KR20230026985A - 폐 전달을 위한 아데노-관련 변이체, 제제 및 방법 - Google Patents

폐 전달을 위한 아데노-관련 변이체, 제제 및 방법 Download PDF

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멜리사 칼튼
조니 곤잘레스
록산느 크로즈
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4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨.
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Abstract

본 개시 내용은 폐 세포에 향성(tropism)을 부여하는 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 변이체 AAV를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 및 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 폐 장애의 치료를 위해 이종성 핵산을 폐 세포로 전달하는 데 있어서의 이들의 용도를 제공한다.

Description

폐 전달을 위한 아데노-관련 변이체, 제제 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 27일에 출원된 미국 가특허출원 제63/016,246호 및 2020년 10월 6일에 출원된 미국 가특허출원 제63/088,432호의 우선권을 주장하며, 이들의 전체 개시 내용은 참고로 본원에 포함된다.
EFS-WEB을 통한 서열 목록 제출
약 186KB의 파일 크기로 2021년 4월 26일경에 생성된 "090400-5013-WO-Sequence-Listing"이라는 제목의 컴퓨터 판독 가능 텍스트 파일에는 이 출원에 대한 서열 목록이 포함되어 있으며, 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
발명의 배경
아데노-관련 바이러스(AAV)를 기반으로 하는 유전자 전달 벡터는 전임상 질병 모델 및 최근에 여러 질병 표적에 대한 인간 임상 시험 모두에서 가능성을 입증했다. AAV를 기반으로 하는 벡터는 야생형 AAV가 비병원성이며 알려진 질병과의 병인학적 연관성이 없기 때문에 매우 안전하다. 또한 AAV는 간, 근육, 폐, 망막 및 뇌를 포함한 수많은 조직에서 고효율 유전자 전달 및 지속적인 이식유전자 발현에 대한 성능을 제공한다.
AAV는 2개의 오픈 리딩 프레임, rep 및 cap을 함유하는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 첫 번째 유전자는 게놈 복제에 필요한 4개의 단백질(Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 인코드하고, 두 번째 유전자는, 조립되어 바이러스 캡시드를 형성하는 3개의 구조 단백질(VP1-3)을 발현한다. 이름에서 알 수 있듯이, AAV는 활성 복제를 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 헬퍼(helper) 바이러스의 존재에 의존한다. 헬퍼가 없으면 게놈이 에피솜으로 유지되거나 숙주 염색체에 통합되는 잠복 상태를 설정한다. 여러 상동 영장류 AAV 혈청형 및 수많은 비인간 영장류 혈청형이 확인되었다. AAV2는 유전자 전달 비히클로서 가장 잘 특징지어진다.
2010년 현재, AAV를 유전자 전달 비히클로서 사용한 75건의 진행중인 임상 시험이 있었다. 그러나, 인간 집단 내의 수많은 AAV 변이체 및 혈청형에 대한 광범위한 노출로 인해 항-캡시드 중화 항체의 높은 유병률은 AAV 유전자 요법의 효능을 감소시킨다. 이러한 기존 면역과 벡터 투여로 인한 면역의 후속 발달은 AAV 유전자 요법의 광범위한 구현을 방해할 수 있다. 예를 들어, 현재까지 AAV는 면역 특권 여역으로의 전달과 관련된 임상 연구에서 가장 성공적이었다.
최근 분석에 따르면 인간에서 항-AAV IgG 항체의 유병률은 AAV2(72%) 및 AAV1(67%)에 대해 가장 높았지만, AAV9(47%), AAV6(46%), AAV5(40%), 및 AAV8(38%) 항체도 연구된 집단의 많은 부분에 존재했다. 여러 연구에 따르면 유전자 치료 중 AAV 캡시드에 대한 체액성 면역은 전달되는 rAAV 입자의 양을 낮추어 예방할 수 있다. 불행하게도, 낮은 벡터 용량의 투여는 낮은 형질도입을 초래하고 따라서 낮은 치료 유전자 발현을 초래한다.
항-AAV 항체에 의한 중화에 내성인 신규한 AAV 변이체의 개발이 당업계에 필요하다.
발명의 요약
일부 실시 양태에서, (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 5'에서 3'으로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) 프로모터 (c) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(CFTR) 단백질 또는 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 말단 반복부를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)를 본원에 제공한다.
관련 실시 양태에서, 인간 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 천연 인간 CFTR 단백질을 인코딩하고 하기 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다:
ATGCAGAGGTCGCCTCTGGAAAAGGCCAGCGTTGTCTCCAAACTTTTTTTCAGCTGGACCAGACCAATTTTGAGGAAAGGATACAGACAGCGCCTGGAATTGTCAGACATATACCAAATCCCTTCTGTTGATTCTGCTGACAATCTATCTGAAAAATTGGAAAGAGAATGGGATAGAGAGCTGGCTTCAAAGAAAAATCCTAAACTCATTAATGCCCTTCGGCGATGTTTTTTCTGGAGATTTATGTTCTATGGAATCTTTTTATATTTAGGGGAAGTCACCAAAGCAGTACAGCCTCTCTTACTGGGAAGAATCATAGCTTCCTATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGCTCTATCGCGATTTATCTAGGCATAGGCTTATGCCTTCTCTTTATTGTGAGGACACTGCTCCTACACCCAGCCATTTTTGGCCTTCATCACATTGGAATGCAGATGAGAATAGCTATGTTTAGTTTGATTTATAAGAAGACTTTAAAGCTGTCAAGCCGTGTTCTAGATAAAATAAGTATTGGACAACTTGTTAGTCTCCTTTCCAACAACCTGAACAAATTTGATGAAGGACTTGCATTGGCACATTTCGTGTGGATCGCTCCTTTGCAAGTGGCACTCCTCATGGGGCTAATCTGGGAGTTGTTACAGGCGTCTGCCTTCTGTGGACTTGGTTTCCTGATAGTCCTTGCCCTTTTTCAGGCTGGGCTAGGGAGAATGATGATGAAGTACAGAGATCAGAGAGCTGGGAAGATCAGTGAAAGACTTGTGATTACCTCAGAAATGATTGAAAATATCCAATCTGTTAAGGCATACTGCTGGGAAGAAGCAATGGAAAAAATGATTGAAAACTTAAGACAAACAGAACTGAAACTGACTCGGAAGGCAGCCTATGTGAGATACTTCAATAGCTCAGCCTTCTTCTTCTCAGGGTTCTTTGTGGTGTTTTTATCTGTGCTTCCCTATGCACTAATCAAAGGAATCATCCTCCGGAAAATATTCACCACCATCTCATTCTGCATTGTTCTGCGCATGGCGGTCACTCGGCAATTTCCCTGGGCTGTACAAACATGGTATGACTCTCTTGGAGCAATAAACAAAATACAGGATTTCTTACAAAAGCAAGAATATAAGACATTGGAATATAACTTAACGACTACAGAAGTAGTGATGGAGAATGTAACAGCCTTCTGGGAGGAGGGATTTGGGGAATTATTTGAGAAAGCAAAACAAAACAATAACAATAGAAAAACTTCTAATGGTGATGACAGCCTCTTCTTCAGTAATTTCTCACTTCTTGGTACTCCTGTCCTGAAAGATATTAATTTCAAGATAGAAAGAGGACAGTTGTTGGCGGTTGCTGGATCCACTGGAGCAGGCAAGACTTCACTTCTAATGGTGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAGCATGCCAACTAGAAGAGGACATCTCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAATCACACTGAGTGGAGGTCAACGAGCAAGAATTTCTTTAGCAAGAGCAGTATACAAAGATGCTGATTTGTATTTATTAGACTCTCCTTTTGGATACCTAGATGTTTTAACAGAAAAAGAAATATTTGAAAGCTGTGTCTGTAAACTGATGGCTAACAAAACTAGGATTTTGGTCACTTCTAAAATGGAACATTTAAAGAAAGCTGACAAAATATTAATTTTGCATGAAGGTAGCAGCTATTTTTATGGGACATTTTCAGAACTCCAAAATCTACAGCCAGACTTTAGCTCAAAACTCATGGGATGTGATTCTTTCGACCAATTTAGTGCAGAAAGAAGAAATTCAATCCTAACTGAGACCTTACACCGTTTCTCATTAGAAGGAGATGCTCCTGTCTCCTGGACAGAAACAAAAAAACAATCTTTTAAACAGACTGGAGAGTTTGGGGAAAAAAGGAAGAATTCTATTCTCAATCCAATCAACTCTATACGAAAATTTTCCATTGTGCAAAAGACTCCCTTACAAATGAATGGCATCGAAGAGGATTCTGATGAGCCTTTAGAGAGAAGGCTGTCCTTAGTACCAGATTCTGAGCAGGGAGAGGCGATACTGCCTCGCATCAGCGTGATCAGCACTGGCCCCACGCTTCAGGCACGAAGGAGGCAGTCTGTCCTGAACCTGATGACACACTCAGTTAACCAAGGTCAGAACATTCACCGAAAGACAACAGCATCCACACGAAAAGTGTCACTGGCCCCTCAGGCAAACTTGACTGAACTGGATATATATTCAAGAAGGTTATCTCAAGAAACTGGCTTGGAAATAAGTGAAGAAATTAACGAAGAAGACTTAAAGGAGTGCTTTTTTGATGATATGGAGAGCATACCAGCAGTGACTACATGGAACACATACCTTCGATATATTACTGTCCACAAGAGCTTAATTTTTGTGCTAATTTGGTGCTTAGTAATTTTTCTGGCAGAGGTGGCTGCTTCTTTGGTTGTGCTGTGGCTCCTTGGAAACACTCCTCTTCAAGACAAAGGGAATAGTACTCATAGTAGAAATAACAGCTATGCAGTGATTATCACCAGCACCAGTTCGTATTATGTGTTTTACATTTACGTGGGAGTAGCCGACACTTTGCTTGCTATGGGATTCTTCAGAGGTCTACCACTGGTGCATACTCTAATCACAGTGTCGAAAATTTTACACCACAAAATGTTACATTCTGTTCTTCAAGCACCTATGTCAACCCTCAACACGTTGAAAGCAGGTGGGATTCTTAATAGATTCTCCAAAGATATAGCAATTTTGGATGACCTTCTGCCTCTTACCATATTTGACTTCATCCAGTTGTTATTAATTGTGATTGGAGCTATAGCAGTTGTCGCAGTTTTACAACCCTACATCTTTGTTGCAACAGTGCCAGTGATAGTGGCTTTTATTATGTTGAGAGCATATTTCCTCCAAACCTCACAGCAACTCAAACAACTGGAATCTGAAGGCAGGAGTCCAATTTTCACTCATCTTGTTACAAGCTTAAAAGGACTATGGACACTTCGTGCCTTCGGACGGCAGCCTTACTTTGAAACTCTGTTCCACAAAGCTCTGAATTTACATACTGCCAACTGGTTCTTGTACCTGTCAACACTGCGCTGGTTCCAAATGAGAATAGAAATGATTTTTGTCATCTTCTTCATTGCTGTTACCTTCATTTCCATTTTAACAACAGGAGAAGGAGAAGGAAGAGTTGGTATTATCCTGACTTTAGCCATGAATATCATGAGTACATTGCAGTGGGCTGTAAACTCCAGCATAGATGTGGATAGCTTGATGCGATCTGTGAGCCGAGTCTTTAAGTTCATTGACATGCCAACAGAAGGTAAACCTACCAAGTCAACCAAACCATACAAGAATGGCCAACTCTCGAAAGTTATGATTATTGAGAATTCACACGTGAAGAAAGATGACATCTGGCCCTCAGGGGGCCAAATGACTGTCAAAGATCTCACAGCAAAATACACAGAAGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACATTTCCTTCTCAATAAGTCCTGGCCAGAGGGTGGGCCTCTTGGGAAGAACTGGATCAGGGAAGAGTACTTTGTTATCAGCTTTTTTGAGACTACTGAACACTGAAGGAGAAATCCAGATCGATGGTGTGTCTTGGGATTCAATAACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGGAGTGATACCACAGAAAGTATTTATTTTTTCTGGAACATTTAGAAAAAACTTGGATCCCTATGAACAGTGGAGTGATCAAGAAATATGGAAAGTTGCAGATGAGGTTGGGCTCAGATCTGTGATAGAACAGTTTCCTGGGAAGCTTGACTTTGTCCTTGTGGATGGGGGCTGTGTCCTAAGCCATGGCCACAAGCAGTTGATGTGCTTGGCTAGATCTGTTCTCAGTAAGGCGAAGATCTTGCTGCTTGATGAACCCAGTGCTCATTTGGATCCAGTAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACAAGCATTTGCTGATTGCACAGTAATTCTCTGTGAACACAGGATAGAAGCAATGCTGGAATGCCAACAATTTTTGGTCATAGAAGAGAACAAAGTGCGGCAGTACGATTCCATCCAGAAACTGCTGAACGAGAGGAGCCTCTTCCGGCAAGCCATCAGCCCCTCCGACAGGGTGAAGCTCTTTCCCCACCGGAACTCAAGCAAGTGCAAGTCTAAGCCCCAGATTGCTGCTCTGAAAGAGGAGACAGAAGAAGAGGTGCAAGATACAAGGCTTTAG(서열 식별 번호 42).
바람직한 실시 양태에서, 인간 CFTR 또는 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다:
ATGCAGCGCAGCCCACTGGAGAAGGCAAGCGTGGTGTCCAAGCTGTTCTTTTCCTGGACCAGGCCTATCCTGAGGAAGGGATACAGGCAGCGGCTGGAGCTGAGCGACATCTATCAGATCCCTTCTGTGGACAGCGCCGATAATCTGTCCGAGAAGCTGGAGAGAGAGTGGGATAGGGAGCTGGCCTCTAAGAAGAACCCAAAGCTGATCAATGCCCTGCGGAGATGCTTCTTTTGGCGGTTCATGTTCTACGGCATCTTCCTGTATCTGGGCGAGGTGACCAAGGCCGTGCAGCCACTGCTGCTGGGCAGAATCATCGCCTCTTACGACCCCGATAACAAGGAGGAGAGGAGCATCGCCATCTATCTGGGCATCGGCCTGTGCCTGCTGTTTATCGTGAGGACACTGCTGCTGCACCCAGCCATCTTCGGCCTGCACCACATCGGCATGCAGATGAGAATCGCCATGTTCAGCCTGATCTACAAGAAGACCCTGAAGCTGAGCTCCAGGGTGCTGGACAAGATCTCCATCGGCCAGCTGGTGTCCCTGCTGTCTAACAATCTGAACAAGTTTGATGAGGGACTGGCCCTGGCACACTTCGTGTGGATCGCACCACTGCAGGTGGCCCTGCTGATGGGCCTGATCTGGGAGCTGCTGCAGGCAAGCGCCTTTTGCGGACTGGGCTTCCTGATCGTGCTGGCCCTGTTCCAGGCAGGACTGGGACGCATGATGATGAAGTACAGAGACCAGAGGGCCGGCAAGATCTCTGAGCGGCTGGTCATCACCAGCGAGATGATCGAGAACATCCAGTCCGTGAAGGCCTATTGTTGGGAGGAGGCCATGGAGAAGATGATCGAGAATCTGCGCCAGACAGAGCTGAAGCTGACCAGAAAGGCCGCCTACGTGAGGTACTTCAACTCTAGCGCCTTCTTTTTCTCTGGCTTTTTCGTGGTGTTCCTGAGCGTGCTGCCATACGCCCTGATCAAGGGCATCATCCTGCGGAAGATCTTTACCACAATCTCCTTCTGCATCGTGCTGAGAATGGCCGTGACAAGGCAGTTTCCCTGGGCCGTGCAGACCTGGTATGACTCTCTGGGCGCCATCAATAAGATCCAGGATTTCCTGCAGAAGCAGGAGTACAAGACACTGGAGTATAACCTGACCACAACCGAGGTGGTCATGGAGAATGTGACCGCCTTCTGGGAGGAGGGCTTTGGCGAGCTGTTCGAGAAGGCCAAGCAGAACAATAACAATCGCAAGACATCTAACGGCGACGATAGCCTGTTTTTCAGCAATTTTTCCCTGCTGGGCACCCCCGTGCTGAAGGACATCAACTTCAAGATCGAGAGGGGACAGCTGCTGGCAGTGGCAGGCTCCACAGGCGCCGGCAAGACCTCTCTGCTGATGATGATCATGGGCGAGCTGGAGCCAAGCGAGGGCAAGATCAAGCACTCCGGCCGGATCTCTTTTTGCAGCCAGTTCTCCTGGATCATGCCCGGCACCATCAAGGAGAATATCATCTTTGGCGTGTCCTACGATGAGTACAGATATAGGTCTGTGATCAAGGCCTGTCAGCTGGAGGAGGACATCAGCAAGTTCGCCGAGAAGGATAACATCGTGCTGGGCGAGGGCGGCATCACACTGAGCGGAGGACAGAGGGCAAGGATCTCCCTGGCCAGAGCCGTGTACAAGGACGCCGATCTGTATCTGCTGGACAGCCCCTTTGGCTATCTGGATGTGCTGACCGAGAAGGAGATCTTCGAGTCCTGCGTGTGCAAGCTGATGGCCAATAAGACAAGGATCCTGGTGACCTCTAAGATGGAGCACCTGAAGAAGGCCGACAAGATCCTGATCCTGCACGAGGGCTCCTCTTACTTTTATGGCACATTCAGCGAGCTGCAGAATCTGCAGCCTGACTTCAGCTCCAAGCTGATGGGCTGTGACTCCTTTGATCAGTTCTCTGCCGAGAGGCGCAACTCCATCCTGACAGAGACCCTGCACAGATTCTCTCTGGAGGGCGACGCACCCGTGAGCTGGACAGAGACCAAGAAGCAGTCCTTTAAGCAGACCGGCGAGTTCGGCGAGAAGAGGAAGAATTCTATCCTGAACCCTATCAATAGCACACTGCAGGCCCGGAGAAGGCAGTCTGTGCTGAACCTGATGACCCACAGCGTGAACCAGGGCCAGAATATCCACAGAAAGACAACCGCCAGCACAAGGAAGGTGTCCCTGGCACCTCAGGCAAACCTGACCGAGCTGGACATCTACTCCCGCCGGCTGTCTCAGGAGACCGGACTGGAGATCTCTGAGGAGATCAATGAGGAGGATCTGAAGGAGTGCTTTTTCGACGATATGGAGAGCATCCCAGCCGTGACAACCTGGAACACATACCTGCGCTATATCACCGTGCACAAGTCCCTGATCTTTGTGCTGATCTGGTGTCTGGTCATCTTCCTGGCAGAGGTGGCAGCATCTCTGGTGGTGCTGTGGCTGCTGGGCAACACACCCCTGCAGGACAAGGGCAATTCTACCCACAGCCGCAACAATTCCTACGCCGTGATCATCACATCTACCTCTAGCTACTACGTGTTCTACATCTATGTGGGCGTGGCCGATACACTGCTGGCCATGGGCTTTTTCCGGGGCCTGCCCCTGGTGCACACACTGATCACCGTGAGCAAGATCCTGCACCACAAGATGCTGCACAGCGTGCTGCAGGCCCCTATGTCCACACTGAACACCCTGAAGGCCGGCGGCATCCTGAATCGGTTTTCCAAGGACATCGCCATCCTGGACGATCTGCTGCCTCTGACCATCTTTGATTTCATCCAGCTGCTGCTGATCGTGATCGGAGCAATCGCAGTGGTGGCCGTGCTGCAGCCTTACATCTTCGTGGCCACAGTGCCAGTGATCGTGGCCTTTATCATGCTGCGCGCCTATTTCCTGCAGACCAGCCAGCAGCTGAAGCAGCTGGAGAGCGAGGGCCGGTCCCCTATCTTTACACACCTGGTGACCTCCCTGAAGGGACTGTGGACACTGAGGGCCTTCGGCCGGCAGCCATACTTTGAGACCCTGTTCCACAAGGCCCTGAACCTGCACACAGCCAATTGGTTTCTGTATCTGAGCACCCTGCGCTGGTTTCAGATGCGGATCGAGATGATCTTCGTGATCTTTTTCATCGCCGTGACCTTCATCTCCATCCTGACAACCGGAGAGGGAGAGGGAAGAGTGGGAATCATCCTGACACTGGCCATGAACATCATGTCTACCCTGCAGTGGGCCGTGAATTCCTCTATCGACGTGGATAGCCTGATGAGATCTGTGAGCAGGGTGTTTAAGTTCATCGACATGCCCACAGAGGGCAAGCCTACAAAGAGCACCAAGCCATACAAGAACGGCCAGCTGTCCAAAGTGATGATCATCGAGAATTCTCACGTGAAGAAGGACGATATCTGGCCATCCGG(서열 식별 번호 43)
서열 식별 번호 43은 인간에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이고 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 인간 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시 양태에서, 서열 식별 번호 43의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하며, 임의로 뉴클레오타이드 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는, 분리된(isolated) 핵산이 본원에 제공된다. 또한, 서열 식별 번호 43의 핵산 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 플라스미드 및 벡터, 및 이러한 플라스미드 및 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또한, 서열 식별 번호 43의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하며, 임의로 뉴클레오타이드 서열이 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 핵산의 용도, 본원에 기재된 바와 같은 낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환의 치료를 위한 용도, 또는 낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환의 치료를 위한 의약 제조에 사용하기 위한 용도가 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 임의로 절단된 사이토메갈로바이러스 전/초기(cytomegalovirus immediate/early)(CMVie) 인핸서/프로모터이고 인간 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
다른 양태에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이며, 바람직하게는 프로모터가 폐 세포에서 핵산의 우선적 발현을 지시하고 인간 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
바람직한 실시 양태에서, 프로모터는 절단된 CMVie 프로모터이고 인간 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, CMVie 프로모터는 하기 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는 CMV173이다:
ACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGT(서열 식별 번호 44)
특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV 벡터는 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 5' 내지 3'으로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) 프로모터 (c) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질 또는 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 말단 반복부를 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 5'에서 3'으로의 하기 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다:
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAATTCTCGAGTGATCGAAAGAGCCTGCTAAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGCAGCGCAGCCCACTGGAGAAGGCAAGCGTGGTGTCCAAGCTGTTCTTTTCCTGGACCAGGCCTATCCTGAGGAAGGGATACAGGCAGCGGCTGGAGCTGAGCGACATCTATCAGATCCCTTCTGTGGACAGCGCCGATAATCTGTCCGAGAAGCTGGAGAGAGAGTGGGATAGGGAGCTGGCCTCTAAGAAGAACCCAAAGCTGATCAATGCCCTGCGGAGATGCTTCTTTTGGCGGTTCATGTTCTACGGCATCTTCCTGTATCTGGGCGAGGTGACCAAGGCCGTGCAGCCACTGCTGCTGGGCAGAATCATCGCCTCTTACGACCCCGATAACAAGGAGGAGAGGAGCATCGCCATCTATCTGGGCATCGGCCTGTGCCTGCTGTTTATCGTGAGGACACTGCTGCTGCACCCAGCCATCTTCGGCCTGCACCACATCGGCATGCAGATGAGAATCGCCATGTTCAGCCTGATCTACAAGAAGACCCTGAAGCTGAGCTCCAGGGTGCTGGACAAGATCTCCATCGGCCAGCTGGTGTCCCTGCTGTCTAACAATCTGAACAAGTTTGATGAGGGACTGGCCCTGGCACACTTCGTGTGGATCGCACCACTGCAGGTGGCCCTGCTGATGGGCCTGATCTGGGAGCTGCTGCAGGCAAGCGCCTTTTGCGGACTGGGCTTCCTGATCGTGCTGGCCCTGTTCCAGGCAGGACTGGGACGCATGATGATGAAGTACAGAGACCAGAGGGCCGGCAAGATCTCTGAGCGGCTGGTCATCACCAGCGAGATGATCGAGAACATCCAGTCCGTGAAGGCCTATTGTTGGGAGGAGGCCATGGAGAAGATGATCGAGAATCTGCGCCAGACAGAGCTGAAGCTGACCAGAAAGGCCGCCTACGTGAGGTACTTCAACTCTAGCGCCTTCTTTTTCTCTGGCTTTTTCGTGGTGTTCCTGAGCGTGCTGCCATACGCCCTGATCAAGGGCATCATCCTGCGGAAGATCTTTACCACAATCTCCTTCTGCATCGTGCTGAGAATGGCCGTGACAAGGCAGTTTCCCTGGGCCGTGCAGACCTGGTATGACTCTCTGGGCGCCATCAATAAGATCCAGGATTTCCTGCAGAAGCAGGAGTACAAGACACTGGAGTATAACCTGACCACAACCGAGGTGGTCATGGAGAATGTGACCGCCTTCTGGGAGGAGGGCTTTGGCGAGCTGTTCGAGAAGGCCAAGCAGAACAATAACAATCGCAAGACATCTAACGGCGACGATAGCCTGTTTTTCAGCAATTTTTCCCTGCTGGGCACCCCCGTGCTGAAGGACATCAACTTCAAGATCGAGAGGGGACAGCTGCTGGCAGTGGCAGGCTCCACAGGCGCCGGCAAGACCTCTCTGCTGATGATGATCATGGGCGAGCTGGAGCCAAGCGAGGGCAAGATCAAGCACTCCGGCCGGATCTCTTTTTGCAGCCAGTTCTCCTGGATCATGCCCGGCACCATCAAGGAGAATATCATCTTTGGCGTGTCCTACGATGAGTACAGATATAGGTCTGTGATCAAGGCCTGTCAGCTGGAGGAGGACATCAGCAAGTTCGCCGAGAAGGATAACATCGTGCTGGGCGAGGGCGGCATCACACTGAGCGGAGGACAGAGGGCAAGGATCTCCCTGGCCAGAGCCGTGTACAAGGACGCCGATCTGTATCTGCTGGACAGCCCCTTTGGCTATCTGGATGTGCTGACCGAGAAGGAGATCTTCGAGTCCTGCGTGTGCAAGCTGATGGCCAATAAGACAAGGATCCTGGTGACCTCTAAGATGGAGCACCTGAAGAAGGCCGACAAGATCCTGATCCTGCACGAGGGCTCCTCTTACTTTTATGGCACATTCAGCGAGCTGCAGAATCTGCAGCCTGACTTCAGCTCCAAGCTGATGGGCTGTGACTCCTTTGATCAGTTCTCTGCCGAGAGGCGCAACTCCATCCTGACAGAGACCCTGCACAGATTCTCTCTGGAGGGCGACGCACCCGTGAGCTGGACAGAGACCAAGAAGCAGTCCTTTAAGCAGACCGGCGAGTTCGGCGAGAAGAGGAAGAATTCTATCCTGAACCCTATCAATAGCACACTGCAGGCCCGGAGAAGGCAGTCTGTGCTGAACCTGATGACCCACAGCGTGAACCAGGGCCAGAATATCCACAGAAAGACAACCGCCAGCACAAGGAAGGTGTCCCTGGCACCTCAGGCAAACCTGACCGAGCTGGACATCTACTCCCGCCGGCTGTCTCAGGAGACCGGACTGGAGATCTCTGAGGAGATCAATGAGGAGGATCTGAAGGAGTGCTTTTTCGACGATATGGAGAGCATCCCAGCCGTGACAACCTGGAACACATACCTGCGCTATATCACCGTGCACAAGTCCCTGATCTTTGTGCTGATCTGGTGTCTGGTCATCTTCCTGGCAGAGGTGGCAGCATCTCTGGTGGTGCTGTGGCTGCTGGGCAACACACCCCTGCAGGACAAGGGCAATTCTACCCACAGCCGCAACAATTCCTACGCCGTGATCATCACATCTACCTCTAGCTACTACGTGTTCTACATCTATGTGGGCGTGGCCGATACACTGCTGGCCATGGGCTTTTTCCGGGGCCTGCCCCTGGTGCACACACTGATCACCGTGAGCAAGATCCTGCACCACAAGATGCTGCACAGCGTGCTGCAGGCCCCTATGTCCACACTGAACACCCTGAAGGCCGGCGGCATCCTGAATCGGTTTTCCAAGGACATCGCCATCCTGGACGATCTGCTGCCTCTGACCATCTTTGATTTCATCCAGCTGCTGCTGATCGTGATCGGAGCAATCGCAGTGGTGGCCGTGCTGCAGCCTTACATCTTCGTGGCCACAGTGCCAGTGATCGTGGCCTTTATCATGCTGCGCGCCTATTTCCTGCAGACCAGCCAGCAGCTGAAGCAGCTGGAGAGCGAGGGCCGGTCCCCTATCTTTACACACCTGGTGACCTCCCTGAAGGGACTGTGGACACTGAGGGCCTTCGGCCGGCAGCCATACTTTGAGACCCTGTTCCACAAGGCCCTGAACCTGCACACAGCCAATTGGTTTCTGTATCTGAGCACCCTGCGCTGGTTTCAGATGCGGATCGAGATGATCTTCGTGATCTTTTTCATCGCCGTGACCTTCATCTCCATCCTGACAACCGGAGAGGGAGAGGGAAGAGTGGGAATCATCCTGACACTGGCCATGAACATCATGTCTACCCTGCAGTGGGCCGTGAATTCCTCTATCGACGTGGATAGCCTGATGAGATCTGTGAGCAGGGTGTTTAAGTTCATCGACATGCCCACAGAGGGCAAGCCTACAAAGAGCACCAAGCCATACAAGAACGGCCAGCTGTCCAAAGTGATGATCATCGAGAATTCTCACGTGAAGAAGGACGATATCTGGCCATCCGGAGGACAGATGACCGTGAAGGATCTGACAGCCAAGTATACCGAGGGCGGCAACGCCATCCTGGAGAATATCTCCTTTTCTATCAGCCCTGGACAGAGGGTGGGACTGCTGGGACGGACAGGCTCCGGCAAGTCTACCCTGCTGAGCGCCTTCCTGAGGCTGCTGAATACAGAGGGCGAGATCCAGATCGACGGCGTGAGCTGGGATTCCATCACCCTGCAGCAGTGGAGAAAGGCCTTTGGCGTGATCCCTCAGAAGGTGTTTATCTTCTCCGGCACCTTCAGGAAGAACCTGGACCCATACGAGCAGTGGTCTGATCAGGAGATCTGGAAGGTGGCCGACGAAGTGGGCCTGAGATCTGTGATCGAGCAGTTTCCAGGCAAGCTGGACTTCGTGCTGGTGGATGGAGGATGCGTGCTGAGCCACGGACACAAGCAGCTGATGTGCCTGGCCAGGTCTGTGCTGAGCAAGGCCAAGATCCTGCTGCTGGACGAGCCAAGCGCCCACCTGGATCCCGTGACATACCAGATCATCAGAAGGACCCTGAAGCAGGCCTTTGCCGATTGCACCGTGATCCTGTGCGAGCACCGCATCGAGGCCATGCTGGAGTGCCAGCAGTTCCTGGTCATCGAGGAGAACAAGGTGCGGCAGTATGACAGCATCCAGAAGCTGCTGAATGAGCGGAGCCTGTTTCGGCAGGCCATCTCCCCCTCTGATCGCGTGAAGCTGTTCCCTCACCGGAACAGCTCCAAGTGTAAGTCCAAGCCCCAGATCGCCGCCCTGAAGGAGGAGACAGAGGAGGAGGTGCAGGACACCAGACTGTGAAATAAAACATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAACAACGGCCGGCCGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA(서열 식별 번호 45)
서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 5'에서 3'으로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) 서열 식별 번호 44의 CMV173 프로모터 (c) 서열 식별 번호 43의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 인간 CFTR 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 말단 반복부를 포함한다.
또한, (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 치료적 유효량의 감염성 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 낭포성 섬유증을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 바람직한 실시 양태에서, CFTR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 식별 번호 43의 서열을 갖고/거나 프로모터는 서열 식별 번호 44의 서열을 갖고/거나 핵산은 서열 식별 번호 45의 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체는 낭포성 섬유증의 하나 이상의 특징을 개선하는 데 효과적인 양의 rAAV를 투여받고, 그의 비제한적 예는 상기도 및 하기도 염증, 비정상적인 상피 사이토카인 신호전달 및 상승된 IgE 수준을 포함한다.
다른 양태에서, 본원은 상기도 질환, 하기도 질환, 비인두 질환, 부비동염 및/또는 낭포성 섬유증과 관련된 타액 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 낭포성 섬유증과 관련된 폐 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 감염성 rAAV의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, CFTR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 식별 번호 43의 서열을 갖고/거나 프로모터는 서열 식별 번호 44의 서열을 갖고/거나 핵산은 서열 식별 번호 45의 서열을 포함한다.
서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 rAAV 유전자 요법 벡터(예를 들어, 서열 식별 번호 44의 프로모터에 임의로 연결되는 서열 식별 번호 43의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함)는 낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환의 치료를 위한 CFTR 또는 이의 일부의 치료적 유효 수준을 달성하고 유지하기 위해 다양한 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 감염성 rAAV는 낭포성 섬유증이 있는 대상체에게 하나 이상의 용량으로 투여되고, 각각의 용량은 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈(vector genome)(vg), 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1014 vg, 약 1 x 1014 내지 약 1 x 1015 vg, 또는 약 1 x 1015 내지 약 5 x 1015 vg를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 각각의 용량은 약 1 x 1014 vg 또는 약 1 x 1015 vg의 rAAV를 포함한다.
일부 양태에서, 치료는 대상체에 대한 단일 용량 투여 이하를 포함하고 CFTR 또는 그의 생물학적 활성 부분의 지속적이고 유지된 치료 농도를 달성하는 데 효과적이다. 관련 양태에서, 치료는 낭포성 섬유증이 있는 인간에 대한 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 서열 식별 번호 45의 핵산을 포함하는 rAAV의 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1015 플라크 형성 단위(plaque forming unit)(pfu), 바이러스 입자(virus particle)(vp) 또는 바이러스 게놈(virus genomes)(vg)의 흡입에 의한 단일 용량 투여 이하를 포함한다. 다른 양태에서, 용량 치료는 다중 용량 일정일 수 있다.
인간에 대한 AAV 벡터의 투여에 관한 방법은 이전에 Kay et al. (2000, Nat Genet 24:257-261)에 의해 기술되었으며, 그 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 감염성 rAAV는 폐, 기관지내(endobronchial), 비강내, 기관내 및/또는 기관지내(intrabronchial) 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 감염성 rAAV는 분무기를 사용하여 투여된다.
관련 양태에서, (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 낭포성 섬유증의 치료에 사용하거나 낭포성 섬유증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 감염성 rAAV가 본원에 제공된다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 인간 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 식별 번호 43의 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고, 서열 식별 번호 44의 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다.
다른 실시 양태에서, (i) (a) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (b) 하나 이상의 유전자 산물(들)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 감염성 rAAV 및 (ii) 약 10mM 내지 약 50mM 시트르산염(citrate), 약 70mM 내지 약 150mM NaCl 및 임의로 계면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Pluronic F- 68, 보다 바람직하게는 약 0.005% Pluronic F68를 포함하는 완충액을 포함하고, 5 내지 7의 pH, 바람직하게는 약 6.0의 pH를 갖는 흡입에 적합한 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 바람직한 양태에서, 약학적 조성물은 약 20mM 내지 약 50mM 시트르산염, 약 85mM 내지 약 125mM NaCl 및 약 0.005% Pluronic F68을 포함하고 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 특히 바람직한 양태에서, 약학적 조성물은 약 20mM 시트르산염, 약 125mM NaCl 및 약 0.005% Pluronic F68을 포함하고 약 6.0의 pH를 갖는다. 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (b) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 포함하는 rAAV를 포함한다. 관련된 실시 양태에서, rAAV는 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 약학적 조성물은 ml당 1011 내지 1014 벡터 게놈(vg)을 포함한다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 약 1 x 1013 내지 약 9 x 1013 vg/ml, 바람직하게는 약 2 x 1013 내지 6 x 1013 vg/ml를 포함한다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 약 1 x 1013 vg/ml, 약 2 x 1013 vg/ml, 약 3 x 1013 vg/ml, 약 4 x 1013 vg/ml, 약 5 x 1013 vg/ml, 약 6 x 1013 vg/ml, 약 7 x 1013 vg/ml, 약 8 x 1013 vg/ml, 또는 약 9 x 1013 vg/ml를 포함한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 약 2 x 1013 vg/ml 내지 약 5 x 1013 vg/ml를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 약학적 조성물은 에어로졸화된 전달에 적합한 액체/현탁액으로서 제제화된다. 관련 실시 양태에서, 약학적 조성물은 에어로졸로서 제제화되고/되거나 흡입 투여 형태이다.
또한 폐 세포를 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 비리온과 접촉시키는 것을 포함하는 폐 세포에 이종성 핵산을 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 이종성 핵산은 단백질 및/또는 짧은 간섭 RNA를 인코딩한다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 폐 세포는 폐 또는 기관의 임의의 세포이다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 폐 세포는 폐포 상피 세포, 기관지(1차, 2차 또는 3차) 상피 세포 또는 기관 상피 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 기도 상피 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 폐 세포는 섬모 기도 상피 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 폐 세포는 폐포 상피 유형 1(lung alveolar epithelial type 1)(AECI) 또는 유형 2(lung alveolar epithelial type 2)(AECII) 세포이다. 다른 실시 양태에서, 폐 세포는 평활근 또는 내피 세포이다. 다른 실시 양태에서, 폐 세포는 기저 세포, 배상 세포 또는 난모세포이다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다.
또한 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 비리온을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 폐에 이종성 핵산을 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 이종성 핵산은 단백질 및/또는 짧은 간섭 RNA를 인코딩한다. 관련 실시 양태에서, (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 비리온을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 상기도, 비인두, 부비동, 입/협측 부위 및/또는 침샘에 이종성 핵산을 전달하는 방법이 제공된다. 관련 양태에서, rAAV 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 폐, 기관지내, 비강내, 기관내 및/또는 기관지내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다.
또한 폐 질환의 치료가 필요한 대상체에게 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 치료적 유효량의 재조합 AAV(rAAV)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이종성 핵산은 다중 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이 경우 다중(예를 들어, 2) 유전자 산물의 발현은 다중(예를 들어, 2) 독립적인 프로모터에 의해 매개될 수 있거나 단일 프로모터에 의해 매개될 수 있으며, 다중 이식유전자가 내부 리보솜 진입 부위( internal ribosome entry site)(IRES) 또는 2A 펩타이드 서열에 의해 분리된다. 바람직한 실시 양태에서, 이종성 핵산은 치료적 단백질 및/또는 치료적 짧은 간섭 RNA를 인코딩한다. 관련 양태에서, rAAV에 의해 전달된 유전자 산물(들)은 장애(hindering) 유전자 산물의 수준을 감소시키고/시키거나 지지 유전자 산물의 수준을 도입하거나 보충한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 다른 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 알파-1-항트립신(antitrypsin)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 폐 질환은 폐동맥고혈압, 폐고혈압, 폐암(원발성, 속발성 및 전이성), 계면활성제 결핍, 바이러스성 및/또는 세균 감염, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 급성 기관지염, 폐렴(바이러스성, 세균성 및 진균성 폐렴 포함), 호흡기 감염(인두염, 크루프(croup), 아스페르길루스(aspergillus), 콕시듐 균증(coocidiomycosis), 한타바이러스 폐 증후군 및 히스토플라스마증(histoplasmosis) 포함), 화학 및 과민성 폐렴, 결핵 및 기타 마이코박테리아 감염(마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium)을 포함하되 이에 국한되지 않음), 사르코이드증(sarcoidosis), 호흡기 세포융합 바이러스, 폐부종, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)(ARDS), 진폐증(검은 폐 질환, 석면폐 및 규폐증 포함), 간질성 폐 질환(유육종증 및 자가면역질환 포함), 폐색전증, 흉막삼출, 흉막염, 중피종, 기흉, 급성 기관지염, 세기관지염(폐쇄성 세기관지염 포함), 영아 돌연사 증후군, 수면 무호흡증, 기관지 확장증, 기관지폐 이형성증, 잠복성 조직 폐렴, 전자 담배 또는 전자담배 사용 관련 폐 손상(E-cigarette or vaping use associated lung injury)(EVALI), 중동 호흡기 증후군(Middle Eastern Respiratory Syndrome)(MERS), 원발성 모양체 운동 이상증(primary ciliary dyskinesia), 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome)(SARS), 알파-1-항트립신(antitrypsin) 결핍증, 천식, 간질성 폐 질환 및 COVID-19(코로나바이러스 질병 2019)로부터 선택된다. 다른 양태에서, 폐 질환은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)이다. 관련 양태에서, (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 하나 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 치료적 유효량의 재조합 AAV(rAAV) 또는 rAAV를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 COVID-19를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 유전자 산물(들)은 폐 또는 비인두에서 바이러스 병원성 또는 복제를 감소 또는 제거하고/하거나 바이러스의 에피토프(epitope)에 대한 중화 항체를 발현하는 바이러스 유전자 산물 또는 숙주 세포 유전자를 녹다운(knok-down), 변형 및/또는 과발현한다.
일부 양태에서, IPF의 치료를 위해 표적화될 수 있는 유전자는 SFTPA1(계면활성제 A1) 및 카베올린(Caveolin)-1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. COPD 치료를 위해 표적화될 수 있는 유전자는 알파-1-안티트립신(antitrypsin), 알파-1-안티키모트립신(antitrypsin), 알파-1-마크로글로불린(macroglobulin), 매트릭스 메탈로프로테이나제 1(matrix metalloproteinase 1)(MMP1), 매트릭스 메탈로프로테이나제 12(matrix metalloproteinase 12)(MMP12), 마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소(microsomal epoxide hydrolyase), CYP1A1, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase), 헴 옥시게나제(heme oxygenase)-1, TGF-베타-1, TNF-알파, IL-1 복합체, IL-8, IL-13, 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA-B7 및 Bw16), 비타민 D 결합 단백질 및 베타-2-아드레날린성 수용체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
관련 양태에서, rAAV 또는 약학적 조성물은 폐, 기관지내, 비강내, 기관내 및/또는 기관지내 투여에 의해 투여되어 이를 필요로 하는 대상체에서 폐 질환을 치료한다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 감염성 rAAV는 분무기를 사용하여 투여된다.
다른 양태에서, rAAV의 약 1012 내지 1014 벡터 게놈(vg)/kg의 적어도 1회 용량이 폐 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 관련 양태에서, 대상체는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 vg/kg, 약 1 x 1012 내지 약 9 x 1013 vg/kg, 약 1 x 1012 vg/kg 내지 약 9 x 1012 vg/kg, 바람직하게는 약 2 x 1012 vg/kg 내지 약 3 x 1012 vg/kg, 더욱 바람직하게는 약 2.6 x 1012 vg/kg, 약 2.7 x 1012 vg/kg, 약 2.8 x 1012 vg/kg, 약 2.9 x 1012 vg/kg 약 3.0 x 1012 vg/kg 또는 약 3.1 x 1012 vg/kg을 투여 받는다. 바람직한 실시 양태에서, 대상체는 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈(vg), 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1014 vg, 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1014 vg를 포함하는 하나 이상의 투여량으로 1회 이상의 용량을 투여받는다. 1 x 1014 및 약 1 x 1015 vg, 또는 약 1 x 1015 내지 약 5 x 1015 vg의 rAAV. 일부 바람직한 양태에서, 각각의 투여량은 약 1 x 1014 vg 또는 약 1 x 1015 vg의 rAAV를 포함한다.
본 개시 내용은 변이체 캡시드 단백질 및 이종성 핵산을 포함하는 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 감염성 rAAV 비리온에 부여하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(및/또는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산)을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 감염성 rAAV 비리온 및/또는 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 상기 비리온, 캡시드 단백질, 핵산, 및/또는 숙주 세포의 라이브러리를 추가로 제공하고; 여기서 라이브러리의 적어도 하나의 구성원의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용은 표적 세포가 대상 감염성 rAAV 비리온과 접촉되는 표적 세포에 이종성 핵산을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 유전자 산물을 개체에게 전달하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 대상 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함한다. 또한 대상 방법을 실행하기 위한 조성물 및 키트를 본원에 제공한다.
