導入する必要がある。宿主細胞の中で，３種類のプラスミドが導入される細胞の比率は低く，これにより組換えAAVビリオンの製造効率は低下する。また，３種類のプラスミドの中で，ITRに挟まれた所望の蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミドが導入されず，他の２種のプラスミドのみが導入された宿主細胞では，rAAVゲノムを含まない空のウイルス粒子（空カプシド）が産生されることになるので，更に製造効率は低下する。
　本発明の好適な実施例の一つである配列番号２４で示される塩基配列を有する環状プラスミドは，これら３種類のプラスミドの機能を全て有する。従って，この環状プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することにより，rAAVビリオンの細胞中での産生に必要なすべての要素が細胞に同時に導入されることになるので，rAAVビリオンの生産量が上昇させることができるのみならず，空カプシドの発生を抑制することもできる。総カプシドに占める空カプシドの比率が高いほど，rAAVビリオンの品質は低下することになるので，この環状プラスミドを用いることにより，空カプシドの比率の低い高品質のrAAVビリオンを効率よく製造できる。これに限らず，統合rAAVプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することにより，空カプシドの比率の低い高品質のrAAVビリオンを効率よく製造できる。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕pHelper(mod)ベクターの構築
　5’側より，SalIサイト，RsrIIサイト，複製開始点（ColE1 ori），アンピシリン耐性遺伝子，BsiWIサイト，BstZ17Iサイト，及びBsrGIサイトを含む配列番号２７で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をSalIとBsrGIで消化した。pHelperベクター（タカラバイオ社）をSalIとBsrGIで消化し，これに，上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper(mod)ベクターとした（図１）。
〔実施例２〕pAAV-CMV-GFPベクター及びpAAV-CMV-GFP(mod) ベクターの構築
　5’側より，EcoRIサイト，MluIサイト，GFP遺伝子（緑色蛍光蛋白質遺伝子），NotIサイト，及びBamHIサイトを含む配列番号２８で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をEcoRIとBamHIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をEcoRIとBamHIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-CMV-GFPベクターとした。pAAV-CMV-GFPベクターのPciIサイトに，配列番号２９で示される塩基配列を有する，BsiWIサイトとAvrIIサイトを含むマルチクローニングサイト１を挿入し，更に，SfoIサイト，配列番号３０で示される塩基配列を有する，BsrGIサイト，AgeIサイト，及びBstZ17Iサイトを含むマルチクローニングサイト２を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-CMV-GFP(mod)ベクターとした（図２）。
〔実施例３〕pR2(mod)C6ベクターの構築
　5’側より，AfeIサイト，RsrIIサイト，BsrGIサイト，AvrIIサイト，アンピシリン耐性遺伝子サイト，複製開始点（ColE1 ori），RsrIIサイト，AAV2 Rep領域の5’部分（p5プロモーターを含む），及びSacIIサイトを含む配列番号３１で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をAfeIとSacIIで消化した。pRC6ベクター（タカラバイオ社）をAfeIとSacIIで消化し，これに上記の制限処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C6ベクターとした（図３）。
〔実施例４〕pR2(mod)C9ベクターの構築
　5’側より，HindIIIサイト，AAV2 Rep領域の3’部分，AAV9 Cap領域，p5プロモーター，RsrIIサイト，及びBsrGIサイトを含む配列番号３２で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をHindIIIとBsrGIで消化した。pR2(mod)C6ベクターをHindIIIとBsrGIで消化し，これに上記の制限酵素処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C9ベクターとした（図４）。
〔実施例５〕pHelper-ITR/CMV/GFPベクターの構築
　pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをBsiWIとBstZ17Iで消化し，ITR-CMVプロモーター，ヒトβグロビンイントロン，GFP遺伝子，合成ポリA配列，及びITRを含むDNA断片を切り出した。pHelper(mod)ベクターをBsiWIとBstZ17Iで消化し，これに切り出したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとした（図５）。
〔実施例６〕pHelper-R2(mod)C6ベクターの構築
　pR2(mod)C6ベクターをRsrIIで消化し，AAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV6 Cap領域-p5プロモーターを含む配列を切り出した。別にpHelper(mod)ベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-R2(mod)C6ベクターとした（図６）。
〔実施例７〕pHelper-R2(mod)C9ベクターの構築
　pR2(mod)C9ベクターをRsrIIで消化し，p5 promoter-Rep2-AAV9 VP1-p5 promoterを含む配列を切り出した。pHelper(mod)ベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-R2(mod)C9ベクターとした（図７）。
〔実施例８〕pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターの構築
　pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをAvrIIとBsrGIで消化し，ITR- CMVプロモーター-ヒトβグロビンイントロン-GFP-合成ポリA配列-ITRを含む配列を切り出した。pR2(mod)C6ベクターをAvrIIとBsrGIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとした（図８）。
〔実施例９〕pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターの構築
　pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをAvrIIとBsrGIで消化し，ITR-CMVプロモーター-ヒトβグロビンイントロン-GFP-合成ポリA配列-ITRを含むDNA断片を切り出した。別に，pR2(mod)C9ベクターをAvrIIとBsrGIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとした（図９）。
〔実施例１０〕pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターの構築
　pR2(mod)C6ベクターをRsrIIで消化してAAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV6 Cap領域，及びエンハンサーとして機能するp5プロモーターを含む配列を切り出した。別に，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターをRsrIIで消化した。これに上記で切り出した配列を挿入し，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターとした。（図１０）
〔実施例１１〕pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの構築