본 개시 내용의 특징은 (a) 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질; 및 (b) 이종성 핵산을 포함하는 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 (a) 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 식별 번호 2에 대해 아미노산 치환 N312K, N449D, D472N, N551S, 1698V, 및 L735Q를 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 및 (b) 이종성 핵산을 포함하는 감염성 재조합 변이체 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, rAAV는 AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 일부 경우에, rAAV는 AAV2에 의해 나타나는 내성보다 인간 AAV 중화 항체에 대해 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 30배 등) 더 큰 내성을 나타낸다. 일부 경우에, rAAV는 야생형 AAV 혈청형 2(AAV2)에 의해 나타나는 포유동물 세포의 형질도입과 비교하여 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 경우에, 포유동물 세포는 간 세포, 췌장 세포, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 활액 관절 세포, 폐 세포, T 세포, 뉴런, 신경교 세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈줄기세포, 조혈전구세포, 신경줄기세포, 신경전구세포, 신경제(neural crest)줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)(iPS cell), 간엽줄기세포, 중배엽줄기세포, 간줄기세포, 췌장줄기세포, 췌장전구세포, 근육 줄기세포, 망막 줄기세포 등), 내피 세포 또는 암 세포이다. 일부 경우에, 이종성 핵산은 RNA 간섭제를 포함한다. 일부 경우에, 이종성 핵산은 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 식별 번호 2에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, D472N, N551S, I698V, 및 L735Q를 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포함한다.
일부 경우에, 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질(분리된 핵산에 의해 인코딩됨)은 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온에게 AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 부여한다. 일부 경우에, 증가된 내성은 AAV2에 의해 나타나는 내성보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 30배 등)이다. 일부 경우에, 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질(분리된 핵산에 의해 인코딩됨)은 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온에 AAV2에 의해 나타나는 형질도입과 비교하여 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입을 부여한다.
본 개시 내용의 특징은 상기 기재된 바와 같은 대상 핵산을 포함하는 분리된 숙주 세포를 포함한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 핵산으로 안정적으로 형질감염된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 AAV rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 재조합 AAV 벡터를 추가로 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 표적 세포를 대상 비리온(상기 기재됨)과 접촉시키는 것을 포함하는, 이종성 핵산을 표적 세포에 전달하는 방법을 포함한다. 일부 경우에, 표적 세포는 간 세포, 췌장 세포, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 활액 관절 세포, 폐 세포, T 세포, 뉴런, 신경교 세포, 줄기세포(예를들어, 조혈 줄기세포, 조혈 전구 세포, 신경 줄기세포, 신경 전구 세포, 신경제 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPS 세포), 간엽줄기세포, 중배엽줄기세포, 간줄기세포, 췌장줄기세포, 췌장전구세포, 근육줄기세포, 또는 망막줄기세포 등), 내피세포 또는 암세포를 포함한다. 어떤 경우에는 표적 세포가 시험관 내(in vitro)에 있다. 어떤 경우에는 표적 세포가 생체 내(in vivo)이다.
본 개시 내용의 특징은 유전자 산물을 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법을 포함하며, 이 방법은 개체에게 유효량의 대상 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온(상기 기재됨)을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, rAAV 비리온의 이종성 핵산은 RNA 간섭제를 포함한다. 일부 경우에, rAAV 비리온의 이종성 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 감염성 rAAV 비리온의 간접적인 전달을 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 감염성 rAAV 비리온의 직접 전달을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 11-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 포함하며, 서열 식별 번호 2에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, D472N, N551S, 1698V, 및 L735Q를 포함하는 변이체 아데노-관련 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온에 부여한다. 일부 경우에, 증가된 내성은 AAV2에 의해 나타나는 내성보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 30배 등)이다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온에 AAV2에 의해 나타나는 형질도입과 비교하여 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입을 부여한다.
본 개시 내용의 특징은 (i) 각각 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 및 이종성 핵산을 포함하는 둘 이상의 감염성 rAAV 비리온; (ii) 각각 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개 이상의 분리된 핵산; (iii) 각각 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 둘 이상의 숙주 세포; 및 (iv) 둘 이상의 변이체 AAV 캡시드 단백질; 중 적어도 하나를 포함하는 라이브러리를 포함하며, 여기서 라이브러리의 적어도 하나의 구성원의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 스타터(starter) 캡시드 단백질을 포함하는 스타터(모(parent)) 비리온에 비해 감염의 변경된 특성을 나타내는 변형된 감염성 rAAV 비리온을 생성 및 식별하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 (a) 스타터 캡시드 단백질로부터의 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질를 생성하는 단계, 여기서 스타터 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 스타터 캡시드 단백질에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며; (b) 단계 (a)에서 생성된 변이체 캡시드 AAV 단백질을 각각 포함하는 변이체 AAV 비리온을 생성하는 단계; 및 (c) 변형된 감염성 rAAV 비리온을 식별하기 위해 변경된 감염 특성에 대해 단계 (b)에서 생성된 변이체 AAV 비리온을 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질의 라이브러리의 생성은 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 루프-스와핑(loop-swapping) 돌연변이유발, 단편 셔플링(shuffling) 돌연변이유발 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로 선택된 돌연변이유발 방법을 포함한다. 일부 경우에, 감염의 변경된 특성은 스타터 비리온에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 중화 AAV 항체에 대한 증가된 내성이다. 일부 경우에, 감염의 변경된 특성은 스타터 비리온에 의해 나타나는 형질도입과 비교하여 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입이다. 일부 경우에, 변형된 감염성 rAAV 비리온은 스타터 캡시드 단백질에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 스타터 캡시드 단백질로부터 변이체 AAV 캡시드 단백질을 생성하는 방법을 포함하며, 이 방법은 스타터 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 루프-스와핑 돌연변이유발, 단편 셔플링 돌연변이유발 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이유발 유형에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 스타터 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
도 1. 도 1A-B는 향상된 항체 회피(evasion)를 위한 AAV의 유도 진화를 도시한다.
도 2A-B는 인간 IVIG를 사용한 항체 회피 변이체의 중화 프로파일을 도시한다.
도 3A-C는 AAV에 대한 높은 중화 항체 역가의 존재로 인해 혈우병 B 임상 시험에서 제외된 개체로부터 획득한 인간 혈청을 사용한 항체 회피 변이체의 중화 프로파일을 도시한다.
도 4A-B는 루프-스왑/셔플(loop-swap/shuffle) 및 포화 돌연변이유발 클론의 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 AAV 변이체의 시험관 내(in vitro) 향성(tropism)을 설명한다.
도 6A-B는 신규한 AAV 변이체의 생체 내(in vivo) 국소화 및 중화를 나타낸다.
도 7A-D는 인간 항체 회피자의 생성을 설명한다.
도 8A-I는 AAV1-9(서열 식별 번호 1-9)의 야생형 캡시드 단백질 서열과 정렬된 Shuffle 100-1(서열 식별 번호 11)의 캡시드 단백질 서열을 도시한다.
도 9A-I는 AAV1-9(서열 식별 번호 1-9)의 야생형 캡시드 단백질 서열과 정렬된 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12)의 캡시드 단백질 서열을 도시한다.
도 10A-I은 AAV1-9(서열 식별 번호 1-9)의 야생형 캡시드 단백질 서열과 정렬된 Shuffle 100-7(서열 식별 번호 13)의 캡시드 단백질 서열을 도시한다.
도 11은 면역화된 마우스 혈청에서 라이브러리 클론 및 모 혈청형의 중화 항체 역가를 나타낸다.
도 12는 인간 중화 항체의 존재 하에 폐로의 향상된 유전자 전달을 갖는 캡시드 변이체 "A101"(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함)을 식별하기 위해 사용된 유도 진화 과정을 예시한다.
도 13A-B. 도 13A는 유도 진화 과정에 사용된 캡시드 라이브러리의 추정된 유전적 다양성을 예시한다. 라이브러리의 전체 다양성은 10억 개 이상의 유전자 변이체이다. 도 13B는 캡시드 라이브러리의 생산성을 예시한다. 모든 캡시드 라이브러리는 생체 내 치료 벡터 진화 프로그램 연구를 위한 재료를 생산하기에 충분한 수준에서 제조되었다. 투여된 바이러스 게놈(vg)은 전달 장치 및 투여 경로와 관련된 손실을 고려하지 않은 목표 용량을 나타낸다.
도14A-B. 도 14A는 a) AeroProbe® 투여 또는 b) 첫 번째 선택 라운드로부터의 분무기 투여 후 분리된 AT II 세포로부터의 바이러스 게놈의 외부 PCR 증폭을 예시한다. 파란색 상자 안의 밴드는 바이러스 게놈의 성공적인 증폭을 나타낸다. 온도 구배는 겔의 각 레인에 해당하는 PCR 중에 사용되는 어닐링 온도를 나타낸다. 도 14B는 a) AeroProbe® 투여 또는 b) 첫 번째 선택 라운드로부터 분무기 투여 후 분리된 AT II 세포로부터의 바이러스 게놈의 내부 PCR 증폭을 예시한다. 파란색 상자 안의 밴드는 바이러스 게놈의 성공적인 증폭을 나타낸다.
도 15A-15B. 도 15A는 연구를 위한 시퀀싱 분석 내 키메라 모티프(motif)의 빈도를 예시한다. 시퀀싱 분석은 AeroProbe 및 Nebulizer 전달 장치 모두에 대해 시퀀싱된 모집단 내의 총 빈도를 기반으로 한다. 도 15B는 연구를 위한 키메라 모티프 내의 A101 변이체의 빈도를 예시한다. AeroProbe 및 Nebulizer 전달 장치 모두에 대해 시퀀싱된 모집단 내 총 빈도를 기반으로 하는 시퀀싱 분석.
도 16. 폐 샘플링 도식(실시예 3 및 7). 기관 및 폐 샘플링의 도식적 표현. 오른쪽 폐의 원은 DNA 및 단백질 분리를 위해 얻은 인접 샘플을 나타낸다. 조직 절편을 위한 장축과 단축을 따라 배향된 샘플은 사각형으로 표시된다.
도 17. 변이체 캡시드(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함) 1:10 혈청 희석에서 NHP 혈청 샘플을 사용한 형질도입. 연구 포함에 적합한 NHP로부터의 혈청 샘플을 항-AAV 중화 항체의 존재에 대해 분석했다. 1:10 혈청 희석이 존재하는 경우의 형질도입(혈청이 없는 경우의 형질도입과 비교)은 모든 NHP에 대해 보고된다. 연구 포함을 위해 선택된 NHP는 노란색 막대로 표시된다. 에러 바(error bar) = 표준 편차, n = 3(내부 복제).
도 18. 변이체 캡시드 매개 게놈 생물학적 분포(biodistribution). EGFP 이식유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 사용한 qPCR에 의한 폐 및 추가 전신 기관의 바이러스 게놈 정량화. 바이러스 게놈은 모든 48개 샘플에서 검출되었다(n = NHP당 16개 샘플, n = 3개 NHP). 골격근(상완삼두근, 외측광근), 횡격막, 신장, 비장, 뇌 및 척수에서 테스트한 모든 샘플은 정량화 하한 미만(lower limit of quantification)이었다. 평균 ± 표준 오차; n = 3개 NHP(n = NHP당 폐당 16개 생검 부위, n = NHP당 간당 10개 생검 부위, n = NHP당 심장당 15개 생검 부위, n = NHP당 골격근당 생검 부위 9개, n = NHP당 신장당 2개 샘플, n = NHP당 비장당 1개 샘플, n = NHP당 뇌당 8개 생검 부위, n = NHP당 척수당 3개 생검 부위).
도 19. 폐에서 변이체 캡시드 매개 단백질 발현. EGFP 단백질에 대한 ELISA에 의한 폐에서의 EGFP 단백질 발현의 정량화. EGFP 발현은 모든 48개 폐 샘플에서 관찰되었다(n = NHP당 16개 샘플, n = 3개 NHP). EGFP 발현은 바이러스 게놈에 대해 양성인 10개의 간 샘플에서 관찰되었다(n = NHP당 10개 샘플, n = 3개 NHP). 평균 ± 표준 오차.
도 20. 폐의 변이체 캡시드 매개 단백질 국소화. NHP V002969의 기관(a-b), 기관지(c, e, g) 및 폐포(d, f, h)에서 EGFP 발현의 대표적인 이미지. 기관(b), 폐포(d) 및 기관지(e)에서 흰색 상자로 표시된 섹션은 각각 i, j 및 k에서 확대된 이미지로 제공된다. 이미지의 대략적인 위치는 개략도에서 자홍색 상자로 표시된다. EGFP 발현은 모든 이미지에서 항-GFP 항체(빨간색)에 의해 검출된다. 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었다.
도 21A-21D. 폐포 상피 유형 2 비인간 영장류 세포 특성화. NHP AECII 세포는 90% 이상의 LysoTracker 양성이었고, 형광 현미경으로 나타내었고(도 17A), 유동 세포분석(flow cytometry)에 의해 정량화되었다(도 21B). AECII 세포의 성숙한 마커인 계면활성제 단백질 C는 접종 후 1일 및 5일에 명백했다(도 21C). AECII 세포는 EdU 혼입(incorporation)에 의해 나타난 배양에서 시간이 지남에 따라 증식 속도를 감소시켰다(도 21D). EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine), 에러 바 = 표준 편차, n = 3 내부 복제.
도 22A-22B. 비인간 영장류 폐포 상피 유형 2 세포 벡터 특성화. 서열 식별 번호 12(4D-A101) 캡시드의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 갖는 rAAV는 AECII NHP 세포의 ALI 배양물에서 CAG-eGFP를 보유하는 AAV5 캡시드보다 더 높은 형질도입율을 나타냈다. 유동 세포분석에 의한 eGFP 양성 세포의 정량화(도 22A). eGFP 양성 세포의 대표적인 ICC 이미지(도 22B). 3일의 감염 후 시간, 배양에서 총 5일. 에러 바 = 표준 편차, n = 3 내부 복제. 스튜던트 t-검정, AAV5과 비교하여 p<0.05.
도 23A-23D. 폐포 상피 유형 2 인간 세포 특성화. 인간 AECII 세포는, 50%로 감소되고 형광 현미경(도 23A)에 의해 표시되고 유동 세포분석(도 23B)에 의해 정량화되었을 때, 배양 11일째까지 약 80% LysoTracker 양성이었다. AECII 세포의 성숙한 마커인 계면활성제 단백질 C는 접종 후 5일 및 11일에 명백했다(도 23C). AECII 세포는 EdU 혼입에 의해 나타난 배양에서 시간이 지남에 따라 증식 속도를 감소시켰다(도 23D). EdU = 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine, 에러 바 = 표준 편차, n = 3 내부 복제.
도 24. 인간 폐포 상피 유형 2 세포 벡터 특성화. 서열 식별 번호 12(4D-A101)의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드는 AECII 인간 세포의 ALI 배양에서 CAG-eGFP를 보유하는 AAV5 캡시드보다 더 높은 형질도입율을 나타냈다. eGFP 양성 세포의 대표적인 ICC 이미지. 감염 후 6일 및 10일, 배양 기간 총 7일 및 11일.
도 25. 서열 식별 번호 12(4D-A101)의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 야생형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 rAAV의 시험관 내 중화 프로파일. 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV는 야생형 AAV와 비교하여 인간 IVIG에서 AAV 중화 항체를 회피하는 우수한 능력을 나타냈다. AAV.CAG.Luciferase 벡터는 1,000의 MOI에서 2V6.11 세포의 감염 전에 IVIG의 희석과 함께 배양되었다. 항체를 회피할 수 있는 벡터가 세포를 형질도입하고 루시페라아제(luciferase) 활성을 감염 48시간 후에 측정했다. IVIG= 정맥 면역글로빈(intravenous immunoglobin), 에러 바 = 표준 편차, n = 3, 내부 복제. * 4D-A101 대 AAV1, AAV2, AAV8 및 AAV9의 경우 p < 0.05, † 4D-A101 대 AAV5의 경우 p < 0.05.
도 26. A101 VP1 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 순 전하 대 pH의 그래프.
도 27. 실온에서 1일 보관 후 A101-GFP pH 용해도의 그래프.
도 28A-C. 형질도입은 HEK2v6.11 세포에서 강력한 단백질 발현 및 막 국소화로 이어진다. HEK2v6.11을 4D-710으로 형질도입하고 항-CFTR 항체를 사용한 웨스턴 블롯(western blot)(도 28A)으로 탐침했다(도 28A). 대표적인 이미지(도 28B)는 면역세포화학, 항-CFTR(적색), F-액틴(녹색), DAPI, 핵(청색)에 의해 분석된 세포를 보여준다. 스케일 바는 100μM(도 28B) 및 25μM(도 28C)이다.
도 29A-B. 4D-710을 사용한 16HBE14o-G542X 세포의 형질도입. 역전사-ddPCR(RT-ddPCR) 디지털 액적(digital droplet) PCR(ddPCR)은 증가하는 MOI에서 4D-710 형질도입 후 HBE 배양물로부터 추출된 RNA에 대해 수행되었다(도 29A). 외인성 CFTRΔR 전사체 수준을 결정하고 설정된 임계값을 초과하는 카피/μL로 정량화하고 선형 척도로 플로팅했다. BLQ, 정량화 한계 미만(below the limit of quantification). NT, 비형질도입(nontransduced). 35,000 및 50,000 MOI에서 형질도입 후 HBE 배양물의 면역세포화학(도 29B). 파란색은 DAPI이고 빨간색은 CFTR 단백질이다. 스케일은 100μm이다.
도 30. 4D-710을 사용한 건강한 생체 외(ex vivo) ALI 폐 배양물의 형질도입. 4D-710 형질도입 후 배양물로부터 추출된 RNA로부터 제조된 cDNA에 대해 ddPCR을 수행했다. 내인성 인간 CFTR 유전자로부터 코돈 최적화된 인간 CFTRΔR 이식유전자를 특이적으로 분화시키기 위해 2개의 프라이머/프로브 세트가 생성되었다. 정량화는 검사된 프라이머/프로브 세트의 전사체를 함유하는 설정된 임계값을 초과하는 액적의 수를 분석했다. BLQ, 정량화 한계 미만. NT, 비형질도입.
도 31. 1:10 혈청 희석에서 NHP 혈청 샘플을 사용한 4D-A101 형질도입. 연구 포함에 적합한 NHP로부터의 혈청 샘플은 4D-710(4D-A101, 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함)의 캡시드에 대한 항-AAV 중화 항체의 존재에 대해 분석되었다. 1:10 혈청 희석이 있는 경우의 형질도입(혈청이 없는 경우의 형질도입과 비교)은 모든 NHP에 대해 보고된다. 에러 바 = 표준 편차, n = 3(내부 복제).
도 32A-C. CFTRΔR 이식유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 사용한 qPCR에 의한 바이러스 게놈의 정량화. 도 32A, 바이러스 게놈은 우측 폐 전체에 분포된 폐 샘플에서 강력하게 검출되었다. 도 32B, 개별 동물 폐 샘플은 폐포(녹색), 1차/2차 기관지(파란색), 3차/하부 기관지(빨간색), 두개엽(원), 중엽(사각형), 미엽(삼각형), 부엽(다이아몬드)의 대략적인 영역 및 폐엽으로 표시된다. 도 32C, 3 x 1013 vg 투여된 동물에서 정량화된 바이러스 게놈은 심장, 간, 뇌, 골격근(상완삼두근, 외측광근, 횡격막), 척수, 췌장, 신장 및 고환에서 테스트한 모든 샘플이 정량화 하한 미만보다 낮음을 입증한다. 세 동물 모두 기관지(tracheobronchial)(TB) 림프절에서 탐지 가능한 바이러스 게놈을 가지고 있었고 한 동물은 비장에서 탐지 가능한 바이러스 게놈을 가지고 있었다. 평균 ± SD.
도 33A-B. 4D-710 폐에서의 이식유전자 전사체 발현. 4D-710 이식유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 사용한 RT-qPCR에 의한 CFTRΔR 전사체의 정량화. 도 33A, 전사체는 3 x 1013 vg 투여 동물의 엽 전체에 분포된 우측 폐 샘플에서 검출되었으며, 모든 비히클 동물은 BLQ였다. 도 33B, 3 x 1013 vg 투여된 개별 동물 폐 샘플은 폐포(녹색), 1차/2차 기관지(파란색), 3차/하부 기관지(적색), 두개엽(원), 중엽(사각형), 미엽(삼각형), 부엽(다이아몬드)의 대략적인 영역 및 폐엽으로 표시된다. 평균 ± SD.
도 34A-B. 4D-710 폐에서의 단백질 발현. 면역조직화학 염색에 의한 폐에서의 CFTR 단백질 발현. 도 34A, 각 치료군의 기관 상피, 기관지 상피 및 폐포 절편에서의 CFTR 발현, 대표적인 이미지. 도 34B, 3 x 1013 vg 치료된 동물의 기관 상피, 기관지 상피 및 폐포 절편에서의 CFTR 단백질 발현(개별 동물 표시), 대표적인 이미지.
도 35. A101-Luc 용해도 대 pH의 그래프.
정의
아데노-관련 바이러스는 비-외피, 20면체 캡시드 내에 4.7kb 단일 가닥 DNA 게놈으로 구성된 비병원성 파보바이러스이다. "AAV"는 adeno-associated virus의 약자로, 바이러스 자체 또는 그 유도체를 지칭하는 용어로 사용될 수 있다. 게놈은 복제 및 패키징 신호의 바이러스 기원으로 기능하는 ITR(inverted terminal repeat)(역 말단 반복부)이 측면에 있는 3개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)(ORF)을 함유한다. rep ORF는 바이러스 복제, 전사 조절, 부위 특이적 통합 및 비리온 조립에서 역할을 하는 4개의 비구조 단백질을 인코딩한다. cap ORF는 60-mer 바이러스 캡시드를 형성하기 위해 조립되는 3개의 구조 단백질(VP1-3)을 인코딩한다. 마지막으로, cap 유전자 내에서 대체 리딩 프레임으로 존재하는 ORF는 AAV 캡시드 단백질을 핵소체에 국한시키고 캡시드 조립 과정에서 기능하는 바이러스 단백질인 어셈블리 활성화 단백질(assembly-activating protein)(AAP)을 생성한다.
자연적으로 발생하는 여러 혈청형 및 AAV의 100개 이상의 변이체가 있으며, 각각은 아미노산 서열, 특히 캡시드 단백질의 초가변 영역 내에서 상이하고, 따라서 이들의 유전자 전달 특성이 상이하다. AAV는 인간 질병과 관련이 없으므로 재조합 AAV를 임상 적용에 매력적으로 만든다.
본원에 사용된 용어 "AAV"는 달리 요구되는 경우를 제외하고 모든 서브타입(subtype) 및 자연 발생 및 재조합 형태 모두를 포괄한다. 용어 "AAV"는 AAV 유형 1(AAV-1 또는 AAV1), AAV 유형 2(AAV-2 또는 AAV2), AAV 유형 3(AAV-3 또는 AAV3), AAV 유형 4(AAV-4 또는 AAV4), AAV 유형 5(AAV-5 또는 AAV5), AAV 유형 6(AAV-6 또는 AAV6), AAV 유형 7(AAV-7 또는 AAV7), AAV 유형 8(AAV-8 또는 AAV8), AAV 유형 9(AAV- 9 또는 AAV9), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물 등을 감염시키는 AAV를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "4D-A101" 또는 "A101"은 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "4D-710"은 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 지칭한다.
AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 말단 반복부(TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌이나 GenBank와 같은 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁번호 NC_002077.1(AAV-1), AF063497.1(AAV-1), NC_001401.2(AAV-2), AF043303.1(AAV-2), J01901.1(AAV-2), U48704.1(AAV-3), NC_001729.1(AAV-3), NC_001829.1(AAV-4), U89790.1(AAV-4), NC_006152.1(AAV-5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1(AAV-6), NC_006260.1(AAV-7), AF513851.1(AAV-7), AF513852.1(AAV-8) NC_006261.1(AAV-8), 및 AY530579.1(AAV-9)를 참조; 그 개시 내용은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어 Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; international patent publications WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 U.S. Pat. No. 6,156,303을 참조.
AAV 혈청형과 관련된 자연적으로 존재하는 cap(캡시드) 단백질의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, AAV1(서열 식별 번호 1), AAV2(서열 식별 번호 2), AAV3(서열 식별 번호 3), AAV4(서열 식별 번호 4), AAV5(서열 식별 번호 5), AAV6(서열 식별 번호 6), AAV7(서열 식별 번호 7), AAV8(서열 식별 번호 8), 및 AAV9(서열 식별 번호 9)을 포함한다. 용어 "변이체 AAV 캡시드 단백질"은 서열 식별 번호 1-9로 나타낸 자연적으로 존재하는 AAV 캡시드 단백질 서열 중 하나에 비해 적어도 하나의 치환(삭제, 삽입 등 포함)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질이다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡슐화된 AAV 폴리뉴클레오타이드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드에 적용되는 "재조합"은 폴리뉴클레오타이드가 클로닝, 제한 또는 결찰 단계, 및 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드와 구별되는 구조를 초래하는 기타 절차의 다양한 조합의 산물임을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자이다. 이 용어는 각각 원래의 폴리뉴클레오타이드 구조의 복제와 원래의 바이러스 구조의 자손을 포함한다.
AAV 비리온이 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 표적 세포에 전달될 이식유전자, 표적 세포에 전달될 RNAi 작용제 또는 CRISPR 작용제 등)를 포함하는 경우, 일반적으로 "재조합 AAV(rAAV) 비리온" 또는 "rAAV 바이러스 입자"라고 지칭한다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 AAV 역 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된다.
용어 "rAAV 벡터"는 rAAV 비리온(즉, rAAV 바이러스 입자)(예를 들어, 감염성 rAAV 비리온)을 포함하며, 이는 정의에 의해 rAAV 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 또한 rAAV를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, rAAV를 인코딩하는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드(single stranded polynucleotide)(ss-rAAV); rAAV를 인코딩하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(double stranded polynucleotide)(ds-rAAV), 예를 들어, rAAV를 인코딩하는 플라스미드 등)를 포함한다.
"패키징"은 AAV 입자의 조립 및 캡슐화를 초래하는 일련의 세포 내 이벤트를 지칭한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡슐화 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "패키징 유전자"로 지칭된다.
AAV에 대한 "헬퍼(helper) 바이러스"는 AAV(예를 들어, 야생형 AAV)가 포유동물 세포에 의해 복제되고 패키징되도록 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 백시니아와 같은 폭스바이러스를 포함하는 다양한 AAV용 헬퍼 바이러스가 당업계에 공지되어 있다. 아데노바이러스는 서브그룹 C의 아데노바이러스 유형 5가 가장 일반적으로 사용되지만 다양한 서브그룹을 포함한다. 인간, 비-인간 포유류 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 알려져 있으며 ATCC와 같은 수탁소에서 입수할 수 있다. 헤르페스과의 바이러스는 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)(HSV) 및 엡스타인-바 바이러스(pseudorabies virus)(EBV), 뿐만 아니라 거대세포바이러스(cytomegaloviruse)(CMV) 및 가광견병 바이러스(pseudorabies virus)(PRV)포함한다; ATCC와 같은 수탁소에서도 입수할 수 있다.
"헬퍼 바이러스 기능(들)"은 AAV 복제 및 패키징(본원에 기재된 복제 및 패키징에 대한 다른 요건과 함께)을 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에 인코딩된 기능(들)을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나, 예를 들어, 필수 기능(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 트랜스로(in trans) 생산자 세포에 제공하는 것을 포함하는 다양한 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아데노바이러스 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 발현 벡터는 rAAV 벡터와 함께 생산자 세포로 형질감염된다.
"감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는 반응력 있게 조립된 바이러스 캡시드를 포함하고 바이러스 종이 향성인 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 성분을 전달할 수 있는 것이다. 이 용어가 반드시 바이러스의 복제 능력을 의미하는 것은 아니다. 감염성 바이러스 입자를 계수하기 위한 분석은 본 개시 내용 및 당업계의 다른 곳에서 설명된다. 바이러스 감염성은 전체 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율로 표현될 수 있다. 총 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337 (describing a TCID50 infectious titer assay); and Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. 실시예를 참조.
본원에 사용된 용어 "향성(tropism)"은 바이러스(예를 들어, AAV)에 의한 특정 숙주 종 또는 숙주 종 내의 특정 세포 유형의 우선적 표적화를 지칭한다. 예를 들어, 심장, 폐, 간 및 근육의 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스는 폐 및 근육 세포만 감염시킬 수 있는 바이러스에 비해 더 넓은(즉, 증가된) 향성을 갖습니다. 향성은 또한 숙주의 특정 유형의 세포 표면 분자에 대한 바이러스의 의존성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 바이러스는 표면 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로 세포만 감염시킬 수 있는 반면, 다른 바이러스는 시알산(sialic acid)으로 세포만 감염시킬 수 있다(이러한 의존성은 바이러스 감염에 대한 잠재적 숙주 세포로서 특정 부류의 분자가 결여된 다양한 세포주를 사용하여 테스트할 수 있음). 어떤 경우에는 바이러스의 향성이 바이러스의 상대적 선호도를 나타낸다. 예를 들어, 첫 번째 바이러스는 모든 세포 유형을 감염시킬 수 있지만 표면 글리코사미노글리칸으로 이러한 세포를 감염시키는 데 훨씬 더 성공적이다. 두 번째 바이러스가 동일한 특성을 선호하는 경우(예를 들어, 두 번째 바이러스도 표면 글리코사미노글리칸으로 해당 세포를 감염시키는 데 더 성공적임), 절대 형질도입 효율은 비슷하지 않을지라도, 두 번째 바이러스는 첫 번째 바이러스와 유사한(또는 동일한) 향성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 두 번째 바이러스는 테스트된 모든 주어진 세포 유형을 감염시키는 데 첫 번째 바이러스보다 더 효율적일 수 있지만 상대적 선호도가 유사(또는 동일)하면 두 번째 바이러스는 여전히 최초의 바이러스로 유사한(또는 동일한) 향성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 향성은 자연 발생 비리온에 비해 변경되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 향성은 자연 발생 비리온에 비해 확장(즉, 확대)된다. 일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 향성은 자연 발생 비리온에 비해 감소된다.
"복제-가능(competent)" 바이러스(예를 들어, 복제-가능 AAV)는 감염성이고 또한 감염된 세포에서 복제될 수 있는 표현형 야생형 바이러스(즉, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재 하)를 지칭한다. AAV의 경우 복제 능력은 일반적으로 기능적 AAV 패키징 유전자의 존재를 필요로 한다. 일반적으로, 본원에 기재된 rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 패키징 유전자의 결여로 인해 포유동물 세포(특히 인간 세포에서)에서 복제-불능이다. 전형적으로, 이러한 rAAV 벡터는 AAV 패키징 유전자와 유입되는 rAAV 벡터 간의 재조합에 의해 복제 가능 AAV가 생성될 가능성을 최소화하기 위해 임의의 AAV 패키징 유전자 서열이 결여되어 있다. 많은 실시 양태에서, 본원에 기재된 rAAV 벡터 제제는 복제 가능 AAV(rcAAV, RCA로도 지칭됨)를 거의 함유하지 않는 것들이다(예를 들어, 102 rAAV 입자당 약 1 rcAAV 미만, 104 rAAV입자당 약 1 rcAAV 미만, 108 rAAV 입자당 약 1 rcAAV 미만, 1012 rAAV 입자당 약 1 rcAAV 미만, 또는 rcAAV 없음).
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 비뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 상호교환적으로 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 실시 양태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 특정 백분율 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬될 때 두 서열을 비교할 때 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일함을 의미한다. 서열 유사성은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 월드 와이드 웹(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 이용 가능한 BLAST를 포함하는 컴퓨터 프로그램 및 방법을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은 Oxford Molecular Group, Inc.의 전액 출자 자회사인 Madison, Wis., USA의 Genetics Computing Group(GCG) 패키지로 이용 가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA에 기재되어 있다. 특히 흥미로운 것은 서열의 간격을 허용하는 정렬 프로그램이다. Smith-Waterman은 서열 정렬의 간격을 허용하는 알고리즘 유형 중 하나이다. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)를 참조. 또한 Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)을 참조.
"유전자"는 세포에서 몇 종류의 기능을 수행하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 유전자는 전사되고 번역된 후 특정 단백질을 인코딩할 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 반면에 유전자는 번역되지 않은 기능적 RNA 산물(예를 들어, 앱타머(aptamer), 간섭 RNA, 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA) 등)을 인코딩할 수 있다.
"유전자 발현 산물" 또는 "유전자 산물"은 상기 정의된 바와 같은 특정 유전자의 발현으로부터 생성된 분자이다. 유전자 발현 산물은, 예를 들어 폴리펩타이드, 앱타머, 간섭 RNA, 메신저 RNA(mRNA), rRNA, tRNA, 비코딩 RNA(ncRNA) 등을 포함한다.
"RNA 간섭제" 또는 "RNAi 작용제"는 유전자(상기 정의된 바와 같음)의 발현을 변경하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제(또는 이러한 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다. 당업자에게 공지된 RNAi 작용제의 예에는 (i) siRNA 작용제; (ii) 안티센스(antisense) RNA; (iii) CRISPR 작용제; (iv) 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease) 작용제, 및 (v) 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN) 작용제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
(i) siRNA 작용제("작은 간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA"(또는 siRNA))는 관심 유전자("표적 유전자")를 표적으로 하는 뉴클레오타이드의 RNA 이중체(duplex)이다. "RNA 이중체"는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 영역을 형성하는 RNA 분자의 두 영역 사이의 상보적 짝짓기(pairing)에 의해 형성된 구조를 의미한다. siRNA는 siRNA의 이중체 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이라는 점에서 유전자에 "표적화"된다. 일부 실시 양태에서, siRNA의 이중체의 길이는 30개 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 실시 양태에서, 이중체는 길이가 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이중체의 길이는 19-25개 뉴클레오타이드 길이이다. siRNA의 RNA 이중체 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 헤어핀을 포함하는 siRNA 작용제는 "shRNA(짧은 헤어핀 RNA) 작용제"로도 지칭될 수 있다. 이중체 부분에 더하여, 헤어핀 구조는 이중체를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치한 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프의 길이는 다를 수 있다. 일부 실시 양태에서 루프는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 뉴클레오타이드이다. 헤어핀 구조는 또한 3' 또는 5' 돌출부(overhang) 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 돌출부는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오타이드 길이의 3' 또는 5' 돌출부이다. 일반적으로 표적 유전자의 발현 산물(예를 들어, mRNA, 폴리펩타이드 등)의 수준은 5' 비번역(untranslated)(UT) 영역, ORF, 또는 3' UT 영역을 포함하는 표적 유전자 전사체의 적어도 19-25개 뉴클레오타이드 길이 분절(예를 들어, 20-21개 뉴클레오타이드 서열)에 상보적인 특정 이중 가닥 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA 작용제(예를 들어, siRNA, shRNA 등)에 의해 감소된다. 일부 실시 양태에서, 짧은 간섭 RNA는 길이가 약 19-25 nt이다. 예를 들어, siRNA 기술에 대한 설명은 PCT applications WO0/44895, WO99/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/89304, WO02/16620, 및 WO02/29858; 및 U.S. Patent Publication No. 20040023390을 참조. siRNA 및/또는 shRNA는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있고, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 폴리아데닐화 신호는 합성 최소 폴리아데닐화 신호이다.
(ii) 안티센스 RNA는 유전자 발현 산물에 상보적인 RNA이다. 예를 들어, 특정 mRNA를 표적으로 하는 안티센스 RNA는 mRNA에 상보적인 RNA 기반 작용제(또는 변형된 RNA일 수 있음)이며, 여기서 mRNA에 대한 안티센스 RNA의 혼성화는 mRNA의 발현을 변경한다(예를 들어, RNA의 안정성 변경, RNA 번역 변경 등). "안티센스 RNA"에는 또한 안티센스 RNA를 인코딩하는 핵산이 포함된다.
(iii) CRISPR 작용제. CRISPR(Clustered regular interspaced short palindromic repeats)/CRISPR 관련(Cas) 시스템은 침입하는 핵산의 침묵을 유도하기 위해 CRISPR RNA(crRNA)를 사용하여 박테리아와 고세균에 바이러스 및 플라스미드에 대한 적응 면역을 제공한다. Cas 9 단백질(또는 이의 기능적 등가물 및/또는 변이체, 즉, Cas9-유사 단백질)은 단백질과 crRNA 및 tracrRNA(가이드(guide) RNA라고도 함)라고 하는 2개의 자연 발생 또는 합성 RNA 분자와의 결합에 의존하는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 자연적으로 포함한다. 어떤 경우에는, 두 분자가 공유 결합되어 단일 분자(단일 가이드 RNA("sgRNA")라고도 함)를 형성한다. 따라서 Cas9 또는 Cas9-유사 단백질은 Cas9 또는 Cas9-유사 단백질을 활성화하고 표적 핵산 서열에 단백질을 가이드하는 DNA-표적화 RNA(이 용어는 2분자 가이드 RNA 구성 및 단일 분자 가이드 RNA 구성 모두를 포함)와 결합한다. Cas9 또는 Cas9-유사 단백질이 천연 효소 기능을 유지하는 경우, 표적 DNA를 절단하여 이중 가닥 파손을 생성하여 게놈 변경(즉, 편집: 삭제, 삽입(기증자 폴리뉴클레오타이드가 존재하는 경우), 대체 등)을 야기시키고, 이에 의해 유전자 발현을 변경한다. Cas9의 일부 변이체(변이체는 Cas9-유사라는 용어에 포함)가 변경되어 DNA 절단 활성이 감소한다(어떤 경우에는 표적 DNA의 두 가닥 대신 단일 가닥을 절단하지만 다른 경우에는 경우에, 그들은 DNA 절단 활성이 전혀 없는 것으로 심각하게 감소되었다). DNA 절단 활성이 감소된 Cas9-유사 단백질(DNA 절단 활성이 없더라도)은 여전히 표적 DNA로 안내될 수 있으며 RNA 중합효소 활성을 차단할 수 있다. 따라서 효소적으로 불활성인 Cas9-유사 단백질은 표적 DNA의 전사를 차단하기 위해 DNA-표적화 RNA에 의해 표적 DNA의 특정 위치로 표적화될 수 있다. CRISPR 작용제에 대한 자세한 정보는 예를 들어 (a) Jinek et. al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21: "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity"; (b) Qi et al., Cell. 2013 Feb. 28; 152(5):1173-83: "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression", 및 (c) U.S. patent application Ser. No. 13/842,859 and PCT application number PCT/US13/32589에서 찾을 수 있으며; 이들 모두는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "CRISPR 작용제"는 Cas9-기반 시스템에서 사용될 수 있는, 자연 발생 및/또는 합성 서열을 포함하는 임의의 작용제(또는 이러한 작용제를 인코딩하는 핵산)를 포함한다(예를 들어, Cas9 또는 Cas9-유사 단백질; DNA-표적화 RNA의 임의의 성분, 예를 들어 crRNA-유사 RNA, tracrRNA-유사 RNA, 단일 가이드 RNA 등; 기증자 폴리뉴클레오타이드 등).
(iv) 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 작용제. 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시켜 생성된 인공 DNA 엔도뉴클레아제이다. ZFN은 원하는 DNA 서열을 표적으로 하도록 조작될 수 있으며 이것은 징크-핑거 뉴클레아제가 독특한 표적 서열을 절단할 수 있게 한다. 세포 내로 도입될 때, ZFN은 이중 가닥 파손을 유도함으로써 세포의 표적 DNA(예를 들어, 세포의 게놈)를 편집하는 데 사용될 수 있다. ZFN의 사용에 대한 추가 정보는 예를 들어 Asuri et al., Mol Ther. 2012 February; 20(2):329-38; Bibikova et al. Science. 2003 May 2; 300(5620):764; Wood et al. Science. 2011 Jul. 15; 333(6040):307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 August; 15(8):875-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 October; 40(10):759-65; Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2):121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Apr. 26; 108(17):7052-7; Goldberg et al, Cell. 2010 Mar. 5; 140(5):678-91; Geurts et al, Science. 2009 Jul. 24; 325(5939):433; Flisikowska et al, PLoS One. 2011; 6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun. 13; Hauschild et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jul. 19; 108(29):12013-7; 및 Yu et al, Cell Res. 2011 November; 21(11):1638-40를 참조; 이들 모두는 ZFN과 관련된 그들의 교시를 위해 참조로 본원에 포함된다. 용어 "ZFN 작용제"는 징크 핑거 뉴클레아제 및/또는 징크 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
(v) 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 작용제. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 TAL(전사 활성제-유사) 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합하여 생성된 인공 DNA 엔도뉴클레아제이다. TALENS는 실질적으로 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하도록 신속하게 조작될 수 있으며, 세포에 도입될 때 TALEN은 이중 가닥 파손을 유도하여 세포(예를 들어, 세포의 게놈)에서 표적 DNA를 편집하는 데 사용할 수 있다. TALEN 사용에 대한 추가 정보는 예를 들어 Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul. 7; 29(8):731-4; Wood et al. Science. 2011 Jul. 15; 333(6040):307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug. 5; 29(8):695-6; 및 Huang et. al., Nat Biotechnol. 2011 Aug. 5; 29(8):699-700를 참조; 이들 모두는 TALEN과 관련된 그들의 교시를 위해 참고로 본원에 포함된다. 용어 "TALEN 작용제"는 TALEN 및/또는 TALEN을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"제어 요소" 또는 "제어 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱(splicing), 번역 또는 분해를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오타이드 서열이다. 조절은 과정의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있으며, 본질적으로 향상되거나 억제될 수 있다. 당업계에 공지된 제어 요소는, 예를 들어 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 결합하고 일반적으로 프로모터로부터 하류(3' 방향)에 위치한 코딩 영역의 전사를 개시하는 특정 조건 하에서 가능한 DNA 영역이다.
"작동적으로(operatively) 연결된" 또는 "작동 가능하게(operably) 연결된"은 유전 요소의 병치를 지칭하며, 여기서 요소는 예상된 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 개시를 돕는 경우 프로모터는 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기(intervening residue)가 있을 수 있다.
"발현 벡터"는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 영역을 포함하는 벡터이며, 의도된 표적 세포에서 단백질의 발현을 수행하는 데 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 인코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 제어 요소를 포함한다. 제어 요소와 유전자 또는 발현을 위해 작동 가능하게 연결된 유전자들의 조합은 종종 "발현 카세트"라고 하며, 이들 중 다수는 당업계에 알려져 있고 이용 가능하거나 당업계에서 이용 가능한 구성요소로부터 쉽게 구성될 수 있다.
"이종성"은 비교되는 개체의 나머지 부분과 유전형으로 구별되는 개체에서 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 다른 종에서 유래된 플라스미드 또는 벡터에 도입된 폴리뉴클레오타이드는 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 천연 코딩 서열로부터 제거되고 자연적으로 발견되지 않은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 따라서, 예를 들어, 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV는 자연 발생 야생형 AAV에 정상적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이고, 인코딩된 이종성 유전자 산물은 자연 발생 야생형 AAV에 의해 정상적으로 인코딩되지 않는 유전자 산물이다.
"2A 펩타이드"는 동일한 mRNA로부터 등몰(equimolar) 수준의 다중 유전자를 생성하고 멀티시스트론 벡터에서 IRES 요소 대신에 사용될 수 있는 약 20개 아미노산의 "자가-절단" 펩타이드를 지칭한다. 비제한적 예는 T2A, P2A, E2A 및 F2A 펩타이드 서열을 포함한다.
용어 "유전적 변경" 및 "유전적 변형"(및 이의 문법적 변이체)은 유전 요소(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)가 유사 분열 또는 감수 분열에 의한 것이 아닌 세포 내로 도입되는 과정을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 요소는 세포에 대해 이종성일 수 있거나, 세포에 이미 존재하는 요소의 추가 카피 또는 개선된 버전일 수 있다. 유전적 변경은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전 또는 폴리뉴클레오타이드-리포솜 복합체와의 접촉과 같은 당업계에 공지된 임의의 과정을 통해 재조합 플라스미드 또는 기타 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. 유전적 변경은 또한 예를 들어 DNA 또는 RNA 바이러스 또는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로 유전 요소는 세포의 염색체 또는 미니-염색체에 도입된다. 그러나 세포 및 그 자손의 표현형 및/또는 유전자형을 변경하는 모든 변경은 이 용어에 포함된다.