　pR2(mod)C9ベクターをRsrIIで消化してAAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV9 Cap領域，及びエンハンサーとして機能するp5プロモーターを含むDNA断片を切り出した。別にpHelper-ITR/CMV/GFPベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターとした（図１１）。
〔実施例１２〕3種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
　SV40ウイルスのlarge T抗原遺伝子を発現させたヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株である，HEK293T細胞を宿主細胞として用いた。HEK293T細胞を，1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地（Thermo Fisher Scientific社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，下記の（１）～（２）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクター（タカラバイオ社），
（２）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター。
　それぞれの溶液は，3種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が4 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞中で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。実施例１３及び１４においても同様である。
〔実施例１３〕2種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
　HEK293T細胞を1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，下記の（１）～（６）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター（タカラバイオ社），
（２）pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，
（３）pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，
（４）pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，
（５）pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクター（タカラバイオ社），
（６）pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelper（タカラバイオ社）ベクター。
　それぞれの溶液は，2種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が3.5～3.6 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15 cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。
〔実施例１４〕統合rAAVプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
　HEK293T細胞を1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターが3.2 μg/mLの濃度で含まれる溶液を調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAV6ビリオンとrAAV9ビリオンとをそれぞれ産生させた。
〔実施例１５〕培養上清の回収
　実施例１２～１４の培養終了後，細胞培養液を50 mL遠心チューブに移し，3000×gで10分間遠心して，培養上清を回収した。また，遠心して沈殿させた細胞は，実施例１７の細胞溶解物溶液の調製に用いた。
〔実施例１６〕培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
　培養上清中のウイルスゲノム含有量はAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。実施例１５で回収した2 μLの培養上清に，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で1時間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution （タカラバイオ社）で100倍希釈し，リアルタイムPCR用サンプル溶液とした。
　リアルタイムPCR用サンプル溶液と検量線用スタンダードプラスミド溶液（pAAV-CMV-GFPベクターを直鎖化したもの）のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM 順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー(プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃，2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃，5秒→60℃，30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるrAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。
　培養上清中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit (PROGEN社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例１５で回収した培養上清（検体サンプル）を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.3×109～1.0×107 カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈したKit Controlを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体又はマウス抗AAV6抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。
〔実施例１７〕細胞溶解物溶液の調製
　実施例１５で細胞培養液を遠心して沈殿させた細胞に，1% TritonX-100，4 mM MgCl2，50U/mL Turbonuclease（Accelagen社），及び4×Protease Inhibitor Cocktail（シグマ社）を含有するクエン酸緩衝液（32 mM クエン酸ナトリウム）を加え，37℃で1.5時間静置した。4 mM MgCl2含有クエン酸緩衝液（68 mM クエン酸）を添加して中和後，6000×g，4℃で10分間遠心した。これに0.25% TritonX-100，4 mM MgCl2，12.5U/mL Turbonuclease（Accelagen社），及び1×Protease Inhibitor Cocktail（シグマ社）を含有する25 mMクエン酸緩衝液（pH 3.6，8 mM クエン酸ナトリウム＋17 mM クエン酸）を2倍量添加して細胞溶解物とした。
　SP-Sepharose 1 mLカラム（GEヘルスケア社）を，4 mM MgCl2を含有する25 mM クエン酸緩衝液（pH 3.6，8 mM クエン酸ナトリウム＋17 mM クエン酸）で平衡化し，これに細胞溶解物を供した。4 mM MgCl2，500 mM NaClを含有する50 mM クエン酸緩衝液（pH 5.18，40.2 mM クエン酸ナトリウム＋9.8 mM クエン酸）で溶出後，最終濃度が50 mMとなるように1M Tris緩衝液を添加して溶出液を中和した。中和サンプルをVivaspin-500 100K MWCO（Vivaproducts社）に入れ，3000×g，4℃で10分間遠心後，180 mM NaCl，0.001% F68含有PBSを入れてさらに3000×g，4℃で10分間遠心して緩衝液を置換した。得られた溶液を細胞溶解物溶液とした。
〔実施例１８〕細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