세포는 외인성 DNA(예를 들어, 재조합 바이러스를 통해)에 의해, 이러한 DNA가 세포 내부에 도입되었을 때, "유전적으로 변형" 또는 "형질전환" 또는 "형질감염"된다. 외인성 DNA의 존재는 영구적이거나 일시적인 유전적 변화를 초래한다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈에 통합(공유 결합)되거나 통합되지 않을 수 있다. "클론"은 유사 분열에 의해 단일 세포 또는 공통 조상에서 유래된 세포 집단이다. "세포주"는 여러 세대 동안 시험관 내에서 안정적으로 성장할 수 있는 1차 세포의 클론이다.
서열이 시험관 내 세포의 연장된 배양 동안 및/또는 생체 내 장기간 동안 기능을 수행하는 데 이용 가능한 경우, 세포는 "안정적으로" 변경, 형질도입, 유전적으로 변형, 또는 유전자 서열로 형질전환된다고 한다. 일반적으로, 이러한 세포는 변경된 세포의 자손에게도 유전될 수 있는 유전적 변경이 도입된다는 점에서 "유전적으로" 변경(유전적으로 변형)된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화 또는 표지(labeling) 성분과의 접합을 포함한다. 유전자 산물을 포유동물 대상체에게 전달하는 맥락에서 논의될 때, 항-혈관신생 폴리펩타이드, 신경보호 폴리펩타이드 등과 같은 폴리펩타이드 및 이를 위한 조성물은, 각각의 온전한 폴리펩타이드, 또는 이의 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 지칭하고, 이는 온전한 단백질의 원하는 생화학적 기능을 유지한다. 유사하게, 항-혈관신생 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 신경보호 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 및 포유동물 대상체에게 유전자 산물을 전달하는 데 사용하기 위한 기타 그러한 핵산에 대한 언급(이는 수용자 세포로 전달되는 "이식유전자"로 지칭될 수 있음)은 온전한 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 원하는 생화학적 기능을 갖는 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 포함한다.
"분리된" 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 비리온, 숙주 세포, 단백질 또는 기타 물질은 물질 또는 이와 유사한 물질이 자연적으로 발생하거나 처음에 제조된 경우에도 존재할 수 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 결여된 물질의 제제를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 분리된 물질은 정제 기술을 사용하여 소스 혼합물에서 농축하여 제조할 수 있다. 농축(enrichment)은 용액의 부피당 중량과 같은 절대 기준으로 측정하거나 소스 혼합물에 존재하는 두 번째 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정할 수 있다. 본 개시 내용의 실시예의 증가하는 농축은 점점 더 분리된다. 분리된 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 숙주 세포, 또는 다른 물질은 일부 실시 양태에서, 예를 들어, 약 80% 내지 약 90% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 적어도 약 98% 순도, 또는 적어도 약 99% 순도로 정제된다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 질병에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질병의 모든 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉽거나 질병에 걸릴 위험이 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병(및/또는 질병으로 인한 증상)이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질병(및/또는 질병으로 인한 증상)을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질병(및/또는 질병으로 인한 증상)의 완화, 즉 질병(및/또는 질병으로 인한 증상)의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.
용어 "개인", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물; 유인원을 포함한 비-인간 영장류; 포유류 스포츠 동물(예를 들어, 말); 포유류 농장 동물(예를 들어, 양, 염소 등); 포유류 동물 애완동물(개, 고양이 등); 및 설치류(예를 들어, 마우스, 쥐 등)을 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 개체는 이전에 AAV에 자연적으로 노출되었고 결과적으로 항-AAV 항체(즉, AAV 중화 항체)를 보유하는 인간이다. 일부 실시 양태에서, 개체는 이전에 AAV 벡터를 투여받았고(결과적으로 항-AAV 항체를 보유할 수 있음) 상이한 병태의 치료 또는 동일한 병태의 추가 치료를 위해 벡터의 재투여를 필요로 하는 인간이다. 예를 들어, 간, 근육 및 망막(이 비히클에 대한 중화 항체에 의해 영향을 받는 모든 조직)에 대한 AAV 유전자 전달과 관련된 임상 시험의 긍정적인 결과를 기반으로 하여 이러한 치료 적용/질병 표적이 많이 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 임상 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 화합물(예를 들어, 감염성 rAAV 비리온)의 유효량은 특정 질병 상태(예를 들어, 암)(및/또는 이와 관련된 증상)의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전, 예방, 지연 또는 지체시키기에 충분한 양이다. 따라서, 감염성 rAAV 비리온의 유효량은 개체의 항-AAV 항체의 중화 활성을 회피할 수 있는 감염성 rAAV 비리온의 양이며, 따라서 이종성 핵산을 개체의 표적 세포(또는 표적 세포들)에 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 실시 양태로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지 및 기타 언급된 또는 언급된 범위의 중간 값은 본 발명에 포함됨을 이해해야 한다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참조로 본원에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a(하나)", "an(하나)" 및 "the(이)"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온"에 대한 언급은 다수의 이러한 비리온을 포함하고 "감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 비리온 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 따라서, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등의 배타적 용어를 사용하기 위한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.
명확성을 위해 별도의 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정 특징은 단일 실시예에서 조합하여 제공될 수도 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 속하는 실시예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시예 및 그 요소의 모든 하위 조합도 본 발명에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 하위 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 공개를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공개보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로 별도로 확인해야 할 수 있다.
본 개시 내용은 변이체 캡시드 단백질 및 이종성 핵산을 포함하는 감염성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 비리온을 제공한다. 본 개시 내용은 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 감염성 rAAV 비리온에 부여하는, 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(및/또는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산)을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 감염성 rAAV 비리온 및/또는 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 상기 비리온, 캡시드 단백질, 핵산, 및/또는 숙주 세포의 라이브러리를 추가로 제공하고; 여기서 라이브러리의 적어도 하나의 구성원의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용은 표적 세포가 대상 감염성 rAAV 비리온과 접촉되는 표적 세포에 이종성 핵산을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 유전자 산물을 개체에게 전달하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 대상 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함한다. 또한 본원은 대상 방법을 실행하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 많은 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온, 대상 핵산, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질, 대상 숙주 세포 등이 분리된다.
변이체 AAV 캡시드 폴리펩타이드
대상 변이체 AAV 캡시드 폴리펩타이드(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)는 변이체 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 부여한다. 일부 실시 양태에서, 증가된 내성은 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 내성보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배 , 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 더 크다.
대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 감염성 rAAV 비리온에 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 형질도입과 비교하여 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입을 부여한다고 말할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 증가된 형질도입은 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 형질도입보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배 , 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 더 크다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 중화 항체에 대한 감소된 결합을 나타낸다. 예를 들어, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대한 항체의 결합 친화성(binding affinity)과 비교하여 야생형 캡시드 AAV 단백질에 결합하는 중화 항체에 대한 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배 , 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 감소된 결합(예를 들어, 감소된 친화성)을 나타낼 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-AAV 중화 항체는 약 10-7 M 미만, 약 5×10-6M 미만, 약 10-6 M 미만, 약 5×10-5 M 미만, 약 10-5 M 미만, 약 10-4 M 미만, 또는 그 미만의 친화성으로 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)에 결합한다.
용어 "변이체 캡시드 단백질"은 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하지 않는다. "변이체 AAV 캡시드 단백질"은 자연 발생 AAV 캡시드 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 대상 변이체 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 1-9에 표시된 서열 중 어느 것에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다시 말해서, 대상 변이체 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 1-9 중 어느 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 변이체 캡시드 단백질은 "스타터" 또는 "모" AAV 캡시드 단백질과 아미노산 서열이 상이할 수 있으며, 이 모 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질 또는 비-야생형 AAV 캡시드 단백질일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열 중 아미노산 203-736에 대해 적어도 약 90%(예를 들어, 적어도 약 92%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%)) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%(예를 들어, 적어도 약 92%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%)) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열의 아미노산 203-736에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, D472N, N551S, I698V, 및 L735Q를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 10에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, D472N, N551S, I698V, 및 L735Q를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 31에 표시된 아미노산 서열의 아미노산 203-736에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, N551S, 및 I698V를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 31에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, N551S, 및 I698V를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 32에 표시된 아미노산 서열의 아미노산 203-736에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 D180N, N312K, Q385R, N449D, N551S, I698V, 및 S721T를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 32에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 D180N, N312K, Q385R, N449D, N551S, I698V, 및 S721T를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 33에 표시된 아미노산 서열의 아미노산 203-736에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, T450A, N551S, 및 I698V를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질(또는 대상 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질)은 서열 식별 번호 33에 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, AAV2의 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 서열 식별 번호 2) 또는 다른 AAV 모 혈청형의 상응하는 위치에 비해 아미노산 치환 N312K, N449D, T450A, N551S, 및 I698V를 포함한다.
예시적인 변이체 AAV 캡시드 단백질은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(선택된 예시적인 서열 정렬에 대해 도 8-10 참조):
SM 10-2(아미노산 서열)(서열 식별 번호 10); SM 10-2(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 22); Shuffle 100-1(아미노산 서열)(서열 식별 번호 11); Shuffle 100-1(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 23);
Shuffle 100-3(아미노산 서열)(서열 식별 번호 12):
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPTGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL;
Shuffle 100-3(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 24):
atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgacacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaaggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccaactggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccactgaaagatttgggactgtggcagtcaatctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgccatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagacgtatacctgcagggtcctatttgggccaaaattcctcacacggatggacactttcacccgtctcctctcatgggcggctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttcattcatcacccagtattccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacgttgatttcactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctgtaa;
Shuffle 100-7(아미노산 서열)(서열 식별 번호 13); Shuffle 100-7(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 25); Shuffle 10-2(아미노산 서열)(서열 식별 번호 26); Shuffle 10-2(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 34); Shuffle 10-6(아미노산 서열)(서열 식별 번호 27); Shuffle 10-6(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 35); Shuffle 10-8(아미노산 서열)(서열 식별 번호 28); Shuffle 10-8(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 36); Shuffle 100-2(아미노산 서열)(서열 식별 번호 29); Shuffle 100-2(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 37); SM 10-1(아미노산 서열)(서열 식별 번호 30); SM 10-1(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 38); SM 10-8(아미노산 서열)(서열 식별 번호 31); SM 10-8(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 39); SM 100-3(아미노산 서열)(서열 식별 번호 32); SM 100-3(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 40); SM 100-10(아미노산 서열)(서열 식별 번호 33); 및 SM 100-10(뉴클레오타이드 서열)(서열 식별 번호 41).
핵산 및 숙주 세포
본 개시 내용은 변이체 AAV 캡시드 단백질(전술한 바와 같음)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산뿐만 아니라 대상 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 핵산 및 숙주 세포는 rAAV 비리온(후술되는 바와 같음)을 생성하는 데 유용하다.
본 개시 내용은 대상 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 분리된 숙주 세포를 제공한다. 대상 숙주 세포는 "유전적으로 변형된 숙주 세포"로 지칭될 수 있고 전형적으로 분리된 세포, 예를 들어 시험관 내 배양 세포이다. 대상 숙주 세포는 후술되는 바와 같이, 대상 rAAV 비리온을 생산하는 데 유용하다. 대상 숙주 세포가 대상 rAAV 비리온을 생산하는 데 사용되는 경우, 이를 "패키징 세포"로 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 대상 숙주 세포는 대상 핵산으로 안정적으로 유전적으로 변형(즉, 안정적으로 형질감염)된다. 다른 실시 양태에서, 대상 숙주 세포는 대상 핵산으로 일시적으로 유전적으로 변형(즉, 일시적으로 형질감염)된다.
대상 핵산은 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포솜-매개 형질감염 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 확립된 기술을 사용하여 숙주 세포에 안정적으로 또는 일시적으로 도입된다. 안정적인 형질전환을 위해, 대상 핵산은 일반적으로 선택 가능한 마커, 예를 들어 네오마이신(neomycin) 내성 등과 같은 여러 잘 알려진 선택 가능한 마커 중 임의의 것을 추가로 포함할 것이다.
대상 숙주 세포는 대상 핵산을 임의의 다양한 세포, 예를 들어, 뮤린 세포 및 영장류 세포(예를 들어, 인간 세포)를 포함하는 포유동물 세포에 도입함으로써 생성된다. 적합한 포유동물 세포에는 1차 세포 및 세포주가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 여기서 적합한 세포주는 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, Vero 세포, 3T3 마우스 섬유아세포, C3H10T1/2 섬유아세포, CHO 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 대상 숙주 세포는 돌연변이체 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 더하여, 하나 이상의 AAV rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 대상 숙주 세포는 후술되는 바와 같이, rAAV 벡터를 추가로 포함한다. 아래에 더 상세히 기술되는 바와 같이, rAAV 비리온은 대상 숙주 세포를 사용하여 생성된다.
감염성 rAAV 비리온
대상 감염성 rAAV 비리온은 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 이종성 핵산(아래에 더 상세히 기재됨)을 포함하고, 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 내성과 비교하여 인간 AAV 중화 항체에 대한 증가된 내성을 나타낸다. "증가된 내성"은 대상 감염성 rAAV 비리온이 인간 항-AAV 항체의 존재 하에 증가된 감염성을 나타낸다는 것을 의미한다. 전술한 바와 같이, 바이러스 감염성은 총 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율로 표현될 수 있다. 따라서 증가된 감염성은 총 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 증가된 비율을 의미한다. 인간 항-AAV 항체에 대한 AAV의 내성을 결정하기 위해, 유전자 전달 효율(즉, 감염성)을 인간 항-AAV 항체가 없는 경우의 50%로 감소시키는 데 필요한 항체 농도(예를 들어, 혈청 농도, IVIG 농도 등)(mg/mL)를 얻기 위해 다양한 농도의 인간 항-AAV 항체의 존재 하에 AAV의 감염성을 측정한다. 인간 항-AAV 항체가 없을 때의 50%로 유전자 전달 효율을 감소시키기 위해 더 높은 항체 농도를 요구하는 바이러스는 항체 중화에 대한 증가된 내성을 갖는다고 한다. 따라서, 내성의 2배 증가는 유전자 전달 효율을 인간 항-AAV 항체가 없는 경우의 50%로 감소시키는 데 필요한 항체 농도의 2배 증가를 의미한다. 일부 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 내성보다 인간 AAV 중화 항체에 대해 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어생물학적 분포배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 더 큰 내성을 나타낸다.
대상 감염성 rAAV 비리온은 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 증가된 형질도입을 나타낸다고 말할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV(예를 들어, AAV2(야생형 AAV 혈청형 2)) 또는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV에 의해 나타나는 형질도입보다 인간 AAV 중화 항체의 존재 하에 포유동물 세포의 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어생물학적 분포배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 더 큰 형질도입을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 중화 항체에 대한 감소된 결합을 나타낸다. 예를 들어, 대상 감염성 rAAV 비리온은 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대한 항체의 결합 친화성과 비교하여 야생형 캡시드 AAV 단백질에 결합하는 중화 항체에 대해 적어도 약 1.5배(예를 들어, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어생물학적 분포배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 17배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배 등) 감소된 결합(예를 들어, 감소된 친화성)을 나타낼 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-AAV 중화 항체는 약 10-7 M 미만, 약 5×10-6 M 미만, 약 10-6M 미만, 약 5×10-5M 미만, 약 10-5M 미만, 약 10-4M 미만, 또는 그 미만의 친화성으로 대상 감염성 rAAV 비리온에 결합한다.
일부 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV와 비교하여 증가된 생체 내 체류 시간을 나타낸다. 예를 들어, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 AAV의 체류 시간보다 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 또는 그 이상 더 긴 체류 시간을 나타낸다.
주어진 대상 감염성 rAAV 비리온이 중화 항체에 대한 감소된 결합 및/또는 중화 항체에 대한 증가된 내성을 나타내는지 여부는 당업자에게 공지된 임의의 편리한 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 야생형 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 단백질을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 대상 감염성 rAAV 비리온은 하나 이상의 변이체 캡시드 단백질에 더하여 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 단백질 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
이종성 핵산
대상 rAAV 벡터(예를 들어, 대상 감염성 rAAV 비리온)에서 사용하기 위한 적합한 이종성 DNA 분자(본원에서 "이종성 핵산"으로도 지칭됨)는 임의의 이종성 핵산일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이종성 핵산은 폴리펩타이드(예를 들어, 표적 세포에 일부 원하는 특성을 부여하는 단백질, 예를 들어 세포 추적을 허용하는 형광 단백질, 표적 세포에서 누락되거나 변경된 활성을 제공하는 효소, 등)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이종성 핵산은 RNA 간섭제(상기 정의된 바와 같음)를 포함한다.
대상 이종성 핵산은 일반적으로 크기가 약 5 킬로베이스(kilobase)(kb) 미만일 것이고, 예를 들어 수용자 개체 또는 표적 세포로부터 결함이 있거나 누락된 단백질을 인코딩하는 유전자(뉴클레오타이드 서열)를 포함할 것이다; 원하는 생물학적 또는 치료적 효과(예를 들어, 항균, 항바이러스 또는 항종양/항암 기능)를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자; 유해하거나 그렇지 않으면 원하지 않은 단백질의 생성을 억제하거나 감소시키는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 RNA 간섭제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열); 및/또는 항원성 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
적합한 이종성 핵산에는 내분비, 대사, 혈액, 심혈관, 신경, 근골격, 비뇨기과, 폐 및 면역 장애(염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환과 같은 장애 포함)의 치료에 사용되는 단백질을 인코딩하는 것들이 포함되지만 이에 국한되지 않으며, 이러한 장애에는 다음을 포함한다: 후천성 면역결핍 증후군(acquired immunodeficiency syndrome)(AIDS), 암(cancer), 고콜레스테롤혈증(hypercholestemia), 활성인자 결핍/GM2 강글리오시드증(Activator Deficiency/GM2 Gangliosidosis)과 같은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage diseases), 알파-만노시드증(Alpha-mannosidosis), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(Cholesteryl ester storage disease), 만성 헥소사미니다제 A 결핍증(Chronic Hexosaminidase A Deficiency), 시스틴증(Cystinosis), 다농병(Danon disease), 파브리병(Fabry disease), 파베르병(Farber disease), 후코시드증(Fucosidosis), 갈락토시알리도증(Galactosialidosis), 고셔병(Gaucher Disease), GM1 강글리오시드증(GM1 gangliosidosis), I-세포병/점액지질증 II(I-Cell disease/Mucolipidosis II), 유아 유리 시알산 축척 질환/ISSD(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease/ISSD), 소아 헥소사미니다제 A 결핍(Juvenile Hexosaminidase A Deficiency), 크라베병(Krabbe disease), 리소좀산 리파제 결핍증(Lysosomal acid lipase deficiency), 변색성 백혈구(Metachromatic Leukodystrophy), 점액다당류 장애(Mucopolysaccharidoses disorders)(가성-헐러 다이영양증/점액지질증 IIIA(Pseudo-Hurler polydystrophy/Mucolipidosis IIIA), MPSI 헐러 증후군(MPSI Hurler Syndrome), MPSI 샤이 증후군(MPSI Scheie Syndrome), MPS I 헐러-샤이 증후군(MPS I Hurler-Scheie Syndrome), MPS II 헌터 증후군(MPS II Hunter syndrome), 산필리포 증후군 유형 A/MPS III A(Sanfilippo syndrome Type A/MPS III A), 산필리포 증후군 유형 B/MPS III B(Sanfilippo syndrome Type B/MPS III B), 산필리포 증후군 유형 C/MPS III C(Sanfilippo syndrome Type C/MPS III C), 산필리포 증후군 유형 D/MPS III D(Sanfilippo syndrome Type D/MPS III D), 모르퀴오 유형 A/MPS IVA(Morquio Type A/MPS IVA), 모르퀴오 유형 B/MPS IVB(Morquio Type B/MPS IVB), MPS IX 히알루로니다제 결핍증(MPS IX Hyaluronidase Deficiency), MPS VI 마로토-라미(MPS VI Maroteaux-Lamy), MPS VII 슬라이 증후군(MPS VII Sly Syndrome), 점액 지질증 I/시알리도증(Mucolipidosis I/Sialidosis), 점액 지질증 IIIC(Mucolipidosis IIIC) 및 점액지질증 유형 IV(Mucolipidosis type IV)를 포함), 다발성 설파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease), 신경 세로이드 리포푸시노즈(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses), 폼페병/글리코겐 축적 질환 유형 II(Pompe disease/Glycogen storage disease type II), 피크노이소스토시스(Pycnodysostosis), 샌드호프병/성인 발병/GM2 강글리오시드증(Sandhoff disease/Adult Onset/GM2 Gangliosidosis), 샌드호프병/GM2 강글리오시드증-영아기(Sandhoff disease/GM2 gangliosidosis―Infantile), 샌드호프병 강글리오시드증-소아(Sandhoff disease/GM2 gangliosidosis―Juvenile), 쉰들러병(Schindler disease), 살라병/시알산 축적병(Salla disease/Sialic Acid Storage Disease), 테이-삭스/GM2 강글리오시드증(Tay-Sachs/GM2 gangliosidosis), 및 월만병(Wolman disease), 당뇨병(diabetes)과 같은 인슐린 장애(insulin disorders), 성장 장애(growth disorders), 각종 빈혈(anemias), 지중해 빈혈(thalassemias) 및 혈우병(hemophilia)을 포함한 각종 혈액 장애(blood disorders); 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 고셔병(Gaucher's Disease), 헐러병(Hurler's Disease), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase)(ADA) 결핍(deficiency), 폐기종(emphysema) 등과 같은 유전적 결함(genetic defects).
적합한 이종성 핵산은 다음이 포함되지만 이에 국한되지 않는, 다양한 단백질 중 임의의 것을 인코딩하는 것들이 포함된다:
인터페론(interferon)(예를 들어, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN- ω, IFN-τ); 인슐린(예를 들어, Novolin, Humulin, Humalog, Lantus, Ultralente 등); 에리트로포이에틴(erythropoietin)("EPO"; 예를 들어, Procrit®, Eprex®, 또는 Epogen®(epoetin-α); Aranesp®(darbepoietin-α); NeoRecormon®, Epogin®(epoetin-β) 등); 항체(예를 들어, 단일클론 항체)(예를 들어, Rituxan®(rituximab); Remicade®(infliximab); Herceptin®(trastuzumab); Humira™(adalimumab); Xolair®(omalizumab); Bexxar®(tositumomab); Raptiva™ (efalizumab); Erbitux™(cetuximab); Avastin® (bevacizumab) 등), 단일클론 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, Lucentis®(ranibizumab) 포함)); 혈액 인자(예를 들어, Activase®(alteplase) 조직 플라스미노겐 활성화제; NovoSeven®(재조합 인간 인자 VIIa); 인자 VIIa; 인자 VIII(예를 들어, Kogenate®); 인자 IX, β-글로빈, 헤모글로빈 등); 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor)(예를 들어, Neupogen®(filgrastim; G-CSF); Neulasta(pegfilgrastim); 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte-monocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(granulocyte-monocyte colony stimulating factor), 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor), 거핵구 콜로니 자극 인자(megakaryocyte colony stimulating factor) 등); 성장 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀(somatotropin), 예를 들어 Genotropin®, Nutropin®, Norditropin®, Saizen®, Serostim®, Humatrope® 등; 인간 성장 호르몬 등); 인터류킨(interleukin)(예를 들어, IL-1; IL-2, 예를 들어, Proleukin® 포함; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등); 성장 인자(예를 들어, Regranex®(beclapermin; PDGF); Fiblast®(trafermin; bFGF); Stemgen®(ancestim; 줄기세포 인자); 각질세포 성장 인자; 산성 섬유아세포 성장 인자, 줄기세포 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 등); 가용성 수용체(예를 들어, Enbrel®(etanercept)와 같은 TNF-α-결합 가용성 수용체; 가용성 VEGF 수용체; 가용성 인터루킨 수용체; 가용성 γ/δ T 세포 수용체 등); 효소(예를 들어, α-글루코시다제(glucarase), Cerazyme®(이미글루카라제(imiglucarase), β-글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), Ceredase®(alglucerase)); 효소 활성화제(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화제), 케모카인(chemokine)(예를 들어, IP-10; Mig; Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등); 혈관신생제(예를 들어, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor )(VEGF); 항혈관신생제(예를 들어, 가용성 VEGF 수용체); 단백질 백신; 브래디키닌(bradykinin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 가스틴(gastin), 세크레틴(secretin), 옥시토신(oxytocin), 고나도트로핀 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone), 베타-엔도르핀(beta-endorphin), 엔케팔린(enkephalin), 물질 P(substance P), 소마토스타틴(somatostatin), 프로락틴(prolactin), 갈라닌(galanin), 성장 호르몬 방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 봄베신(bombesin), 다이노르핀(dynorphin), 뉴로텐신(neurotensin), 모틸린(motilin), 티로트로핀(thyrotropin), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 황체형성 호르몬(luteinizing hormone), 칼시토닌(calcitonin), 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon), 바소프레신(vasopressin), 안지오텐신 II(angiotensin II), 티로트로핀 방출 호르몬(thyrotropin-releasing hormone), 혈관활성 장 펩타이드(vasoactive intestinal peptide), 수면 펩타이드(sleep peptide 등과 같은 신경 활성 펩타이드(neuroactive peptide); 혈전용해제(thrombolytic agent), 심방 나트륨 이뇨 펩타이드(atrial natriuretic peptide), 뼈 형성 단백질(bone morphogenic protein), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 릴랙신(relaxin), 교종 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein), 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, 인간 알파-1 항트립신(human alpha-1 antitrypsin), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor), 변형 성장 인자(transforming growth factor), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone), 대식세포 활성화 인자(macrophage activating factor), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 호중구 주화 인자(neutrophil chemotactic factor), 신경 성장 인자(nerve growth factor), 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(tissue inhibitor of metalloproteinases)와 같은 기타 단백질; 혈관 활성 장 펩타이드(vasoactive intestinal peptide), 안지오제닌(angiogenin), 안지오트로핀(angiotropin), 피브린(fibrin); 히루딘(hirudin); 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor); IL-1 수용체 길항제(예를 들어, Kineret®(anakinra)); 이온 채널, 예를 들어 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(CFTR); 디스트로핀(dystrophin); 종양 억제제(tumor suppressor)인 유트로핀(utrophin); 리소좀 효소 산 α-글루코시다아제(lysosomal enzyme acid α-glucosidase)(GAA); 등등. 적합한 핵산은 또한 전술한 단백질 중 임의의 것의 기능적 단편을 인코딩하는 것들을 포함하고; 그리고 전술한 단백질 중 임의의 것의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
적합한 이종성 핵산은 또한 항원성 단백질을 인코딩하는 것들을 포함한다. 항원성 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 대상 rAAV 벡터는 포유동물 숙주에서 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 자극하는 데 적합하다. 항원성 단백질은 자가항원, 알레르겐(allergen), 종양/암-관련 항원, 병원성 바이러스, 병원성 박테리아, 병원성 원생동물, 병원성 기생충, 또는 포유동물 숙주를 감염시키는 임의의 다른 병원성 유기체로부터 유래된다. 본원에 사용된 용어 "유래 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산"은 야생형 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 바이러스 단백질을 인코딩하는 병원성 바이러스로부터 분리된 핵산; 자연 발생 항원성 단백질과 아미노산 서열이 동일한 항원성 단백질을 인코딩하는 실험실에서 생성된 합성 핵산; 자연 발생 항원성 단백질과 아미노산 서열이 다르지만(예를 들어, 1개 아미노산 내지 약 15개 아미노산) 그럼에도 불구하고 상응하는 자연 발생 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 항원성 단백질을 인코딩하는 실험실에서 생성된 합성 핵산; 항원성 단백질의 단편(예를 들어, 약 5개 아미노산 내지 약 50개 아미노산의 단편, 이 단편은 하나 이상의 항원성 에피토프(epitope)를 포함)을 인코딩하는 실험실에서 생성된 합성 핵산, 이 단편은 상응하는 자연 발생 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도함; 등을 포함한다.
유사하게, 자가항원, 알레르겐, 종양/암-관련 항원, 병원성 바이러스, 병원성 박테리아, 병원성 원생동물, 병원성 기생충, 또는 포유동물 숙주를 감염시키는 임의의 다른 병원성 유기체"로부터 유래된" 항원성 단백질은, 자연 발생 항원성 단백질과 아미노산 서열이 동일한 단백질, 및 자연 발생 항원성 단백질과 아미노산 서열이 다르지만(예를 들어, 1개 아미노산 내지 약 15개 아미노산) 그럼에도 불구하고 상응하는 자연 발생 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 단백질; 및 항원성 단백질의 단편(예를 들어, 약 5개 아미노산 내지 약 100개 아미노산의 단편, 예를 들어, 약 5개 내지 약 50개 아미노산의 단편, 이 단편은 하나 이상의 항원성 에피토프를 포함), 이 단편은 상응하는 자연 발생 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도함;을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상 rAAV 벡터에 의해 인코딩되는 항원성 단백질에 대한 면역 반응은 포유동물 숙주에서 항원성 단백질 또는 항원성 에피토프(또는 rAAV-인코딩된 항원성 단백질 또는 항원성 에피토프와 함께 교차 반응성(cross-reactive)인 단백질 또는 에피토프)를 표시하는 병원성 유기체에 대한 보호 면역 반응을 자극할 것이다. 일부 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)(CTL) 반응은 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 다른 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 체액성 반응은 항원성 단백질에 특이적인 항체가 생성되도록 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 많은 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 TH1 면역 반응은 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 적합한 항원성 단백질은 종양/암-관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 및 원생동물 항원; 및 이의 항원성 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원성 단백질은 세포 내 병원체로부터 유래된다. 다른 실시 양태에서, 항원성 단백질은 자가-항원이다. 또 다른 실시 양태에서, 항원성 단백질은 알레르겐이다.
종양/암 특이적 항원에는 MAGE 1(예를 들어, GenBank 수탁번호 M77481), MAGE 2(예를 들어, GenBank 수탁번호 U03735), MAGE 3, MAGE 4 등을 포함하는 다양한 MAGEs(흑색종 관련 항원 E)(Melanoma-Associated Antigen E) 중 임의의 것; 다양한 티로시나제(tyrosinase) 중 임의의 것; 돌연변이 라스(mutant ras); 돌연변이 p53(예를 들어, GenBank 수탁번호 X54156 및 AA494311); 및 p97 흑색종 항원(예를 들어, GenBank 수탁번호 M12154)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 종양/암 특이적 항원에는 진행성 암과 관련된 Ras 펩타이드 및 p53 펩타이드, 자궁경부암과 관련된 HPV 16/18 및 E6/E7 항원, 유방암과 관련된 MUCI1-KLH 항원(예를 들어, GenBank 수탁번호 J03651), 결장직장암과 관련된 CEA(암배아 항원(carcinoembryonic antigen))(예를 들어, GenBank 수탁번호 X98311), gp100(예를 들어, GenBank 수탁번호 S73003) 또는 흑색종과 관련된 MART1 항원, 및 전립선암과 관련된 PSA 항원(예를 들어, GenBank 수탁번호 X14810)을 포함한다. p53 유전자 서열은 공지되어 있고(예를 들어, Harris et al. (1986) Mol. Cell. Biol., 6:4650-4656을 참조), 수탁번호 M14694로 GenBank에 수탁되어 있다. 따라서, 대상 단백질, 핵산 및/또는 비리온은 자궁경부암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 폐암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암에 대한 면역치료제로 사용될 수 있다.
바이러스 항원은 홍역, 볼거리, 풍진, 소아마비, 간염 A, B형(예를 들어, GenBank 수탁번호 E02707) 및 C형(예를 들어, GenBank 수탁번호 E06890), 기타 간염 바이러스, 인플루엔자, 아데노바이러스(예를 들어, 4형 및 7형), 광견병(예를 들어, GenBank 수탁번호 M34678), 황열병, 일본 뇌염(예를 들어, GenBank 수탁번호 E07883), 뎅기열(예를 들어, GenBank 수탁번호 M24444), 한타바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, GenBank 수탁번호 U18552)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 질병의 원인이 되는 알려진 원인 물질로부터 유래된다.
적합한 박테리아 및 기생충 항원은 디프테리아(diphtheria), 백일해(pertussis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 M35274), 파상풍(tetanus(예를 들어, GenBank 수탁번호 M64353), 결핵(tuberculosis, 세균성 및 진균성 폐렴(bacterial and fungal pneumonias)(예를 들어, Haemophilus influenzae, Pneumocystis carinii 등), 콜레라(cholera), 장티푸스(typhoid), 페스트(plague), 이질균증(shigellosis), 살모넬라증(salmonellosis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 L03833), 재향 군인병(Legionnaire's Disease), 라임병(Lyme disease)(예를 들어, GenBank 수탁번호 U59487), 말라리아(malaria(예를 들어, GenBank 수탁번호 X53832), 구충(hookworm), 사상충증(onchocerciasis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 M27807), 주혈흡충증(schistosomiasis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 L08198), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 레쉬만편모충증(leshmaniasis), 편모충증(giardiasis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 M33641), 아메바증(amoebiasis), 사상충증(filariasis)(예를 들어, GenBank 수탁번호 J03266), 보렐리아증(borreliosis) 및 선모충증(trichinosis)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 질병의 원인이 되는 알려진 원인 물질로부터 유래된 항원을 포함한다.
이종성 유전자 산물을 인코딩하는 적합한 이종성 핵산에는 RNAi 작용제(위에서 더 자세히 기술됨)(예를 들어, 안티센스 RNA; siRNA; shRNA; 이중 가닥 RNA(dsRNA); CRISPR 작용제, 예를 들어 Cas9 또는 Cas9-유사 단백질, crRNA-유사 RNA, tracrRNA-유사 RNA, 단일 가이드 RNA 및/또는 기증자 폴리뉴클레오타이드 등)와 같은 비번역 RNA, 리보자임(ribozyme) 등을 포함한다. RNAi 작용제는 유전자 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 일부 RNAi 작용제는 이후에 유전자 발현을 억제하는 데 사용할 수 있는 도구를 제공한다(예를 들어, cas9 또는 cas9-유사 단백질과 같은 CRISPR 작용제).
표적 유전자는 유해한(예를 들어, 병리학적인) 표적 유전자 산물(RNA 또는 단백질), 예를 들어 오작동하는 표적 유전자 산물(예를 들어, 인코딩된 단백질 서열의 돌연변이, 유전자 산물의 정상 상태 수준을 제어하는 비-코딩 서열의 돌연변이로 인한 것 등)을 인코딩하는 임의의 유전자를 포함한다. 표적 유전자 산물에는 헌팅틴(huntingtin); C형 간염 바이러스(hepatitis C virus); 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus); 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein); 타우(tau); 폴리글루타민 반복(polyglutamine repeat)을 포함하는 단백질; 헤르페스 바이러스(herpes virus)(예를 들어, 수두 대상포진(varicella zoster)); 모든 병리학적 바이러스 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
RNAi 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 이러한 대상 rAAV는 신경퇴행성 질환, 예를 들어 트리뉴클레오타이드 반복 질환, 예를 들어, 폴리글루타민 반복과 관련된 질병, 예를 들어 헌팅턴병, 척수소뇌 운동실조, 척수 및 구근 근위축증(spinal and bulbar muscular atrophy)(SBMA), 치아루브로팔리돌루이시안 위축증(dentatorubropallidoluysian atrophy)(DRPLA) 등; HCV 감염의 결과로 발생하거나 발생할 수 있는 간염과 같은 바이러스 감염과 같은 후천성 병리(예를 들어, 비정상적인 생리적, 생화학적, 세포적, 구조적 또는 분자적 생물학적 상태에 의해 나타나는 질병 또는 증후군), HIV 감염의 결과로 발생하는 후천성 면역 결핍 증후군; 암 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 장애 및 병태를 치료하는 데 유용하다.
많은 실시 양태에서, RNAi 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있고 임의의 단백질-인코딩 유전자, 예를 들어 내인적으로 조절되는 유전자 또는 구성적으로 발현되는 유전자의 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 세포 생리학적 사건, 예를 들어 열 쇼크, 산소 수준 및/또는 일산화탄소 수준, 예를 들어 저산소증에 의해 조절되는 유전자의 프로모터는 siRNA-인코딩 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
EPO-인코딩 또는 관심 핵산과 같은 선택된 이종성 뉴클레오타이드 서열은 생체 내 뉴클레오타이드 서열에서 그의 전사 또는 발현을 지시하는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 제어 요소는 선택된 유전자(예를 들어, 내인성 세포 제어 요소)와 정상적으로 관련된 제어 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 제어 서열이 사용될 수 있다. 유용한 이종성 제어 서열은 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 예에는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 장기 반복부(long terminal repeat)(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter)(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)(HSV) 프로모터, 관심 유전자에 이종성인 내인성 세포 프로모터, 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 전초기 프로모터 영역(immediate early promoter region)(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus)(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 뮤린 메탈로티오네인 유전자(murine metallothionein gene)와 같은 비바이러스 유전자로부터 유래된 서열도 본원에서 사용될 것이다. 이러한 프로모터 서열은 예를 들어 Stratagene (San Diego, Calif.)으로부터 상업적으로 입수 가능하다.
일부 실시 양태에서, 세포 유형-특이적 또는 조직-특이적 프로모터는 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 이종성 핵산에 작동 가능하게 연결되어, 유전자 산물이 특정 세포 유형(들) 또는 조직(들)에서 선택적으로 또는 우선적으로 생산된다. 일부 실시 양태에서, 유도성 프로모터는 이종성 핵산에 작동 가능하게 연결될 것이다.
예를 들어, 근육 특이적 및 유도성 프로모터, 인핸서 등은 유전자 산물을 근육 세포로 전달하는 데 유용하다. 이러한 제어 요소에는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 액틴 및 mytoD 유전자 패밀리와 같은 미오신 유전자 패밀리로부터 유래된 것들; 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2; 인간 골격 액틴 유전자 및 심장 액틴 유전자로부터 유래된 제어 요소; 근육 크레아틴 키나제 서열 요소 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서(murine creatine kinase enhancer)(mCK) 요소; 골격 속근 트로포닌 C 유전자, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자에서 유래된 제어 요소; 저산소증 유발성 핵인자; 스테로이드 유도성 요소 및 프로모터들, 예를 들어 글루코코르티코이드 반응 요소(glucocorticoid response element)(GRE); RU486 유도를 위한 융합 합의 요소(fusion consensus element); 및 테트라사이클린(tetracycline) 조절 유전자 발현을 제공하는 요소.
AAV ITR에 의해 결합된 관심 DNA 분자(이종성 DNA)를 보유하는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 주요 AAV 오픈 리딩 프레임("ORFs")에서 절단된 AAV 게놈에 직접 삽입하여 구성할 수 있다. 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 ITR의 충분한 부분이 남아 있는 한, AAV 게놈의 다른 부분도 삭제할 수 있다. 이러한 구조물은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,173,414 및 5,139,941; International Publication Nos. WO 92/01070 (published Jan. 23, 1992) 및 WO 93/03769 (published Mar. 4, 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875를 참조.
대안적으로, AAV ITR은 바이러스 게놈으로부터 또는 당업자에게 공지된 임의의 편리한 방법을 사용하여 다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구조물의 동일하고 융합된 5' 및 3'을 함유하는 AAV 벡터로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 접근법은 Sambrook et al., supra에 기술된 것과 같은, 표준 결찰 기술을 사용한다. 예를 들어, 결찰은 20mM Tris-Cl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 33μg/ml BSA, 10mM-50mM NaCl, 및 0℃ 내지 16℃에서 40μM ATP, 0.01-0.02(Weiss) 단위 T4 DNA 리가제(ligase)("스티키 말단(sticky end)" 결찰용) 또는 14℃에서 1mM ATP, 0.3-0.6(Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("블런트 말단(blunt end)" 결찰용)에서 수행할 수 있다. 분자간 "스티키 말단" 결찰은 일반적으로 30-100μg/ml 총 DNA 농도(5-100nM 총 말단 농도)에서 수행된다. ITR을 함유하는 AAV 벡터는, 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,139,941에 기술되어 있다. 특히, 수탁번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226 하에 American Type Culture Collection("ATCC")에서 입수할 수 있는 여러 AAV 벡터가 여기에 기술되어 있다.
추가로, 키메라 유전자는 하나 이상의 선택된 핵산 서열의 5' 및 3'에 배열된 AAV ITR 서열을 포함하도록 합성적으로 생성될 수 있다. 포유동물 근육 세포에서 키메라 유전자 서열의 발현을 위한 바람직한 코돈이 사용될 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오타이드로부터 조립된다. 예를 들어, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al. Science (1984) 223:1299; Jay et al. J. Biol. Chem. (1984) 259:6311를 참조.
대상 감염성 rAAV 비리온의 생성
도입의 방식으로, rAAV 벡터 복제 및 패키징을 위해 숙주 또는 "생산자(productor)" 세포를 사용하는 것이 일반적이다. 이러한 생산자 세포(보통 포유동물 숙주 세포)는 일반적으로 rAAV 생산을 위한 여러 상이한 유형의 성분을 포함하거나 포함하도록 변형된다. 첫번째 구성요소는 숙주 패키징 세포에 의해 복제되고 벡터 입자로 패키징될 수 있는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 게놈(또는 "rAAV 프로-벡터")이다. rAAV 프로-벡터는 일반적으로 이종성 폴리뉴클레오타이드(또는 "이식유전자")를 포함할 것이며, 이를 통해 유전자 요법의 맥락에서 다른 세포를 유전적으로 변경하는 것이 바람직한다(이러한 이식유전자를 rAAV 벡터 입자로 패키징하는 것이 다양한 포유동물 세포에 이식유전자를 전달하기 위해 효과적으로 사용될 수 있기 때문). 이식유전자는 일반적으로 AAV 벡터의 절단, 복제 및 패키징 동안 뿐만 아니라 벡터가 숙주 세포 게놈으로 통합되는 동안 인식되는 서열을 포함하는 2개의 AAV 역 말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된다.
두 번째 구성요소는 AAV 복제를 위한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 헬퍼 바이러스이다. 아데노바이러스가 일반적으로 사용되지만, 당업계에 알려진 바와 같이 다른 헬퍼 바이러스도 사용될 수 있다. 대안적으로, 필수 헬퍼 바이러스 기능은 헬퍼 바이러스로부터 유전적으로 분리될 수 있고 인코딩 유전자는 트랜스로 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터 요소 및 헬퍼 바이러스(또는 헬퍼 바이러스 기능)는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다.
생산자 세포에 제공될 AAV 생산을 위한 최종 구성요소는 각각 복제 및 캡슐화 단백질을 제공하는 AAV rep 및 cap 유전자와 같은 "AAV 패키징 유전자"이다. AAV 패키징 유전자의 여러 다양한 버전이 제공될 수 있다(rep 및/또는 cap 유전자가 천연 프로모터의 제어 하에 남아 있거나 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 rep-cap 카세트 및 별도의 rep 및/또는 cap 카세트를 포함한다). 이러한 AAV 패키징 유전자는 당업계에 공지되어 있고 하기에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 숙주 패키징 세포 내로 일시적으로 또는 안정적으로 도입될 수 있다.
1. rAAV 벡터
관심 이종성 DNA(여기서 "관심 이종성 DNA"는 본원에서 "이종성 핵산"으로도 지칭됨)를 포함하는 대상 rAAV 비리온은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 (1) 대상 rAAV 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (2) AAV 헬퍼 구조물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 헬퍼 구조물은 AAV 벡터로부터 누락된 AAV 헬퍼 기능을 보완하기 위해 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함한다; (3) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 및/또는 액세서리(accessory) 기능 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 여기서 헬퍼 바이러스 및/또는 액세서리 기능 벡터는 숙주 세포에서 효율적인 재조합 AAV("rAAV") 비리온 생산을 지원할 수 있는 액세서리 기능을 제공한다; 및 (4) rAAV 비리온을 생산하기 위해 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. AAV 발현 벡터, AAV 헬퍼 구조물 및 헬퍼 바이러스 또는 액세서리 기능 벡터(들)는 표준 형질감염 기술을 사용하여 동시에 또는 연속적으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
AAV 발현 벡터는 적어도 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 구성요소로서, 전사 개시 영역, 관심 DNA 및 전사 종결 영역을 포함하는 제어 요소를 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구성된다. 제어 요소는 포유류 근육 세포에서 기능하도록 선택된다. 작동적으로 연결된 구성요소를 포함하는 생성된 구성물은 기능적 AAV ITR 서열과 결합된다(5' 및 3').
AAV ITR 영역의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-2 서열에 대해 Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)를 참조. 본 발명의 벡터에 사용되는 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없으며, 예를 들어 뉴클레오타이드의 삽입, 삭제 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 여러 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 또한, AAV 발현 벡터에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 측면에 있는 5' 및 3' ITR은, 의도된 대로 기능하는 한, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터으로부터 관심 서열의 절단 및 보호(rescue)를 허용하는 한, 그리고 AAV Rep 유전자 산물이 세포에 존재할 때 DNA 분자가 수용체 세포 게놈으로 통합을 허용하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 분리물로부터 유래될 필요는 없다. ITR은 Rep 단백질의 적절한 혼합물이 있는 경우 벡터 서열의 복제를 허용한다. ITR은 또한 AAV 입자를 생성하기 위해 캡시드 내로 벡터 서열의 통합을 허용한다.
rAAV 비리온을 생산하기 위해, AAV 발현 벡터는 형질감염과 같은 공지된 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197을 참조. 특히, 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘 공침(phosphate co-precipitation)(Graham et al. (1973) Virol. 52:456-467), 배양된 세포로의 직접 미세주입(Capecchi, M. R. (1980) Cell 22:479-488), 전기천공법(Shigekawa et al. (1988) BioTechniques 6:742-751), 리포솜 매개 유전자 전달(Mannino et al. (1988) BioTechniques 6:682-690), 지질 매개 형질도입(Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), 및 고속 미세발사체를 사용한 핵산 전달(Klein et al. (1987) Nature 327:70-73)을 포함한다.
본 개시 내용의 목적을 위해, rAAV 비리온을 생산하기 위한 적합한 숙주 세포는 이종성 DNA 분자의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되어 온 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다. 이 용어는 형질감염된 근원 세포(original cell)의 자손을 포함한다. 따라서, rAAV 비리온을 생산하기 위한 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 안정한 인간 세포주 293(예를 들어, 수탁번호 ATCC CRL1573 하에 American Type Culture Collection을 통해 쉽게 입수 가능)으로부터의 세포가 많은 실시 양태에서 사용된다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 5형 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이며(Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다(Aiello et al. (1979) Virology 94:460). 293 세포주는 쉽게 형질감염되고 rAAV 비리온을 생산하는 데 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
2. AAV 헬퍼 기능
상기 기재된 AAV 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 rAAV 비리온을 생산하기 위해 AAV ITR에 의해 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 복제하고 캡슐화하기 위해 AAV 헬퍼 기능을 제공할 수 있게 되어야 한다. AAV 헬퍼 기능은 일반적으로, 결과적으로 생산적인 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 산물을 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV 유래 코딩 서열이다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터에서 누락된 필수 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV ORF 중 하나 또는 둘 모두, 즉 rep 및 cap 코딩 영역, 또는 그의 기능적 상동체를 포함한다. 본 개시 내용의 맥락에서, cap 기능은 하나 이상의 돌연변이체 캡시드 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 캡시드 단백질은 상기 기재된 바와 같이 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
"AAV rep 인코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 인코딩하는 AAV 게놈의 당업계에서 인정하는 영역을 의미한다. 이러한 Rep 발현 산물은, DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉킹(nicking), DNA 헬리카제(helicase) 활성 및 AAV(또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사 조절을 포함하는 많은 기능을 보유하는 것으로 나타났다. Rep 발현 산물은 AAV 게놈을 복제하는 데 집합적으로 필요하다. AAV rep 코딩 영역에 대한 설명은, 예를 들어 Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; 및 Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801를 참조. AAV rep 코딩 영역의 적합한 상동체는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로도 알려진 인간 헤르페스바이러스 6(HHV-6) rep 유전자를 포함한다(Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
AAV cap 단백질은 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3 중 적어도 하나는 상기 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 이전에 또는 이와 동시에 AAV 헬퍼 구조물로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. 따라서 AAV 헬퍼 구조물은 생산적인 AAV 감염에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공하는 데 사용된다. AAV 헬퍼 구조물에는 AAV ITR이 없으며 스스로 복제하거나 패키징 할 수 없다. 이러한 구조물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. Rep 및 Cap 발현 산물을 모두 인코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 구조물이 기재되었다. 예를 들어, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945를 참조. Rep 및/또는 Cap 발현 산물을 인코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되었다. 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,139,941를 참조.
AAV 발현 벡터 및 AAV 헬퍼 구조물 둘 모두는 하나 이상의 선택적인 선택가능한 마커를 함유하도록 구성될 수 있다. 적절한 마커는 세포가 적절한 선택 배지에서 성장할 때 선택 마커를 함유하는 핵산 구성물로 형질감염된 세포에 항생제 내성 또는 감수성을 부여하거나, 색을 부여하거나, 항원 특성을 변경하는 유전자를 포함한다. 본 개시 내용의 방법을 실행하는 데 유용한 몇몇 선택 가능한 마커 유전자는, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 내성을 부여함으로써 포유동물 세포에서 선택을 허용하는 하이그로마이신 B 내성 유전자(아미노글리코시드 포스포트랜퍼라제(Aminoglycoside phosphotranferase)(APH)를 인코딩함); G418에 대한 내성을 부여함으로써 포유동물 세포에서 선택을 허용하는 네오마이신 포스포트랜퍼라제 유전자(네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotranferase)를 인코딩함) 등을 포함한다. 다른 적합한 마커는 당업자에게 공지되어 있다.
3. AAV 액세서리 기능
숙주 세포(또는 패키징 세포)는 또한 rAAV 비리온을 생산하기 위해 비 AAV 유래 기능, 또는 "액세서리 기능"을 제공할 수 있어야 한다. 액세서리 기능은 AAV가 복제에 의존하는 비 AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능이다. 따라서, 액세서리 기능에는, AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립에 관련된 것을 비롯한 AAV 복제에 필요한 비 AAV 단백질 및 RNA가 적어도 포함된다. 바이러스 기반 액세서리 기능은 알려진 헬퍼 바이러스에서 유래될 수 있다.
특히, 액세서리 기능은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입된 다음 발현될 수 있다. 일반적으로 액세서리 기능은 관련 없는 헬퍼 바이러스에 의한 숙주 세포의 감염에 의해 제공된다. 아데노바이러스; 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 및 2와 같은 헤르페스 바이러스; 및 백시니아 바이러스를 비롯한 다수의 적합한 헬퍼 바이러스가 알려져 있다. 다양한 공지된 임의의 작용제를 사용하여 세포 동기화에 의해 제공되는 것과 같은 비바이러스 액세서리 기능도 본원에서 사용된다. 예를 들어, Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117를 참조.
대안적으로, 액세서리 기능은 액세서리 기능 벡터를 사용하여 제공될 수 있다. 액세서리 기능 벡터는 하나 이상의 액세서리 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 액세서리 기능 벡터는 숙주 세포에서 효율적인 AAV 비리온 생산을 지원하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 액세서리 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드 또는 다른 바이러스의 형태일 수 있다. 액세서리 벡터는 또한 적절한 제어 요소 및 효소와 관련될 때 액세서리 기능을 제공하기 위해 숙주 세포에서 전사되거나 발현될 수 있는 하나 이상의 선형화된 DNA 또는 RNA 단편의 형태일 수 있다.
액세서리 기능을 제공하는 핵산 서열은 아데노바이러스 입자의 게놈과 같은 천연 공급원으로부터 얻어지거나 당업계에 공지된 재조합 또는 합성 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 이와 관련하여, 아데노바이러스 유래 액세서리 기능에 대한 연구가 광범위하게 이루어지고 있으며, 액세서리 기능에 관여하는 다수의 아데노바이러스 유전자가 식별되어 부분적으로 특성화되었다. 예를 들어, CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen, ed.)의 Carter, B. J. (1990) "Adeno-Associated Virus Helper Functions,", 및 Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97-129를 참조. 구체적으로, 초기 아데노바이러스 유전자 영역 E1a, E2a, E4, VAI RNA 및 아마도 E1b가 액세서리 과정에 참여하는 것으로 생각된다. Janik et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925-1929. 헤르페스바이러스 유래 액세서리 기능이 설명되었다. 예를 들어, Young et al. (1979) Prog. Med. Virol. 25:113를 참조. 백시니아 바이러스 유래 액세서리 기능도 기술되어 있다. 예를 들어, Carter, B. J. (1990), supra., Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117를 참조.
헬퍼 바이러스에 의한 숙주 세포의 감염, 또는 액세서리 기능 벡터로 숙주 세포의 형질감염의 결과로서, AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 생산하기 위해 AAV 헬퍼 구조물을 전사활성화시키는 액세서리 기능이 발현된다. Rep 발현 산물은 AAV 발현 벡터로부터 재조합 DNA(관심 DNA, 예를 들어, 이종성 핵산 포함)를 절단한다. Rep 단백질은 또한 AAV 게놈을 복제하는 역할을 한다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드로 조립되고 재조합 AAV 게놈은 캡시드로 패키징된다. 따라서 생산적인 AAV 복제가 발생하고 DNA는 rAAV 비리온으로 패키징된다.
재조합 AAV 복제 후, rAAV 비리온은 CsCl 구배, 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 다양한 통상적인 정제 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 또한, 감염을 이용하여 액세서리 기능을 발현시키는 경우, 공지된 방법을 사용하여 잔류 헬퍼 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 예를 들어 20분 이상 동안 대략 60℃의 온도로 가열함으로써 불활성화될 수 있다. 이 치료는 AAV가 극도로 열에 안정한 반면 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하기 때문에 헬퍼 바이러스만 효과적으로 비활성화한다.
그 다음 생성된 rAAV 비리온은 유전자 치료 적용과 같은 DNA 전달 또는 포유동물 숙주로의 유전자 산물 전달에 사용할 준비가 된다.
이종성 핵산 전달
본 개시 내용은 표적 세포 및/또는 이를 필요로 하는 개체에게 이종성 핵산을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이를 필요로 하는 개체는 이전에 AAV에 자연적으로 노출되었고 결과적으로 항-AAV 항체(즉, AAV 중화 항체)를 보유하는 인간이다. 예를 들어, 간, 근육 및 망막-이 비히클에 대한 중화 항체에 의해 영향을 받는 모든 조직-에 대한 AAV 유전자 전달과 관련된 임상 시험의 긍정적인 결과를 기반으로 하여, 이러한 치료 적용/질병 표적이 많이 있다.
대상 방법은 일반적으로 (i) 대상 rAAV 비리온의 유효량을 개체에게 투여하고/하거나 (ii) 대상 세포를 대상 비리온과 접촉시키는 것을 포함한다. 일반적으로, rAAV 비리온은 생체 내("직접") 또는 시험관 내("간접") 형질도입 기술을 사용하여 대상체에게 투여된다. 시험관 내("간접적으로") 형질도입된 경우, 원하는 수용체 세포(즉, "표적 세포")를 개체로부터 제거하고 rAAV 비리온으로 형질도입하고 개체에 재도입할 수 있다. 대안적으로, 동계(syngeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포가 개인에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용될 수 있다.
형질도입된 표적 세포의 개체 내로의 전달 및 도입에 적합한 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 적절한 배지에서 재조합 AAV 비리온을 세포와 조합하고, 서던 블롯(Southern blot) 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하거나 선택 가능한 마커를 사용하여 관심 DNA를 보유하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 시험관 내에서 형질도입될 수 있다. 그런 다음 형질도입된 세포는 하기에 보다 상세히 기술되는 약학적 조성물로 제제화될 수 있고, 조성물은 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사와 같은 다양한 기술에 의해 대상체에 도입될 수 있다.
생체 내(즉, "직접") 전달을 위해, rAAV 비리온은 약학적 조성물로 제제화될 것이고 일반적으로 비경구적 투여 경로로 투여될 것이다(예를 들어, 근육내, 피하, 종양내, 경피, 척추강내, 정맥내 등을 통해 투여될 것이다).
약학적 조성물은 관심 유전자 발현 산물의 치료적 유효량, 즉 문제의 질병 상태의 증상을 감소 또는 개선하기에 충분한 양 또는 원하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 생성하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제는 조성물을 받는 개인에게 유해한 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산 염을 포함한다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 매우 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 상세히 논의될 필요는 없다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어 A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.를 비롯한 다양한 간행물에 충분히 설명되어 있다.
적절한 용량은 치료되는 포유동물(예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류 또는 기타 포유동물), 치료될 대상체의 연령 및 일반적인 병태, 치료되는 병태의 중증도, 문제의 특정 치료적 단백질, 다른 인자들 중에서도 투여 방식에 의존될 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, "치료적 유효량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 예를 들어, 생체 내 주사, 즉 골격 또는 심장 근육에 직접 주사하는 경우, 치료적 유효량은 rAAV 비리온의 약 106 내지 약 1015, 예를 들어 약 108 내지 1012 rAAV 비리온일 것이다. 시험관 내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 rAAV 비리온의 유효량은 대략 rAAV 비리온의 약 108 내지 약 1013일 것이다. 다른 유효량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다.
용량 치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정일 수 있다. 더욱이, 대상체는 적절한 만큼 많은 용량을 투여받을 수 있다. 당업자는 적절한 용량 횟수를 쉽게 결정할 수 있다.
관심 세포(즉, "표적 세포")는 일반적으로 포유동물이며, 여기서 이 용어는 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 실험실, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 마우스, 쥐, 토끼 등을 포함하는 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 표적 세포는 인간 세포이다.
관심 표적 세포는 대상 rAAV 비리온에 의한 감염에 민감한 임의의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어 방법이 표적 세포에 이종성 핵산을 전달하는 방법인 경우, 표적 세포는 개체로부터 제거된 세포(예를 들어, "일차" 세포)일 수 있거나 표적 세포는 조직 배양 세포(예를 들어, 확립된 세포주로부터)일 수 있다.
예시적인 표적 세포는 간 세포, 췌장 세포(예를 들어, 섬(islet) 세포: 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, 감마 세포, 및/또는 입실론(epsilon) 세포), 골격근 세포, 심장 근육 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 활액 관절 세포, 폐 세포, T 세포, 뉴런, 신경교 세포, 줄기세포, 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 내피 세포 및 암세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 줄기세포 표적 세포는 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 신경제 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPS 세포), 중간엽 줄기세포, 중배엽 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 근육 줄기세포 및 망막 줄기세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "줄기세포"는 자가 재생 능력과 분화된 자손을 생성하는 능력 모두를 갖는 포유동물 세포를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다(예를 들어, Morrison et al. (1997) Cell　88:287-298을 참조). 일반적으로 줄기세포는 또한 다음 특성 중 하나 이상을 가지고 있다: 분열 후 두 딸 세포가 다른 표현형을 가질 수 있는, 비동기 또는 대칭 복제를 겪을 수 있는 능력; 광범위한 자기 갱신 능력; 유사분열이 정지된 형태로 존재하는 능력; 및 존재하는 모든 조직의 클론 재생, 예를 들어 모든 조혈 계통을 재구성하는 조혈 줄기세포의 능력. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "전구 세포"는 전형적으로 광범위한 자가 재생 능력을 갖지 않고, 종종 유래되는 조직의 계통, 예를 들어, 조혈 환경(setting)에서 림프계 또는 적혈구 계통만의 보다 제한된 서브세트를 생성할 수 있다는 점에서 줄기세포와 상이하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기세포"는 상기 정의된 바와 같은 "줄기세포" 및 "전구 세포"를 모두 포함한다.
줄기세포는 항체에 의해 식별된 특정 에피토프와 관련된 마커의 존재 및 특정 항체의 결합 부족으로 식별된 특정 마커의 부재 둘 다를 특징으로 할 수 있다. 줄기세포는 또한 시험관 내 및 생체 내 둘 다의 기능적 검정, 특히 다중 분화된 자손을 발생시키는 줄기세포의 능력과 관련된 검정에 의해 식별될 수 있다.
적합한 관심 줄기세포는 조혈 줄기세포 및 이로부터 유래된 전구 세포(U.S. Pat. No. 5,061,620); 신경제 줄기세포(Morrison et al. (1999) Cell 96:737-749을 참조); 신경 줄기세포 및 신경 전구 세포; 배아줄기세포; 간엽줄기세포; 중배엽 줄기세포; 간 줄기세포, 근육 줄기세포, 망막 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPS 세포) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관심 기타 조혈 "전구" 세포에는 림프 계통에 전용하는 세포, 예를 들어, 미성숙 T 세포 및 B 세포 집단이 포함된다.
줄기세포 또는 전구 세포의 정제된 집단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 조혈 줄기세포는 CD34, thy-1에 특이적인 항체를 사용하여 양성으로 선택될 수 있으며; 또는 글리코포린(glycophorin) A, CD3, CD24, CD16, CD14, CD38, CD45RA, CD36, CD2, CD19, CD56, CD66a 및 CD66b를 포함할 수 있는 계통 특이적 마커를 사용하여 음성으로 선택될 수 있으며; T 세포 특이적 마커, 종양/암 특이적 마커 등일 수 있다. 중배엽 줄기세포의 분리에 유용한 마커에는 FcγRII, FcγRIII, Thy-1, CD44, VLA-4a, LFA-113, HSA, ICAM-1, CD45, Aa4.1, Sca-1 등이 포함된다. 신경제 줄기세포는 저친화성 신경성장인자수용체(low-affinity nerve growth factor receptor)(LNGFR)에 특이적인 항체로 양성으로 선택될 수 있고, 마커 설파타이드(markers sulfatide), 신경교 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein )(GFAP), 미엘린 단백질(myelin protein) P, 페리페린(peripherin)과 신경섬유(neurofilament)에 대해 음성으로 선택될 수 있다. 인간 중간엽 줄기세포는 마커 SH2, SH3 및 SH4를 사용하여 양성으로 분리될 수 있다.
사용되는 표적 세포는 신선하거나, 냉동되거나, 사전 배양 대상일 수 있다. 이들은 태아, 신생아, 성인일 수 있다. 조혈 세포는 태아 간, 골수, 혈액, 특히 G-CSF 또는 GM-CSF 동원(mobilized) 말초 혈액, 또는 임의의 다른 통상적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 줄기세포가 조혈 또는 다른 계통의 다른 세포로부터 분리되는 방식은 본 개시 내용에 중요하지 않다. 상기 기재된 바와 같이, 줄기세포와 관련된 에피토프 특성을 나타내면서 분화된 세포와 관련된 마커가 없는 세포를 선택적으로 분리함으로써 줄기 또는 전구 세포의 실질적으로 동종성 집단을 수득할 수 있다.
개체에게 전달될 수 있는 핵산에는 상기 정의된 이종성 핵산 중 임의의 것이 포함된다. 본 방법을 사용하여 전달될 수 있는 단백질은 또한 전술한 단백질 중 임의의 것의 기능적 단편; 및 전술한 단백질 중 임의의 것의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 치료적 유효량의 단백질이 포유동물 숙주에서 생산된다. 특정 단백질의 치료적 유효량이 본 방법을 사용하여 포유동물 숙주에서 생산되는지 여부는 특정 단백질에 적절한 검정을 사용하여 쉽게 결정된다. 예를 들어, 단백질이 EPO인 경우 헤마토크릿(hematocrit)이 측정된다.
rAAV가 항원성 단백질을 인코딩하는 경우, 본 방법을 사용하여 개체에게 전달될 수 있는 적합한 항원성 단백질에는 종양/암 관련 항원, 자가항원("자체" 항원), 바이러스 항원, 박테리아 항원, 원생동물 항원 및 알레르겐; 및 이의 항원성 단편이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)(CTL) 반응은 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 다른 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 체액성 반응은, 항원성 단백질에 특이적인 항체가 생성되도록 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 많은 실시 양태에서, rAAV-인코딩된 항원성 단백질에 대한 TH1 면역 반응은 포유동물 숙주에서 유도될 것이다. 항원 단백질에 대한 면역 반응이 생성되었는지 여부는 잘 확립된 방법을 사용하여 쉽게 결정된다. 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석을 사용하여 항원 단백질에 대한 항체가 생성되었는지 여부를 결정할 수 있다. 항원-특이적 CTL을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 표면에 항원성 단백질을 발현하는 검출 가능하게 표지된 표적 세포를 사용하여 혈액 샘플에서 항원-특이적 CTL의 존재를 분석한다.
치료적 유효량의 이종성 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, RNAi 작용제 등)이 본 방법을 사용하여 포유동물 숙주에 전달되었는지 여부는 임의의 적절한 검정을 사용하여 쉽게 결정된다. 예를 들어, 유전자 산물이 HIV를 억제하는 RNAi 작용제인 경우, 바이러스 부하를 측정할 수 있다.
변형된 rAAV 비리온의 생성 및 식별 방법
본 개시 내용은, 스타터 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환(삭제, 삽입 등 포함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드를 포함하는 변형된 감염성 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 생성 및 식별하는 방법을 제공한다. 스타터 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
238]방법은 일반적으로 돌연변이체 rAAV 비리온 라이브러리를 생성하는 단계; 및 스타터 rAAV 비리온에 비해 변경된 특성을 갖는 변형된 rAAV 비리온에 대한 라이브러리를 선택하는 단계를 포함한다. 스타터 rAAV 비리온은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 본 개시 내용은 라이브러리 및 라이브러리를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
일부 실시 양태에서, 주어진 선택 단계는 변경된 비리온 특성에 대한 대상 AAV 라이브러리를 농축시키기 위해 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 반복된다. 일부 실시 양태에서, AAV 라이브러리의 선택 후, 개별 클론이 분리되고 서열화 된다.
돌연변이체 AAV 라이브러리의 생성
스타터 AAV cap 유전자에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 AAV 라이브러리가 생성된다. 스타터 cap 유전자는 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 cap이다. rAAV cap 유전자의 돌연변이는 공지된 방법을 사용하여 생성된다. 스타터 AAV cap 유전자의 돌연변이유발에 적합한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR) 기반 방법, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 루프-스와핑 돌연변이유발, 단편 셔플링 돌연변이유발(즉, DNA Shuffling) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 돌연변이를 생성하는 방법은 당업계에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, Zhao et al. Nat Biotechnol. 1998 March; 16(3):234-5; Koerber et. al.; Mol Ther. 2008 October; 16(10):1703-9; Koerber et. al.; Mol Ther. 2009 December; 17(12):2088-95; U.S. Pat. No. 6,579,678; U.S. Pat. No. 6,573,098; 및 U.S. Pat. No. 6,582,914를 참조; 이들 모두는 돌연변이유발과 관련된 그들의 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시 양태에서, cap 유전자에 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 AAV 라이브러리는 시차 연장 프로세스(staggered extension process)를 사용하여 생성될 것이다. 시차 연장 프로세스는 PCR 기반 방법을 사용하여 cap 유전자의 증폭을 포함한다. 주형(template) cap 유전자는 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 프라이밍된 후 변성 및 매우 짧은 어닐링/폴리머라제 촉매 확장 주기가 반복된다. 각 주기에서 성장하는 단편은 서열 상보성을 기반으로 다른 주형에 어닐링되고 더 확장된다. 전장 서열이 형성될 때까지 변성, 어닐링 및 확장 주기가 반복된다. 생성된 전장 서열은 야생형 AAV cap 유전자와 비교하여 cap 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AAV cap 서열을 포함하는 PCR 산물은 야생형 AAV 게놈을 포함하는 플라스미드에 삽입된다. 결과는 AAV cap 돌연변이체의 라이브러리이다. 따라서, 본 개시 내용은 약 10 내지 약 1010 구성원을 포함하고 AAV cap 유전자에 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 AAV cap 유전자 라이브러리를 제공한다. 라이브러리의 주어진 구성원은 AAV cap 유전자에 약 1 내지 약 50개의 돌연변이를 갖는다. 대상 라이브러리는 각각 AAV cap 유전자에 상이한 돌연변이(들)를 갖는 10 내지 약 109개의 별개의 구성원을 포함한다.
cap 돌연변이체 라이브러리가 생성되면, 변경된 캡시드 특성에 기초하여 선택될 수 있는 바이러스 입자가 생산된다. 라이브러리 플라스미드 DNA를 적합한 숙주 세포(예를 들어, 293 세포)에 형질감염시킨 후 헬퍼 바이러스 세포에 도입한다. 형질감염된 숙주 세포에 의해 생산된 바이러스 입자(rAAV 라이브러리 입자)를 수집한다.
라이브러리 선택
라이브러리가 생성되면 특정 비리온 속성(즉, 변경된 감염 속성)에 대해 라이브러리가 선택된다. 바이러스 입자는 위에서 논의된 바와 같이 생성되고(따라서 변형된 rAAV 비리온의 라이브러리를 생산함), (서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 비해) 변경된 감염의 특성과 변형된 rAAV 비리온을 식별하기 위해 하나 이상의 선택 단계를 거친다. 선택되는 감염의 특성은 1) AAV 중화 항체에 대한 변경된 결합(예를 들어, 감소된 결합); 2) AAV 중화 항체의 증가된 회피; 3) AAV 감염에 내성인 세포의 증가된 감염성; 및 4) 변경된 헤파린 결합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
1. AAV 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위한 선택
일부 실시 양태에서, 대상 AAV 라이브러리는, 야생형 AAV 비리온 및 야생형 AAV 비리온의 중화에 대한 이러한 항체의 결합과 비교하여 (또는 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 비해) 야생형 AAV 비리온에 결합하고 이를 중화하는 중화 항체에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 위해 선택된다. AAV 라이브러리 입자(AAV 라이브러리 비리온)를 중화 항체와 접촉시키고 허용 숙주 세포를 감염시키는 AAV 라이브러리 입자의 능력을 테스트한다. 일반적으로 AAV 라이브러리 입자는 다양한 농도의 중화 항체와 접촉된다. AAV 라이브러리 입자의 감염성을 감소시키는 데 필요한 중화 항체의 농도가 높을수록, AAV 입자는 중화에 더 내성이 있다. 당업자에게 공지된 임의의 편리한 검정을 사용하여 항-AAV 항체 중화에 대한 AAV 라이브러리 비리온의 결합을 직접 측정(예를 들어, 결합 친화성 측정)할 수 있다.
2. AAV 중화 항체의 증가된 회피를 위한 선택
일부 실시 양태에서, 대상 AAV 라이브러리는 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 비해 중화 항체의 증가된 회피(즉, 인간 중화 AAV 항체에 대한 증가된 내성)를 위해 선택된다. AAV 라이브러리 입자는 중화 AAV 항체(일반적으로 인간 중화 항-AAV 항체)의 존재 하에 표적 세포와 접촉된다. AAV 라이브러리 입자로 세포를 감염시킬 수 있는 적절한 시간 후, 헬퍼 바이러스가 추가되고, 세포를 성공적으로 감염시킨 AAV 라이브러리 입자가 수확된다. 일부 실시 양태에서, 감염성은 성공적인 감염을 나타내는 비리온에 대해 (예를 들어, 앞서 기재된 바와 같이) 측정된다. 일부 실시 양태에서, 감염, 헬퍼 바이러스의 첨가 및 AAV 입자의 수확 주기는 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 반복된다. 선택은 다양한 회피 정도를 선택하기 위해 다양한 양(농도)의 중화 AAV 항체로 발생할 수 있다(예를 들어, 각 반복 라운드는 이전 라운드에 비해 증가된 농도의 항체를 활용할 수 있다).
3. 비허용 세포의 증가된 감염성을 위한 선택
일부 실시 양태에서, 대상 AAV 라이브러리는 (서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 비해) 비허용 세포의 증가된 감염성을 위해 선택된다. AAV 라이브러리 입자는 비허용 세포(예를 들어, 비허용 세포 집단)와 접촉된다. AAV 라이브러리 입자로 세포를 감염시킬 수 있는 적절한 시간 후, 헬퍼 바이러스가 추가되고 비허용 세포(들)을 성공적으로 감염시킨 AAV 라이브러리 입자가 수확된다. 일부 실시 양태에서, 감염, 헬퍼 바이러스의 첨가 및 AAV 입자의 수확 주기는 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 반복된다.
4. 변경된 헤파린 결합을 위한 선택
일부 실시 양태에서, 대상 라이브러리는 야생형 AAV 비리온 헤파린 결합에 비해(또는 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 감염성 rAAV 비리온에 비해) 증가된 헤파린 결합 및 감소된 헤파린 결합을 포함하는 변경된 헤파린 결합을 위해 선택된다. AAV 라이브러리 입자는 헤파린 친화성 매트릭스와 접촉된다. 예를 들어, AAV 라이브러리 입자는 헤파린에 대한 AAV 라이브러리 입자의 결합을 허용하는 조건 하에 헤파린 친화성 컬럼에 로딩된다. 예시적인 조건은 pH 7.5에서 0.15M NaCl 및 50mM Tris로 컬럼의 평형을 포함한다. AAV 라이브러리 입자가 헤파린 친화성 매트릭스에 결합하도록 한 후, AAV 라이브러리 입자/헤파린 친화성 매트릭스 복합체를 점진적으로 증가하는 농도의 NaCl을 함유하는 완충액 부피로 세척하고, 각각의 NaCl 농도에서 용리된 AAV 라이브러리 입자를 수집한다. 예를 들어, AAV 라이브러리 입자/헤파린 친화성 매트릭스 복합체를 결합한 후 200mM NaCl을 함유하는 pH 7.5 50mM Tris 완충액의 부피로 세척하고 용리된 AAV 라이브러리 입자를 수집한다. 용리 단계는 약 250mM NaCl, 약 300mM NaCl, 약 350mM, 약 400mM NaCl, 약 450mM NaCl, 약 500mM NaCl, 약 550mM NaCl, 약 600mM NaCl, 약 650mM NaCl, 약 700mM NaCl, 또는 약 750mM NaCl을 함유하는 pH 7.5, 50mM Tris 완충액으로 반복된다.
약 450mM NaCl 미만의 NaCl 농도에서 용리되는 AAV 라이브러리 입자는 야생형 AAV에 비해 감소된 헤파린 결합 특성을 나타낸다. 약 550mM NaCl보다 높은 NaCl 농도에서 용리되는 AAV 라이브러리 입자는 야생형 AAV에 비해 증가된 헤파린 결합 특성을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 용리된 AAV 라이브러리 입자는 허용 세포의 헬퍼 바이러스 동시 감염에 의해 증폭되고, 헤파린 친화성 매트릭스 상에서 재분획된다. 이 단계는 헤파린 결합 특성이 변경된 AAV 라이브러리 입자를 농축시키기 위해 여러 번 반복될 수 있다.
본 방법에서, 하나 이상의 선택 단계는 AAV 라이브러리 입자의 생성을 따를 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 방법은 증가된 헤파린 결합을 위해 선택하고, 이어서 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하고, 이어서 증가된 헤파린 결합을 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 감소된 헤파린 결합을 위해 선택하고, 이어서 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하고, 이어서 감소된 헤파린 결합을 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하고, 이어서 줄기세포의 증가된 감염성을 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 중화 항체에 대한 감소된 결합을 위해 선택하고, 이어서 중화 항체의 증가된 회피를 위해 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 방법은 중화 항체의 증가된 회피를 위해 선택하고, 이어서 중화 항체에 대한 감소된 결합를 위해 선택하는 것을 포함한다.
따라서, 본 개시 내용은 복수의 핵산을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 라이브러리를 제공하고, 이들 각각은 핵산이 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 본 개시 내용은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 각각 포함하는 복수의 AAV 입자를 포함하는 돌연변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자의 라이브러리를 제공한다. 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산은 인코딩된 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질의 특성과 마찬가지로 앞서 기재되어 있다.
본 개시 내용은 (i) 각각 변이체 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 및 이종성 핵산을 포함하는 2개 이상의 감염성 rAAV 비리온; (ii) 각각 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개 이상의 분리된 핵산; (iii) 각각 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 2개 이상의 숙주 세포; 및 (iv) 2개 이상의 변이체 AAV 캡시드 단백질; 중 적어도 하나를 포함하는 라이브러리를 추가로 제공하며, 여기서 라이브러리의 적어도 하나의 구성원의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열 식별 번호 10-13 및 26-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
조성물 및 키트
또한, 본 개시 내용의 방법에 사용하기 위한 조성물 및 키트가 제공된다. 대상 조성물 및 키트는, 대상 감염성 rAAV 비리온, 대상 rAAV 벡터, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 대상 뉴클레오타이드, 대상 핵산(즉, 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 대상 숙주 세포)을 포함하는 분리된 숙주 세포, 대상 라이브러리(예를 들어, 앞서 설명된 라이브러리 중 임의의 것); 및 대상 변이체 AAV 캡시드 단백질 중 적어도 하나를 포함한다. 조성물 또는 키트는 상기의 임의의 편리한 조합을 포함할 수 있다. 조성물 또는 키트는 또한 헬퍼 바이러스 및/또는 헬퍼 바이러스를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 키트는 또한 변형된 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산(즉, "돌연변이체" 핵산)의 생성을 위한 시약을 포함할 수 있다.
상기 구성요소에 추가하여, 대상 키트는 (특정 실시예에서) 대상 방법을 실행하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지침은 다양한 형태로 대상 키트에 존재할 수 있으며, 그 중 하나 이상이 키트에 존재할 수 있다. 이러한 지침이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기재, 예를 들어, 정보가 인쇄된 종이 조각, 키트 포장, 패키지 삽입물 등에 인쇄된 정보인다. 이러한 지침의 또 다른 형태는 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, 컴팩트 디스크(CD), 플래시 드라이브 등이다. 존재할 수 있는 이러한 지침의 또 다른 형태는 제거된 사이트의 정보에 액세스하기 위해 인터넷을 통해 사용할 수 있는 웹사이트 주소이다.
이제 본 발명이 완전히 설명될 때, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
아데노-관련 바이러스(AAV) 유전자 치료 벡터는 현재까지 여러 임상 시험에서 상당한 가능성을 입증했다. 그러나, 어린 시절 노출 또는 AAV 벡터의 사전 투여로 인한 순환(circulating) 항-AAV 항체는 많은 잠재적 환자에 대한 AAV 유전자 요법의 실행을 방해했다. 우리는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 항-AAV 항체 회피를 향상할 수 있는 신규한 AAV 변이체를 분리했다. 낮거나 높은 효능의 인간 혈청 풀(pool)과 인간 IVIG 진화된 AAV 변이체를 사용한 선택으로 인한 엄격한 압력은 현재까지 가장 광범위하게 회피하는 변이체인 개별 인간 혈청, 인간 IVIG 및 마우스 혈청에서 항체 중화를 회피할 수 있다.
재료 및 방법
세포주
세포주는 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었고, 달리 언급되지 않는 한 American Type Culture Collection (Manassas, Va.)에서 입수했다. HEK293T, HeLa 및 HT1080 세포를 10% 소태아 혈청(Gibco, Carlsbad, Calif.) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 배양했다. CHO K1 및 CHO pgsA 세포를 10% 소태아 혈청(Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 F-12K 배지(ATCC)에서 배양했다. Pro5 및 Lec1 세포는 10% 소태아 혈청(Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 MEM-알파 배지(Gibco)에서 배양되었다.
선택을 위한 인간 혈청 풀
18개의 개별 인간 혈청 샘플을 Innovative Research, Inc.(Southfield, Mich.)로부터 입수했고 야생형 AAV2에 대한 중화 항체 역가를 각 샘플에 대해 결정했다(표 2). 개별 샘플은 항체의 친화성과 에피토프 특이성 모두에서 변이를 가질 가능성이 높기 때문에, 3개의 강력한 혈청 풀(α=A+F+G, β=B+H+M 및 γ=I+J+N)을 동일한 부피의 개별 혈청 샘플을 혼합하여 생성했다. 항체의 이러한 변이가 있는 상태에서 선택하면 기존의 많은 인간 항체에 대한 내성이 전반적으로 향상되어야 한다. 더 넓은 범위의 항체에 대한 내성을 선택하기 위해 나중에 선택을 Gamimune N, 10% 인간 IVIG(Bayer, Elkhart Ind.)의 존재 하에 수행했다.
표 2: 개별 인간 혈청 샘플의 중화 항체 역가
각 샘플에 대한 중화 항체(NAb) 역가는 감염성을 혈청이 없는 상태에서 측정된 값의 37%로 감소시키는 데 필요한 혈청 부피 분율의 역수로 보고된다. 그 이후 3개의 혈청 풀(α=A+F+G, β=B+H+M 및 γ=I+J+N)은 3개의 개별 혈청 샘플의 동량을 혼합하여 생성되었다.
[표 2]
Figure pct00001
라이브러리 생성 및 바이러스 생산
포화 돌연변이유발 라이브러리를 생성하기 위해, AAV2 cap 라이브러리는 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의해 생성된 후 5'-GCGGAAGCTTCGATCAACTACGC-3'(서열 식별 번호 14) 및 5'-GGGGCGGCCGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTG-3'(서열 식별 번호 15)을 각각 포워드(forward) 및 리버스(reverse) 프라이머로 사용하는, Zhao et al.에 의해 설명된 시차 연장 프로세스를 따랐다. 풀링된 개별 인간 혈청을 사용한 선택은 포화 돌연변이유발 라이브러리의 기초 역할을 하는 4개의 점 돌연변이(결과 섹션에 설명됨)를 함유하는 변이체를 밝혀냈다. 이 변이체에 대한 cap 유전자는 특정 부위의 아미노산을 변경함으로써 추가 돌연변이유발에 적용되었다. 프라이머 5'-cattNNKgaccagtctaggaactgg-3'(서열 식별 번호 16) 및 상응하는 역보체 프라이머를 사용하여 R471 아미노산 부위를 돌연변이시켰다. 프라이머 5' gccacaaggacgatgaagaaNNKtttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcaNNKaaaacaagt gtggacattg-3'(서열 식별 번호 17) 및 상응하는 역보체 프라이머를 사용하여 K532 및 E548 아미노산 부위를 돌연변이시켰다. 프라이머 5'-ccaacctccagagaggcNNKagacaagcagctacc-3'(서열 식별 번호 18) 및 상응하는 역보체 프라이머를 사용하여 N587 아미노산 부위를 돌연변이시켰다. 프라이머 5'-ccaactacaacaagtctNNKaatgtggactttactgtggacNNKaatggcgtgtatt-3'(서열 식별 번호 19) 및 상응하는 역보체 프라이머를 사용하여 V708 및 T716 아미노산 부위를 돌연변이시켰다. 무작위 cap 루프 영역을 함유하는 AAV2 및 야생형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 cap 유전자로부터의 셔플된 DNA를 함유하는 라이브러리로 구성된 라이브러리를 패키징하고 초기 선택 단계를 위해 풀링했다(Koerber et. al.; Mol Ther. 2008 October; 16(10):1703-9; 및 Koerber et. al.; Mol Ther. 2009 December; 17(12):2088-95; 둘 다 그 전체가 참고로 본원에 포함된다).
두 번째 및 세 번째 진화 라운드의 경우, 무작위 돌연변이유발 라이브러리는, Loop-Swap(루프-스왑)/Shuffle(셔플) 라이브러리 및 포화 돌연변이유발 라이브러리로부터의 cap 유전자를 5'-CATGGGAAAGGTGCCAGACG-3'(서열 식별 번호 20) 및 5'-ACCATCGGCAGCCATACCTG-3'(서열 식별 번호 21)을 앞서 설명한 바와 같이, 포워드 및 리버스 프라이머로 사용하는 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 적용하여 생성되었다. CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 복제 가능 AAV 라이브러리 및 재조합 AAV 벡터를 인산칼슘 형질감염 방법을 사용하는 HEK293T 세포(ATCC)를 사용하여 패키징하고, 바이러스를 요오딕손(idodixonal) 구배 원심분리에 의해 정제했다. 생체 내 사용을 위한 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP 또는 루시페라아제를 발현하는 재조합 AAV 벡터를 Amicon(아미콘) 여과에 의해 추가로 정제했다. DNase-내성 게놈 역가는 정량적 PCR을 통해 결정되었다. (Excoffon et. al, Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Mar. 10; 106(10):3865-70; 및 Maheshri et al., Nat Biotechnol. 2006 February; 24(2):198-204; 둘 다 그 전체가 참고로 본원에 포함된다).
라이브러리 선택 및 진화
선택의 하나의 라운드는 AAV 시작 라이브러리를 사용하는 HEK293T 세포 감염으로 정의되며(풀링된 개별 인간 혈청에 대해 실온에서 30분 동안 또는 감염 전에 열 불활성화된 IVIG로 37℃에서 1시간 동안 배양된다), 아데노바이러스 보호 및 성공적인 변이체의 수확이 뒤따른다. 진화의 각 라운드는 시작 라이브러리를 생성하기 위한 cap 유전자의 돌연변이유발 및 3회의 선택 라운드로 이루어진다. 각 라이브러리에 대해 3회의 진화 라운드가 수행되었으며, 진화의 각 라운드 사이에 클론 분석이 수행되었다. 진화의 각 라운드에 대한 시작 라이브러리는 앞에서 설명한 대로 생성되었다. 세 번째 선택 라운드 후, AAV cap 유전자를 성공적인 AAV 변이체 풀에서 분리하고 PCR을 통해 증폭했다. Cap 유전자는 NotI 및 HindIII를 사용하여 pXX2 재조합 AAV 패키징 플라스미드에 삽입되었다. 그런 다음 Cap 유전자는 University of California, Berkeley DNA sequencing 시설에서 서열화되었으며 Geneious 소프트웨어(Biomatters, Auckland, New Zealand)를 사용하여 분석되었다. AAV2 캡시드(Protein Databank 수탁번호 1LP3)의 3차원 모델은 Pymol(DeLano Scientific, San Carlos, CAlif.)에서 렌더링되었다.
항체 회피 변이체의 시험관 내 형질도입 분석
HEK293T를 감염 24시간 전에 3 x 104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅했다. 변이체를 감염 전에 열 불활성화된 IVIG, 개별 인간 혈청 또는 개별 마우스 혈청과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, 세포를 2000의 게놈 MOI에서 rAAV-GFP로 감염시켰다. GFP 양성 세포의 백분율은 ImageXpress Micro Cellular Imaging and Analysis System(Molecular Devices, Sunnyvale, CAlif.) 및 MetaXpress Image Analysis Software, version 3.1.0, Multi Wavelength Cell Scoring Application Module(Molecular Devices)을 사용하여 감염 후 48시간에 평가되었다.
시험관 내 형질도입 분석
상대적 형질도입 효율을 결정하기 위해, 모 야생형 AAV 혈청형, HEK293T, CHO K1, CHO pgsA(모든 표면 글리코사미노글리칸 결핍), CHO Pro5(Lec1 세포를 포함하는 여러 글리코실화 돌연변이체에 대한 모 계통), CHO Lec1(글리코실화 결함), HeLa 및 HT1080 세포(인간 섬유육종 세포주)와 비교하여 선택된 돌연변이체를 감염 24시간 전에 웰당 2.5 x 104개 세포의 밀도로 플레이팅했다. 세포를 100-1000의 MOI 범위에서 rAAV1-GFP, rAAV2-GFP, rAAV6-GFP, Shuffle 100.1-GFP, Shuffle 100.3-GFP, SM 10.2-GFP 또는 Shuffle 100.7-GFP로 감염시켰다. GFP 양성 세포의 백분율은 Beckman-Coulter Cytomics FC500 유동 세포분석기(Beckman-Coulter, Brea, Calif.)를 사용하여 감염 후 48시간에 평가되었다.
항체 회피 변이체의 생체 내 분석
생체 내 유전자 발현 분석을 위해, 8주령 암컷 Balb/c 마우스를 재조합 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조), SM 10-2(서열 식별 번호 10 참조), 또는 AAV2 벡터의 투여 24시간 전에 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스당 4 mg IVIG 또는 인산염 완충 식염수(대조군 마우스용)로 프라이밍했다. 마우스를 꼬리 정맥 주사를 통해 CMV 프로모터의 제어 하에 루시페라아제를 인코딩하는 재조합 AAV 벡터의 1011개 바이러스 게놈으로 감염시켰다. 생물발광 이미징을 위해, 마우스를 2% 이소플루오란(isofluorane)과 산소로 마취시켰다. D-루시페린 기질(luciferin substrate)(GOLD Biotechnology, St. Louis, MO)을 체중 500㎍/g의 용량으로 복강내 주사했다. VivoVision IVIS Lumina imager(Xenogen, Alameda, Calif.)를 사용하여 이미지를 생성했다. 각 마우스에 대해, 4주 동안 매주 기질 주입 후 7-10분에 복부 이미지를 촬영했다. 감염 5주 후, 심장 천자를 통해 혈청을 수집하고 마우스에 0.9% 식염수 용액을 관류시켰다. 심장, 간, 폐, 신장, 비장, 뇌, 척수 및 뒷다리 근육을 채취하여 동결시켰다. 동결된 조직 샘플을 균질화하고 시험관 내 루시페라아제 분석을 위해 리포터 용해 완충액(Promega, Mannheim, Germany)에 재현탁했다. 루시페라아제를 함유하는 용해물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 샘플을 분석하기 위해, 20μL의 용해물을 100μL의 루시페라아제 분석 완충액에 첨가하고, 혼합하고, 5분 동안 배양하고, 광도계에 두었다. 신호는 2초 지연으로 30초 동안 통합되었으며 TD 20/20 광도계(Turner Designs, Sunnyvale, CA)에 의해 감지된 상대 광 단위(Relative Light Units)(RLU)로 보고되었다. 루시페라아제 신호는 비신코닌산 분석(bicinchoninic acid assay)(Pierce)에 의해 결정된 총 단백질 함량으로 정규화되었다.