　精製した細胞溶解物溶液中のウイルスゲノム含有量はAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。実施例１７で調製した2 μLの細胞溶解物溶液サンプルに，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で1時間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution（タカラバイオ社）で100倍希釈したものをリアルタイムPCR用のサンプル溶液とした。
　リアルタイムPCR用サンプル溶液と検量線用スタンダードプラスミド溶液（pAAV-CMV-GFPベクターを直鎖化したもの）のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー (プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃, 2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃, 5秒→60℃, 30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるAAVウイルスゲノム量（vg）を求めた。ここでvgはAAVウイルスゲノムの個数を示す単位である。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。
　細胞溶解物溶液中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit (PROGEN社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例１７で調製した細胞溶解物溶液（検体サンプル）を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.3×109～1.0×107 カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈したKit Controlを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体又はマウス抗AAV6抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。
〔実施例１９〕rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率の算出
　実施例１８で測定した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果と総カプシド量の測定結果からrAAVゲノムを含む組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）と空カプシドの量を，それぞれ算出した。rAAVビリオンの量は，rAAVゲノムが全てカプシドにパッケージングされてビリオンを形成したものとみなして，rAAVゲノム量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とした。（rAAVビリオンの量／総カプシド量）X100%を，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率として算出した。なお，総カプシド量（個数）の測定値からrAAVビリオンの量（個数）を減ずると空カプシド量（個数）が算出される。
〔実施例２０〕細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定
　HEK293T細胞を1×105個/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，8% CO2存在下で16時間培養した。実施例１８で調製したrAAV6ビリオンを含む細胞溶解物溶液を，2% FBSを含む1 mLのDMEM/High Glucose培地に添加し，トランスダクション用溶液を調製した。トランスダクション用溶液は，rAAV6ビリオンが，2x108 個と2x109個含まれるものをそれぞれ調製した。24ウェルプレートの培養上清を全て除いた後，トランスダクション用溶液を添加し，37℃，8% CO2存在下で3日間培養した。
　3日後に24ウェルプレートの培養上清を全て除き，PBSで洗浄後20 μLのTrypLETM（トリプシン様活性を有する酵素溶液：Thermo Fisher Scientific社）を添加して37℃で2分間静置した。その後，1 mLのPBSで再び懸濁し，このうち65 μLを用いてMOXI-GO II（ORFLO社）でGFP陽性細胞の割合を測定した。
〔実施例２１〕細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定
　HEK293T細胞を1×105個/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し， 10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，8% CO2存在下で16時間培養した。実施例１８で調製したrAAV9ビリオンを含む細胞溶解物溶液を，2% FBSを含む1 mLのDMEM/High Glucose培地に添加し，トランスダクション用溶液を調製した。トランスダクション用溶液は，rAAV6ビリオンが，2x108個と2x109個含まれるものをそれぞれ調製した。24ウェルプレートの培養上清を全て除いた後，トランスダクション用溶液を添加し，37℃，8% CO2存在下で3日間培養した。
　3日後に24ウェルプレートの培養上清を全て除き，PBSで洗浄後20 μLのTrypLE TM（トリプシン様活性を有する酵素溶液：Thermo Fisher Scientific社）を添加して37℃で2分間静置した。その後，1 mLのPBSで再び懸濁し，このうち65 μLを用いてMOXI-GO II（ORFLO社）でGFP陽性細胞の割合を測定した。
〔実施例２２〕Transducing Unitの算出
　Transducing Unitを以下の計算式で算出した。ここでTransducing Unitは，細胞溶解物溶液の全量を用いて宿主細胞を感染させたときに得られる，GFP陽性細胞数（rAAVビリオンで感染した細胞数）を意味する。（[ウェル内の総細胞数]×[GFP陽性細胞の割合(%)]/100）×（[rAAVビリオンサンプル総量(mL)]/[各ウェルに投入したrAAVビリオンサンプル量(mL)]）
〔実施例２３〕結果（培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定）
　実施例１５で得た培養上清中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を図１２に黒バーで示す。，図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は，それぞれ2.6×1011 vg，7.2×1011 vg，11.1×1011 vgであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は15.6×1011 vgであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は35.0×1011 vgであった。
　また，総カプシド量の測定結果を図１２に白バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量はそれぞれ2.6×1012 capsids，5.6×1012 capsids，5.9×1012 capsidsであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量は3.6×1012 capsidsであった。これに対して(4)%はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，総カプシド量は6.6×1012 capsidsであった。rAAVゲノム量と総カプシド量のいずれの結果も，統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した時に最も発現量が高い結果となった（図１２）。
〔実施例２４〕結果（細胞溶解物溶液中に含まれるrAAV量の測定）