결과
우리의 결과는 AAV가 시험관 내 및 생체 내 모두에서 항-AAV 항체에 의한 중화를 상당히 극복하도록 진화할 수 있음을 입증한다. 시험관 내 야생형 AAV보다 2배 내지 35배 더 높은 중화 항체 역가(인간 IVIG 사용)를 필요로 하는 신규한 AAV 변이체를 분리했다. 항체 중화 특성은 또한 중화 항체의 존재 하에 생체 내에서 향상된 형질도입으로 번역되었다. 항-AAV 항체에 내성이 있는 그러한 신규한 클론의 분리는 핵산 전달 벡터로서 AAV를 기반으로 하는 치료의 광범위한 구현을 허용한다(현재 AAV 유전자 치료에 부적격인 높은 항체 역가를 갖는 개체 포함).
유도 진화를 통한 AAV 라이브러리 생성 및 선택
도 1a는 인간 항체 중화를 회피할 수 있는 신규한 AAV 변이체를 분리하기 위해 사용된 유도 진화 접근법의 개략도를 보여준다. 바이러스 라이브러리는 다음 단락에 설명된 DNA 돌연변이유발 기술을 사용하여 생성되었다(도 1a, 단계 1 및 2). 초기 선택 동안, 오류가 발생하기 쉬운 PCR 돌연변이에서 AAV2 cap 유전자로 개발된 바이러스 라이브러리 풀을 HEK293T 세포 감염 전에 실온에서 30분 동안 저효능 α 인간 혈청 풀의 다양한 희석과 함께 배양했다(단계 3). 저 효능 α 인간 혈청 풀에 대한 3라운드의 선택 후(도 1a, 단계 4 및 5), 이러한 중화 혈청 풀에 대한 내성이 강화된 여러 변이체를 얻었다(도 1a, 단계 6, 도 7a). 변이체 1.45에는 2개의 점 돌연변이(N312K, N449D)가 포함되어 있어 야생형 AAV2와 비교해 α 풀에 의한 중화에 대한 내성이 >10배 이상의 결과를 가져왔다.
변이체 1.45로부터의 cap 유전자는 추가의 무작위 돌연변이유발에 적용되었고, 생성된 라이브러리는 병렬로 β 및 γ 풀에 대한 3회의 추가 라운드 선택을 위해 선택되었다. 항체 회피의 약간의 개선만 관찰되었기 때문에(데이터는 표시되지 않음), 회수된 cap 유전자를 풀링하고 DNA Shuffling 및 EP PCR을 통해 추가 다양화를 수행했다. β 및 γ 풀 둘 다로부터의 혈청의 증가하는 양에 대한 3회의 추가 라운드 선택은 야생형 AAV2와 비교하여 바이러스 라이브러리로부터 회수된 바이러스의 양이 실질적으로 농축된 결과를 가져왔다(도 7b, c). 두 풀의 성공적인 cap 유전자의 시퀀싱(sequencing)은 두 라이브러리에 존재하는 4개의 점 돌연변이(N312K, N449D, N551S 및 1698V)를 함유하는 여러 저주파 돌연변이체와 단일 우성 돌연변이체인 변이체 γ4.3을 밝혀냈다. 인간 IVIG의 존재 하에, 변이체 1.45는 중화에 대한 내성이 1.2배 향상된 완만함을 입증한 반면, γ4.3은 중화에 대한 내성이 3.1배 향상됨을 입증했다(도 7d). 이러한 관찰은 개별 인간 혈청의 풀이 일반 인간 집단에 존재하는 항체의 회피를 향상할 수 있는 AAV 변이체를 분리하는 데 사용될 수 있다는 가설을 확인시켜준다.
항-AAV 항체에 의한 중화에 내성의 변이체 γ4.3의 적당한 성공은 γ4.3 cap 유전자에 기초한 라이브러리의 개발을 촉발시켰다. AAV2 캡시드의 면역원성 부위로 이전에 결정된 아미노산 부위 R471, K532, E548, N587, V708, T716은 γ4.3의 항체 내성을 개선할 수 있는 아미노산 돌연변이를 찾기 위한 시도에서 포화 돌연변이유발에 적용되었다. 이 "포화 돌연변이유발" 라이브러리는, 7개의 모 AAV 혈청형의 무작위 cap 키메라로 구성된 "셔플된" 라이브러리 및 치환된 루프 영역이 있는 AAV2 cap으로 구성된 "루프 스왑" 라이브러리와 함께, HEK293T 세포의 감염 전에 바이러스 라이브러리 풀을 37℃에서 1시간 동안 인간 IVIG의 다양한 희석과 함께 배양하는, 3회의 추가 선택 라운드를 거쳤다. AAV 라이브러리 감염 및 아데노바이러스 중복감염을 통한 감염성 AAV 변이체 증폭 후, 각 라이브러리 조건에서 바이러스 게놈의 수 또는 바이러스 역가를 정량화하고 선택의 성공 여부를 결정하기 위한 방법으로 야생형 AAV2의 역가와 비교했다(도 1b). 포화 돌연변이유발 및 루프-스왑/셔플링된 라이브러리를 사용하는 각 라운드의 선택을 위해, 야생형 AAV2보다 더 높은 바이러스 역가를 생산하는 1:10 및 1:100 IVIG 희석 조건의 바이러스 풀을 후속 라운드의 선택에 대한 시작점으로 사용했다. 선택 라운드. 3회의 선택 라운드 후, 성공적인 바이러스 cap 유전자를 분리하고 개별적으로 테스트하여 가장 효율적인 유전자 전달을 갖는 바이러스를 결정했다. 또한, 3차 선택 라운드에서 분리된 cap 유전자는 오류가 발생하기 쉬운 PCR 돌연변이유발의 추가 라운드를 거쳐 바이러스의 적합도를 반복적으로 증가시키는 과정을 반복했다.
도 1은 향상된 항체 회피를 위한 AAV의 유도 진화를 도시한다. (a) 유도 진화의 개략도. 1) 바이러스 라이브러리는 여러 보완적 접근법을 사용하여 cap 유전자를 유전적으로 다양화함으로써 생성된다. 2) 바이러스는 플라스미드 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포에 패키징된 후 수확 및 정제된다. 3) 바이러스 라이브러리는 여러 농도에서 인간 IVIG와 함께 배양되고 시험관 내에서 HEK293T 세포에 도입된다. 4) 성공적인 바이러스는 아데노바이러스 중복감염을 통해 증폭 및 회수된다. 5) 더 낮은 MOI에서 반복적인 선택을 통해 성공적인 클론이 농축된다. 6) 분리된 바이러스 DNA는 성공적인 cap 유전자를 나타낸다. 7) 성공적인 cap 유전자는 선택을 위한 새로운 출발점 역할을 하기 위해 다시 돌연변이된다. (b) 루프 스왑/셔플링된 및 포화 돌연변이유발 라이브러리에서 돌연변이를 회피하는 항체의 선택. HEK293T 세포를 24시간 동안 바이러스 라이브러리로 감염시켰다. 세포를 생산적으로 감염시킨 바이러스 입자는 아데노바이러스 감염에 의해 증폭되었고, 보호된(rescured) AAV는 qPCR(정량적 중합효소 연쇄 반응)에 의해 정량화되었다. IVIG의 1:10 희석은 10 mg IVIG/mL의 농도에 상응한다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다(n = 3).
도 7은 AAV2에 기초한 인간 항체 회피자의 생성을 입증한다. (a) 낮은 엄격도 α 풀에 대한 3회의 선택 라운드 후에 선택된 4개의 바이러스 클론은 MOI 1에서 1μL의 α 혈청에 대한 향상된 내성을 보여준다. 2회의 추가 다양화 라운드(즉, 돌연변이유발 및 DNA 셔플링) 및 선택(3회의 혈청 양 증가)으로 인해 다량의 고효능 물질의 존재 하에서 바이러스 회수를 상당히 향상시켰다 (b) β 및 (c) γ 풀. (d) 추가로, 2개의 바이러스 클론(1.45 및 γ4.3)은 야생형 AAV2와 비교하여 ~100,000개의 개체로부터 풀링된 인간 정맥내 면역글로불린(human intravenous immunoglobulin)(IVIg)과 함께 존재하는 매우 다양한 기존 항체 풀에 대해 1.23배 및 3.10배 향상된 내성을 나타낸다.
시험관 내 신규한 진화된 AAV 변이체의 증가된 항체 회피
인간 IVIG에 대한 9회 라운드의 스크리닝 후 포화 돌연변이유발 및 루프-스왑/셔플링된 라이브러리로부터 개별 분석을 위해 선택되고 패키징된 12개 클론 중에서, 12개 클론 모두 야생형 AAV1 및 AAV2 둘 다보다 더 높은 중화 항체 역가를 필요로 했다(도 2a 및 표 1). 야생형 AAV2보다 중화를 위해 35배 더 높은 시험관 내 IVIG 농도를 필요로 하는 변이체 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조)은 여전히 1mg/mL IVIG의 존재 하에서 세포의 약 10%를 형질도입할 수 있었다(도 2b). 또한, AAV2 포화 돌연변이유발 라이브러리의 변이체 SM 10-2는 야생형 AAV2보다 중화를 위해 7.5배 더 높은 시험관 내 WIG 농도가 필요했다. 또한, 변이체 Shuffle 100-3 및 SM 10-2(서열 식별 번호 10 참조)는 혈우병 B 임상 시험에서 제외된 개별 환자의 혈청 샘플의 존재 하에 향상된 형질도입을 보여주었다(도 3)(Nathwani et al., N Engl J Med. 2011 Dec. 22; 365(25):2357-65).
도 2는 항체 회피 변이체의 중화 프로파일을 도시한다. 3회 라운드의 진화 후에 분리된 항체 회피 돌연변이체의 cap 유전자를 사용하여 GFP를 인코딩하는 재조합 AAV를 패키징하고 HEK293T 세포의 감염 전에 인간 IVIG와 배양했다. 남아있는 감염성 입자의 분율은 고함량 형광 이미징을 사용하여 결정되었고 IVIG가 없는 경우 감염성 역가로 정규화되었다. IVIG에 대한 내성이 있는 각 라이브러리의 두 클론이 표시된다. 분석된 다른 클론에 대한 데이터는 표 1에 표시된다. (a) 중화 곡선. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다(n = 3). (b) 여러 IVIG 희석액의 대표적인 형광 이미지는 돌연변이체가 고농도의 중화 항체 존재 하에 HEK293T 형질도입이 가능함을 보여준다.
도 3은 항체 회피 변이체의 중화 프로파일을 도시한다. 인간 혈청은 AAV에 대한 높은 중화 항체 역가의 존재로 인해 혈우병 B 임상 시험에서 제외된 개체로부터 획득되었다. GFP를 인코딩하는 재조합 AAV를 HEK293T 세포의 감염 전에 개별 인간 혈청 샘플과 함께 배양했다. 남아있는 감염성 입자의 분율은 형광현미경을 사용하여 결정되었고 인간 혈청이 없는 경우 감염성 역가로 정규화되었다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다(n = 3).
12개 클론의 서열 분석은 가장 높은 중화 항체 내성을 갖는 2개의 변이체, Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조) 및 Shuffle 100-1(서열 식별 번호 11 참조)이 AAV1-4, AAV6 및 AAV9의 단편을 함유하는 셔플된 캡시드와 거의 동일한 것으로 밝혀졌다(도 4). 두 변이체 간의 아미노산 469(AAV6 잔기에서 AAV7 잔기까지) 및 598(AAV6 잔기에서 AAV1 잔기까지)의 차이는 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조)에 대한 중화 항체 역가의 거의 3배 증가로 해석된다(표 1). 네 번째로 높은 중화 항체 내성을 갖는 변이체 Shuffle 100-7(서열 식별 번호 13 참조)(표 1)은 또한 AAV1, AAV6 및 AAV8(도 4)의 단편을 함유하는 셔플된 캡시드이며(도 4), 이는 야생형 AAV1 및 AAV8이 항-AAV2 항체를 피하는 데 효과적임을 보여주는 보고된 데이터와 잘 일치한다. 흥미롭게도, 변이체 SM 10-2(서열 식별 번호 10 참조)는 변이체 γ4.3에 의해 획득된 점 돌연변이를 보유하고 또한 포화 돌연변이유발 부위에서 야생형 잔기를 보유했다. 변이체 SM 10-2(서열 식별 번호 10 참조)는 표면 잔기 D472N 및 내부 잔기 L735Q에서 추가 점 돌연변이를 획득했다. 도 4는 루프-스왑/셔플 및 포화 돌연변이유발 클론의 아미노산 서열을 도시한다. (a) 캡시드 단백질의 개략도는 가장 높은 중화 IVIG 농도를 가진 각 라이브러리의 두 클론에 대해 표시된다. 각 영역은 유래된 모 혈청형에 따라 음영 처리된다. 검은색 화살표는 (왼쪽에서 오른쪽으로) VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질의 시작 코돈을 나타낸다. 회색 화살표는 (왼쪽에서 오른쪽으로) AAV2 캡시드를 기반으로 하는 표면 루프 영역 I, II, III, IV 및 V를 나타낸다. (b) 해결된 구조를 기반으로 하는 전체 AAV2 캡시드의 분자 모델은 가장 높은 중화 IVIG 농도를 가진 각 라이브러리의 두 클론에 대해 표시된다. 각 영역은 유래된 모 혈청형에 따라 음영 처리된다. 변이체 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조)의 경우 검은색 화살표는 변이체 Shuffle 100-1(서열 식별 번호 11 참조)과의 차이점을 나타낸다. 변이체 SM 10-2(서열 식별 번호 10 참조)의 경우 돌연변이 N449D, D472N, N551S 및 1698V는 표면 돌연변이(검정색)이다.
표 1: 라이브러리 클론 및 모 혈청형의 IVIG 중화 항체 역가
인간 IVIG를 사용하여 야생형 AAV1, AAV2, AAV8 및 루프-스왑/셔플된 및 포화 돌연변이유발 라이브러리로부터 회수된 변이체로부터의 캡시드로 재조합 AAV-GFP 벡터를 중화시켰다. 유전자 전달 효율을 IVIG가 없는 경우의 50%로 감소시키는 데 필요한 IVIG 농도(mg/mL)를 AAV2의 전달을 감소시키는 데 필요한 농도와 비교하여 표시한다. 분석된 모든 변이체에는 야생형 AAV1 및 AAV2보다 더 높은 농도의 IVIG가 필요했다. 중화항체 역가는 도 2의 곡선을 지수 곡선으로 피팅하여 결정했다. 서열 식별 번호들은 "아미노산, 뉴클레오타이드"로 나열된다.
[표 1]
Figure pct00002
변이체 Shuffle 100-3(서열 식별 번호 12 참조), Shuffle 100-1(서열 식별 번호 11 참조), 및 Shuffle 100-7(서열 식별 번호 13 참조)은 모 혈청형 AAV1 및 AAV6의 형질도입 프로파일을 모방하는 형질도입 프로파일을 가지고 있다(생물학적 분포). 또한, SM 10-2의 돌연변이(서열 식별 번호 10 참조)는 AAV2와 유사한 프로파일을 유도하는 헤파린 의존성(모 혈청형 AAV2에서 볼 수 있음)을 방지하지 않는다(도 5).
도 5는 신규한 aav 변이체의 시험관 내 향성을 입증한다. 녹색 형광 단백질을 발현하는 재조합 AAV 벡터는 새로운 AAV 변이체의 형질도입 특성을 프로파일링하기 위해 CHO, pgsA(모든 표면 글리코사미노글리칸 결핍), Pro5, Lec1(시알산 결핍), HEK293T, HeLa 및 HT1080(인간 섬유육종 세포주)의 세포주 패널을 형질도입하는 데 사용되었다. 새로운 AAV 변이체의 형질도입 특성. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다(n = 3).
생체 내에서 신규한 진화된 AAV 변이체의 증가된 항체 회피
변이체 Shuffle 100-3 및 Shuffle 100-7의 국소화 패턴을 결정하기 위해, AAV2, Shuffle 100-3 또는 Shuffle 100-7이 주사된 나이브(naive) 마우스의 다양한 조직에서 루시페라아제 효소 활성을 조사했다(도 6a). 변이체 Shuffle 100-7은 심장의 7배 더 높은 형질도입, 5배 더 높은 폐의 형질도입 및 4.5배 더 낮은 간의 형질도입을 제외하고 AAV2와 유사한 생체 내 향성을 나타냈다. Shuffle 100-3 변이체는 AAV2보다 뇌의 4배 이상 높은 형질도입, 3배 이상의 폐 형질도입 및 27배 더 높은 근육 형질도입을 나타냈다. 이들 마우스로부터의 혈청의 분석은 AAV1, AAV2, AAV8 또는 Shuffle 100-3 유전자 전달 벡터가 제공된 마우스로부터의 혈청에 대해 AAV1 및 AAV8보다 중화를 위해 변이체 Shuffle 100-3이 동일하거나 더 높은 시험관 내 혈청 농도를 필요로 함을 보여주었다(도 11). Shuffle 100-7은 AAV1, AAV2, AAV8, Shuffle 100-3, 또는 SM 10-2 유전자 전달 벡터가 제공된 마우스로부터의 혈청에 대해 AAV1보다 중화를 위해 동일하거나 더 높은 시험관 내 혈청 농도를 필요로 했다(도 11). 또한, 두 변이체 모두 테스트된 모든 야생형 AAV 혈청형보다 AAV2 유전자 전달 벡터가 제공된 마우스의 혈청에 의해 덜 중화되었다. 흥미롭게도, 변이체 Shuffle 100-3은 테스트된 다른 혈청형 또는 변이체보다 면역화된 마우스의 혈청에 의해 덜 중화되었다(도 11). 이 데이터는 이러한 변이체가 야생형 AAV 혈청형 또는 다중 벡터 투여를 필요로 하는 적용에서 다른 변이체와 조합하여 사용될 수 있다는 가능성을 보여준다.
도 11은 면역화된 마우스 혈청에서 라이브러리 클론 및 모 혈청형의 중화 항체 역가를 나타낸다. 라이브러리 클론 또는 야생형 AAV가 투여된 마우스의 혈청을 사용하여 야생형 AAV1, AAV2, AAV8 및 루프-스왑/셔플된 및 포화 돌연변이유발 라이브러리에서 회수된 변이체의 캡시드로 재조합 AAV-GFP 벡터를 중화했다. 유전자 전달 효율을 혈청이 없는 경우의 50%로 감소시키는 데 필요한 혈청 희석이 표시된다.
생체 내에서 항체 중화를 회피하는 변이체 Shuffle 100-7 및 Shuffle 100-3의 능력을 결정하기 위해, 마우스를 AAV 주사 전에 인간 IVIG로 수동 면역화시켰다. 변이체 Shuffle 100-7은 루시페라아제 효소 활성에 의해 측정된 바와 같이, AAV2보다 상당히 더 높은 심장, 간 및 근육 형질도입을 가졌다(도 6b). 변이체 Shuffle 100-3은 AAV2와 비교하여 상당히 더 높은 심장 및 근육 형질도입을 가졌다(도 6b).
도 6은 신규한 AAV 변이체의 생체 내 국소화 및 중화를 나타낸다. (a) 루시페라아제를 인코딩하는 재조합 AAV 벡터를 암컷 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여했다. 5주 후, 루시페라아제 활성 수준을 결정하고 분석된 각 샘플의 총 단백질로 정규화했다. (b) 루시페라아제를 발현하는 재조합 AAV 벡터는 4mg의 인간 IVIG의 꼬리 정맥 주사 24시간 후 암컷 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여되었다. 5주 후, 루시페라아제 발현 수준은 분석된 각 샘플에 대한 총 단백질로 정규화되었다. 에러 바는 표준 편차(n = 3), * =p<0.05를 나타낸다. RLU, 상대 루시페라아제 단위(relative luciferase unit).
개별 인간 혈청의 풀에 대해 선택된 AAV2 기반 오류가 발생하기 쉬운 라이브러리로부터 분리된 변이체 γ4.3은 4개의 점 돌연변이(N312K, N449D, N551S 및 I698V)를 함유했다. 흥미롭게도, 이들 위치 중 2개(N449 및 N551)는 이전에 인간 혈청의 다른 풀을 사용하여 면역원성 잔기로 식별되었으며, 이는 이들 부위를 포함하는 항원성 에피토프가 많은 상이한 중화 항체에 의해 표적화됨을 입증한다. 따라서 이러한 부위는 돌연변이에 대한 흥미롭고 가치있는 표적이다. 포화 돌연변이유발 라이브러리에서 유도 진화와 합리적인 설계를 짝지어서 시험관 내에서 AAV1 및 AAV2보다 더 높은 항체 내성을 가질 수 있는, 변이체 SM 10-2를 분리했다. 변이체 SM 10-2는 변이체 γ4.3에서 발견된 점 돌연변이(D472N 및 L735Q)에 2개의 추가 점 돌연변이를 통합한다. D472N 돌연변이는 이전에 HEK293 세포에서 캡시드 합성 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. 유사하게, 아미노산 위치 735에서 양전하를 띤 라이신 측쇄를 전하를 띠지 않는 글루타민 측쇄로 교체하는 것은 캡시드를 안정화시키는 기능을 할 수 있는데, 이는 조립된 캡시드의 내부에 위치함에도 불구하고 변이체 Shuffle 100-7에도 존재하기 때문이다(도 4).
키메라 AAV 캡시드의 생성은 다중 AAV 혈청형으로부터의 바람직한 특성을 병합할 수 있는 바이러스 변이체의 생성을 허용한다. AAV8 및 AAV9가 AAV2보다 IVIG에 의한 중화에 대해 훨씬 더 내성이 있는 것으로 나타났지만, 이들 캡시드에 특이적인 아미노산은 우리의 선택 동안 분리된 셔플된 변이체 표면의 작은 범위에만 존재했다(도 4). 시험관 내에서 항체 중화의 보다 효율적인 회피를 나타내는 변이체인 Shuffle 100-3은 모 혈청형 AAV1 및 AAV6과 유사한 시험관 내 향성을 나타내었지만 어느 야생형 혈청형보다 더 높은 감염률을 나타냈다. 변이체 Shuffle 100-1과 Shuffle 100-3 간의 아미노산 469와 598의 차이는 Shuffle 100-3에 대한 중화 항체 역가의 거의 3배 증가로 해석된다. Lochrie et al.의 연구는 인간 혈청과 IVIG에 의해 인식되는 면역원성 잔기가 다르다고 보고했으며, 이는 다른 인간이 AAV 캡시드의 상이한 에피토프 세트에 대한 다양한 중화 항체를 생산할 수 있고 중화로부터 완전한 탈출이 쉽지 않음을 시사한다(Lochrie et al., J Virol. 2006 January; 80(2):821-34). 우리의 연구는 항-AAV 항체의 다양한 양과 효능을 함유하는 여러 다른 혈청 풀을 사용하여 여러 라운드의 유도 진화를 사용하면 다중 항-AAV 항체 풀의 존재 하에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 세포 형질 도입을 향상시킬 수 있는 새로운 AAV 변이체를 분리할 수 있음을 입증한다.
동물 및 인간의 AAV 벡터 성분에 대한 적응 면역 반응은 종종 동일한 혈청형의 AAV 벡터의 재투여를 방지하여 다중 벡터 투여를 필요로 하는 유전자 전달 적용을 어렵게 만든다. 생물학적 분포 연구에 사용된 마우스의 혈청을 사용한 시험관 내 중화 분석은 변이체가 야생형 AAV보다 이들 혈청에 의해 덜 중화된다는 것을 입증하며(도 11), 이는 벡터 재투여가 필요한 유전자 치료 전략에 유용할 수 있다. 예를 들어, Shuffle 100-3은 AAV2가 주사된 마우스의 혈청에 의해 중화되지 않았고 AAV2는 Shuffle 100-3이 주사된 마우스의 혈청에 의해 중화되지 않았으며, 이는 이 변이체가 야생형 AAV 혈청형과 조합하여 또는 다중 벡터 투여가 필요한 적용에 사용될 수 있음을 시사한다. 결론적으로, 우리는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 개별 인간 환자, 풀링된 인간 혈청 및 마우스 혈청에서 유래된 항-AAV 항체에 의해 중화를 감소시킬 수 있는 신규한 AAV 변이체를 분리하기 위해 유도 진화를 사용했다.
실시예 2
영장류 폐에 대한 유전자 치료에 사용하기에 적합한 캡시드 변이체의 식별
소개
인간 중화 항체(human neutralizing antibodie)(NAb)의 존재 하에 기관내 에어로졸 투여 후 비인간 영장류(non-human primate)(NHP) 폐 폐포 상피 유형 II(AT II) 세포에 대한 유전자 전달 효율이 향상된 AAV 캡시드 변이체를 식별하기 위해 유도 진화 전략을 사용했다. 간단히 말해서, 야생형 아데노-관련 바이러스(AAV) cap 유전자는 바이러스 입자의 라이브러리를 생성하기 위해 패키징된 대규모 유전자 라이브러리를 생성하기 위해 여러 접근법으로 다양화되었으며, 그런 다음 유전자 전달 장벽을 극복할 수 있는 신규한 변이체를 분리하기 위해 선택적 압력이 적용되었으며, 이는 항캡시드 면역 반응, 특정 조직의 제한된 형질도입, 및 특정 세포 유형으로의 표적 전달 불능을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
방법
세포주 및 라이브러리 생산
HEK293T 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 입수했다. 세포는 10% 소태아혈청(Gibco, Carlsbad, CA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 삼중 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포에서 바이러스 라이브러리를 생산하고, 요오딕사놀 구배 원심분리 및 Amicon 여과에 의해 바이러스를 정제했다. DNase-내성성 게놈 역가는 정량적 PCR(qPCR)을 통해 결정되었다.
기관내 주사 및 조직 수확
선택에 사용된 각각의 전달 장치에 대해, 4-6세 및 5.5-6.0kg 체중 사이의 단일 수컷 시노몰구스 원숭이(macaca fascicularis)가 투여되었다. 동물을 10mg/kg 케타민 및 15μg/kg 덱스메데토미딘으로 근육내(intramuscularly)(IM) 전달하여 마취시켰다. 5mL의 라이브러리를 1.75mg/mL의 인간 정맥내 면역글로불린(IVIG)과 사전-복합화하고 아래 설명된 대로 투여했다. 각 동물에 5mm 기관내관을 삽관하고 관 끝이 쇄골 높이(기관 분기부(carina) 위 약 5cm)에 위치하도록 하고 그 위치를 형광투시로 확인했다.
분무기 장치를 기관내 튜브의 말단부에 연결하고, 버드(bird) 호흡기를 사용하여 20cm H2O의 압력으로 15±1 호흡/분의 속도로 호흡을 전달했다. AeroProbe® 카테터(Trudell Medical International)는 기관내관 내 적절한 위치를 용이하게 하기 위해 0.144인치 스타 튜브 조각이 장착되었다. 카테터의 끝은 기관내관의 끝 바로 위에 위치했다. AeroProbe® 카테터는 AeroProbe 카테터 제어 시스템(AeroProbe Catheter Control System)에 연결되었으며 인공호흡기(Harvard Appartatus)를 사용하여 18-20cm H2O의 압력으로 20호흡/분의 속도로 호흡을 전달했다. 투여 완료 후, 각 동물은 발관되었고 진정 작용을 역전시키기 위해 0.15mg/kg 아티파메졸(atipamezole) IM을 받았다. 동물은 케이지로 돌아가기 전에 마취에서 완전히 회복될 때까지 시각적으로 모니터링되었다.
안락사는 15±1일에 정맥내로 전달된 100mg/kg 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium)을 사용하여 훈련된 수의사 직원에 의해 수행되었다. 기관을 포함한 폐를 아래에 상세히 설명된 대로 제거하고 해부했다. AT II 세포에서 DNA를 분리하고 바이러스 게놈이 증폭될 때까지 -20℃에서 보관했다.
폐포 상피 유형 II(AT II) 세포 분리
AT II 세포는 Fang et al., Measurement of Protein Permeability and Fluid Transport of Human Alveolar Epithelial Type II Cells Under Pathological Conditions. Humana Press, New York, NY, 2018, pp 121-128에 기재된 바와 같이 비인간 영장류 폐로부터 분리되었다. 간단히 말해서, 기관내에 배치된 주사기를 사용하여 5mM EDTA 및 5mM EGTA를 함유하는 PBS 500mL로 폐를 세척했다. 그런 다음 폐를 250mL의 1.2mg/mL 엘라스타아제 용액(elastase solution)으로 채우고 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 폐를 균질화하여 폐 내벽 세포를 방출하고 기도를 버렸다. AT II 세포는 Percoll 구배 및 CD14/CD45 Dynabeads를 포함한 일련의 포함 및 제외 단계에 따라 분리되었다. AT II 세포는 DNA 분리 전 24시간 동안 콜라겐 IV 코팅된 삽입물에 플레이팅되었다. 특성화는 세포 분리물의 순도를 보장하기 위해 유동 세포분석 및 면역세포화학에 의해 Lysotracker 및 계면활성제 단백질 C를 조사하여 수행되었다.
치료 벡터 진화
사용된 벡터 진화 과정은 도 12에 나와 있다. 간단히 말해서, DNA 돌연변이 기술과 cap 유전자의 독점 조합을 포함하는 바이러스 캡시드 라이브러리가 생성되었다(a). 그런 다음 바이러스를 패키징(b)하여 각 입자가 해당 캡시드를 인코딩하고 정제된 cap 유전자를 둘러싸는 돌연변이체 캡시드로 구성되도록 했다. 캡시드 라이브러리는 생체 내에서 선택적인 압력 하에 놓였다. 관심 조직 또는 세포 유형을 수확하여 표적에 성공적으로 국소화된 AAV 변이체를 분리했다. 성공적인 바이러스는 PCR 증폭에 의해 회수되었다. 성공적인 클론은 반복 선택을 통해 농축되었다(단계 I - (c)). 그런 다음 선택된 cap 유전자는 독점적인 재다양화를 거쳤고 바이러스 적합성을 반복적으로 증가시키기 위해 추가 선택 단계를 통해 농축되었다(2단계 - (d)). 벡터 선택 단계 1 및 2 동안 적중(hit)으로 식별된 변이체를 평가하여 원하는 특성을 가진 캡시드 변이체를 식별했다(e).
모티프는 다음 기준이 충족되었을 때 "적중(Hits)"으로 선언되었다: 1) 모티프는 2회 이상의 연속적인 선택 라운드에서 서열화된 집단의 약 5%를 나타낸다; 또는 2) 모티프는 1회 이상의 선택 라운드에서 서열화된 집단의 적어도 10%를 나타낸다.
결과
전달 장치 파라미터 및 AT II 세포 분리에 대한 파일럿 연구
2개의 전달 장치인 AeroProbe® 카테터(Trudell Medical International) 및 CRO의 사내 분무기를 사용하여 다수의 임상적으로 번역 가능한 장치와의 다운스트림 호환성을 가능하게 했다. 두 전달 장치는 환기 파라미터가 모든 폐엽과 폐포낭에 적절하게 분포되도록 하기 위해 Evans 청색 염료를 전달하는 파일럿 연구에서 평가되었다. 두 전달 장치 모두 폐포 구획을 포함한 모든 엽에 좋은 분포를 보였고 종속 엽에서 더 강렬한 염료가 관찰되었다.
AT II 세포 분리 프로토콜은 총 6개의 NHP 폐를 사용하여 최적화되었다. 프로토콜 최적화는 치료 벡터 진화 동안 사용된 두 NHP 폐에서 분리된 AT II 세포의 높은 수율과 순도를 가져왔다.
치료 벡터 진화
치료 벡터 진화(Therapeutic Vector Evolution) 프로그램의 라운드 1을 시작하기 전에, 37개의 벡터 라이브러리를 합성, 제조 및 특성화했다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 플라스미드 라이브러리의 다양성은 라이브러리당 대략 1 x 106 내지 >1 x 108 개별 고유 변이체를 포함하는 것으로 추정된다. 이것은 AAV 변이체의 고품질의 매우 다양한 시작 라이브러리를 나타낸다. 다음으로, 1차 선택 라운드를 위한 재료를 충분히 생성하기 위해 각 개별 라이브러리 제작을 완료했다. 도 13B에 도시된 바와 같이, 모든 라이브러리는 생체 내 치료 벡터 진화 선택을 위한 재료를 생산하기에 충분한 수준에서 제조되었다.
37개의 라이브러리 모두가 결합되었고 AeroProbe® 또는 분무기를 사용하여 단일 용량 에어로졸 투여를 통해 두 NHP에 성공적으로 투여되었다. 투여 전에 라이브러리를 1.75mg/mL 인간 정맥내 면역글로불린과 함께 배양했다. 이것은 높지만 생리학적으로 관련된 인간 NAb의 폐 점액 농도를 나타낸다. NHP당 1.7 x 1012 vg의 라이브러리 용량은 제조 고려 사항을 기반으로 하는 현재 최대 가능 용량보다 약 10배 낮은 용량을 나타낸다. 따라서, 이는 NAb의 존재 하에 폐포 공간에서 AT II 세포를 형질도입할 수 있는 벡터의 발견을 가능하게 하는 엄격한 선택 압력을 나타낸다. NHP 폐를 투여 후 2주에 수확했다. AT II 세포는 폐에서 분리되었고 DNA는 AT II 세포에서 분리되었다.
AAV 캡시드 게놈의 성공적인 증폭
조직으로부터 캡시드 유전자의 증폭은 라이브러리 벡터의 관심 세포 유형으로의 성공적인 국소화를 나타낸다. 각 전달 장치로부터 증폭된 캡시드(도 14A-B)를 서열 분석을 위해 그리고 (필요한 경우) 후속의 선택 라운드를 시작하기 위해 AAV 라이브러리 패키징 플라스미드에 클로닝했다.
시퀀싱 분석
집단 내의 변이체의 빈도를 결정하기 위해 라이브러리 내의 개별 클론에 대해 서열 분석을 수행했다. 각 전달 장치에서 최소 90개의 클론에 대한 시퀀싱을 수행했다. 변이체는 시퀀싱 데이터 내의 모티프의 존재에 대해 평가되었다. 변이체는 여러 서열에서 발생하는 통합 변이(예를 들어, 캡시드 내 일관된 위치에 있는 특정 점 돌연변이 또는 특정 펩티드 삽입 서열)의 존재에 따라 모티프로 분류되었다. 모티프는 2회 이상의 연속적인 선택 라운드에서 서열화된 집단의 5% 이상 또는 1회 이상의 선택 라운드에서 서열화된 모집단의 10% 이상을 나타내는 경우에만 추가 평가를 위해 진행되었다. 후자의 기준을 충족하는 모티프는 도 15A-B에 나와 있다. 두 전달 장치를 모두 사용하여 A101 변이체(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함)에 대한 강한 수렴이 관찰되었기 때문에 선택은 첫 번째 라운드 후에 완료된 것으로 간주되었다.
상기 순위 기준에 기초하여, 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 A101 캡시드 변이체는 인간 중화 항체(NAb)의 존재 하에 기관내 에어로졸 투여 후 영장류 폐에 향상된 유전자 전달 효율을 부여하는 것으로 확인되었다. A101은 주로 AAV1로 구성되지만 AAV2, AAV4, AAV6 및 AAV9의 아미노산도 포함하는 키메라이다.
실시예 3
폐에 대한 AAV 기반 유전자 요법을 개발하려는 초기 시도가 임상적 안전성을 입증했지만, AAV2 벡터의 사용은 궁극적으로 낭포성 섬유증에서 임상적 이점을 나타내도록 폐 세포를 효율적으로 형질도입하지 못했다. 보다 최근에는, AAV1 및 AAV5를 포함한 추가 AAV 혈청형이 에어로졸 투여 후 영장류 폐의 개선된 형질도입을 나타내었지만 여전히 최적은 아니다. 하기 실험 데이터는 인간 중화 항체의 존재 하에 영장류 폐 전체에 걸쳐 인간 CFTR과 같은 이식유전자를 효율적으로 전달하기 위한 비히클로서 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV의 놀라운 적합성을 확인시켜준다.
(i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 이식유전자(GFP 또는 EGFP)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)의 유전자 전달은 3개의 비인간 영장류(NHP)에 에어로졸 투여 후 특성화되었다(조직병리학 평가 포함). rAAV의 분무된 전달은, 최소한의 전신 생물학적 분포로, 말초(기관지폐포 영역)를 포함한 폐의 모든 영역에 바이러스 게놈의 강력한 전달을 가져왔고, rAAV는 폐포를 포함한 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개한다.
재료 및 방법
중화 항체 검정
HEK2v6.11 세포(John Hopkins University에서 입수)를 1% 열 불활성화 소태아 혈청(FBS; GE Healthcare Life Sciences) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(John Hopkins University)으로 변형된 Dulbecco의 Eagle 배지(DMEM; Corning)에서 30,000개 세포/웰의 세포 밀도로 검은색 불투명 96웰 플레이트에 플레이팅했다. 실험을 시작하기 전에 세포를 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다.
각 NHP 혈청 샘플을 1:10, 1:25, 1:50의 희석으로 분석했다. 각 플레이트에는 형질도입을 위한 양성 및 음성 대조군이 포함되어 있다. NHP 혈청 샘플은 (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 루세리파제 유전자에 작동 가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV와 함께 37℃에서 1시간동안 1,000 MOI에서 배양되었다. 1시간 배양 후, 각각의 NHP 혈청 샘플 희석과 rAAV를 2V6.11 세포를 함유하는 검점색 불투명 96웰 플레이트의 개별 웰에 첨가했다. 루시페라아제는 형질도입 48시간 후에 ONE-Glo EX 루시페라아제 분석 키트(Promega)에 의해 검출되었다. ONE-Glo EX를 첨가하여 세포를 용해시키고, 루시페라아제 기질을 세포에 단일 단계로 첨가했다. Cytation 3 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 발광을 판독했다.
변동 계수(Coefficients of variation)(CV) 및 표준 편차는 모든 NHP 혈청 샘플 희석 및 표준 곡선의 각 지점에 대해 계산되었다. NHP 혈청 샘플을 양성 형질도입 대조군으로 정규화했다. 각 NHP에는 중화 항체 역가가 할당되었다. 각 NHP 혈청 샘플에 대한 중화 항체 역가는 ≥50% 형질도입이 관찰되는 가장 낮은 혈청 희석으로 정의되었다. 1:10 혈청 희석에서 ≥50% 형질도입이 관찰된 NHP는 연구에 포함되는 것으로 간주되었다.
테스트 시스템 및 면역억제
3마리의 수컷 시노몰구스 원숭이가 연구에 포함되었다. 동물의 연령 범위는 4세 10개월에서 9세 8개월이며 체중 범위는 4.73kg에서 7.09kg이다. 동물은 -7일부터 시작하여 매주 1회 메틸프레드니솔론(methylprednisolone)(20mg/kg, 근육내) 면역억제제를 투여받았다.
테스트 물품 준비 및 투여
(i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) EGFP에 작동 가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 테스트 물품 로트를 얼음 위에서 해동시키고, 함께 풀링하고, 각 NHP에 5mL 중 2.80 x 1012 vg/kg의 최종 용량을 전달하기 위해 제제 완충액에서 희석했다. 각 동물에 대한 테스트 물품 희석이 표 3에 제공되어 있다. 동물을 케타민(Ketamine) 및 덱스메데토미딘(Dexmedetomidine)으로 진정시켰다. 동물은 기관 분기부 위 약 5cm에 위치한 삽관 튜브의 끝으로 삽관되었다. 동물을 투여를 위해 앉은 자세로 의자에 놓았다. 각 동물에 대해 희석된 테스트 물품 5mL를 AeroEclipseII 분무기 저장소(Trudell Medical)에 로드했다. 투여하는 동안 압력을 15-20cm H2O로 조정했다. 테스트 물품은 10 펄스 동안 눈에 보이는 안개가 생성되지 않을 때까지 12-24 호흡/분의 속도로 투여되었다(동물에게 < 40분 동안 연속적으로 투여되었다). 투여 완료 후, 동물을 발관하고 진정을 역전시켰다.
표 3: 테스트: 물품 용량 준비
[표 3]
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생전(in-life), 부검 및 조직 수확
CRO 직원은 -7일부터 부검까지 매일 2회 케이지 측 관찰을 수행했다. 체중은 매주 평가되었고 혈액 샘플은 혈액학 및 임상 화학에 대해 정의된 시점에 수집되었다. 57±1일에 훈련된 수의사 직원이 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium)(100mg/kg)을 정맥 주사한 후 양측 개흉술 및 헤파린 처리된 인산염 완충 식염수를 통한 경심 관류를 사용하여 안락사를 수행했다. 관류 후 폐(기관 포함), 뇌, 척수(경추, 흉부 및 요추 부위), 심장(심실 및 심방 부위), 간, 비장, 골격근(상완삼두근, 외측광근), 횡격막 및 신장이 수집되었다. 조직 샘플을 수집하고 후속 DNA 및 단백질 분리를 위해 급속 냉동했다. 추가 샘플을 수집하고 면역형광을 위한 후속 파라핀 포매 및 절편을 위해 4% 파라포름알데히드(폐 및 신경 조직용) 또는 10% 중성 완충 포르말린(말초 조직용)에 고정했다.
기관 및 폐를 광범위하게 샘플링하여 각 분석 과정에 대해 다중 샘플을 제공했다. 폐를 수확하고 가능한 한 기관에서 위쪽으로 고정했다. 오른쪽 폐를 본선(mainstem) 기관지에서 약 1mm 간격으로 두 번 고정했다. 클램프 사이를 절단하여 오른쪽 폐를 제거했다. 도 16에 설명된 대로, DNA 및 단백질 분리를 위해 각각 16개의 샘플을 1차/2차 기관지, 3차 기관지 및 폐포를 포함하는 오른쪽 폐 영역에서 수집했다. 기관 및 왼쪽 폐를 4% 파라포름알데히드로 팽창시키고 4% 파라포름알데히드의 10배 부피에 고정했다. 그런 다음 도 16에 설명된 대로 기관, 1차/2차 기관지, 3차 기관지 및 폐포 샘플을 포함하도록 기관 및 왼쪽 폐를 절단했다.
바이러스 게놈 생물학적 분포
EGFP 이식유전자 서열을 함유하는 AAV 바이러스 게놈에 대한 적격 검정을 사용하여 Charles River Laboratories의 Mattawan 사이트에 의해 바이러스 게놈 생물학적 분포를 수행했다. QIAsymphony(Qiagen) 및 관련 DSP DNA 미니 키트를 사용하여 조직 샘플에서 전체 DNA를 추출했다. qPCR 반응은 96웰 플레이트에서 수행되었으며, 각 플레이트에는 표준 곡선, QC 샘플 세트 및 연구 샘플이 포함되어 있다. 중복 QC 샘플은 반응당 1,000ng NHP 매트릭스 DNA의 배경에서 높은, 중간 및 낮은 카피/반응으로 준비되었다. 가능한 경우, 조직 DNA 샘플을 반응당 1,000ng에서 테스트했다. 특정 샘플에 대해 위에서 지정된 양을 로드할 수 없는 경우(DNA 농도가 너무 낮거나 샘플 볼륨이 제한되어 있기 때문) 더 적은 양의 샘플 DNA가 분석되었다.
모든 샘플 반응은 삼중으로 실행되었고, 세 번째 반응은 잠재적인 qPCR 억제를 평가하기 위해 200개 카피의 pAAV-CAG-EGFP-SV40 DNA로 스파이크되었다. qPCR 억제가 표적 DNA의 110개 카피 미만에서 세 번째 스파이크된 웰의 측정 값과 같이 관찰되면 샘플 DNA는 더 적은 양으로 재분석되었다.
단백질 발현 생물학적 분포
gentleMACS 조직 해리제(Miltenyi Biotec) 및 관련 시약을 사용하여 조직 샘플로부터 총 단백질을 추출했다. EGFP는 GFP ELISA 키트(Abcam)를 사용하여 정량화하였고 총 단백질은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher)를 사용하여 정량화했다. GFP 및 총 단백질 모두에 대해 반응을 3회 수행하고 각 키트에는 표준 곡선이 포함되어 있다.
면역형광 이미징
Seventh Wave Laboratory에 의해 개, NHP 및 돼지 조직에 대한 표준 프로그램을 사용하는, Sakura VIP 5를 사용하여 조직을 파라핀 블록으로 처리했다. 슬라이드는 4℃에 보관된 Seventh Wave Laboratory에 의해 10μm 두께로 절단되었다. 면역조직화학은 각 연구 동물(n = 3)의 폐 6개 절편(폐포 및 기관지 영역 포함) 및 기관 2개 절편 그리고 추가 대조군 동물에서 수행되었다. 파라핀 슬라이드는 표준 파라핀 항체 염색 프로토콜을 사용하여 탈수되었다. 간단히 말해서, 절편을 크실렌(xylene)으로 탈파라핀화하고 물 중 에탄올 농도를 감소시키면서(100%, 90%, 70%, 50% 및 30%) 재수화한 다음 PBS로 세척했다. 열유도 에피토프 검색(heat-induced epitope retrieval)(HEIR)과 압력의 조합을 사용하여 항체로 염색하기 전에 항원 검색을 수행했다. 슬라이드를 끓는 구연산 나트륨 완충액에서 10분 동안 배양한 다음 압력 하에 3분 동안 배양했다. 슬라이드는 항체 염색 전에 실온으로 냉각되었다. 항원 검색 후 슬라이드는 1:1000 희석의 1차 닭 다클론 항GFP 항체(Abcam #13970), 1:1000 희석의 2차 염소 항-닭 IgY 항체(Abcam #175779) 및 DAPI를 사용하여 염색되었다. Zeiss AxioObserver 현미경을 사용하여 형광 이미징을 수행했다. Anti-GFP 신호는 1000ms로 원적외선 채널(647nm)에서 획득되었다. DAPI 신호는 100ms로 파란색 채널(355nm)에서 감지되었다. 모든 이미지는 Anti-GFP 채널에서 동일한 파라미터와 픽셀 강도 값을 사용하여 Zeiss ZenPro 소프트웨어를 사용하여 처리되었다.
조직병리학 평가
조직 트리밍, 포매, 절편 및 H&E 염색이 Seventh Wave Laboratory에서 수행되었다. 개, NHP 및 돼지 조직에 대한 표준 프로그램을 사용하는, Sakura VIP 5를 사용하여 조직을 파라핀 블록으로 처리했다. 슬라이드를 4㎛ 두께로 절단하고 Leica XL Autostainer를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)(H&E)에 대해 염색했다. 각 연구 동물(n = 3) 및 추가 대조군 동물의 폐 16개 절편, 기관 4개 절편 및 기관 분기부 1개 절편에 대해 조직병리학 평가를 수행했으며, 조직병리학자는 치료 조건을 알지 못했다. 슬라이드는 표준 평가 척도를 사용하여 결과의 성격과 심각도에 대해 점수를 매겼다.
컴퓨터화된 시스템
혈청 중화 항체 스크리닝을 위해 데이터를 생성하고 Cytation 3 마이크로플레이트 판독기(Biotek), Gen5plus 소프트웨어 버전 3.03.14 및 Microsoft Excel 버전 15.32를 사용하여 분석했다.
조직 샘플 내 바이러스 게놈의 정량화를 위해 QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR 시스템, QuantStudio Real Time PCR 소프트웨어 v1.4, Microsoft Excel 및 GraphPad Prism 버전 8.1.2를 사용하여 데이터를 생성하고 분석했다.
조직 샘플 내 EGFP 발현의 정량화를 위해 Cytation 3 마이크로플레이트 판독기(Biotek), Gen5plus 소프트웨어 버전 3.03.14, Microsoft Excel 버전 15.32 및 GraphPad Prism 버전 8.1.2를 사용하여 데이터를 생성하고 분석했다.
대표적인 면역형광 이미징을 위해 Zeiss Axio Observer z1 현미경 및 ZenPro 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득했다. 이미지는 ZenPro 소프트웨어를 사용하여 처리되었다. 이미지는 프레젠테이션을 위해 Microsoft PowerPoint 버전 15.32로 전송되었다.
모든 데이터 분석 및 편집은 OSX(10.12.6)를 실행하는 Macbook Pro에서 수행되었다.
결과 및 논의
항-AAV 중화 항체 스크린은 연구 포함을 위한 NHP를 식별한다
비인간 영장류(NHP) 혈청에서 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 갖는 AAV 캡시드에 대한 중화 항체의 수준을 평가하기 위해 중화 항체 검정을 사용했다. 각 NHP 혈청 샘플에는 중화 항체 역가가 할당되었다. 동물은 1:10 혈청 희석에서 ≥ 50% 형질도입이 관찰되는 경우 혈청음성으로 간주되어 연구 포함 기준을 통과했다.
전체 중에, 20개의 NHP 혈청 샘플을 4개의 96웰 플레이트에 걸쳐 평가했다. 검정 허용 기준은 1) 표준 곡선의 분산 계수(CV), 2) 미지 혈청 샘플의 CV, 및 3) 표준 곡선에 대한 실제 입력 단백질과의 백분율 편차에 대해 설정되었다. 표준 곡선에 대한 허용 가능한 CV는 < 25%로 정의되었지만, 실제 CV는 5%를 초과하지 않았다. 정량 한계 내에서 미지의 혈청 시료에 대한 허용 가능한 CV는 < 30%로 정의되었지만, 실제 CV는 19%를 초과하지 않았다. 표준 곡선에 대한 입력 단백질로부터 허용 가능한 백분율 편차는 < 25%로 정의되었지만, 실제 백분율 편차는 19%를 초과하지 않았다. 모든 플레이트는 모든 분석 허용 기준을 충족했으며 이들 플레이트들의 데이터를 평가에 사용했다. 전반적으로, 평가된 11개(55%) NHP 혈청 샘플은 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드에 대해 혈청음성이었다(도 17). 1:10 혈청 희석에서 상위 3개의 가장 높은 백분율 형질도입을 갖는 NHP가 연구 포함을 위해 선택되었다. 선택된 모든 NHP는 NHP 혈청의 부재 하에 관찰된 형질도입보다 높은 형질도입을 입증했다. 이 관찰은 이전 연구에서 언급되었으며 미지의 혈청 단백질과의 호의적인 상호작용의 결과일 가능성이 높다. 1:10 혈청 희석에서 선택된 NHP ID 및 백분율 형질도입은 표 4에 보고되어 있다.
표 4: 연구에 포함된 NHP
[표 4]
Figure pct00004
서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 변이체 캡시드의 분무 전달은 NHP에서 내성이 우수하다
연구 설계는 표 5에 요약되어 있다. 모든 동물은 테스트 물품 투여 후 정상적으로 회수되었고 예정된 부검 날짜까지 생존했다. 연구의 생전 기간(in-life portion) 동안 어느 시점에서든 어떤 동물에서도 유의미한 임상 소견이 보고되지 않았다. 혈액학 및 임상 화학 소견에 대한 참조 범위를 벗어난 사소한 변화가 일부 동물에서 일부 시점에서 관찰되었지만 이러한 변화는 정상적인 생리학적 변화로 해석되었다. 부검 시 육안 검사에서 주요 소견은 보고되지 않았다.
표 5 - 연구 설계 요약
[표 5]
Figure pct00005
서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 변이체 캡시드는 폐의 모든영역에 대한 강력한 유전자 전달을 매개한다
바이러스 게놈은 변이체 캡시드(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함) 및 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 EGFP 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 게놈 생물학적 분포를 결정하기 위해 부검 동안 얻은 모든 샘플에 대해 qPCR에 의해 정량화되었다.
대략 104 - 105 vg/μg 범위의 다량의 바이러스 게놈이 모든 48개의 폐 샘플(NHP당 n = 16개 샘플, n = 3개 NHP)에서 관찰되었으며, 이는 폐포, 3차 기관지 및 1차/2차 기관지로부터의 샘플을 나타낸다(도 18). 세 동물 모두에 대해 다른 폐엽 또는 다른 폐 영역 내에서 바이러스 게놈의 양에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 소수의 심장 및 간 샘플, NHP V003424의 심장 샘플 3개(15개 중) 및 NHP V002969의 간 샘플 10개(10개 중)에 검출 가능한 바이러스 게놈이 존재했다. 그러나 DNA 1μg당 존재하는 바이러스 게놈의 양은 폐에 존재하는 바이러스 게놈의 양보다 1,000 내지 10,000배 적었다. 골격근(상완삼두근, 외측광근), 횡격막, 신장, 비장, 뇌 및 척수에서 테스트한 모든 샘플은 정량화 하한(BLQ) 미만이었다. 따라서, rAAV의 분무 전달은 최소한의 전신 노출로 폐의 모든 영역에 바이러스 게놈의 강력한 전달을 초래한다.
변이체 캡시드(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함)는 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개하고 여러 세포 유형을 형질도입한다
EGFP 단백질 발현은 qPCR이 검정의 정량화 하한을 초과하는 바이러스 게놈의 존재를 입증한 모든 샘플에 대해 정량화되었다. 이 샘플 세트에는 3개의 NHP 모두의 모든 폐 샘플, NHP V003424의 3개(15개 중) 심장 샘플 및 NHP V002969의 10개(10개 중) 간 샘플이 포함되었다. EGFP 발현은 폐포, 3차 기관지 및 1차/2차 기관지의 샘플을 나타내는 48개 폐 샘플(NHP당 n = 16개 샘플, n = 3개 NHP)에서 모두 관찰되었다(도 19). 발현은 모든 영역 및 모든 폐엽에 걸쳐 동물 V002969에 대해 가장 높았다. 세 동물 모두에 대해, 서로 다른 폐 엽 내에서 EGFP 단백질 발현의 양에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 일반적으로 폐포 영역의 샘플에는 평균 또는 평균 이상의 양의 EGFP가 함유되어 있지만 이러한 경향은 중요하지 않는다. NHP V002969의 qPCR+ 간 샘플은 검출 가능한 EGFP 단백질 발현을 초래했지만, 발현 수준은 폐에서의 발현 수준보다 수십 배 더 낮았다.
이들 결과는 간으로의 게놈 국소화가 폐로의 게놈 국소화보다 수십 배 더 낮았다는 것을 입증하는 게놈 생물학적 분포 데이터와 일치한다(도 18). NHP V003424의 qPCR+ 심장 샘플은 검출 가능한 EGFP 단백질 발현을 함유하지 않았다. 이들 결과는 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 이식유전자를 인코딩하는 핵산을 갖는 캡시드를 포함하는 rAAV의 분무 전달이 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개한다는 것을 입증한다.
면역형광 이미징을 수행하여 폐의 상이한 영역 내의 형질도입 정도를 추가로 정의했다. 각 연구 동물(n = 3) 및 추가 대조군 동물의 폐(폐포 및 기관지 영역 포함)의 6개 절편과 기관의 2개 절편을 나타내는 슬라이드를 스캔하고, 각 영역에 대한 대표적인 이미지를 획득했다. 일반적으로, EGFP 발현은 모든 영역 및 모든 폐엽에 걸쳐 동물 V002969에 대해 가장 높았으며, 이는 ELISA에 의해 결정된 동물 전반에 걸쳐 관찰된 상대적 발현에 해당한다. 기관 및 기관지 내에서, EGFP 발현은 섬모상피층의 세포에서 주로 관찰되었다(도 20). 폐포 내에서 광범위한 EGFP 발현이 관찰되었지만(도 20), ATI 및 ATII 세포는 특정 세포 마커를 사용하지 않고는 결정할 수 없다. 이들 결과는 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 이식유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV의 분무 전달이 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개한다는 것을 입증한다.
서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV의 투여는 안전하고 폐 조직에 염증을 일으키지 않는다
케이지 측(cageside) 관찰은 투여 1주 전에 시작하여 연구의 생전 기간 전체에 걸쳐 매일 2회 수행했다. 연구의 연구 수명 기간 전체에 걸쳐 어떤 동물에서도 유의미한 임상 징후가 관찰되지 않았다. 혈액 샘플의 혈액학 및 임상 화학 분석은 연구의 생전 기간 동안 및 투여 1주 전에 걸쳐 격주로 수행되었다. 일부 개별 혈액학 및/또는 임상 화학 값이 기준 범위를 벗어났지만 이러한 값은 대부분 생리학적 변화로 해석되었다.
부검 후, 조직병리학적 평가를 폐 조직에 대해 수행하고 대조군(비투여) 동물과 비교했다. 국소 출혈, 검은색 색소 및 폐포 공간의 최소 단핵 세포 침윤이 모든 동물에서 관찰되었으며 원숭이에게서 흔히 볼 수 있는 부수적인 소견이다. 또한, 기관의 점막하 림프구 침윤 및 기관 분기부 점막 표면의 염증도 부수적인 소견일 가능성이 있으며 테스트 물품 투여와 관련이 없다. 관찰 결과 중 어느 것도 불리한 것으로 간주되지 않았다. 치료된 동물의 소견은 대조군 동물에서 관찰된 것과 다르거나 더 심각하지 않았다.
결론
서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질 및 리포터 이식유전자(EGFP)를 인코딩하는 핵산을 갖는 캡시드를 포함하는 rAAV는 시노몰구스 원숭이에 리포터 유전자의 에어로졸 전달을 특징으로 했다. 혈청은 테스트 물품 캡시드에 대한 기존의 중화 항체에 대해 혈청음성인 동물을 식별하기 위해 사전 스크린되었다. 동물(n = 3)은 임상적으로 관련된 작동식 분무기인 AeroEclipseII 장치를 사용하여 전달된 rAAV의 가능한 최대 용량을 받았다.
많은 양의 바이러스 게놈(qPCR에 의함) 및 생산된 EGFP 발현(ELISA 및 면역염색에 의함)이, 폐포, 3차 기관지 및 1차/2차 기관지의 샘플을 나타내는 연구의 모든 3개 NHP에 걸쳐 모든 폐 샘플에서 관찰되었다. 소수의 심장 및 간 샘플은 낮지만 검출 가능한 바이러스 게놈이 존재했으며, 다른 모든 조직의 모든 샘플에서는 검출 가능한 바이러스 게놈이 없었다. 이들 데이터는 rAAV의 분무 전달이 최소한의 전신 생물학적 분포로 폐의 모든 영역에 바이러스 게놈의 강력한 전달을 초래하고, rAAV가 폐포를 포함하는 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개한다는 것을 입증한다. rAAV 전달 및 EGFP 발현은 여러 기관지 수준 및 폐포에 걸쳐 균일한 분포 및 두개골, 중간 및 꼬리 부분에 걸쳐 균일한 분포로 동물들 사이에 일관되었다. 단백질 발현 데이터는 간으로의 게놈 국소화가 폐로의 게놈 국소화보다 수십 배 더 낮다는 것을 입증하는 게놈 생물학적 분포 데이터와 일치한다.
영장류 폐에서 AECII 세포에 대한 효율성 및 특이성을 결정하기 위해 추가 실험을 수행했다. 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV에 고유한 것 이상으로 추가의 특이성이 바람직한 경우, 세포-특이적 프로모터의 사용은 관심 이식유전자의 발현을 유도하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 실험은 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV가 낭포성 섬유증을 갖는 대상체의 폐에 CFTR 이식유전자를 안전하고 효과적으로 전달하고 다른 폐 장애를 치료하기 위한 치료 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
요약
갓 분리된 비인간 영장류 폐 및 이식이 거부된 인간 기증자 폐로부터의 폐포 상피 유형 2(AECII) 세포의 세포 배양 모델이 확립되었다. 이 모델은 AECII 세포를 표적으로 하는 것으로 식별된 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV의 특성화에 사용되었다. rAAV 및 천연 혈청형 AAV5는 AECII 세포 공기 액체 계면(air liquid interface)(ALI) 배양에서 형질도입 효율에 대해 평가되었다. 35,000의 감염 다중도(MOI)로 정점 형질도입 후, 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV는 AAV5와 비교하여 AECII 세포의 향상된 형질도입을 나타냈다. rAAV는 또한 인간 항-AAV 항체에 대한 강한 내성을 입증했다.
rAAV 캡시드가 AECII 세포를 표적으로 하고 감염성이 인간 AECII로 해석된다는 것을 확인하기 위해, AECII 세포를 NHP 폐 및 인간 기증자 폐로부터 분리하고, 이식을 거부하고, 폐 환경을 모방하기 위해 공기 액체 계면에서 배양했다. rAAV 형질도입 효율은 감염 후 여러 시점에서 CAG 프로모터에 의해 구동되는 리포터 향상된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein)(eGFP) 발현을 통해 결정되었고 AAV5.CAG-eGFP와 비교되었다. 이 데이터는 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV 변이체가 자연 발생 혈청형보다 더 감염성이고(즉, AAV5 캡시드보다 우수한 형질도입기), 잠재적으로 유전 질환에 대한 개선된 치료를 제공한다는 것을 입증한다.
AAV를 사용한 전임상 및 임상 유전자 요법 연구에서 한 가지 일반적인 해볼만한 일은 기존의 중화 항체가 성공적인 형질도입을 억제할 수 있다는 것이다. 야생형 AAV와 비교하여 인간 집단 내에서 중화 항체를 회피하는 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV의 능력을 이해하기 위해, rAAV 및 야생형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, 및 AAV9는 시험관 내 루시페라아제 검정에서 인간 IVIG에 대해 분석되었다. 여기서 제공된 데이터는 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV가 인간 IVIG(AAV5에 비해 4배 및 AAV2에 비해 32배)에 노출되었을 때 중화 항체 내성을 가지며, 이는 치료 벡터 진화 과정(Therapeutic Vector Evolution process) 동안에 적용되는 에어로졸 전달 및 선택적 압력을 통한 치료에 대한 중요한 구성 요소이다.
재료 및 방법
폐 폐포 상피 유형 2 세포 분리
비인간 영장류(NHP, Cynomolgus macaque, CRO) 또는 이식을 위해 거부된 인간 기증자 폐(Donor Network West, Donor ID: AGES430)를 사용하여 Fang et al1, 2에 따라 폐포 상피 유형 2 세포(AECII)를 분리했다. NHP 세포 분리를 위해 전체 폐를 활용했다. 인간 기증자 폐의 경우, 오른쪽 중엽을 절개하여 세포 분리에 사용했다. 기관지를 EDTA(Sigma) 및 EGTA(Sigma)를 함유하는 칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS(ThermoFisher)로 세척한 후 엘라스타아제(Worthington Chemicals)로 팽창시켰다. 조직을 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 폐를 균질화하고 기관 및 기관지를 제거했다. 세포 균질액을 거즈 층에 통과시켜 남아 있는 큰 조각을 제거했다. 세포를 100μm 및 20μm 여과기에 순차적으로 통과시켰다. 세포를 2단계 Percoll(ThermoFisher) 밀도 구배(70% 및 30%)에 로딩하고, 1800rpm에서 20분 동안 원심분리했다. 중간층을 제거하고, 원심분리하고, 칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS로 2회 세척했다. CD14 및 CD45 Dynabeads(ThermoFisher)를 사용하여 단핵구 및 대식세포를 제거했다. 나머지 세포를 IgG 코팅된 플레이트에서 37℃에서 밤새 배양하여 T 세포를 제거했다. 다음 날, 플레이트에서 비부착 세포를 수집하고, 원심분리하고, 저장성 용액에 적용하여 적혈구를 용해시켰다(ACK Lysis Buffer 1:10, ThermoFisher). 생성된 세포를 인간 콜라겐 IV 코팅된 삽입물(Sigma, 인간 태반 콜라겐(human placental collagen) IV, 25℃에서 18-24시간)에 1.5 x 106 cells/cm2의 밀도로 플레이팅하고 37℃, 5% CO2에서 배양했다. 세포는 상업용 보충제, 태아 소 혈청(10%, HyClone, ThermoFisher) 및 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄(1:200, ThermoFisher)이 포함된 기도 상피 세포 기저 배지(Airway Epithelial Cell Basal Medium)(ATCC)에서 배양되었다. 접종 하루 후, 삽입물을 PBS로 2회 세척하여 비부착 세포를 제거했다. 삽입물의 상단은 공기 액체 계면(ALI)의 형성을 보장하기 위해 건조한 상태로 유지되었다.
LysoTracker 염색
ALI를 달성한 세포는 배양물에서 LysoTracker 염색에 대해 조사되었다. LysoTracker(ThermoFisher)는 AECII 세포의 리소좀 및 박막층체와 같은 살아있는 세포의 고산성 성분에 흡수되는 지시 염료이다. 그 것은 AECII 세포를 표시하는 데 일상적으로 사용된다.
부착 세포 및 현미경 검사에 대한 LysoTracker
염색에 대해 식별된 삽입물 상의 세포를 PBS로 2회 세척했다. LysoTracker 농축액은 배지에서 희석되었다(1:1000). 희석된 LysoTracker 100 마이크로리터를 살아있는 세포 염색을 위해 삽입물에 추가했다. 세포를 37℃에서 5분 동안 배양했다. 배양 후, 삽입물을 PBS로 3회 세척하고 Zeiss Axio Observer D.1 형광 현미경으로 이미지화했다. 비염색 웰을 대조군으로 사용하고 노출을 설정했다.
세포 현탁액 및 유동 세포분석에 대한 LysoTracker
세포를 37℃에서 10분 동안 Trypsin-EDTA 0.05%(ThermoFisher)와 함께 배양한다. 트립신(Trypsin)은 Defined Trypsin Inhibitor(ThermoFisher)로 비활성화되었고, 세포는 삽입물에서 수집되었고 4분 동안 300xg에서 원심분리되었다. LysoTracker 농축액은 배지에서 희석되었다(1:1000). 희석된 LysoTracker 100 마이크로리터를 각 세포 펠렛에 첨가하고 반 속도로 와동시켜 혼합했다. 염색되지 않은 세포 샘플을 대조군으로 사용하고 유동 세포분석 게이트를 설정했다. 세포를 37℃에서 5분 동안 배양했다. 배양 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 2회 세척했다. 세포를 PBS에 재현탁하고 BD Accuri C6 Plus 유동 세포분석기에서 실행했다. LysoTracker 양성 집단은 염색되지 않은 대조군에서 오른쪽으로 이동하는 집단으로 식별되었다.
EdU 혼입(incorporation)
제조사의 지침에 따라 Click-iT EdU Alexa Fluor Kit(ThermoFisher)를 사용하여 세포 증식을 측정했다. 간단히 말해서, 세포를 EdU로 2시간 동안 펄스하고, PBS로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다(4℃에서 15분). Alexa Fluor azide를 포함하는 Click-iT 반응 칵테일을 준비하고 25℃에서 30분 동안 세포와 함께 배양했다. 반응 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 25℃에서 10분 동안 DAPI로 대조염색했다. 세포는 Zeiss Axio Observer D.1 형광 현미경에서 이미지화되었다.
벡터 형질도입
NHP AECII 세포를 접종 2일 후에 형질도입했다. 인간 AECII 세포는 접종 하루 후 형질도입되었다. 형질도입 당일, 3개의 삽입물을 Tripsin-EDTA 0.05%(ThermoFisher)와 함께 37℃에서 10분 동안 배양했다. 트립신은 Defined Trypsin Inhibitor(ThermoFisher)로 비활성화되었다. 삽입물에서 세포를 수집하고 혈구계산기에서 계수했다. 삽입물당 평균 세포 수를 결정하고 삽입물당 필요한 총 바이러스 게놈을 계산하는 데 사용했다. 35,000의 감염 다중도(MOI)는 삽입물당 100μl의 총 부피에서 모든 실험에 사용되었다. 세포는 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GFP 유전자 또는 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GFP 유전자를 포함하는 혈청형 5의 천연 AAV를 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV로 48시간 동안 정점에 노출되었다. 감염 2일 후, 공기 액체 계면을 회복하기 위해 삽입물에서 바이러스가 제거되었다. 감염 후 3일에 NHP 세포를 분석을 위해 수확하여 총 5일 동안 배양했다. 감염 6일 및 10일 후, 분석을 위해 인간 세포를 수확하여 총 7일 및 11일 동안 배양했다.
면역세포화학(ICC)
세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다(4℃에서 15분). 세포를 PBS 중 0.2% Triton X-100 중 5% 염소 혈청 및 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분 동안 차단했다. 세포를 25℃에서 2시간 동안 계면활성제 단백질 C 항체 또는 IgG 대조군(MilliporeSigma, 1:100)과 함께 배양했다. 1차 항체를 PBS 중 0.2% Triton으로 3회 세척한 후 25℃에서 30분 동안 2차 항체 배양(Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 555, 1:500)을 수행했다. 세포를 25℃에서 10분 동안 DAPI로 대조염색하고 PBS로 3회 세척했다. 세포는 노출을 설정하기 위해 IgG 대조군을 사용하여 Zeiss Axio Observer D.1 형광 현미경에서 이미지화되었다.
유동 세포분석
형질도입 후 세포를 Trysin-EDTA 0.05%(ThermoFisher)로 37℃에서 10분 동안 리프트 했다. 트립신은 Defined Trypsin Inhibitor(ThermoFisher)로 비활성화되었고, 세포는 삽입물에서 수집되었고 4분 동안 300xg에서 원심분리되었다. 세포를 PBS에 재현탁하고 BD Accuri C6 Plus 유동 세포분석기에서 실행했다. 형질도입된(eGFP 양성) 세포는 형질도입되지 않은 대조군에서 오른쪽으로 이동하는 집단으로 식별되었다.
중화 항체 내성 검정
HEK 2V6.11(John Hopkins University로부터 입수) 세포를 웰당 3 x 104세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅했다. 접종 24시간 후, (i) 서열 식별 번호 12("A101")의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터 및 야생형 AAV(혈청형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9, 모두 루시페라아제 리포터 이식유전자를 보유함)에 작동 가능하게 연결된 루시페라아제 이식유전자를 포함하는 rAAV를 감염 전 인간 정맥 면역글로빈(IVIG)의 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600의 5가지 희석으로 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 1,000의 MOI에서 rAAV 및 야생형 AAV로 감염시켰다. 각 플레이트에는 형질도입을 위한 양성 및 음성 대조군이 포함되어 있다. 양성 대조군은 rAAV 또는 IVIG 부재 하의 야생형 AAV였다. 형질도입에 대한 음성 대조군은 혈청 또는 AAV.CAG-루시페라아제가 없는 배지였다. 루시페라아제 활성은 Cytation 3(Biotek) 플레이트 판독기를 사용하여 감염 48시간 후에 측정되었다.
컴퓨터화된 시스템
FloJo, LLC 소프트웨어를 사용하여 유동 세포분석 데이터를 분석했다.
Microsoft Excel을 사용하여 FloJo 출력으로부터 평균 및 표준 편차를 계산하고 히스토그램을 만들었다.
혈청 중화 항체 스크리닝을 위해 데이터를 생성하고 Cytation 3 마이크로플레이트 판독기(Biotek), Gen5plus 소프트웨어 버전 3.03.14 및 Microsoft Excel을 사용하여 분석했다.
결과 및 논의
비인간 영장류 AECII ALI 배양 특성화
폐 폐포 상피 유형 2 세포(AECII)를 비인간 영장류(NHP) 폐로부터 분리하고 공기 액체 계면(ALI)에서 배양했다. 세포를 콜라겐 코팅된 삽입물에서 배양하고 AECII 특이적 마커, LysoTracker 염료 및 계면활성제 단백질-C(Surfactant Protein-C)(SPC)에 대해 분석했다. 1일 및 5일차의 세포는 90% 이상의 LysoTracker 양성 세포를 함유했으며, ICC에 의해 표시되고 유동 세포분석에 의해 정량화되었다(도 21A 및 21B). AECII 배양된 세포는 배양 1일차 및 5일차에 성숙한 AECII 마커인 SPC에 대해서도 조사되었다. 세포는 분석된 시점에서 ICC에 의해 SPC를 발현했다(도 21C). AECII 배양 시스템을 추가로 특성화하기 위해 시간 경과에 따른 세포 유사 분열을 조사했다. 유사 분열은 EdU 혼입에 이어 아지드 연결 형광 염료(azide linked fluorescent dye)를 사용한 Click-iT 반응을 통해 모니터링되었다.
유사 분열을 2일부터 5일까지 조사하고 형광 현미경 및 핵 염색으로 보고했다(도 21D). 유사 분열은 접종 후 2일에 가장 높았다; 세포가 배양에서 유지됨에 따라 유사 분열을 겪는 세포의 수가 감소했으며, 이는 핵에 EdU 혼입의 부족으로 입증되었다.
비-인간 영장류 AECII ALI 배양 시스템에서 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 갖는 캡시드를 포함하는 rAAV의 특성화
NHP 분리된 AECII 세포를 접종한 지 2일 후, 이들을 CAG 프로모터의 제어 하에 서열 식별 번호 12의 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 GFP 이식유전자를 포함하는 rAAV 또는 CAG 프로모터의 제어 하에 야생형 AAV5 캡시드 및 GFP 이식유전자를 포함하는 AAV로 5,000의 MOI에서 형질도입했다. 감염 후 3일, 배양에서 총 5일, 세포를 ICC 및 유동 세포분석에 의해 eGFP 발현에 대해 분석했다. 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV는 더 나은 형질도입 효율을 나타내는 AAV5(~8%)과 비교하여 상당히 더 높은 백분율의 eGFP 양성 세포(~30%)를 산출했다(도 22A 및 22B).
인간 AECII ALI 배양 특성화
Donor Network West(Doneor ID: AGES430)로부터 입수한 인간 폐의 우중엽을 나머지 폐 세트로부터 절개하고 AECII 세포를 분리했다. 세포는 콜라겐 코팅된 삽입물에서 성장되었고 ALI가 달성되었다. 순도를 결정하기 위해 두 개의 AECII 마커인 LysoTracker 및 SPC 단백질 발현을 조사했다. LysoTracker는 신선한 분리물(0일)부터 배양 11일까지 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. LysoTracker 양성 세포는 7일까지 약 80%였다. AECII가 AECI로 전환분화됨에 따라 LysoTracker 양성 세포 집단은 11일에 약 50%로 감소했다(도 23A 및 23B). 세포는 또한 분석된 시점에서 강력한 SPC 발현을 나타냈다(도 23C).
유사 분열은 NHP AECII 시스템에서와 같이 시간 경과에 따라 모니터링되었다. 유사한 결과가 관찰되었으며, 유사 분열을 겪는 세포의 가장 많은 수가 배양에서 처음 3일 이내에 발생하고 시간이 지남에 따라 감소했다(도 23D).
인간 AECII ALI 배양 시스템에서 4D-A101의 특성화
접종 하루 후, 인간 AECII 세포는 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 또는 eGFP 이식유전자를 함유하는 AAV5를 포함하는 rAAV로 35,000 MOI에서 감염되었다. 감염 6일 및 10일 후, 형질도입 효율을 위한 대용물 eGFP 발현에 대해 세포를 이미지화했다. 감염 후 6일 및 10일 둘 모두에서 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV는 AAV5와 비교하여 더 높은 수준의 eGFP 양성 세포를 나타냈다(도 24). 세포는 AECII 세포 표현형을 나타내는 LysoTracker 염색을 유지했다.
중화 항체 내성 검정
각각의 IVIG 희석에서 각각의 AAV 루시페라아제 벡터의 상대 광 단위(Relative Light Unit)(RLU)를 양성 형질도입 대조군인 AAV 루시페라아제 벡터 단독으로 정규화했다. 정규화 후 각 IVIG 희석의 각 벡터는 변환되어 백분율 형질도입으로 발현되었다. 높은 백분율 형질도입은 낮은 중화와 상관관계가 있고 낮은 백분율 형질도입은 높은 중화와 상관관계가 있다. 이어서, 각각의 AAV 루시페라아제 벡터는 50% 형질도입 초과에 도달하는 최저 희석으로 정의된 중화 항체 역가를 할당받았다. 전반적으로, 4D-A101은 테스트된 각각의 야생형 AAV에 비해 중화 항체에 대한 내성이 개선됨을 입증했다(도 25, 인간 IVIG의 존재 하에 HEK2v6.11 세포의 백분율 형질도입을 예시함). 4D-A101은 야생형 AAV1, AAV2, AAV8 및 AAV9와 비교하여 항체 회피에서 32배 초과 증가를 입증했으며 야생형 AAV5와 비교하여 항체 회피에서 4배 더 우수했다(표 6).
표 6. 야생형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 4D-A101의 중화 항체 역가. 루시페라아제 활성을 IVIG가 없는 경우의 50%로 감소시키는 데 필요한 IVIG 희석이 표시된다.
[표 6]
Figure pct00006
결론
AECII 세포를 분리하고 ALI에서 배양하고 LysoTracker 염색 및 SPC 발현에 의해 결정된 고순도를 유지했다. 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV는 NHP 및 인간 AECII ALI 배양 시스템 둘 다에서 AAV5와 비교하여 우수한 형질도입 효율을 나타냈다.
인간 풀링된 IVIG에서 중화 항체를 회피하는 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 rAAV의 능력이 환자에 대한 그의 치료 가능성을 향상시키는 것으로 입증되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 기존 중화 항체의 존재를 기반으로 하는 표적 환자 집단의 훨씬 적은 부분이 치료에서 제외될 가능성이 있다.
실시예 5
서열 식별 번호 12의 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드, 서열 식별 번호 12의 아미노산 138-736을 포함하는 VP2 캡시드 단백질 및 서열 식별 번호 12의 아미노산 203-736을 포함하는 VP3 캡시드 및 이식유전자(예를 들어, 루시페라아제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자 또는 CFTR와 같은 치료적 이식유전자)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자의 용해도, 전달 및 저장을 위한 최적의 제제 완충액을 선택하고 특성화하기 위해 제제 스크리닝 연구가 착수되었다.
모든 연구는 친화성(AVB) 및 음이온 교환(CIMQA) 크로마토그래피에 의해 정제된 캡시드(서열 식별 번호 12의 VP1 포함)로 수행되었다. 초기 연구는 0.005% Pluronic이 포함된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline))에서 이전에 제제화된 정제된 물질로 수행되었다. 이 로트는 희석되거나 관련 완충액 시스템으로 완충액 교환(buffer-exchange)되었다. CIMQA 정제 직후에 적절한 완충액 시스템으로 직접 완충액을 교환한 로트에 대한 후속 연구를 수행했다.
동결-해동 안정성
mL당 ~ 2-3 x 1013 바이러스 게놈을 함유하는 작은 샘플 분취량(≤ 100 uL)을 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 급속 동결(즉, -80C에서 급랭 냉각)의 5 또는 10 주기를 적용한 후 얼음 결정이 보이지 않을 때까지 실온에서 해동한다. 별도의 연구에서, 대략 ~ 6 x 1011 바이러스 게놈/mL을 함유하는 부피 ≥ 5mL를 15mL 폴리프로필렌 팔콘(Falcon) 튜브로 옮기고 약 1시간 동안(동결될 때까지) -80C에 놓은 다음 부드럽게 혼합할 때 얼음 결정이 관찰되지 않을 때까지 실온에서 약 1시간 동안 해동했다. 이 과정을 추가로 2회 반복했다(3X FT). 샘플은 세 번째 동결-해동 주기 후 실온에서 밤새 보관되었다.
5℃, 실온, 37℃ 및 40℃/75%RH 가속 안정성
농도 범위가 대략 1 x 1012 - 6 x 1013 바이러스 게놈/mL 범위의 다양한 샘플을 1.5mL 폴리프로필렌 튜브 또는 2.0mL 폴리프로필렌 냉동 바이알로 분취하고(≤ 100uL) 5℃, 실온, 37℃ 및 40℃/75%RH에서 각 연구 프로토콜에서 미리 결정된 시간 동안 보관했다. 샘플 튜브는 통풍이 잘 되는 보관 상자에 보관되었으며 파라필름(parafilm)은 샘플 보관 중 증발 손실의 영향을 최소화하기 위해 일상적으로 사용되었다.
교반 안정성
mL당 ~ 2-3 x 1013 바이러스 게놈을 함유하는 작은 샘플 분취량(≤ 100 uL)을 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 1500rpm으로 설정된 볼텍스(vortex) 믹서에 고정된 샘플 상자 내부에 넣었다. 샘플을 실온에서 2-4일 동안 교반했다.
충전 상태 모델링
전하 상태 엑셀 기반 계산기(온라인 다운로드; Gale Rhodes, University of Southern Maine)는 이온화 가능하고(ionizable) 불안정한 잔기를 자동으로 추출하고 정량화하도록 변형되었다. 캡시드 단백질 단량체(예를 들어, VP1 및 VP3) 순 전하는 각 pH 간격(≤ 1pH 단위)에서 각 이온화 가능한 종에 대해 부분 음전하 및 부분 양전하를 추가하여 결정되었다.
음전하 기여 = 잔기 수 * -1 * (10^-(pKa-pH)/((10^-(pKa-pH))+1)
양전하 기여 = 잔기 수 * (10^(pKa-pH)/((10^(pKa-pH))+1)
Figure pct00007
보고된 등전점(iso-electric point)(pI)은 순 전하가 수학적으로 0에 가장 가까운 것으로 결정된 pH이다.
280nm에서 흡광 계수(이론적)
ProtParam(web.expasy.org/protparam/)은 알려진 1차 서열에 기초하여 VP1, VP2 및 VP3 단백질의 몰 질량을 결정하는 데 사용되었다. 280nm에서 몰 흡광 계수는 다음 방정식에 따라 계산되었다: (M-1 cm-1) = (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125). 참고: VP1, VP2 및 VP3은 모두 5개의 시스테인 잔기를 포함하지만 문헌에 따르면 AAV 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다(S-S = cystine). Abs280nm 0.1%(또는 1mg/mL 용액과 동일한 흡광 단위)는 몰 흡광 계수를 몰 질량으로 나누어 계산되었다.
Figure pct00008
280nm에서 흡광(A280) 및 UV 분광광도법에 의한 탁도
대략 30uL의 샘플(또는 완충액)을 3mm 석영 큐벳으로 옮기고 UV 스펙트럼(250-400nm; 1nm 간격)을 NanoDrop 분광광도계에서 수집했다. 대안적으로, 다수의 테스트 물품(또는 완충액)을 UV Star 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트로 옮기고 UV 스펙트럼(250-400nm; 1nm 간격)을 Cytation 플레이트 판독기에서 수집했다. 마이크로타이터 샘플 웰의 경로 길이는 977 및 900nm에서 흡광을 측정하고 다음 방정식을 적용하여 경험적으로 결정되었다.
Figure pct00009
완충액 및 샘플 스펙트럼은 큐벳 또는 샘플 웰 경로 길이로 각 파장에서 측정된 광학 밀도(optical density)(O.D.)를 나눔으로써 1cm 경로 길이 세포로 정규화되었다. 정규화된 스펙트럼은 평균을 냈고, 여기서 중복이 실행되었다. 샘플 스펙트럼은 정규화된 O.D.를 빼서 보정된 백그라운드이다. 해당 완충액 공백에 대한 값이다. 280nm(LS280)에서의 광산란 기여는 비흡수 UV 영역(~300-400nm)에서 유래된 로그-로그 외삽을 사용하여 계산하고 O.D. 280 -LS280 = A280에서 뺍니다. 광산란 보정된 A280에 샘플 희석 계수(적절한 경우)를 곱하고 이론적인 VP3 흡광 계수(Abs280nm 0.1% = 1.71)로 나누어 mg/mL 단백질로 추정된 캡시드 단백질 농도를 산출했다. 그러나 이 방법은 DNA의 흡광으로 인해 캡시드 단백질을 과대평가하는 경향이 있었다. 대안적으로 A280 값은 DNA 흡광으로 인한 캡시드 단백질 과대평가를 피하기 위해 추가 변환 없이 이 보고서에 표시된다. O.D.350 값은 처음에 자가-결합에서 발생하는 광산란 또는 탁도의 변화를 반정량적으로 모니터링하는 데 사용되었다. 그러나 350/A280 값도 이 보고서에 제시되어 산란을 가용성 분획의 캡시드 양으로 정규화한다.
pH
샘플 또는 완충액 pH를 각각 측정하기 위해 소량 또는 대용량 pH 프로브를 사용했다. pH 프로브는 pH 4.01, 7.01, 10.01 사전 패키징된 Mettler Toledo pH 표준을 사용하여 보정되었다.
빙정 강하에 의한 삼투질농도
15uL의 기준 용액(예를 들어, 290mOsm/kg) 또는 샘플을 어드밴스 어는점 강하 삼투압계(Advanced Instruments Freezing Point Depression Osmometer)의 동결실로 옮겼다. 샘플을 동결될 때까지 과냉각하고 안정기가 관찰될 때까지 온도를 모니터링했다. 다음 방정식에 따라 삼투질농도를 계산하기 위해 안정기 온도를 사용했다. 1 mOsm 용질/kg 물 = 1.858 millidegrees(m℃) ↓ 빙점.
동적 광산란에 의한 유체역학적 크기 및 다분산도
대략 30uL의 샘플을 깨끗한 3mm 큐벳(ZN2112)에 로딩하고 Malvern Zetasizer Ultra(분산제 = 물, 샘플 유형 = 단백질)에서 다중 스캔(n = 2 또는 3)을 수집했다. 강도(%) 및 부피(%)에 대한 플롯을 생성하기 위해 스캔을 평균화했다. 전자는 낮은 수준으로 초기 제제 스크리닝 동안 평균을 냈으며, HMW 종은 강도(LS ~ diameter6 ~ Mw2)로 더 쉽게 관찰된다. Cumulants Fits에 의한 다분산도, 강도별 평균 크기(10-100d.nm), 부피별 평균 크기(10-100d.nm), 강도별 % 면적(10-100d.nm) 및 해당되는 경우 부피별 % 면적(10-100d.nm)에 대한 값을 생성하기 위해 스캔도 평균을 냈다.
Horizon 백그라운드 막 이미징(Backgrounded Membrane Imaging)(BMI)에 의한 서브비지블(subvisible) 입자 크기 조정
Horizon 입자 분석 시스템에서 백그라운드 막 이지징(BMI)을 수행했다. 빈 96웰 샘플 플레이트를 Horizon 시스템에 로딩하고 백그라운드 이미지를 획득했다. 그런 다음 플레이트를 진공 매니폴드(manifold)로 옮겼다. 대략 20-30uL의 샘플을 웰당 로딩했다. 블로팅 페이퍼와 블로팅 페이퍼 어댑터를 진공 매니폴드에 부착하고 샘플 플레이트를 스택 상단에 재배치했다. 웰 바닥에 남아 있는 액체를 제거하기 위해 진공을 켰다. 이어서 샘플 플레이트를 Horizon 기기로 옮겼다. 입자 수 및 이미지를 수집했다(2-10um, 10-25um, > 25um 및 총).