　実施例１７で調製した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を図１３に黒バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量はそれぞれ2.5×1011 vg，23.1×1011 vg，22.0×1011 vgであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は6.8×1011 vgであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は29.7×1011 vgであった（図１３）。
　また，総カプシド量の測定結果を図１３に白バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量はそれぞれ3.3×1012 capsids，5.3×1012 capsids，5.3×1012 capsidsであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は3.8×1012 capsidsであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は6.1×1012 capsidsであった。rAAVゲノム量と総カプシド量のいずれの結果も統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した時に最も発現量が高い結果となった（図１３）。
〔実施例２５〕結果（rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率）
　実施例１７で算出した細胞溶解物溶液のrAAVゲノム量と総カプシド量から求めた，理論上，空カプシドが存在せず，全てのカプシドがrAAVを含むrAAVビリオンである場合，rAAVゲノム量と総カプシド量の存在比率は1:1となる。rAAVビリオン（rAAVビリオン）の総カプシド中における存在比率を図１４に示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，存在比率はそれぞれ7.5%，43.5%，41.5%であった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，存在比率は17.8%であった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，存在比率は48.6%であった（図１４）。この結果より，pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合と，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合に，空カプシドの割合が少ないことが示された。
〔実施例２６〕結果（細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定）
　実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定結果を図１５に示す。図中黒バーは2×108 個のrAAV6ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)は，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合はそれぞれ1.5%，9.3%，5%であった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は0.6%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示しGFP陽性細胞の割合は11.2%であった。
　また，図１５において，白バーは2×109個のrAAV6ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ23.2%，70.5%，53.6%であった。(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は12.6%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は71.1%であった。
　これらの結果は，pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，又はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを用いるか，若しくはpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを用いることにより，高い感染能を有するrAAV6ビリオン溶液を得られることを示す。
〔実施例２７〕結果（細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定）
　実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定結果を図１６に示す。図中黒バーは2×108個のrAAV9ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ0.8%, 0.3%, 2%であった。(5)pHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は3.5%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は7.3%であった。
　また，図１６において，白バーは2×109個のrAAV9ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ4.6%，1%，11.4%であった。(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は21.7%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は50.3%であった。
　これらの結果は，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを用いることにより，高い感染能を有するrAAV9ビリオン溶液を得られることを示す。
〔実施例２８〕結果（Transducing Unitの算出）
　実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定結果を図１７に示す。図中(1)は，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示す。
　実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定結果を図１８に示す。図中(1)は，(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(5)pHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示す。
　これらの結果は，統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを用いて宿主細胞への導入を行うことにより，より感染能の高いrAAV6ビリオン又はrAAV9ビリオンをそれぞれ製造できることを示す。
〔実施例２９〕pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターの構築
　実施例２８までのpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの2種類のベクターについての実験結果から，統合rAAVプラスミドを用いることにより感染能の高いrAAV6ビリオン又はrAAV9ビリオンを製造できることがわかった。この統合rAAVプラスミドの感染能の高さは，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率が高いことに起因するものと考えられる。そこで結果を更に検証するために，異なる構造を有する統合rAAVプラスミドを構築して，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率を以下の実験により確認した。