액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction)(ddPCR)에 의한 역가
SOP-AD-018에 따라 ddPCR에 의한 AAV 게놈 농도의 결정을 위해 5-10uL 동결된 분취량을 제출했다. 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV의 샘플을 DNase I 효소와 혼합된 0.02% Pluronic™ F-68 비이온성 계면활성제(DPBS + 0.02% F68)를 함유하는 칼슘 및 마그네슘을 포함하는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수로 희석하여 캡슐화되지 않은 DNA를 소화하고, DPBS + 0.02% F68로 추가 희석하여 테스트 물품을 분석의 동적 범위로 가져온다. DNAse 치료된 샘플은 이후에 ddPCR Supermix 및 SV40(또는 CFTR) 프라이머/FAM-표지된 프로브와 혼합되었다. 그런 다음 20μL의 반응 혼합물을 Bio-Rad QX200 Auto DG Droplet Generator를 사용하여 액적으로 분할하고 PCR을 수행한 다음 Bio-Rad QX200 Droplet Reader에서 판독하여 형광 신호에 대해 각 액적을 개별적으로 측정한다. 데이터는 Bio-Rad QuantaSoft 소프트웨어를 사용하여 분석되었으며, 이 소프트웨어는 양성 및 음성 액적의 Poisson 통계 분석을 사용하여 표적 서열(들)의 절대 정량화를 제공한다. 샘플에 대한 음의 기준을 설정하기 위해 템플릿이 없는 대조군이 사용되었다. DNase I 효소 치료가 없는 ddPCR도 선별된 샘플에서 수행되었다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)(PAGE)에 의한 화학적 순도
SOP-AD-028 Rev. 00(Krypton™ Staied SDS-PAGE에 의한 캡시드 순도 측정) 또는 SOP-AD-002(Siver stained LDS-PAGE에 의한 캡시드 순도 측정)에 따라 화학적 순도 분석을 위해 5-10uL 냉동 분취량을 제출했다. 간단히 말해서, 대략 1.00 x 1010(SOP-AD-028) 또는 1.00 x 109(SOP-AD-002) 바이러스 게놈을 4X LDS 샘플 완충액, 10X 샘플 환원제, 물과 혼합하고 95C에서 10분 동안 가열했다. NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris 젤은 상부 챔버(1X SDS 완충액 + 항산화제) 및 하부 챔버(1X SDS 완충액)를 함유하는 겔 상자에 고정되었다. 열 변성(및 환원) 반응 혼합물을 겔에 로딩했다. 겔 박스 커버를 부착하고 전극을 외부 전원에 연결했다. 그런 다음 제조업체 사양에 따라 전원이 공급되었다. 샘플 염료 전면이 전체 젤 길이의 ≥ 3/4일 때 전류 흐름이 중단되었다. 겔을 제조 지침에 따라 세척하고 염색했다. ChemiDoc MP Imager에서 젤 이미징을 수행했다.
녹색 형광 단백질(GFP) 발현에 의한 기능적 활성
녹색 형광 단백질(GFP) 발현의 분석을 위해 15uL 냉동 분취물을 제출했다. HEK2v6.11 세포를 10,000 MOI에서 형질도입하고 형질도입 후 72시간에 수확했다. GFP 발현은 형광 현미경에 의해 이미지화되었고 유동 세포분석에 의해 정량화되었다.
서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드를 갖는 rAAV의 상당한 손실(~50%)이 ≥ 1 x 1013 바이러스 게놈/밀리리터(viral genomes/milliliter)(vg/mL)로의 농도 및 정제된 AAV를 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 기반 제제 완충액(0.05% Pluronic™ F-68 비이온성 계면활성제(DPBS + 0.05% F68)를 함유하는 칼슘 및 마그네슘을 갖는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수)으로 완충액 교환하는 동안 관찰되었다. 본원에 설명된 실험은 손실의 근본 원인을 결정했으며 우수한 제제 완충액이 설명되어 있다.
서열 식별 번호 12의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 pI는 각각 6.7, 7.4 및 6.8인 것으로 추정되었다. VP1은 VP2 및 VP3와 비교하여 더 많은 수의 하전된 잔기를 가지고 있으며 이는 pH 5 미만 및 pH 9 이상에서 관찰되는 순 전하의 이론적 차이를 설명할 가능성이 있다(도 26). 그러나 pH 5와 pH 9 사이의 순 전하는 VP1과 VP3에 대해 대체로 유사한 것으로 보이지만 VP2에 대해서는 약간의 미묘한 차이가 예상된다. VP1, VP2 및 VP3 단량체는 아스파라긴산(aspartic acid)(D), 아스파라긴(asparagine)(N), 메티오닌(methionine)(M) 및 유리 시스테인(free cysteine)(C) 잔기를 포함한다. 결과적으로, VP1 및 VP3 단량체는 낮은 pH에서 아스파르트산 셔플링, 중성/염기성 pH에서 탈아미드화, 높은 pH에서 산화 및 이황화물 셔플링에 민감한 것으로 가정된다.
DBPS의 pH는 대략 7.0이다. 이것은 VP1 및 VP3 단백질에 대한 pI 또는 이론적인 용해도 최소값에 매우 가깝다. 따라서 pH가 접선 흐름 여과에 의한 농축 및 완충액 교환 동안 관찰되는 물리적 불안정성에 역할을 할 수 있다고 의심되었다.
pH 대 용해도
서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드 및 GFP(DPBS + 0.005% Pluronic F68 중 ~2 x 1013 vg/mL)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 출발 물질을 해동하고 낮은 이온 강도(low ionic strength)(~14mM NaCl) 및 생리학적 이온 강도(physiological ionic strength)(~150mM NaCl)에서 다양한 완충액(pH 4-8)으로 대략 2 x 1012 vg/mL로 10배 희석했다. 낮은 이온 강도 제제는 pH가 4에서 8로 증가함에 따라 고분자량(high molecular weight)(HMW) 종의 pH 의존적 증가를 보여주었다. 이 pH 의존성은 150mM NaCl의 존재 하에서 상당히 감소되었다.
샘플을 후속적으로 실온에 보관한 다음 다음날(T = 1일 @ RT) UV 분광광도법으로 평가했다. 280nm(A280)에서의 UV 흡광도 대 pH가 도 27에 플롯팅되어 있다. 낮은 이온 강도 샘플은 DLS에서 관찰된 물리적 불안정성과 일치하는 pH 5 이상에서 A280 신호의 매우 급격한 감소(즉, 감소된 rAAV 농도 추론)를 나타냈다. 150mM NaCl을 함유하는 모든 샘플은 유사한 A280 값을 보여주었다. 이러한 데이터는 낮은 pH와 염의 첨가가 용해도를 향상시키는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 제제 세부 정보, 샘플 pH 및 A280 값(광 산란 및 경로 길이 보정)은 아래에서 찾을 수 있다.
Figure pct00010
이러한 결과는 이온 강도와 pH가 모두 rAAV 용액 상태 거동(behavior)에 영향을 미친다는 것을 시사하는 것 같다. 따라서, 염화나트륨(~0.15M 이온 강도) 또는 시트르산삼나트륨(Trisodium citrate)(높은 이온 강도)의 존재 하에 pH 5에서 8까지 rAAV의 용해도 한계를 추가로 평가하기 위한 후속 연구가 수행되었다. 서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드 및 루시페라아제(DPBS + 0.005% Pluronic F68 중 1.76 x 1013 vg/mL)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 출발 물질을 해동하고, 완충액-교환하고, 다양한 완충액으로 대략 3 x 1013 vg/mL의 목표까지 농축시켰다(표 7). 회수된 바이러스 게놈을 출발 물질의 바이러스 게놈으로 나누어 공정 수율을 추정했다. 감소된 회수율은 DPBS + 0.005% F68 및 10mM Tris, pH 8 + 150mM NaCl + 0.005% F68 제제에 대해 관찰되었다. 이러한 낮은 수율은 또한 완충액 교환 및 농도의 더 느린 속도와 일치하는 것으로 보인다.
표 7 A101-Luc pH 용해도 연구 요약(0.2μm 여과 후)
[표 7]
Figure pct00011
염화나트륨을 함유하는 샘플은 Titer 및 A280에 의해 유사한 pH 의존적 경향, 즉 ↑ pH에서 ↓ 용해도를 나타냈다. 높은 이온 강도 제제(10mM Tris, pH 8 + 100mM 시트르산나트륨(Sodium Citrate) + 0.005% F68)는 이온 강도의 영향을 추가로 입증하는 테스트된 제제의 가장 높은 용해도를 보여주었다. 0.2μm 여과된 샘플의 경우 pH 의존적 경향, 즉, 더 낮은 pH에서 ↑ O.D.350이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 350/A280 값은 또한 가용성 분획에서 rAAV의 양에 대한 물리적 불안정성을 나타내기 위해 플롯팅되었다. 350/A280은 pH5에서 불안정성을 보였다. 그러나 높은 용해도와 물리적 안정성 사이의 균형을 나타내는 것으로 보이는 pH 6(10mM Citrate, pH 6 + 150mM NaCl + 0.005% F68)에서 변곡점이 관찰되었다. 높은 이온 강도 제제는 pH 6 제제에 필적할만한 탁도를 나타냈다. 도 35에 도시된 바와 같이(표 7의 데이터에 상응), 더 낮은 pH는 0.15M NaCl의 존재 하에서 개선된 용해도를 나타내고(용해도는 염 농도가 ~150mM NaCl일 때 pH 7 및 8과 비교하여 pH 5 및 6에서 더 높다) 더 높은 pH에서 용해도를 "회수"하려면 증가된 이온 강도가 필요하다는 것을 분명히 입증한다. 이러한 연구 결과는 궁극적으로 시트르산염, pH 6 제제의 사용으로 이어졌다.
DLS(동적 광산란)는 높은 이온 강도 제제(10mM Tris, pH 8 + 100mM Trisodium Citrate + 0.005% F68)을 제외하고 농축된 샘플에서 HMW 종의 다양한 수준을 보여주었다. 그러나, HMW 종은 10mM Sodium Acetate(아세트산나트륨), pH 5 + 150mM NaCl + 0.005% F68 제제에서 관찰된 지속적인 서브미크론(sub-micron) 종을 제외하고 0.2um 여과 후에 크게 감소했다. 이는 동일한 샘플에서 관찰된 증가된 350/A280과 일치한다.
이 연구의 결과는 pH ≤ 6일 때 또는 이온 강도가 0.15M 이상으로 증가될 때 rAAV ≥ 3 x 1013 vg/mL를 제제화하는 것이 가능함을 시사했다. 그러나 낮은 pH(예를 들어, pH 5)에서는 가용성의 위험이 있을 수 있으며, HMW 종 및 더 높은 pH 제제는, FDA의 비활성 성분 데이터베이스에 따른 다른 승인된 흡입 제품에서 발견되는 양을 초과하는 농도의 이온 강도 조절제(예를 들어, 시트르산나트륨)가 필요할 수 있다. 따라서 다음 연구는 20 - 100mM에서 시트르산나트륨의 영향 또한 평가하면서 제제 pH 범위(6-8)를 좁히는 것을 목표로 했다.
서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드 및 GFP(DPBS + 0.005% Pluronic F68 중 8.75 x 1012 vg/mL)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 출발 물질을 대략 3 x 1013 vg/mL을 목표로 해동하고, 완충액-교환하고, 다양한 완충액(표 8; 모든 제제는 또한 0.005% F68을 포함)으로 농축했다. 완충액 pH 및 삼투질농도(rAAV 제외)는 표 9에서 찾을 수 있다. 제제화된 샘플을 0.2um 여과하고 폴리프로필렌 튜브에 분취했다. 각 제제의 1개 분취량을 T = 0 측정에 사용한 다음 1500rpm에서 4일 실온 교반에 적용했다. 동결-해동(5/10X FT 주기), 실온 보관(T = 13일) 및 28일 보관(2-8C에서 15일 후 실온에서 13일)의 영향을 평가하기 위해 별도의 분취량을 사용했다. rAAV 출발 물질, DPBS + 0.005% F68 중 8.46 x 1012 vg/mL를 선택 조건에서 평가했다.
[표 8]
Figure pct00012
표 9 완충액 pH 및 삼투질농도(mOsm/kg)
[표 9]
Figure pct00013
ddPCR에 의한 역가 분석은 많은 수의 제제 및 스크리닝할 조건으로 인해 드물게 사용되었다. 그러나 T = 0 샘플 역가는 ~ 2.3에서 2.9 x 1013 vg/mL 범위였다(표 10). 이 약간의 변동성은 대부분의 조건이 > 90% 회수율을 충족하거나 초과하는 것으로 나타났기 때문에 소규모 공정 규모와 관련이 있는 것으로 가정되었다. 예외는 fPD_2019_006_003, fPD_2019_006_005 및 fPD_2019_006_007로 모두 낮은 회수율을 보였다. 샘플 역가는 또한 28일 저장 후에 측정되었다(2-8C에서 15일, 이어서 실온에서 13일). T = 0에 대해 ≥ 100% 역가를 유지한 모든 제제
표 10 T = 0 역가 및 회수율(%)
[표 10]
Figure pct00014
테스트된 조건에서 임의의 제제에 대해 % 체적에 의한 유체역학적 크기의 유의미한 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 따라서 일반적으로 낮은 수준의 HMW 종의 존재에 더 민감한 % 강도로 유체역학적 크기에 대해 오버레이(overlay)가 생성되었다. fPD_2019_006-05 및 fPD_2019_006-10은 1500rpm에서 4일 교반 후 증가된 피크 폭을 보여주었다. 이는 샘플 다분산도 플롯에서도 관찰할 수 있다. 출발 물질(fPD_2019_006-13)의 T = 0 다분산도는 스크리닝된 12개 제제 중 어느 것보다 높았으며, 이는 원래 DPBS 제제보다 개선된 것을 추가로 시사한다.
표 9는 A280 값뿐만 아니라 T = 0에 대해 남아 있는 % A280을 포함한다. 대부분의 제제는 1500rpm에서 4일 교반 후 fPD_2019_006-11와 fPD_2019_006-13(DPBS 대조군) 및 28일 저장 후 약간의 하락을 보인 fPD_2019_006-03와 fPD_2019_006-08을 제외하고 각각의 A280 신호의 ≥ 95%를 유지했다.
교반의 길이가 지나치게 공격적일 수 있음을 암시하는 다른 테스트 조건과 비교하여 교반된 샘플에 대해 상당히 더 많은 수의 입자가 관찰되었다. 그러나 제제는 적용된 다양한 스트레스 요인에 대한 반응이 다양한 것으로 나타났다. 예를 들어, fPD_2019_006-05는 교반 후 > 10μm의 증가된 수의 입자를 포함하는 반면 fPD_2019_006-09 및 fPD_2019_006-10은 10X 동결-해동 후 증가된 수를 나타낸다.
연구 fPD_2019_006에서 생성된 역가 및 물리적 안정성 결과는 반정량적 가중치 시스템으로 평가되었으며 fPD_2019_006-01(20mM Citrate, pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68), fPD_006-09_006-02(50mM Citrate, pH 6 + 70mM NaCl + 0.005% F68), fPD_2019_006-08(10mM Phosphate, pH 5 + 50mM NaCl + 50mM Trisodium Citrate + 0.005% F68) 및 fPD_2019_006-12(10mM Tris, pH 8 + 100mM Trisodium Citrate + 0.005% F68) 모두 유리한 특성을 보였으므로 더 연구해야 하는 것으로 결정되었다.
그 결정에 이어 28일 샘플의 나머지 분취량을 크립톤(Krypton) 염색 PAGE로 분석했다. VP1, VP2 및 VP3은 테스트된 모든 샘플에서 관찰되었다. 저분자량(Low molecular weight)(LMW) 밴드도 다양 다수로 관찰되었다; fPD_2019_006-01에서 가장 눈에 띄는 존재. 불행히도, T = 0은 비교할 수 없었기 때문에 이러한 LMW 밴드가 분해 산물인지 공정 불순물인지 명확하지 않았다. 따라서 후속 연구에서 화학적 안정성을 평가했다.
서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드 및 CFTR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV, CIMQA 풀(lot# dPD_2020_001, 7.92 x 1011 vg/mL)을 완충액 교환하고 fPD_2019_006에서 식별된 4개의 완충액에 대략 3 x 1013 vg/mL의 목표로 직접 농축시켰다. DPBS + 0.005% F68에서, 서열 식별 번호 12의 VP1을 갖는 캡시드 및 GFP(Lot# 4DER000057 vg/mL)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV를 완충액 교환하고 20mM Citrate, pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68으로 대략 6E13 vg/mL의 목표로 농축시켰다. rAAV-CFTR 및 rAAV-GFP 제제는 후속적으로 폴리프로필렌 튜브로 분취되었고 10회 동결-해동 주기, 1500rpm에서 40시간 교반 또는 40℃에서 40시간 저장 중 하나를 거쳤다.
표 11 제제 스크리닝 연구 설계
[표 11]
Figure pct00015
rAAV-CFTR, T = 0 역가는 1.7 - 1.9 x 1013 vg/mL 범위였다. 이는 3 x 1013 vg/mL 목표보다 ≥ 30% 낮았지만 용해도 제한 대신 작은 작업 부피에 기인했다. pH 7 및 pH 8 제제(fPD_2020_001-02 및 fPD_2020_001-03)은 교반 스트레스를 받았을 때 대략 4% 손실을 나타냈지만 pH 6 제제(fPD_2020_001-01 및 fPD_2020_001-04)에서는 손실이 관찰되지 않았다. 이러한 안정성 경향은 pH 7 및 pH 8 제제가 ≥90% 손실을 보인 반면 pH 6 손실은 < 30%였기 때문에 40℃에서 상당히 확대되었다. 모든 4개의 rAAV-CFTR 제제는 10번의 동결-해동 주기 후에 ≥ 100% 역가를 유지했다. rAAV-GFP(fPD_2020_001-05, T = 0에서 5.3E13 vg/mL)는 교반 동안 손실이 없고 40C 보관 10회 동결-해동 주기 동안 < 3%의 손실 없이 pH 6에서 믿을 수 없을 정도로 안정적인 것으로 입증되었다. 동일한 완충액에서 제제화된 rAAV-CFTR과 rAAV-GFP 간의 상대적 안정성의 차이는 이식유전자 크기와 관련이 있는 것으로 추측되었다. 그러나 앞으로 추가적인 연구가 필요할 것이다.
fPD_2020_001-02(pH 7) 및 fPD_2020_001-03(pH 8)은 40C에서 보관하는 동안 pH 6 샘플과 비교하여 더 높은 A280 신호 손실을 나타냈다. 이것은 역가에 대해 관찰된 경향과 일치하지만 감소된 크기이다. 이것은 40C에서 보관하는 동안 빈(empty) 캡시드(및 유리 DNA)의 양이 증가하는 것과 관련이 있을 수 있다. 빈 캡시드와 DNA는 여전히 자외선(UV light)을 흡수하지만 후자는 DNAse 치료에 취약한다. rAAV-GFP 제제(fPD_2020_001-05)에 대한 A280 결과는 역가 분석과도 일치한다; 변화가 거의 없거나 전혀 없다.
표 12 280 nm에서의 흡광도(A280)
[표 12]
Figure pct00016
강도 플롯에 의한 유체역학적 크기는 40℃에서 모든 rAAV-CFTR 샘플에 대한 증가된 피크 폭을 보여주었다. fPD_2020_001-01에서 낮은 수준의 HMW 종이 감지되었다. 그러나 역가와 UV의 상당한 차이는 침전, 표면 흡착 또는 빈/완전 캡시드 비율의 변화로 인해 덜 안정적인 제제에서는 이 피크가 없음을 시사할 수 있다. 크기 차이는 부피에 따라 덜 분명했지만 다분산성은 또한 미묘한 차이에 매우 민감한 것으로 판명되었다. 다른 테스트 방법과 일관되게 rAAV-GFP는 거의 또는 전혀 변화를 나타내지 않았다.
40℃ 저장은 A101-GFP 제제(fPD_2020_001-05)에 대해 높은 2-10um 입자 수로 보이는 결과를 낳았다. 이것은 농도 의존적 현상인 것으로 가정되었다(즉, rAAV-GFP 역가는 rAAV-CFTR 샘플보다 대략 3배 더 높았다). 흥미롭게도, 이 샘플은 > 10um 비교적 적은 수의 입자를 보여주었으며, 이는 제제가 더 큰 응집체의 형성을 방지함을 시사한다. 동일한 완충액(fPD_2020_001-01)에서 제제화된 rAAV-CFTR은 교반 및 열에 대한 민감성을 나타내었지만 > 25um 입자 형성에 내성하는 것으로 나타났다. 다른 rAAV-CFTR 제제는 입자 > 25um에 대해 약간의 경향을 나타냈다.
T = 0, 1500 rpm에서 40hr 또는 10X FT 후 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, pH 7(fPD_2020_001-02) 및 pH 8(fPD_2020_001-03) 제제는 LMW 종 증가를 나타내었고 과부하된 것으로 나타났다. 반대로, fPD_2020_001-01은 40C 보관 후 일부 HMW 밴드의 존재를 보여주었다. 그러나 이것이 샘플 준비 또는 염색 절차와 관련된 인공물인지는 불분명했다(예를 들어, 은-착색은 비정량적 것으로 간주됨). 다행히, 동일한 샘플에 대해 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석도 수행되었다. 웨스턴 블롯은 pH 7 및 pH 8 40C 샘플이 과부하되었음을 분명히 입증했다(역가에 따라 로딩됨). 이것은 A280과 비교하여 역가의 불균형적인 손실이 증가된 빈 캡시드에 기인할 가능성이 있다는 아이디어를 추가로 뒷받침한다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 40C fPD_2020_001-01 샘플에 대해 HMW 밴드가 관찰되지 않았다.
제제 스크리닝 노력의 대부분은 rAAV의 물리적 안정성을 개선하고 더 적은 정도로 화학적 안정성을 모니터링하는 데 집중되었다. 그러나 중요한 부분은 아직 다루지 않았다: 기능 활성. 따라서, rAAV-GFP 기능 활성은 연구 fPD_2020_001에서 테스트된 세 가지 제제에서 평가되었다. DPBS + 0.005% F68 중 rAAV-GFP(1.58 x 1013 vg/mL)를 완충액 교환하고 20mM Citrate pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68(fPD_2020_002-01), 10mM Potassium Phosphate, pH 7 + 50mM Citrate + 50mM NaCl+ 0.005% F68(fPD_2020_002-02) 또는 50mM Citrate pH 6 + 70mM NaCl + 0.005% F68 (fPD_2020_002-03)으로 대략 3 x 1013 vmL의 목표로 농축시켰다. rAAV-GFP 제제는 이후에 폴리프로필렌 튜브에 분취되었고 13일 동안 실온에서 보관되었다. T = 0(표 12)에서 역가를 측정하고 T = 0 및 T = 13일 샘플 모두에 값을 적용했다(즉, 기능 테스트에 대해 동일한 로드 볼륨(load volume)).
표 13. fPD_2020_002: A101-GFP 기능 활성 연구
[표 13]
Figure pct00017
유체역학적 크기는 T = 0에서 평가되었다. 테스트된 3가지 제제에 대해 차이가 관찰되지 않았다. A280 신호의 손실(표 14)은 13일 실온 보관 동안 관찰되지 않았다.
표 14 280nm에서의 흡광도(A280)
[표 14]
Figure pct00018
형광 현미경 및 유동 세포분석 결과는 모든 rAAV-GFP 샘플이 녹색 형광 단백질 발현을 나타내는 반면 비히클에 대해서는 형광이 관찰되지 않음을 입증했다. 13일 실온 저장 후 % GFP 양성 세포에서 차이가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 3가지 제제 모두가 rAAV 기능 활성을 보존함을 의미한다.
연구 fPD_2020_001 및 fPD_2020_002의 결과에 기초하여 2개의 시트르산염, pH 6 제제의 최종 평가를 진행하기로 결정했다. 20mM Citrate, pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68(fPD_2020_003-01, lot# dPD_2020_007) 및 50mM Citrate, pH 6 + 85mM NaCl + 0.005% F68(fPD_2020_003-02, lot# dPD_2020_007)로 제제화된 정제된 rAAV-CFTR(4D130109)을 해동하고 폴리프로필렌 튜브에 분취했다(~ 100uL). 각 제제(n = 2)의 두 분취량을 T = 0 측정에 사용했다. 나머지 바이알을 40C/75%RH에 놓고 4시간(n=2), 20시간(n=2) 또는 44시간(n=2) 후에 빼냈다. 20mM 시트르산염, pH 6 제제(fPD_2020_003-01)은 이전 연구에서 우수한 안정성을 보인 동일한 완충액을 사용했다. 50mM 시트르산염 제제는 약간의 변화를 제외하고 이전 연구에서 식별된 50mM 시트르산염, pH 6 제제와 유사했다; 용액의 등장성(tonicity)을 증가시키기 위해 NaCl 농축을 70mM에서 85mM으로 올렸다. 20mM 및 50mM 시트르산염, pH 6 완충액의 삼투질농도는 각각 289 및 295mOsm/kg이었다.
표 15 fPD_2020_003: 최종 제제 선택 연구 샘플
[표 15]
Figure pct00019
ddPCR(n = 2)에 의한 역가 분석은 플러스 및 마이너스 DNAase 전치료를 수행했다. 유리 캡시드 DNA 및/또는 DNAse 감수성 캡시드(예를 들어, 교란되거나 화학적으로 손상됨)가 존재함을 시사하는 두 가지 방법 간에 측정 가능한 차이가 관찰되었다. 그러나, 40C/75%RH 역가 손실은 두 제제에 대해 비슷했다.
증가된 A280 신호 손실은 fPD_2020_003-02(50mM 시트르산염, pH 6 제제)에 대해 관찰되었으며, 이는 가용성 분획의 일부의 염석(또는 침전)을 암시할 수 있다. 흥미롭게도 fPD_2020_003-01에 대해 탁도가 증가했으며, 이는 더 낮은 시트르산염 농축에서 용액에서 유지되는 교란된 종의 존재를 추가로 암시한다.
탁도 결과와 함께 DLS 경향이 나타났다. 샘플 fPD_2020_003-01은 40C/75%RH에서 20시간 및 44시간에서 강도로 HMW 종의 검출 가능한 수준을 보여주었지만 fPD_2020_003-02에는 HMW 종의 존재하지 않는 것으로 나타났다. 이 피크는 피크 면적 % 및 다분산도에서 관찰된 차이를 설명한다.
샘플은 또한 PAGE에 의해 화학적 순도에 대해 분석되었다. 관찰 내용은 다음과 같다. 분열 산물은 두 제제 모두에 대해 T = 0에서 검출된다. 아마도 이들은 다운스트림 정제를 통해 보유되는 공정 불순물일 것이다. 낮은 수준의 분열 산물은 40C/75%RH에서 장기간에 걸쳐 형성되기 시작한다. 두 제제의 화학적 순도는 비슷한 것으로 보인다.
이들 결과에 기초하여, 증가된 시트르산염는 40℃/75% RH에서 rAAV-CFTR 물리적 안정성에서 약간의 개선을 제공할 수 있는 것으로 결정되었다. 그러나 이것이 진정한 보호 효과인지 또는 A280의 동시 손실로 인해 물리적으로 불안정한 종이 염석되었는지는 분명하지 않았다. 또한, 50mM 시트르산염는 20mM 시트르산염 제제와 비교하여 역가 손실의 감소를 나타내지 않았고 두 제제 모두 PAGE에 의해 LMW 종의 유사한 증가를 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 50mM 시트르산염 제제는 흡입 약물 제품에서 덜 용인될 수 있는 더 높은 시트르산염 농축을 보증하기에 충분한 개선을 제공하지 않는 것으로 결정되었다.
따라서 20mM 시트르산염, pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68 제제는 NHP 파일럿 독소/용량 범위 연구를 위한 주요 제제로 확립되었다. 잠정적인 파일럿 독소 테스트 물품 요구 사항은 표 16에서 찾을 수 있다. 저용량(~6 x 1011 vg/mL) 동결-해동 안정성을 평가하기 위해 연구(fPD_2020_006)가 수행되었다.
표 16 NHP 파일럿 톡스에 대한 잠정 테스트 물품 요건
[표 16]
Figure pct00020
20mM 시트르산염, pH 6 + 125mM NaCl + 0.005% F68에서, rAAV-CFTR(4D130109, lot# 4DER000060.02, ~3 x 1013 vg/mL)은 동일한 제제 완충액으로 대략 6 x 1011 vg/mL(총 부피 5.5mL에서 저용량) 목표로 희석되었다. T = 0 역가 및 DLS에 대해 100uL 분취물을 제거했다. 나머지 물질을 -80C 냉동고에 1시간 동안 두었다. 튜브를 제거하고 실온에서 1시간 동안 해동시켰다. 해동된 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합하고 DLS 및 역가를 위해 100uL 분취량을 제거했다(1X 동결-해동). 이 과정을 두 번 더 반복했다. 세 번째 동결-해동 주기 후 물질을 실온에서 밤새 보관했다.
역가는 3회 동결-해동(3X FT) 주기를 통해 매우 작은 변화를 보인 반면, 3X FT 샘플을 실온에서 밤새 보관할 때 역가의 약간의 감소(~10%)가 관찰되었다. 그러나 이 값은 여전히 ddPCR 분석의 변동 범위 내에 있으므로 최악의 시나리오로 간주된다.
DLS에 의한 동결-해동 샘플의 경우 물리적 안정성에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. T = 0, 2X 및 3X FT 샘플의 더 작은 분취량(~50uL)도 실온에서 추가로 1시간 보관한 후(총 해동 2시간) 측정되었다. 이 샘플에서는 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 6
인간 세포에서 4D-710의 시험관 내 및 생체 외 특성화
(i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 45(4D-710)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV의 능력, 즉 인간 세포를 형질도입하고 서열 식별 번호 43의 코돈 최적화된 인간 CFTR 이식유전자(cohCFTRΔR, 아미노산 708-759가 삭제된 기능적 CFTR 유전자를 인코딩함)를 전달하는 능력을 평가했다. 인간 세포는 HEK2v6.11, 16HBE14o-G542X(낭포성 섬유증 재단을 통해 접근) 및 생체 외 ALI non-CF 배양물이었다. 단백질 발현, 단백질 막-국소화 및 치료적 이식유전자 카세트의 단백질 mRNA 발현을 평가했다.
재료 및 방법 - SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯. 불용성 물질을 제거하기 전에 4℃에서 30분 동안 1% v/v NP-40을 함유하는 PBS에서 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 용해시켰다. 웨스턴 블롯팅의 경우, 1X 로딩 염료 및 환원제(Thermo Bolt)를 함유하는 동일한 부피의 용해물을 50℃에서 10분 동안 가열한 다음, 4-12% 비스-트리스 아크릴아미드 겔(bis-tris acrylamide gel)(Thermo Bolt)에 로딩하고 250V에서 45분 동안 실행했다. 겔은 BIO-RAD Trans-Blot Turbo의 "고분자량(High MW)" 전송 설정(10분, 1.3A)에서 0.2μM 니트로셀룰로오스(BIO-RAD)로 반건조 전송되었다. 그런 다음 블롯은 10분 동안 1X iBind Flex 용액(Thermo)에서 차단되기 전에 초고순도 물로 잠시 헹구었다. 그런 다음 블롯을 항-CFTR 항체(Ab660, CFF/UNC 1:500) 또는 항-튜불린 항체(E-7, DSHB 1:1000)를 함유하는 1X iBindFlex 용액에서 실온에서 2시간 동안 부드럽게 진탕하면서 배양했다. 그런 다음 블롯을 0.01% Tween-20(Sigma)을 함유하는 PBS(Corning)로 5분 동안 진탕하면서 세척하고; 이 세척 단계를 추가로 2회 반복했다. 그런 다음 블롯은 실온에서 1시간 동안 1X iBind Flex 용액에서 항-마우스-HRP 2차 항체(R&D 시스템, 1:5000)에서 배양되었다. 그런 다음 PBS-0.01% Tween-20을 사용한 세척 단계를 반복했다. 그런 다음 세척된 블롯을 DuraWest HRP 검출 기판(Thermo)에서 5분 동안 코팅한 다음, 블롯을 BIO-RAD ChemiDoc Imaging System에서 이미지화했다.
재료 및 방법 - 면역세포화학. 면역세포화학의 경우, 2v6.11 세포는 폴리-L-리신(lysine) 코팅된 유리 챔버 슬라이드에서 성장되었고, 16HBE14o-는 소 콜라겐 I 및 인간 혈장 피브로넥틴(fibronectin) 모두로 코팅된 트랜스웰 삽입물에서 성장되었다. 형질도입 후 2일(2v6.11) 또는 4일(16HBE14o-)에, 세포를 암실에서 실온에서 20분 동안 4% PFA에 고정시켰다. 그런 다음 세포를 PBS(칼슘 및 마그네슘 없음) 에서 0.2% Triton-X로 투과화하고 차단 완충액에서 CFTR MM13-4 항체(EMD Millipore, 1:100)와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. 차단 완충액은 PBS에서 0.2% Triton-X, 5% 염소 혈청 및 2% 소 혈청 알부민으로 구성되었다. PBS-Triton으로 항체를 세척한 후, 2차 염소 항-마우스(Secondary Goat anti-Mouse) Alexa Fluor-647 접합체(Invitrogen, 1:500)를 암실에서 실온에서 1시간 동안 차단 완충액에 첨가했다. 2차 항체는 후속적으로 세척되었다. 핵은 PBS에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI)로 염색한 다음 Prolong Gold(Invitrogen)로 커버 슬립한 다음 이미지화했다. Zeiss Axio Observer.D1 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화했다. Zeiss Zen 2 소프트웨어(Carl Zeiss Microscopy LLC, White Plains, NY)를 사용하여 이미지 처리를 수행했다.
재료 및 방법 - RNA 추출 및 액적 디지털 PCR. RNeasy Micro Qiagen 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포에서 RNA를 분리하고 Maxima H minus cDNA 합성 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 cDNA를 만들었다. cDNA 샘플은 1x TE 완충액(10mM Tris, 0.1mM EDTA pH 8.0)에서 연속 희석하여 준비했다. 그런 다음 샘플을 ddPCR 슈퍼믹스와 CFTRΔR(서열 식별 번호 43) 또는 내인성 CFTR 유전자(Thermo Fisher)를 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트를 함유하는 마스터 믹스에 플레이팅했다. 그런 다음 샘플을 자동 액적 생성기(Automated Droplet Generator)(BIO-RAD)를 사용하여 나노 리터 액적으로 분할하고, C1000 터치 열 순환기(Touch Thermal Cycler)(BIO-RAD)에서 종점 PCR을 수행하고, 형광 신호에 대해 개별적으로 각 액적을 측정하는 QX200 액적 판독기(Droplet Reader)(BIO-RAD)에서 판독했다. 그런 다음 BIO-RAD의 QuantaSoft 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했으며, 이 소프트웨어는 양성(역치보다 높은 형광 신호를 함유하는 액적) 및 음성(역치보다 낮은 형광 신호를 갖는 액적) 액적의 Poisson 통계 분석을 사용하여 표적 서열(들)의 절대 정량화를 제공한다. 분석은 Microsoft Excel을 사용하여 추가로 수행되었다.
결과
4D-710으로 형질도입한 후 초기 개념-증명(proof-concept) 이식유전자 발현 및 단백질 막-국소화는 HEK2v6.11 세포주-비교적 간단한 시스템(더 복잡한 인간 공기 액체 계면 세포 모델에 비해)를 형질도입함으로써 평가되었다. HEK2v6.11 세포는 인간 아데노바이러스 E4 ORF6 단백질의 포나스테론(ponasterone) A-유도성 발현을 갖는 인간 배아 신장 계통인 HEK-293T에서 유래되었다. 여러 AAV 혈청형은 이 세포주에서 높은 형질도입 효율을 낼 수 있다. 간단히 말해서, HEK2v6.11을 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Gibco)에서 성장시켰다. 합류 시, 세포를 다양한 MOI에서 48시간 동안 치료했다. AAV 벡터로부터의 발현을 증가시키기 위해 포나스테론을 1㎍/ml로 첨가했다. 세포를 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학에 의해 분석하고 24시간 동안 4D-710으로 형질도입하고 형질도입 48시간 후에 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학(ICC)에 의해 분석했다. HEK2v6.11 세포로의 4D-710의 용량 의존적 형질도입은 증가하는 감염 다중도(MOI)에서 웨스턴 블롯에 의해 입증되었다(도 28A). 단백질의 ER 코어-클리코실화된(core-glycosylated) 형태(150 kDa)를 반영하는 B 밴드와 CFTR의 완전히 글리코실화된 성숙한 형태(170-180 kDa)를 반영하는 C 밴드를 볼 수 있으며, 이는 적절한 단백질 번역 및 세포질화(cellular processing)를 시사한다. 대표적인 면역형광 이미지는 CFTR 단백질의 용량 의존적 형질도입(도 28B) 및 세포질(도 28B) 및 막(도 28C) 발현을 추가로 입증한다. 형질도입되지 않은 대조군은 내인성 CFTR 단백질이 검출되지 않음을 나타내며, 이는 검출된 단백질이 형질도입된 CFTRΔR 이식유전자임을 나타낸다. 따라서 미성숙하고 성숙한 형태의 CFTRΔR이 만들어질 뿐만 아니라 CFTRΔR 단백질의 막 발현이 ICC에 의해 관찰되었다(항-CFTR 항체 및 F-액틴 항체를 사용하여 세포막 염색).
인간 폐 세포주의 4D-710을 사용한 형질도입을 평가했다. 16HBE14o-G542X 세포는 CFTR 삭제(null) 돌연변이(G542X, CRISPR 기반 유전자 편집을 사용하여 생성)를 보유하는 불멸화 인간 기관지 상피(immortalized human bronchial epithelial)(HBE) 세포주(원래 복제 기점 결함 SV40 플라스미드로 불멸화)이며 CFTR을 발현하지 않는다. 16HBE14o-G542X 세포를 MEM(Gibco 11095-072) + 10% FBS(Gibco 26140-079) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco 15140-122)에서 배양했다. 세포를 삽입물당 9,000개 세포로 트랜스-웰 삽입물에 접종했다. 배지를 상단(100μL)과 하단(500μL)에 모두 추가했다. 접종 후 3일째에, 세포를 다양한 MOI정점에서 72시간 동안 처리했다. 세포는 코돈 최적화된 CFTRΔR mRNA(4D-710 이식유전자)에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 면역세포화학 또는 역전사-액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(RT-ddPCR)에 의해 분석되었다. 외인성 CFTR 단백질을 검출하기 위해, 배양 배지에서 24시간 동안 독소루비신(Doxorubicin) 치료(1μM)와 병행하여 형질도입을 수행했다. 4D-710을 인간 기관지 상피 세포로 형질도입한 후 코돈 최적화된 CFTRΔR 이식유전자의 전사체 수준을 평가하기 위해, 16HBE14o-G542X 배양물을 증가하는 MOI에서 4D-710으로 형질도입했다. 4D-710을 사용한 HBE의 형질도입을 추가로 확인하기 위해, RT-ddPCR을 수행하여 CFTRΔR mRNA의 카피 수를 결정했다. 도 29A는 증가하는 MOI에 대한 CFTRΔR mRNA의 카피 수에 대한 용량 의존적 반응 곡선을 보여준다. 독소루비신의 존재 하에, 형질도입된 세포는 면역세포화학을 통해 식별되었고(도 29B), 50,000 MOI 대 35,000 MOI에서 형질도입된 세포의 수가 더 많았다. 따라서, 인간 기관지 상피 세포의 용량 의존적 형질도입 및 이들 질병 관련 인간 세포에서 CFTR 이식유전자의 강력한 발현이 입증되었다.
공기-액체-계면(ALI) 배양물은 건강한(비-CF) 폐에서 유래하며, 그 자체로 CFTR의 내인성 발현을 갖는다. 내인성 CFTR은 내인성 CFTR에 특이적인 또는 CFTRΔR FTRΔR mRNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하는 RT-ddPCR을 사용하여 절단된 4D-710 CFTR 이식유전자의 발현과 구별되었다. 생체 외 비-CF 폐의 표준 ALI 배양은 생체 내 폐 시스템의 최고의 시험관 내 모델을 나타낸다(이러한 배양은 비균질 세포 유형(생체 내 폐와 같은)에 복잡함). 간단히 말해서, 생체 외 인간 ALI 비-CF 폐 배양물을 콜라겐 IV형 코팅된 Corning 트랜스웰 삽입물에 플레이팅하고, 제조사의 프로토콜에 따라 펜/스트렙(pen/strep)(Gibco 15140-122), 젠타마이신(gentamycin) 및 암포테리신(amphotericin) B가 포함된 PneumaCult ALI 배지(StemCell Technologies 05040)에서 기본적으로 배양했다. ALI 배양물이 성숙하는 접종 30일 후, 배양물을 배양 배지에서 24시간 동안 0.625uM 이다루비신(idarubicin)의 존재 하에 다양한 MOI 정점에서 치료했다. 형질도입 7일 후, 내인성 CFTR에 특이적인 또는 CFTRΔR mRNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-ddPCR에 의해 세포를 분석했다. 생체 외 건강한 ALI 폐로의 형질도입 후 코돈 최적화된 CFTRΔR 이식유전자의 전사체 수준을 평가하기 위해, ALI 배양물을 이다루비신의 존재 하에 50,000 및 100,000 MOI에서 4D-710으로 형질도입했다. RNA는 형질도입 7일 후에 분리되었고 cDNA가 합성되었다. 준비된 샘플에 대해 RT-ddPCR을 실행하고 액적당 전사체 수준을 카피/μL 값으로 분석했다. 정량화는 검사된 프라이머/프로브 세트의 전사체를 함유하는 설정된 임계값을 초과하는 액적의 수를 분석했다. 내인성 인간 CFTR 유전자로부터 코돈 최적화된 인간 CFTRΔR 이식유전자를 특이적으로 구별하기 위해 2개의 프라이머/프로브 세트가 생성되었다. 형질도입되지 않은 ALI 배양물은 예상대로 CFTRΔR 전사체의 정량화 한계 미만 수준으로 발현되었다(도 30). 4D-710으로 형질도입한 후, 세포는 CFTRΔR 전사체에서 용량 의존적 증가를 보여준다(도 30). 50,000 MOI에서 CFTRΔR 전사체 수준은 내인성 CFTR 수준의 ~80%이다(도 30). 100,000 MOI에서 CFTRΔR 전사체는 내인성 CFTR 수준에 도달하고 일부 경우에는 그 이상 증가한다(도 30). 이 데이터는 4D-710이 CFTRΔR 이식유전자의 용량 의존적 발현으로 생체 외 폐 ALI 배양물을 형질도입할 수 있고 높은 MOI에서 내인성 CFTR 이상으로 CFTRΔR mRNA의 증가를 보여준다.
결론 - 4D-710은 바람직하게는 폐로의 단일 용량 에어로졸 전달에 의해 폐의 호흡기 병태인 CFTR 돌연변이에 의해 유발된 낭포성 섬유증을 치료하도록 설계된 재조합 AAV 유전자 대체 요법 제품이다. 4D-710은, 치료 유전자 산물을 폐로 전달하는 데 놀랍게도 유용한 것으로 유도 진화에 의해 식별된 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질, 및 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산(서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드서열은 CMV173 프로모터(서열 식별 번호 44)에 작동 가능하게 연결된 코돈 최적화된 인간 낭포성 섬유증 유전자 요법 페이로드(서열 식별 번호 43)를 포함한다)을 포함한다. 인간 세포와 함께 본원에 제공된 시험관 내 및 생체 외 데이터는 4D-710이 낭포성 섬유증 클래스 I 돌연변이를 함유하는 인간 기관지 상피 세포 및 건강한 ALI 폐 배양물에서 인간 CFTR 전사체 및 이식유전자 발현을 회복시키는 것으로 입증되었다. 또한, 4D-710의 형질도입 후에 발현된 CFTR 단백질은 HEK2v6.11 세포의 세포질 및 세포막에 발현되고, 번역 후 글리코실화되고 국소화되었다. 이러한 데이터는 4D-710이 인간 폐 세포주를 형질도입하고 검출 가능한 CFTRΔR mRNA를 전달하여 CFTR 단백질의 용량 의존적 생산 및 발현된 CFTR 단백질의 막으로의 국소화를 유도할 수 있음을 입증한다. 에어로졸 전달 후 최소의 전신 노출로 영장류 폐 전체에 걸쳐 안전하고 강력하며 광범위한 형질도입 및 이식유전자 발현을 입증하는 실시예 3 및 실시예 7의 데이터와 결합하여, 이들 데이터는 낭포성 섬유증 및 기타 폐 질환에 대한 유전자 요법의 개발을 위한 기존 AAV 혈청형 이상으로 상당한 진전을 나타낸다.
실시예 7
시노몰구스 원숭이의 폐에 4D-710의 에어로졸 전달을 위한 용량 범위 및 파일럿 안전성 연구
기도, 폐 및 기타 조직에 용량 수준 범위 내에서 단일 에어로졸 투여 후 세포를 형질도입하고 CFTRΔR 이식유전자를 발현하는 조작된 바이러스 벡터의 능력을 평가하기 위해, 시노몰구스 원숭이에 대한 파일럿 연구에서 4D-710 치료제의 안전성 및 형질도입 활성을 테스트하기 위해 생체 내 연구가 개시되었다. 실시예 6에서 논의된 바와 같이, 4D-710은 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 서열 식별 번호 45의 이종성 핵산을 포함하는 rAAV이다. 4D-710의 이종성 핵산 성분은 서열 식별 번호 44의 CMV173 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코돈 최적화된 인간 CFTRΔR 이식유전자인 서열 식별 번호 43의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 의도된 치료적 이식유전자 카세트의 발현 및 기능은 시노몰구스 영장류에서 생체 내 특성화되었다. 혈청은 테스트 물품 캡시드에 대한 기존의 중화 항체에 대해 혈청음성인 동물을 식별하기 위해 사전 선별되었다. 동물은 비히클을 받고(제제 완충액만), 3 x 1012 vg의 4D-710 또는 3 x 1013 vg의 4D-710은 AeroEclipseII 장치(Trudell Medical)를 사용하여 후두 바로 아래에 내시경으로 전달하여 말단 폐에 최적의 전달을 보장했다. 8주 후, 분석을 위해 선택된 조직(폐, 심장, 골격근, 간, 신장, 췌장, 비장, 뇌, 척수, 기관지 림프절 및 고환)을 채취했다. 바이러스 게놈은 qPCR을 통해 정량화되었다. 검출 가능한 바이러스 게놈을 함유하는 조직 샘플은 RT-qPCR에 의해 CFTRΔR 전사체에 대해 평가되었고, 폐 샘플은 IHC에 의해 CFTR 단백질 발현에 대해 절편화되고 이미지화되었다.
하기 데이터는 4D-710의 분무 전달이, 최소의 전신 생물학적 분포로 말초(기관지폐포) 영역을 포함하는 폐의 모든 영역으로의 바이러스 케놈의 강력한 전달을 초래하며, 4D-710이 폐의 모든 영역에 대한 CFTRΔR 전사체 및 단백질 발현을 매개했음을 입증한다. 비히클 또는 테스트 물품 4D-710(3 x 1012 및 3 x 1013 vg)이 투여된 동물에서 보고된 유해 안전성 소견은 없었다.
재료 및 방법
중화 항체 검정
HEK2v6.11 세포(John Hopkins University에서 입수)를 1% 열 불활성화 소태아 혈청(FBS, GE Healthcare Life Sciences) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)(DMEM, Corning)에서 30,000개 세포/웰의 세포 밀도로 검은색 불투명 96웰 플레이트에 플레이팅했다. 실험을 시작하기 전에 세포를 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다.
각각의 비인간 영장류(NHP) 혈청 샘플을 1:10, 1:25, 1:50의 희석으로 분석했다. 각 플레이트에는 형질도입을 위한 양성 및 음성 대조군이 함유되어 있다. NHP 혈청 샘플은 37℃에서 1시간 동안 바이러스와 함께 배양되었다. 각각의 웰은 1,000의 MOI에서 4D-A101.CAG-루시페라아제(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 루시페라아제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV)로 감염되었다. 1시간 배양 후, 각 NHP 혈청 샘플과 4D-A101.CAG-루시페라아제 희석을 HEK2v6.11 세포를 함유하는 흑색 불투명 96웰 플레이트의 개별 웰에 첨가했다. 루시페라아제는 형질도입 48시간 후에 ONE-Glo EX 루시페라아제 분석 키트(Promega)에 의해 검출되었다. ONE-Glo EX를 첨가하여 세포를 용해시키고, 루시페라아제 기질을 세포에 단일 단계로 첨가했다. Cytation 3 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 발광을 판독했다.
변동 계수(CV) 및 표준 편차는 모든 NHP 혈청 샘플 희석 및 표준 곡선의 각 지점에 대해 계산되었다. NHP 혈청 샘플을 양성 형질도입 대조군으로 정규화했다. 각 NHP에는 중화 항체 역가가 할당되었다. 각 NHP 혈청 샘플에 대한 중화 항체 역가는 ≥ 50% 형질도입이 관찰되는 가장 낮은 혈청 희석으로 정의되었다. 1:10 혈청 희석에서 ≥ 50% 형질도입이 관찰된 NHP는 연구에 포함되는 것으로 간주되었다.
테스트 시스템 및 면역억제
7마리의 수컷 시노몰구스 원숭이가 연구에 포함되었다. 동물의 연령 범위는 4.7세에서 4.9세였으며 체중 범위는 3.8kg에서 6.0kg이었다. 동물은 안락사 및 조직 수집(D49) 1주일 전까지 -7일부터 매주 1회 메틸프레드니솔론(10mg/kg, 근육 내) 면역억제제를 투여받았다. 추가 세부 정보는 계약 연구 기관(contract research organization)(CRO) 연구 보고서(전임상 연구 보고서 보류 중)에 제공된다.
테스트 물품 준비 및 투여
4D-710 및 비히클의 테스트 물품(Test article)(TA) 로트를 제제 완충액에서 희석하여 5mL 중 3 x 1012 vg 및 3 x 1013의 최종 용량을 전달했다. TA를 실온에서 > 1시간 동안 해동하고 튜브를 부드럽게 5회 뒤집어서 전달 장치(AeroEclipseII)에 5mL를 추가했다.
동물을 Telazol(IM, 7 - 8 mg/kg)로 마취하고 커프(cuff)가 있는 기관내 튜브(크기 4.5)를 후두 바로 아래 기관에 배치하고 운송 및 의자에 배치하는 동안 미끄러지지 않도록 고정했다. 그 후, 기관내 튜브를 에어로졸 생성 시스템에 연결하기 위해 직립 자세로 의자에 위치시켰다. 동물을 담요로 덮고 외부 열과 심박수에 대해 Bair Hugger를 덮었고 노출 및 마취에서 회복하는 동안 O2 포화도를 모니터링했다.
에어로졸 생성 및 전달 시스템은 에어로졸 생성을 위해 AeroEclipse II Breath Actuated Nebulizer(BAN, Trudell Medical International, Canada)를 사용했다. 총 5mL의 대조군 또는 테스트 물품이 기관내 튜브를 통해 마취된 동물에게 전달되었다. 분무기는 분무기 캡의 손잡이를 전환하여 연속 에어로졸 생성 모드에서 작동되었다. 또한 분무기 캡 내부의 통풍구를 막았다.
동물 관찰
실내 비인간 영장류의 보호 및 관리를 위한 CRO 축산(husbandry) SOP 절차에 따라 1일 2회 케이지 측 관찰을 수행했다. 치료 및 절차 당일에 연구 직원이 동물을 면밀히 관찰했다. 주요 관찰에는 구토, 혼수, 호흡 곤란 및 청색증의 징후, 점막 변색, 구토, 오리피스(orifice) 또는 혈변/소변의 불규칙한 배설물이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
혈액 수집
동물을 임의의 혈액 수집 전에 음용수에 자유롭게 접근하면서 밤새 금식하고 그 직후에 급식시켰다. 임상 병리 및 항체 역가 및 면역원성 분석을 위한 혈액 샘플은 대퇴 정맥의 정맥 천자에 의해 수집되었다. 혈액학 및 전체 세포 계수를 위한 샘플(EDTA 중 1mL)은 수집 후 24~48시간 내에 분석하기 위해 수집 당일 외부 참조 실험실(IDEXX)로 배송되었다. 임상 화학을 위한 샘플(SST 중 1mL)은 수집 당일 CRO의 병리학 실험실에서 분석되었다.
기관지폐포 세척(Bronchoalveolar Lavages)(BAL)
금식한 동물을 케타민 히드로클로라이드(ketamine hydrochloride)로 마취시킨 후 비인간 영장류의 SOP 마취에 따라 이소플루란(isoflurane)을 흡입했다. 적절한 크기의 커프가 있는 기관내관을 기관 분기부 바로 옆에 삽입하여 비인간 영장류에서 폐 세척 및/또는 기관지경 검사를 수행하기 위한 SOP ACL-1536 절차에 따라 BAL을 수행하기 위해 소아 광섬유 기관지경을 삽입할 수 있다. 폐의 양쪽에서 샘플을 기준(D-7) 및 치료 4주 후에 수집했다. Dulbecco PBS의 10mL 분취량 3개를 기관지경을 통해 폐의 적절한 쪽에 도입하고 순차적으로 흡인했다. 첫 번째 세척에서 세척 분리물을 분리하여 보관하고 수집하는 동안 두 번째 및 세 번째 세척을 결합하고 수집 후 2시간 이내에 처리할 때까지 젖은 얼음 위에 보관했다. 모든 세척에서 결합된 세포를 계수하고 CRO에서 형태학적 기준을 사용하여 차등 세포 계수를 수행하기 위해 슬라이드를 준비했다.
안락사 및 부검
안락사를 위해 동물을 케타민(11.0 내지 12.4 mg/kg, IM)으로 마취한 후 CRO SOP, 대형 동물 안락사에 따라 안락사 용액을 IV 주사했다. 사망을 확인한 후, 비설치류 종에 대한 CRO SOP 부검 절차에 따라 훈련된 부검 요원이 부검을 수행하고, 조직을 수집, 무게 측정, 보존 및 검사했다. 조직은 그에 따라 DNA 및 RNA에 대해 처리되거나 조직병리학 분석을 위해 준비되었다.
임의의 조직을 수집하기 전에 동물을 헤파린 처리된 식염수로 관류시켰다. 폐 및 기관, 골격근(횡격막, 상완삼두근, 외측광근), 심장, 간, 비장, 췌장, 고환, 신장, 뇌, 기관지 림프절 및 척수가 수집되었다. 각 조직을 다른 영역으로 분리하고 각 영역에서 여러 샘플을 수집했다. 주요 말초 장기에 대한 육안 부검 검사를 수행하고, 임의의 식별된 병변에서 조직 샘플을 수집했다. 조직 샘플을 수집하고 후속 DNA를 위해 급속 냉동하거나 후속 RNA 분리를 위해 RNALater에 저장했다. 추가 샘플을 수집하고 면역조직화학을 위한 후속 파라핀 포매 및 절편을 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정했다.
기관 및 폐를 광범위하게 샘플링하여 각 분석 프로세스에 대해 다중 샘플을 제공했다. 폐를 수확하고 가능한 한 기관에서 위쪽으로 고정했다. 오른쪽 폐를 본선 기관지에서 대략 1mm 간격으로 두 번 고정했다. 클램프 사이를 절단하여 오른쪽 폐를 제거했다. DNA 및 RNA 분리를 위해 각각 16개의 샘플을 도 16에 설명된 대로 1차/2차 기관지, 3차 기관지 및 폐포를 포함하는 오른쪽 폐 영역에서 수집했다. 기관 및 왼쪽 폐를 고정제로 팽창시키고 10% 중성 완충 포르말린으로 고정했다. 그런 다음 도 16에 설명된 대로 기관, 1차/2차 기관지, 3차 기관지 및 폐포 샘플을 포함하도록 기관 및 왼쪽 폐를 절단했다.
바이러스 게놈 생물학적 분포 및 이식유전자 발현
NHP 조직에서의 정량화를 위해 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 역전사효소 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 방법을 개발했다. 각 그룹의 NHP의 폐에서 바이러스 게놈의 정량화는 코돈 최적화된 이식유전자(서열 식별 번호 43)에 대한(및 특이적인) 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR 및 RT-qPCR에 의해 수행되었다. 조직에서 측정된 바이러스 역가는 DNA의 μg당 카피 수(BLQ = 50)로 표시되고 이식유전자 전사체는 250ng RNA(BLQ = 25)의 반응당 카피 수로 표시된다.
모든 동물에서의 도 16에 기재된 바와 같이, 기관, 1차/2차 기관지, 3차 기관지 및 폐포의 샘플을 포함하는 기관 및 좌측 폐 조직 샘플에서 면역조직화학을 수행했다. CFTR IHC 분석은 Roche Discovery ULTRA 자동염색제 및 검출 시약, CC1S 항원 검색 프로토콜 및 티라미드(tyramide) 증폭 키트, 항-CFTR 마우스 단일클론 항체(Abcam ab270238 M3A7)를 사용하여 수행되었다.
결과
항-AAV 중화 항체 스크린은 연구 포함을 위한 NHP를 식별한다
NHP 혈청에서 4D-A101 캡시드(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 포함)에 대한 중화 항체의 수준을 평가하기 위해 중화 항체 검정을 사용했다. 각 NHP 혈청 샘플에는 중화 항체 역가가 할당되었다. 동물은 1:10 혈청 희석에서 ≥ 50% 형질도입이 관찰되는 경우 혈청음성으로 간주되어 연구 포함 기준을 통과했다.
총 50개의 NHP 혈청 샘플을 평가했다. 검정 허용 기준은 1) 표준 곡선의 분산 계수(CV), 2) 미지 혈청 샘플의 CV, 3) 표준 곡선에 대한 실제 입력 단백질과의 백분률 편차에 대해 설정되었다. 표준 곡선에 대해 허용 가능한 CV는 < 25%로 정의되었다. 정량화 한계 내에서 미지 혈청 샘플에 대한 허용 가능한 CV는 < 30%로 정의되었다. 표준 곡선에 대한 입력 단백질로부터 허용 가능한 백분율 편차는 < 25%로 정의되었다. 모든 플레이트는 모든 분석 허용 기준을 충족했으며 이 플레이트의 데이터를 평가에 사용했다. 전반적으로, 평가된 19개(38%) NHP 혈청 샘플은 4D-A101에 대해 혈청음성이었다(도 31). 1:10 혈청 희석에서 백분률 형질도입이 가장 높고 공급업체에서 건강 스크리닝을 통과한 NHP가 연구 포함을 위해 선택되었다. 선택된 NHP ID 및 1:10 희석에서의 백분률 형질도입은 표 17에 보고되어 있다.
표 17: 연구에 포함된 NHP
Assay # NHP ID # % Transduction at 1:10
1 2DRPL2-39C-B-A BLQ
2 2DRPL2-4C-E 10
3 2DRPZ2-18C-G BLQ
4 2DRPZ2-26C-H BLQ
5 2DRPZ2-27C-F 115
6 2DRPZ2-9C-I 96
7 2DRPZ4-16C-B BLQ
8 2DRPZ6-30C-G 100
9 DPC15-39A-K BLQ
10 DPL8-26A-L 74
11 DRP8BL-22K-E 58
12 DRPL13-9A-K 112
13 DRPL3-37D-B 102
14 DRPL4-2D-C 89
15 DRPL5-17D-B 11
16 DRPL7-31D-A 97
17 DRPS1-31C-G BLQ
18 DRPS15-53B-A 118
19 DRPS7-11B-H BLQ
20 DRPZ10-19B-I BLQ
21 DRPZ11-18C-E 40
22 DRPZ12-21A-D-E BLQ
23 DRPZ12-33A-L BLQ
24 DRPZ13-44A-I BLQ
25 DRPZ1-5D-D 78
26 DRPZ16-12C-A BLQ
27 DRPZ16-20B-A-C 12
28 DRPZ16-2B-F 78
29 DRPZ2-24D-A BLQ
30 DRPZ31-13C-G BLQ
31 DRPZ33-36C-A 25
32 DRPZ34-7C-A BLQ
33 DRPZ3-9C-H 56
34 DRPZ40-18C-C 20
35 DRPZ40-22C-C 69
36 DRPZ4-17B-G BLQ
37 DRPZ4-36B-F 112
38 DRPZ5-15D-C 92
39 DRPZ5-62A-E 70
40 DRPZ6-37D-C BLQ
41 DRPZ7-105B-K 49
42 DRPZ7-28B-I BLQ
43 DRPZ7-77B-J BLQ
44 DRPZ9-16C-G BLQ
45 DRPZ9-86C-C BLQ
46 PRPL2-49C6-A 93
47 PRPL2-74C6-A 32
48 PRPL7-21C6-A BLQ
49 PRPL9-33C6-A 116
4D-710의 분무 전달은 NHP에서 내성이 우수하다.
연구 설계는 표 18에 요약되어 있다:
표 18: 연구 설계 요약
[표 18]
Figure pct00021
본 연구를 수행하는 동안 동물이 죽거나 조기에 안락사되지 않았다. 어떤 동물도 연구 기간 동안 TA 노출과 관련된 고통이나 건강 문제의 징후를 나타내지 않았다. 치료 및 샘플 수집 동안 식욕 감소 및 섭식 행동의 변화가 관찰되지 않았다. 이 연구 동안 체중의 치료와 관련된 변화는 발생하지 않았다.
혈액학 및 완전한 세포 계수를 위한 샘플은 수집 당일 외부 참조 실험실(IDEXX)로 배송되었고 수집 후 48시간 이내에 분석되었다. 임상 화학 종점에 대한 샘플은 수집 당일 CRO의 병리학 실험실에서 분석되었다. 임상 화학 파라미터 중 일부는 시간이 지남에 따라 변경되었지만 임의의 시점에서 4D-710 치료 그룹의 두 용량 수준과 비교하여 비히클 그룹 간에 차이가 관찰되지 않았다. 유사하게, 기준 수준과 비교하여 흡입 치료 8주 후에 혈액학 및 혈구 수의 어떠한 주요 변화도 관찰되지 않았다.
세척액의 세포 차이 및 세포 수는 오른쪽 및 왼쪽 세척 면에 대해 결정되었으며 모든 데이터는 양쪽 면의 평균으로 표시된다. BALF의 총 세포 수 및 차이는 기준 수준과 비교하여 D28에 측정된 치료 그룹 간에 다르지 않았으며 변동성과 작은 샘플 크기로 인해 더 이상의 결론을 내릴 수 없다.
모든 치료 그룹에 대해 안락사 당일 장기 중량 및 체중에 대한 중량을 수집했다. 장기 중량 및 체중에 대해 정규화된 중량은 임의의 치료 그룹 간에 차이가 없었다.
부검 시 육안 검사 동안 주요 소견은 보고되지 않았다. 현미경 검사는 검사된 조직에서 치료와 관련된 관찰이 없었다고 결론지었다.
4D-710은 폐의 모든 영역에 대한 강력한 유전자 전달을 매개한다
바이러스 게놈은 4D-710의 게놈 생물학적 분포를 결정하기 위해 부검 동안 얻은 샘플에 대해 계층화된 접근법으로 정량화되었다. 비히클, 3 x 1012 vg 및 3 x 1013 vg 투여 동물로부터 얻은 모든 폐 샘플을 분석했다. 3 x 1013 vg 투여 동물로부터 수집된 뇌, 척수(경추, 흉부 및 요추 부위), 심장, 간, 비장, 췌장, 신장, 골격근(상완삼두근, 외측광근, 횡격막), 기관지 림프절 및 고환 샘플을 모두 분석했다. 그런 다음 BLQ 수준 이상의 바이러스 게놈을 갖는 조직을 더 낮은 3 x 1012 vg 용량에서 분석했다(데이터는 보류 중). 데이터는 DNA의 μg당 바이러스 게놈으로 보고된다.
qPCR 분석에 대한 결과는 R6으로 마크된 샘플을 제외하고, 폐포낭(원위), 3차 기관지(내측) 및 1차/2차 기관지(근위)로부터의 샘플을 나타내는 다양한 폐 영역 전체에 걸쳐 바이러스의 균일한 전달을 나타낸다. 이 샘플은 기관 분기부에 근접하여 폐의 오른쪽과 왼쪽을 분리하고 묶는 위치로 인해 수집하기 어려웠다(도 16 참조). 3 x 1012 vg 및 3 x 1013 vg 용량 그룹에 대한 나머지 샘플 위치에 대한 평균 카피 수는 각각 104 및 105였다(도 32A). 저용량 그룹과 고용량 그룹 간의 적어도 10배 차이는 치료 용량의 10배 차이와 잘 일치한다. 동일한 치료 그룹 내의 모든 동물에 대해, 상이한 폐 엽 또는 상이한 폐 영역 내의 바이러스 게놈의 양에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(도 32B).
비-폐 전신 노출을 3 x 1013 vg 4D-710이 투여된 동물에서 측정했다(도 32C). 동물은 기관지 림프절에 존재하는 ~104 vg/μg의 검출 가능한 바이러스 게놈을 가졌다(도 32C). 이 조직에 대한 이 동물의 병리학 판독은 정상이다. 하나의 NHP는 비장에서 검출 가능한 바이러스 게놈을 갖고(도 32C), 병리학 판독은 정상으로 언급되었다. 뇌, 척수, 심장, 간, 췌장, 신장, 골격근 및 고환에서 테스트한 다른 모든 샘플은 정량화 하한 미만이었다(도 32C). 테스트 물품 관련 병리학은 보고되지 않았다. 따라서 4D-710의 분무 전달은 비-폐 전신 노출을 최소화하면서 폐의 모든 영역에 바이러스 게놈을 안전하고 강력하게 전달하는 결과를 초래한다.
4D-710은 폐의 모든 영역에 대한 이식유전자 발현을 매개한다
CFTRΔR 전사체는 4D-710의 이식유전자 발현을 결정하기 위해 부검 동안 얻은 샘플에 대해 계층화된 접근법으로 정량화되었다. 비히클, 3 x 1012 vg 및 3 x 1013 vg 투여 동물로부터 얻은 모든 폐 샘플을 분석했다. 3 x 1013 vg 투여 동물로부터 수집된 뇌, 척수, 심장, 간, 비장, 췌장, 신장, 골격근, 기관지 림프절 및 고환 샘플을 모두 분석했다(데이터는 보류 중). 그런 다음 BLQ 수준 이상의 전사체를 갖는 조직은 더 낮은 3 x 1012 vg 용량에서 분석되었다(데이터는 보류 중). 데이터는 250ng RNA의 반응당 카피로 보고되고 μg RNA당 카피로 그래프로 표시된다.
RT-qPCR 분석에 대한 결과는 폐에서 성공적인 형질도입 및 전사체 발현을 나타낸다. 3 x 1013 vg 투여된 동물에서, 48개의 폐 샘플 중 44개가 BLQ 이상이었고, BLQ 이상의 비히클 샘플 없이 μg RNA당 ~103개의 카피가 있었다(도 33A). 4개의 BLQ 샘플 중 3개는 수집이 기술적으로 해볼만한 동일한 R6 샘플 위치에서 가져왔으며, 하나의 NHP에는 추가 샘플 BLQ가 있었다. R6(위의 근거 참조)으로 마크된 샘플을 제외하고, 폐포낭(원위), 3차 기관지(내측) 및 1차/2차 기관지(근위)의 샘플을 나타내는 다양한 폐 영역(도 33B)에 걸친 형질도입이 관찰되었다. 대조적으로, 저용량 3 x 1012 vg 동물의 폐 샘플에서는 48개 샘플 중 41개가 BLQ였다. 이러한 데이터는 3 x 1013 vg, 4D-710의 용량이 NHP 폐 조직을 정량화적으로 형질도입 할 수 있고 치료 CFTRΔR 전사체를 발현할 수 있음을 시사한다.
면역조직화학에 의해 검출된 CFTR 단백질 발현은 기관 상피, 기관지 상피 및 폐포 절편에서 비히클과 비교할 때 4D-710 치료된 NHP 폐에서 증가된 CFTR 발현을 나타낸다(도 34A). 비히클(도 34A)과 비교하여 3 x 1013 vg 치료된 동물(도 34B) 모두에서 강력하게 증가된 CFTR 발현이 관찰되었다. 이러한 결과는 4D-710의 분무 전달이 폐의 모든 영역에 대한 단백질 발현을 매개함을 입증한다.
결론
치료제 4D-710은 시노몰구스 원숭이로의 에어로졸 전달을 특징으로 했다. 혈청은 테스트 물품 캡시드 4D-A101에 대한 기존의 중화 항체에 대해 혈청음성인 동물을 식별하기 위해 사전 스크리닝 되었다. 동물은 AeroEclipseII 장치를 사용하여 전달된 비히클(제제 완충액), 3 x 1012 vg 용량의 4D-710 또는 3 x 1013 vg 용량의 4D-710을 투여받았다.
다량의 바이러스 게놈 및 생산된 CFTRΔR 전사체 발현 및 CFTR 단백질 발현이 연구에서 NHP에 걸쳐 폐 샘플에서 관찰되었으며, 이는 폐포, 3차 기관지 및 1차/2차 기관지로부터의 샘플을 나타낸다. 단일 비장 샘플에는 낮지만 검출 가능한 바이러스 게놈이 있었고, 다른 모든 조직의 모든 샘플에서는 검출 가능한 바이러스 게놈이 없었다. 이들 데이터는 4D-710의 분무 전달이 최소한의 전신 생물학적 분포로 영장류 폐의 모든 영역(기관, 폐포 및 기관지 상피)에 바이러스 게놈을 안전하고 강력하게 전달한다는 것을 입증한다. 이들 데이터는 4D-710이 다양한 폐 장애의 치료를 위한 폐 전달 벡터로서 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 갖는 rAAV의 적합성을 확인하는 폐포를 포함하여 폐의 모든 영역에 대한 CFTRΔR mRNA 및 단백질 산물의 강력한 발현을 매개하며, 인간 환자의 낭포성 섬유증 치료를 위한 생물학적 활성 CFTR 치료적 이식유전자의 전달을 위한 4D-710(서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질 및 서열 식별 번호 45의 이종성 핵산 포함)의 용도를 구체적으로 지원한다는 것을 추가로 입증한다.
본 발명이 특정 실시예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞추기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 여기에 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270 Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285 His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300 Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335 Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365 Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380 Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415 Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575 Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala 580 585 590 Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu 705 710 715 720 Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 735 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln 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gctgctgcag 660 gcaagcgcct tttgcggact gggcttcctg atcgtgctgg ccctgttcca ggcaggactg 720 ggacgcatga tgatgaagta cagagaccag agggccggca agatctctga gcggctggtc 780 atcaccagcg agatgatcga gaacatccag tccgtgaagg cctattgttg ggaggaggcc 840 atggagaaga tgatcgagaa tctgcgccag acagagctga agctgaccag aaaggccgcc 900 tacgtgaggt acttcaactc tagcgccttc tttttctctg gctttttcgt ggtgttcctg 960 agcgtgctgc catacgccct gatcaagggc atcatcctgc ggaagatctt taccacaatc 1020 tccttctgca tcgtgctgag aatggccgtg acaaggcagt ttccctgggc cgtgcagacc 1080 tggtatgact ctctgggcgc catcaataag atccaggatt tcctgcagaa gcaggagtac 1140 aagacactgg agtataacct gaccacaacc gaggtggtca tggagaatgt gaccgccttc 1200 tgggaggagg gctttggcga gctgttcgag aaggccaagc agaacaataa caatcgcaag 1260 acatctaacg gcgacgatag cctgtttttc agcaattttt ccctgctggg cacccccgtg 1320 ctgaaggaca tcaacttcaa gatcgagagg ggacagctgc tggcagtggc aggctccaca 1380 ggcgccggca agacctctct gctgatgatg atcatgggcg agctggagcc aagcgagggc 1440 aagatcaagc actccggccg gatctctttt tgcagccagt tctcctggat catgcccggc 1500 accatcaagg agaatatcat ctttggcgtg tcctacgatg agtacagata taggtctgtg 1560 atcaaggcct gtcagctgga ggaggacatc agcaagttcg ccgagaagga taacatcgtg 1620 ctgggcgagg gcggcatcac actgagcgga ggacagaggg caaggatctc cctggccaga 1680 gccgtgtaca aggacgccga tctgtatctg ctggacagcc cctttggcta tctggatgtg 1740 ctgaccgaga aggagatctt cgagtcctgc gtgtgcaagc tgatggccaa taagacaagg 1800 atcctggtga cctctaagat ggagcacctg aagaaggccg acaagatcct gatcctgcac 1860 gagggctcct cttactttta tggcacattc agcgagctgc agaatctgca gcctgacttc 1920 agctccaagc tgatgggctg tgactccttt gatcagttct ctgccgagag gcgcaactcc 1980 atcctgacag agaccctgca cagattctct ctggagggcg acgcacccgt gagctggaca 2040 gagaccaaga agcagtcctt taagcagacc ggcgagttcg gcgagaagag gaagaattct 2100 atcctgaacc ctatcaatag cacactgcag gcccggagaa ggcagtctgt gctgaacctg 2160 atgacccaca gcgtgaacca gggccagaat atccacagaa agacaaccgc cagcacaagg 2220 aaggtgtccc tggcacctca ggcaaacctg accgagctgg acatctactc ccgccggctg 2280 tctcaggaga ccggactgga gatctctgag gagatcaatg aggaggatct gaaggagtgc 2340 tttttcgacg atatggagag catcccagcc gtgacaacct ggaacacata cctgcgctat 2400 atcaccgtgc acaagtccct gatctttgtg ctgatctggt gtctggtcat cttcctggca 2460 gaggtggcag catctctggt ggtgctgtgg ctgctgggca acacacccct gcaggacaag 2520 ggcaattcta cccacagccg caacaattcc tacgccgtga tcatcacatc tacctctagc 2580 tactacgtgt tctacatcta tgtgggcgtg gccgatacac tgctggccat gggctttttc 2640 cggggcctgc ccctggtgca cacactgatc accgtgagca agatcctgca ccacaagatg 2700 ctgcacagcg tgctgcaggc ccctatgtcc acactgaaca ccctgaaggc cggcggcatc 2760 ctgaatcggt tttccaagga catcgccatc ctggacgatc tgctgcctct gaccatcttt 2820 gatttcatcc agctgctgct gatcgtgatc ggagcaatcg cagtggtggc cgtgctgcag 2880 ccttacatct tcgtggccac agtgccagtg atcgtggcct ttatcatgct gcgcgcctat 2940 ttcctgcaga ccagccagca gctgaagcag ctggagagcg agggccggtc ccctatcttt 3000 acacacctgg tgacctccct gaagggactg tggacactga gggccttcgg ccggcagcca 3060 tactttgaga ccctgttcca caaggccctg aacctgcaca cagccaattg gtttctgtat 3120 ctgagcaccc tgcgctggtt tcagatgcgg atcgagatga tcttcgtgat ctttttcatc 3180 gccgtgacct tcatctccat cctgacaacc ggagagggag agggaagagt gggaatcatc 3240 ctgacactgg ccatgaacat catgtctacc ctgcagtggg ccgtgaattc ctctatcgac 3300 gtggatagcc tgatgagatc tgtgagcagg gtgtttaagt tcatcgacat gcccacagag 3360 ggcaagccta caaagagcac caagccatac aagaacggcc agctgtccaa agtgatgatc 3420 atcgagaatt ctcacgtgaa gaaggacgat atctggccat ccgg 3464 <210> 44 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid sequence <400> 44 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 60 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 120 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgt 173 <210> 45 <211> 4874 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid sequence <400> 45 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgcggc cgcactcacg gggatttcca agtctccacc 180 ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 240 gtaataaccc cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 300 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga attctcgagt gatcgaaaga gcctgctaaa 360 gcaaaaaaga agtcaccatg cagcgcagcc cactggagaa ggcaagcgtg gtgtccaagc 420 tgttcttttc ctggaccagg cctatcctga ggaagggata caggcagcgg ctggagctga 480 gcgacatcta tcagatccct tctgtggaca gcgccgataa tctgtccgag aagctggaga 540 gagagtggga tagggagctg gcctctaaga agaacccaaa gctgatcaat gccctgcgga 600 gatgcttctt ttggcggttc atgttctacg gcatcttcct gtatctgggc gaggtgacca 660 aggccgtgca gccactgctg ctgggcagaa tcatcgcctc ttacgacccc gataacaagg 720 aggagaggag catcgccatc tatctgggca tcggcctgtg cctgctgttt atcgtgagga 780 cactgctgct gcacccagcc atcttcggcc tgcaccacat cggcatgcag atgagaatcg 840 ccatgttcag cctgatctac aagaagaccc tgaagctgag ctccagggtg ctggacaaga 900 tctccatcgg ccagctggtg tccctgctgt ctaacaatct gaacaagttt gatgagggac 960 tggccctggc acacttcgtg tggatcgcac cactgcaggt ggccctgctg atgggcctga 1020 tctgggagct gctgcaggca agcgcctttt gcggactggg cttcctgatc gtgctggccc 1080 tgttccaggc aggactggga cgcatgatga tgaagtacag agaccagagg gccggcaaga 1140 tctctgagcg gctggtcatc accagcgaga tgatcgagaa catccagtcc gtgaaggcct 1200 attgttggga ggaggccatg gagaagatga tcgagaatct gcgccagaca gagctgaagc 1260 tgaccagaaa ggccgcctac gtgaggtact tcaactctag cgccttcttt ttctctggct 1320 ttttcgtggt gttcctgagc gtgctgccat acgccctgat caagggcatc atcctgcgga 1380 agatctttac cacaatctcc ttctgcatcg tgctgagaat ggccgtgaca aggcagtttc 1440 cctgggccgt gcagacctgg tatgactctc tgggcgccat caataagatc caggatttcc 1500 tgcagaagca ggagtacaag acactggagt ataacctgac cacaaccgag gtggtcatgg 1560 agaatgtgac cgccttctgg gaggagggct ttggcgagct gttcgagaag gccaagcaga 1620 acaataacaa tcgcaagaca tctaacggcg acgatagcct gtttttcagc aatttttccc 1680 tgctgggcac ccccgtgctg aaggacatca acttcaagat cgagagggga cagctgctgg 1740 cagtggcagg ctccacaggc gccggcaaga cctctctgct gatgatgatc atgggcgagc 1800 tggagccaag cgagggcaag atcaagcact ccggccggat ctctttttgc agccagttct 1860 cctggatcat gcccggcacc atcaaggaga atatcatctt tggcgtgtcc tacgatgagt 1920 acagatatag gtctgtgatc aaggcctgtc agctggagga ggacatcagc aagttcgccg 1980 agaaggataa catcgtgctg ggcgagggcg gcatcacact gagcggagga cagagggcaa 2040 ggatctccct ggccagagcc gtgtacaagg acgccgatct gtatctgctg gacagcccct 2100 ttggctatct ggatgtgctg accgagaagg agatcttcga gtcctgcgtg tgcaagctga 2160 tggccaataa gacaaggatc ctggtgacct ctaagatgga gcacctgaag aaggccgaca 2220 agatcctgat cctgcacgag ggctcctctt acttttatgg cacattcagc gagctgcaga 2280 atctgcagcc tgacttcagc tccaagctga tgggctgtga ctcctttgat cagttctctg 2340 ccgagaggcg caactccatc ctgacagaga ccctgcacag attctctctg gagggcgacg 2400 cacccgtgag ctggacagag accaagaagc agtcctttaa gcagaccggc gagttcggcg 2460 agaagaggaa gaattctatc ctgaacccta tcaatagcac actgcaggcc cggagaaggc 2520 agtctgtgct gaacctgatg acccacagcg tgaaccaggg ccagaatatc cacagaaaga 2580 caaccgccag cacaaggaag gtgtccctgg cacctcaggc aaacctgacc gagctggaca 2640 tctactcccg ccggctgtct caggagaccg gactggagat ctctgaggag atcaatgagg 2700 aggatctgaa ggagtgcttt ttcgacgata tggagagcat 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gacaaccgga gagggagagg 3600 gaagagtggg aatcatcctg acactggcca tgaacatcat gtctaccctg cagtgggccg 3660 tgaattcctc tatcgacgtg gatagcctga tgagatctgt gagcagggtg tttaagttca 3720 tcgacatgcc cacagagggc aagcctacaa agagcaccaa gccatacaag aacggccagc 3780 tgtccaaagt gatgatcatc gagaattctc acgtgaagaa ggacgatatc tggccatccg 3840 gaggacagat gaccgtgaag gatctgacag ccaagtatac cgagggcggc aacgccatcc 3900 tggagaatat ctccttttct atcagccctg gacagagggt gggactgctg ggacggacag 3960 gctccggcaa gtctaccctg ctgagcgcct tcctgaggct gctgaataca gagggcgaga 4020 tccagatcga cggcgtgagc tgggattcca tcaccctgca gcagtggaga aaggcctttg 4080 gcgtgatccc tcagaaggtg tttatcttct ccggcacctt caggaagaac ctggacccat 4140 acgagcagtg gtctgatcag gagatctgga aggtggccga cgaagtgggc ctgagatctg 4200 tgatcgagca gtttccaggc aagctggact tcgtgctggt ggatggagga tgcgtgctga 4260 gccacggaca caagcagctg atgtgcctgg ccaggtctgt gctgagcaag gccaagatcc 4320 tgctgctgga cgagccaagc gcccacctgg atcccgtgac ataccagatc atcagaagga 4380 ccctgaagca ggcctttgcc gattgcaccg tgatcctgtg 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Claims (41)

  1. (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 5'에서 3'으로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) 프로모터 (c) 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(CFTR) 단백질 또는 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 터미널 반복부를 포함하는 핵산을 포함하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    인간 CFTR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 서열 식별 번호 43의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한, rAAV 바이러스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    프로모터가 구성적 프로모터이고, 임의로 CMV 즉시/초기 인핸서/프로모터의 절단된 버전인, rAAV 바이러스.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    프로모터가 조직 특이적 프로모터이고, 바람직하게는 프로모터가 폐 세포에서 핵산의 우선적 발현을 지시하는, rAAV 바이러스.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    프로모터가 CMV173 프로모터이고 인간 CFTR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, rAAV 바이러스.
  6. 제 5항에 있어서,
    CMV173 프로모터가 서열 식별 번호 44의 서열을 갖는, rAAV 바이러스.
  7. 제 1항에 있어서,
    핵산이 서열 식별 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, rAAV 바이러스.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 감염성 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 대상체는 바람직하게는 상기도 염증, 이상 상피 사이토카인 신호전달 및 상승된 IgE 수준으로부터 임의로 선택되는, 낭포성 섬유증의 하나 이상의 특징을 개선하는 데 효과적인 rAAV의 양이 투여되는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    rAAV가 폐(기관지) 및/또는 비강 투여, 바람직하게는 흡입에 의해 대상체에게 투여되고, 바람직하게는 단일 용량으로 투여되는, 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    rAAV가 1 x 1013 내지 5 x 1015 벡터 게놈(vector genome)(vg), 보다 바람직하게는 1 x 1014 내지 1 x 1015 vg 사이의 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  11. 제 1항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환의 치료에 사용하기 위한, rAAV.
  12. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한, rAAV.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 rAAV, 및 약 10mM 내지 약 50mM 시트르산염(citrate), 약 70mM 내지 약 150mM NaCl 및 임의로 계면활성제, 바람직하게는 Pluronic F-68과 같은 비이온성 계면활성제, 보다 바람직하게는 약 0.005% Pluronic F68를 포함하는 완충액을 포함하며 pH가 약 6.0인 흡입에 적합한 약학적 조성물,
  14. 제 13항에 있어서,
    약 20mM 내지 약 50mM 시트르산염, 약 85mM 내지 약 125mM NaCl 및 약 0.005% Pluronic F68을 포함하고 pH가 약 6.0인, 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    약 20mM 시트르산염, 약 125mM NaCl 및 약 0.005% Pluronic F68을 포함하고 pH가 약 6.0인, 약학적 조성물.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    ml당 1011 내지 1014 벡터 게놈(vg)을 포함하는 약학적 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    약 1 x 1013 내지 약 9 x 1013 vg/ml, 바람직하게는 약 2 x 1013 내지 6 x 1013 vg/ml, 더 바람직하게는 약 2 x 1013 vg/ml를 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 조성물은 에어로졸화된 전달에 적합한 액체/현탁액의 형태이거나 에어로졸로서 제제화되고/되거나 흡입 투여 형태인, 약학적 조성물.
  19. 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 낭포성 섬유증 또는 이와 관련된 폐 질환을 치료하는 방법.
  20. (i) 서열 식별 번호 12의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 비리온과 폐 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 폐 세포에 이종성 핵산을 전달하는 방법으로서, 이에 의해 유전자 산물이 폐 세포에서 발현되는, 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    이종성 핵산이 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 단백질 또는 인간 CFTR 단백질 서열의 아미노산 708-759가 결여된 생물학적 활성 절단된 CFTR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    이종성 핵산이 서열 식별 번호 45의 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐 세포가 기도 상피 세포인, 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상피 세포가 폐포 상피 세포, 기관지(1차, 2차 또는 3차) 상피 세포 또는 기관 상피 세포인, 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    폐 세포가 폐 폐포 상피 1형(AECI) 또는 2형(AECII) 세포인, 방법.
  26. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐 세포가 평활근 또는 내피 세포인, 방법.
  27. (i) 서열 식별 번호 12로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 하나 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여, 또는 rAAV를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 폐 질환을 치료하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    폐 질환은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF), 폐동맥고혈압, 폐고혈압, 폐암(원발성, 속발성 및 전이성), 계면활성제 결핍, 바이러스성 및/또는 세균 감염, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 급성 기관지염, 폐렴(바이러스성, 세균성 및 진균성 폐렴 포함), 호흡기 감염(인두염, 크루프(croup), 아스페르길루스(aspergillus), 콕시듐 균증(coocidiomycosis), 한타바이러스 폐 증후군 및 히스토플라스마증(histoplasmosis) 포함), 화학 및 과민성 폐렴, 결핵 및 기타 마이코박테리아 감염(마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium)을 포함하되 이에 국한되지 않음), 사르코이드증(sarcoidosis), 호흡기 세포융합 바이러스, 폐부종, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)(ARDS), 진폐증(검은 폐 질환, 석면폐 및 규폐증 포함), 간질성 폐 질환(유육종증 및 자가면역질환 포함), 폐색전증, 흉막삼출, 흉막염, 중피종, 기흉, 급성 기관지염, 세기관지염(폐쇄성 세기관지염 포함), 영아 돌연사 증후군, 수면 무호흡증, 기관지 확장증, 기관지폐 이형성증, 잠복성 조직 폐렴, 전자 담배 또는 전자담배 사용 관련 폐 손상(E-cigarette or vaping use associated lung injury)(EVALI), 중동 호흡기 증후군(Middle Eastern Respiratory Syndrome)(MERS), 원발성 모양체 운동 이상증(primary ciliary dyskinesia), 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome)(SARS), 알파-1-항트립신(antitrypsin) 결핍증, 천식, 간질성 폐 질환 및 COVID-19(코로나바이러스 질병 2019)로부터 선택되는, 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    폐 질환이 만성폐쇄성폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD) 또는 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)인, 방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    폐 질환이 COPD이며, rAAV가 알파-1-안티트립신(antitrypsin), 알파-1-안티키모트립신(antitrypsin), 알파-1-마크로글로불린(macroglobulin), 매트릭스 메탈로프로테이나제 1(matrix metalloproteinase 1)(MMP1), 매트릭스 메탈로프로테이나제 12(matrix metalloproteinase 12)(MMP12), 마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소(microsomal epoxide hydrolyase), CYP1A1, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase), 헴 옥시게나제(heme oxygenase)-1, TGF-베타-1, TNF-알파, IL-1 복합체, IL-8, IL-13, 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA-B7 및 Bw16), 비타민 D 결합 단백질 및 베타-2-아드레날린성 수용체로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 유전자 산물을 인코딩하는 이종성 핵산을 임의로 포함하는, 방법.
  31. 제 29항에 있어서,
    폐 질환이 IPF이며, rAAV가 임의로 SFTPA1(계면활성제 A1) 및 카베올린(Caveolin)-1로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 유전자 산물을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는, 방법.
  32. 제 28항에 있어서,
    폐 질환이 알파-1-항트립신 결핍이며, rAAV가 기능적 알파-1-항트립신을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는, 방법.
  33. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    rAAV 또는 약학적 조성물이 폐, 기관지내, 비강내, 기관내 및/또는 기관지내 투여에 의해 투여되는, 방법.
  34. 제 27항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서,
    rAAV의 약 1012 내지 1015 벡터 게놈(vg)의 적어도 1회 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    대상체에게 약 1 x 1013 내지 약 5 x 1015 vg, 바람직하게는 약 1 x 1014 vg 내지 약 1 x 1015 vg를 투여하는, 방법.
  36. 아미노산 708-759 및 인간에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이 결여된 생물학적 활성 인간 CFTR 단백질을 인코딩하는 핵산으로서, 서열 식별 번호 43으로 표시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  37. 제 36항에 있어서,
    서열 식별 번호 43으로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  38. 제 36항 또는 제 37항에 따른 핵산 및 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고 이종성인 발현 제어 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  39. 제 38항에 있어서,
    발현 제어 서열이 서열 식별 번호 44로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CMV173 프로모터를 포함하는, 발현 카세트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    5'에서 3'으로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) CMV173 프로모터 (c) 서열 식별 번호 43의 코돈 최적화된 유전자 (d) AAV2 말단 반복부를 포함하는, 발현 카세트.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 (c)와 (d) 사이에 SV40 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
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