　5’側より，ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ヒトI2S遺伝子，及びウシ成長ホルモンpolyA配列を含む配列番号３５で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片を鋳型としてプライマー７（配列番号４８）とプライマー８（配列番号４９）を用いて，PCR反応を行った。実施例２で構築したpAAV-CMV-GFP(mod)ベクターを制限酵素（HindIII / BglII）で消化し,これに上記PCR反応で得られたDNA断片を混合し,両者をin fusion HD cloning Kit(タカラバイオ社)を用いて融合させた。得られたプラスミドをpAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターとした（図１９）。ここで，ヒトI2S遺伝子は配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含むヒトIDSをコードする（実施例３０に同じ）。また，ヒトCMVエンハンサーは配列番号３７で示される塩基配列，ニワトリβアクチンプロモーターは配列番号３８で示される塩基配列，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロンは配列番号３９で示される塩基配列，及びウシ成長ホルモンpolyA配列は配列番号４０で示される塩基配列を含む。
〔実施例３０〕pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの構築
　5’側より，ITR，ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びITRを含む配列番号５０で示される塩基配列を有するDNA断片を合成した。このDNA断片をBsiWIとBstZ17Iで消化し，実施例１で構築したpHelper(mod)のBsiWIサイトとBstZ17Iサイトの間に挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)ベクターとした。
　pHelper-ITR/CBA(BAM)ベクターをRsrIIで消化し，これに実施例４で構築したpR2(mod)C9をRsrIIで消化して得たAAV9 Cap領域を含むDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9ベクターとした。
　ヒトIDS遺伝子を含む配列番号５１で示される塩基配列を有するDNA断片を合成した。このDNA断片をPacIとNotIで消化し，PacIとNotIで消化したpHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9ベクターに挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターとした（図２０）。
〔実施例３１〕3種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生（２）
　HEK293T細胞を，2.5×106個/フラスコの濃度でT-25フラスコに播種し，10% FBS含有MEM培地（シグマ社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，pHelperベクター（タカラバイオ社），pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクター，及びpR2(mod)C9ベクターを含む溶液を作製した。この溶液は，3種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が2.9～3.9 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンを，濃度比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μg)＝1：3となるように添加し，更にMEM培地を加えて液量を5 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。T-25フラスコに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，5 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で5日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞中で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。実施例３２においても同様である。
〔実施例３２〕統合プラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生（２）
　HEK293T細胞を，2.5×106 個/フラスコの濃度でT-25フラスコに播種し，10% FBS含有MEM培地（シグマ社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターが2.9～3.9 μg/mL含まれる溶液を調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンを，濃度比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μL)＝1：3となるように添加し，更にMEM培地を加えて液量を5 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。T-25フラスコに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，5 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で5日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。
〔実施例３３〕培養上清の回収
　実施例３１及び３２の培養終了後，細胞培養液を15 mL遠心チューブに移し，4℃，5800×gで5分間遠心して，培養上清を回収した。
〔実施例３４〕培養上清からのrAAVビリオン溶液の調製
　実施例３３で回収した培養上清に，エンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼTM（Merck名）を濃度が14 U/mLとなるように添加して混合し，37℃で2時間インキュベートした。AAV9に対し特異的な親和性を有する樹脂が充填されたカラムであるPOROSTM CaptureSelectTM AAV9 Affinity Resin（Thermo Fisher Scientific社）0.15 mLを結合バッファー（20mM Tris-HCl，150mM NaCl及び4 mM MgCl2含有，pH 7.5）で平衡化させ，これにエンドヌクレアーゼ処理した培養上清を負荷した。カラムを結合バッファーで洗浄した後，0.5 mL溶出バッファー（0.1 Mクエン酸含有，pH 2.06）を通じてrAAVビリオンを含む溶液を溶出させた。得られた溶出液を150 mM NaCl及び0.001% F68を含有するPBSで予め平衡化したPD MiniTrapTM G-25（GE Healthcare社）に通じrAAVビリオンをカラムに結合させた。次いで，150 mM NaCl及び0.001% F68を含有する1 mL PBSによりrAAVビリオンを溶出させた。これをビバスピンTM ターボ 15（100K MWCO，PES，Sartorius社）を用いて4℃，2000×gで3分間遠心して濃縮した。得られた溶液をrAAVビリオン溶液とした。
〔実施例３５〕rAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
　実施例３４で得られたrAAVビリオン溶液中のウイルスゲノム含有量をAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法でリアルタイムPCR測定した。実施例３４で調製した2 μLのrAAVビリオン溶液に，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で30分間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution（タカラバイオ社）で50倍希釈したものをリアルタイムPCR用サンプル溶液とした。リアルタイムPCR用サンプル溶液と，2×102～2×107 ゲノムコピー数/μLの濃度にEASY Dilution（タカラバイオ社）で希釈した検量線用Kit control溶液のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM 順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー(プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃，2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃，5秒→60℃，30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるrAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。
　また，上記リアルタイムPCR法に加えて，補助的に，rAAVビリオン溶液中のウイルスゲノム含有量を，ドロップレットデジタルPCR法によっても測定した。rAAVビリオン溶液2 μLに1 μLのDNaseI（タカラバイオ社），2 μLの10× DNaseI Buffer（タカラバイオ社），及び15 μLの0.05% F-68含有水を加え，37℃で30分間インキュベートし，rAAVビリオン外のDNAを消化した。
　DNaseI処理を行ったrAAVビリオン溶液を0.05% F-68含有TEバッファーを用いて適宜希釈し，ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液を調製した。1.0 μM 順方向プライマー（プライマー３，配列番号４１），1.0 μM 逆方向プライマー（プライマー４，配列番号４２），及び0.25 μM プローブ（プローブ１，配列番号４３の5’末端にレポーター色素としてFAMを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むFAM標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。また，1.0 μM 順方向プライマー（プライマー５，配列番号４４），1.0 μM 逆方向プライマー（プライマー６，配列番号４５），及び0.25 μMプローブ（プローブ２，配列番号４６の5’末端にレポーター色素としてHEXを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むHEX標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。
　ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液1 μLに，10 μLのddPCR Supermix for probes (no dUTP) （BioRad社），1 μLのFAM標識20×プライマー/プローブミックス，1 μLのHEX標識20×プライマー/プローブミックス，2 μLの5M ベタイン溶液（Sigma社），及び5 μLの0.05% F-68含有水を加え，PCR反応液を調製した。Droplet generator（BioRad社）を用いて，PCR反応液20 μLとDroplet Generator オイル for Probes（BioRad社）70 μLの懸濁液（ドロップレット）を調製した。このドロップレットを用いてPCR反応を行った。PCR反応は変性条件（95℃，10分）の後40サイクルの3ステップPCR（95℃，30秒→60℃，1分→72℃，15秒）を行い，次いでPCR酵素の不活化処理（98℃，10分）を行った。ドロップレットの解析はQX200 Droplet Digital PCRシステム（BioRad社）を用い，FAM/HEXダブルポジティブドロップレットをもとに，rAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ウシ成長ホルモンpolyA，及びITRの内部領域である。
　培養上清中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit（PROGEN社）を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例３４で調製したrAAVビリオン溶液を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.0×107～1.3×109カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈した既知量のAAV9空カプシドを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。
〔実施例３６〕結果（rAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定）
　実施例３４で調製したrAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　理論上，空カプシドが存在せず，全てのカプシドがrAAVゲノムを含むrAAVビリオンである場合，rAAVゲノム量と総カプシド量の存在比率は1:1となる。rAAVゲノムが全てカプシドにパッケージングされてビリオンを形成したものとみなして，rAAVゲノム量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とした。（rAAVビリオンの量（個数）／総カプシド量（個数））X100（%）を，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率として，リアルタイムPCR法で求められたrAAVゲノム量を用いて存在比率を算出すると，3種類のプラスミドを用いた場合は12.7%であることころ，統合rAAVプラスミドを用いた場合は62.2%であった。すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター及びpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターと同様に，pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの場合も，統合rAAVプラスミドを用いることによりrAAVビリオンの総カプシド中における存在比率を高めることができることが検証された。また，rAAVビリオンの量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とすると，統合rAAVプラスミドを用いることにより，3種類のプラスミドを用いる場合と比較して，8倍以上のrAAVビリオンが得られることなるので，統合rAAVプラスミドをrAAVビリオンの製造に用いることによりrAAVビリオンの生産量効率を大幅に上昇されることができる。補助的に行ったドロップレットデジタルPCR法によるrAAVゲノム量の定量結果からも同様の結論が得られる。
　本発明の一実施形態によれば，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産することができるので，かかるrAAVビリオンを医療機関に安定的に供給することができる。
配列番号１：血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列，野生型
配列番号２：血清型2のAAVのRep68のアミノ酸配列，野生型
配列番号３：血清型2のAAVのRep78のアミノ酸配列，野生型
配列番号４：血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列の好ましい一例，合成配列
配列番号５：血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列，野生型
配列番号６：血清型6のAAVのVP1のアミノ酸配列，野生型
配列番号７：血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列，野生型
配列番号８：血清型9のAAVのVP1のアミノ酸配列，野生型
配列番号９：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第一のITR）の塩基配列，野生型
配列番号１０：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第二のITR）の塩基配列，野生型
配列番号１１：第一の逆方向末端反復（第一のITR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１２：第二の逆方向末端反復（第二のITR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１５：E4領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１７：ヘルパー領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１９：第１の遺伝子発現制御部に含まれる塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２０：Rep領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２１：Cap領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２２：Rep-Cap領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２３：Rep-Cap領域の塩基配列の好適な一例（２），合成配列
配列番号２４：組換えAAVビリオンを作製するために使用される核酸分子の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２５：合成ヒトβグロビンイントロンの塩基配列，合成配列
配列番号２６：合成ポリアデニレーションシグナル配列の塩基配列，合成配列
配列番号２７：SalIサイト，RsrIIサイト，ColE1 ori，アンピシリン耐性遺伝子，BsiWIサイト，BstZ17Iサイト，及びBsrGIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号２８：EcoRIサイト，MluIサイト，GFP遺伝子，NotIサイト，及びBamHIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号２９：マルチクローニングサイト１の塩基配列，合成配列
配列番号３０：マルチクローニングサイト２の塩基配列，合成配列
配列番号３１：AfeIサイト，RsrIIサイト，BsrGIサイト，AvrIIサイト，アンピシリン耐性遺伝子，ColE1 ori，RsrIIサイト，血清型2の Rep領域の5’部分（p5プロモーターを含む），及びSacIIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号３２：HindIIIサイト，血清型2のAAVのRep領域の3’部分，血清型9のCap領域，p5プロモーター，RsrIIサイト，及びBsrGIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号３３：順方向プライマー，プライマー１の塩基配列，合成配列
配列番号３４：逆方向プライマー，プライマー２の塩基配列，合成配列
配列番号３５：ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ヒトI2S遺伝子，及びウシ成長ホルモンpolyA配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号３６：ヒトIDSのアミノ酸配列
配列番号３７：ヒトCMVエンハンサーの塩基配列
配列番号３８：ニワトリβアクチンプロモーターの塩基配列
配列番号３９：ニワトリβアクチン/MVMキメライントロンの塩基配列，合成配列
配列番号４０：ウシ成長ホルモンpolyA配列の塩基配列
配列番号４１：プライマー３の塩基配列，合成配列
配列番号４２：プライマー４の塩基配列，合成配列
配列番号４３：プローブ１の塩基配列，合成配列
配列番号４４：プライマー５の塩基配列，合成配列
配列番号４５：プライマー６の塩基配列，合成配列
配列番号４６：プローブ２の塩基配列，合成配列
配列番号４７：ヒトCMVエンハンサー及びニワトリβアクチンプロモーターを含む塩基配列，合成配列
配列番号４８：プライマー７の塩基配列，合成配列
配列番号４９：プライマー８の塩基配列，合成配列
配列番号５０：ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，及びウシ成長ホルモンポリA配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号５１：ヒトIDS遺伝子を含む塩基配列，合成配列

Claims (46)

  1. 　少なくとも以下の塩基配列を含む核酸分子；
    　（ａ）アデノ随伴ウイルスのＲｅｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
    　（ｂ）アデノ随伴ウイルスのＣａｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
    　（ｃ）第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（第一のＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
    　（ｄ）第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（第二のＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
    　（ｅ）第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，
    　（ｆ）アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，
    　（ｇ）アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び
    　（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１　ＲＮＡ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列。
  2. 　該Ｒｅｐ蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，
    　該Ｃａｐ蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び
    　該外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，を更に含むものである請求項１の核酸分子。
  3. 　薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，請求項１又は２の核酸分子。
  4. 　該第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，
    　該Ｒｅｐ蛋白質をコードする塩基配列，
    　更に下流に該第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び
    　更に下流に該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列，を含むものである，
    　請求項２又は３の核酸分子。
  5. 　該第一のＩＴＲを含む塩基配列の下流に，
    　該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，
    　更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，
    　更に下流に該第二のＩＴＲを含む塩基配列，を含むものである，
    　請求項２～４の何れかの核酸分子。
  6. 　該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列の下流に，
    　該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，
    　更に下流に該アデノウイルスＶＡ１　ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，
    　請求項２～５の何れかの核酸分子。
  7. 　該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，
    　該第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，
    　更に下流に該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，
    　更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，
    更に下流に該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，を含むものである，
    　請求項４の核酸分子。
  8. 　該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列の下流に，
    　該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列，
    　更に下流に該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，
    　更に下流に該アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，
    　請求項７の核酸分子。
  9. 　薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，請求項１～８の何れかの核酸分子。
  10. 　薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を，該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流であって，該第一のＩＴＲを含む塩基配列の上流に含むものである，請求項９の核酸分子。
  11. 　該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，Ｒｅｐ蛋白質及びＣａｐ蛋白質の発現量を高めるエンハンサー機能を有する塩基配列を含むものである，請求項１～１０の何れかの核酸分子。
  12. 　該Ｒｅｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，請求項１～１１の何れかの核酸分子。
  13. 　該Ｒｅｐ蛋白質が，Ｒｅｐ６８又は／及びＲｅｐ７８を含むものである，請求項１２の核酸分子。
  14. 　該Ｃａｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，請求項１～１３の何れかの核酸分子。
  15. 　該Ｃａｐ蛋白質が，ＶＰ１を含むものである，請求項１４の核酸分子。
  16. 　該第１の遺伝子発現制御部位が，該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物によって制御されるものである，請求項２～１５の何れかの核酸分子。
  17. 　該第１の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのＰ５プロモーターである，請求項１６の核酸分子。
  18. 　該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノウイルスのＶＡ１　ＲＮＡ又はその機能的等価物によって制御されるものである，請求項２～１７の何れかの核酸分子。
  19. 　該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのＰ４０プロモーターである，請求項１８の核酸分子。
  20. 　該ＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１からなる群から選択されるものである，請求項１～１９の何れかの核酸分子。
  21. 　　該ＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が２である，請求項１～１９の何れかの核酸分子。
  22. 　該外来の蛋白質をコードするための塩基配列が，マルチクローニングサイトを含むものである，請求項１～２１の何れかの核酸分子。
  23. 　該アデノウイルスの血清型が，２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，及びブタＡｄ３型からなる群から選択されるものである，
    　請求項１～２２の何れかの核酸分子。
  24. 　該アデノウイルスのＥ２Ａ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，請求項１～２３の何れかの核酸分子。
  25. 　該アデノウイルスのＥ４領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病からなる群から選択される何れかに由来するものである，請求項１～２４の何れかの核酸分子。
  26. 　該アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，請求項１～２５の何れかの核酸分子。
  27. 　該アデノウイルスのＥ２Ａ領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，請求項２～２６の何れかの核酸分子。
  28. 　該アデノウイルスのＥ４領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，請求項２～２７の何れかの核酸分子。
  29. 　該薬剤耐性遺伝子が，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤への耐性を，原核細胞に付与するものである，請求項９～２８の何れかの核酸分子。
  30. 　該第３の遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，β-アクチンプロモーター，配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーター，及び配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーターの下流に配列番号３９で示される塩基配列を含むもの，からなる群から選択されるものである，
    　請求項２～２９の何れかの核酸分子。
  31. 　該エンハンサー機能を有する塩基配列が，アデノ随伴ウイルスのＰ５プロモーター又はその機能的等価物である，請求項１１～３０の何れかの核酸分子。
  32. 　該外来の蛋白質がヒトのものである，請求項１～３１の何れかの核酸分子。
  33. 　該外来の蛋白質が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものである，請求項１～３１の何れかの核酸分子。
  34. 　該外来の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストからなる群から選択されるものである，
    　請求項１～３２の何れかの核酸分子。
  35. 　該外来の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，
    　請求項１～３２の何れかの核酸分子。
  36. 　該外来の蛋白質が，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，抗ＴＮＦ-α抗体，及び血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有する抗体からなる群から選択されるものである，請求項１～３３の何れかの核酸分子。
  37. 　該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，請求項３６の核酸分子。
  38. 　該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，
    　該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び
    　該他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素からなる群から選択されるものである，
    　請求項１～３１の何れかの核酸分子。
  39. 　該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，
    　該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び
    　他の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ　Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，
    　請求項１～３１の何れかの核酸分子。
  40. 　該他の蛋白質が，ヒトのものである，請求項３８又は３９の核酸分子。
  41. 　該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有するものである，
    　請求項３８～４０の何れかの核酸分子。
  42. 　該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，請求項４１の核酸分子。
  43. 　環状プラスミドである，請求項１～４２の何れかの核酸分子。
  44. 　請求項１～４３の何れかの核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む，組換えＡＡＶ粒子の製造方法。
  45. 　該宿主細胞のゲノムが，アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域を含む塩基配列を含むものである，請求項４４の製造法。
  46. 　該宿主細胞が，ＨＥＫ２９３細胞である，請求項４５の製造法。
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