JP7393565B2 - 肺送達のためのアデノ随伴バリアント、製剤および方法 - Google Patents

肺送達のためのアデノ随伴バリアント、製剤および方法 Download PDF

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Description

関連出願との相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２７日出願の米国仮特許出願第６３／０１６，２４６号、および２０２０年１０月６日出願の米国仮特許出願第６３／０８８，４３２号の優先権を主張するものである。
ＥＦＳ－ＷＥＢ経由で提出された配列表
２０２１年４月２６日またはその前後に作成され、ファイルサイズが約１８６ＫＢである、「０９０４００－５０１３－ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ」という表題のコンピュータ可読テキストファイルは、本出願の配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子送達ベクターは、いくつかの疾患標的に対する前臨床的疾患モデルおよび最近ではヒト臨床試験の両方において有望性が実証されている。野生型ＡＡＶは非病原性であり、また、いかなる公知の疾患との病因学的関連性も有さないので、ＡＡＶに基づくベクターは非常に安全である。さらに、ＡＡＶにより、肝臓、筋肉、肺、網膜、および脳を含めた多数の組織での高度に効率的な遺伝子送達および持続的な導入遺伝子発現の能力がもたらされる。
ＡＡＶは、２つのオープンリーディングフレーム、ｒｅｐおよびｃａｐを含有する一本鎖ＤＮＡウイルスである。第１の遺伝子は、ゲノム複製に必要な４種のタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードし、第２の遺伝子は、アセンブルしてウイルスカプシドを形成する３種の構造タンパク質（ＶＰ１～３）を発現する。その名称が意味する通り、ＡＡＶは、活性な複製に関してアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に依存する。ヘルパーの非存在下で、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームとして維持されるかまたは宿主染色体に組み込まれる、潜伏状態を確立する。複数の相同な霊長類ＡＡＶ血清型および多数の非ヒト霊長類血清型が同定されている。ＡＡＶ２は遺伝子送達ビヒクルとして最も良く特徴付けられている。
２０１０年時点で、ＡＡＶを遺伝子送達ビヒクルとして使用する臨床試験が７５件進行中であった。しかし、ヒト集団内での多数のＡＡＶバリアントおよび血清型への広範にわたる曝露に起因した抗カプシド中和抗体の高保有率によりＡＡＶ遺伝子治療の有効性が低下している。この既存の免疫、ならびにベクター投与に起因したその後の免疫の発生により、ＡＡＶ遺伝子治療のより広範な実行が妨害され得る。例えば、現在まで、ＡＡＶは、免疫特権領域への送達を伴う臨床研究において最も成功している。
最近の分析から、ヒトにおける抗ＡＡＶ ＩｇＧ抗体の保有率がＡＡＶ２（７２％）およびＡＡＶ１（６７％）では最も高いが、ＡＡＶ９（４７％）、ＡＡＶ６（４６％）、ＡＡＶ５（４０％）、およびＡＡＶ８（３８％）抗体も研究集団の大部分に存在することが示された。いくつかの研究で、送達するｒＡＡＶ粒子の量を減少させることによって遺伝子治療の間のＡＡＶカプシドに対する液性免疫を防止することができることが見いだされた。残念ながら、低ベクター用量の投与では低形質導入、したがって低治療用遺伝子発現がもたらされる。
抗ＡＡＶ抗体による中和に対して抵抗性がある新規のＡＡＶバリアントの開発が当技術分野において必要とされている。
発明の概要
一部の実施形態では、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸とを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書で提供される。
関連する実施形態では、ヒトＣＦＴＲをコードするヌクレオチド配列またはその生物活性部分は、ネイティブなヒトＣＦＴＲタンパク質をコードし、以下の配列：
Figure 0007393565000001
Figure 0007393565000002
Figure 0007393565000003
 またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する。
好ましい実施形態では、ヒトＣＦＴＲまたは生物学的に活性化された短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007393565000004
Figure 0007393565000005
Figure 0007393565000006
 またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
配列番号４３は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されており、アミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ヒトＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、配列番号４３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む単離された核酸であって、必要に応じて、ヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結している、核酸が本明細書で提供される。配列番号４３の核酸配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むプラスミドおよびベクターならびにそのようなプラスミドおよびベクターを含む宿主細胞も本明細書で提供される。本明細書に記載の嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患の処置のための、あるいは、嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患を処置するための医薬の製造における使用のための、配列番号４３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む核酸の使用であって、必要に応じて、ヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結している、核酸の使用も本明細書で提供される。
一部の態様では、プロモーターは、構成的プロモーター、必要に応じて短縮型サイトメガロウイルス即時型／初期（ＣＭＶｉｅ）エンハンサー／プロモーターであり、ヒトＣＦＴＲまたはその生物活性部分をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
他の態様では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、好ましくは、ここで、プロモーターは、核酸の肺細胞における優先的発現を指示し、ヒトＣＦＴＲまたはその生物活性部分をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
好ましい実施形態では、プロモーターは、短縮型ＣＭＶｉｅプロモーターであり、ヒトＣＦＴＲをコードするヌクレオチド配列またはその生物活性部分に作動可能に連結している。特に好ましい実施形態では、ＣＭＶｉｅプロモーターは、以下の配列：
Figure 0007393565000007
 またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を有するＣＭＶ１７３である。
特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸であって、５’から３’に、以下の配列：
Figure 0007393565000008
Figure 0007393565000009
Figure 0007393565000010
Figure 0007393565000011
 またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、核酸と
を含む。
配列番号４５のヌクレオチド配列を有する核酸は、５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）配列番号４４のＣＭＶ１７３プロモーター、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ヒトＣＦＴＲタンパク質をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む。
それを必要とする対象における嚢胞性線維症を処置するための方法であって、対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、治療有効量の感染性ｒＡＡＶを投与するステップを含む、方法も本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ＣＦＴＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号４３の配列を有し、かつ／または、プロモーターは配列番号４４の配列を有し、かつ／または核酸は配列番号４５の配列を含む。一部の態様では、対象は、に、嚢胞性線維症の１つまたは複数の特徴を好転させるために効果的な量のｒＡＡＶを投与され、その特徴の非限定的な例としては、上気道および下気道炎症、異常な上皮サイトカインシグナル伝達ならびにＩｇＥレベルの上昇が挙げられる。
他の態様では、これだけに限定されないが、嚢胞性線維症に関連する上気道疾患、下気道疾患、鼻咽頭疾患、副鼻腔炎および／または唾液疾患を含めた、嚢胞性線維症に関連する肺疾患を処置するための方法であって、対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、治療有効量の感染性ｒＡＡＶを投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ＣＦＴＲをコードするヌクレオチド配列は配列番号４３の配列を有し、かつ／またはプロモーターは配列番号４４の配列を有し、かつ／または核酸は配列番号４５の配列を含む。
配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、ＣＦＴＲまたはその生物活性部分をコードする核酸配列（例えば、配列番号４４のプロモーターに必要に応じて連結した配列番号４３のヌクレオチド配列を含む核酸を含む、および／または配列番号４５のヌクレオチド配列を含む）とを含む本発明のｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターを患者に種々の手段によって投与して、ＣＦＴＲまたはその一部の、嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患の処置のための治療有効レベルを実現し、それを維持することができる。
一部の態様では、感染性ｒＡＡＶは、嚢胞性線維症を有する対象に１つまたは複数の投与量で投与され、各投与量は、約１×１０１３～約１×１０１５ベクターゲノム（ｖｇ）の間、約１×１０１３～約１×１０１４ｖｇ、約１×１０１４～約１×１０１５ｖｇの間、または約１×１０１５～約５×１０１５ｖｇの間を含む。一部の好ましい態様では、各投与量は、約１×１０１４ｖｇまたは約１×１０１５ｖｇのｒＡＡＶを含む。
一部の態様では、処置は、対象への単回用量投与だけを含み、ＣＦＴＲまたはその生物活性部分の治療濃度の永続性および維持を実現するために効果的である。関連する態様では、処置は、嚢胞性線維症を有するヒトへの、配列番号１２のカプシドタンパク質と配列番号４５の核酸とを含むｒＡＡＶの約１×１０１３～約１×１０１５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、ウイルス粒子（ｖｐ）またはウイルスゲノム（ｖｇ）の吸入による単回用量投与だけを含む。他の態様では、投与処置は複数用量スケジュールであり得る。
ＡＡＶベクターのヒトへの投与に関する方法は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫａｙ ｅｔ ａｌ． （２０００， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２４： ２５７－２６１）により以前に記載されている。一部の好ましい実施形態では、感染性ｒＡＡＶは、対象に肺、気管支内（ｅｎｄｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ）、鼻腔内、気管内、および／または気管支内（ｉｎｔｒａｂｒｏｎｃｈｉａｌ）投与によって投与される。一部の好ましい実施形態では、感染性ｒＡＡＶは、ネブライザーを使用して投与される。
関連する態様では、嚢胞性線維症の処置における使用のための、または嚢胞性線維症の処置のための医薬の製造における使用のための、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む感染性ｒＡＡＶが本明細書で提供される。一部の好ましい実施形態では、ヒトＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４の配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むプロモーターに作動可能に連結した、配列番号４３の配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含むまたはそれからなる。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸を含む。
他の実施形態では、（ｉ）（ａ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｂ）１種または複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶ感染性ｒＡＡＶを、（ｉｉ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭのクエン酸塩、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌおよび必要に応じて界面活性物質、好ましくは非イオン界面活性物質、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、より好ましくは約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが５～７の間であり、好ましくはｐＨが約６．０である緩衝液中に含む、吸入に適した医薬組成物が本明細書で提供される。一部の好ましい態様では、医薬組成物は、約２０ｍＭ～約５０ｍＭのクエン酸塩、約８５ｍＭ～約１２５ｍＭのＮａＣｌおよび約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが約６．０である。一部の特に好ましい態様では、医薬組成物は、約２０ｍＭのクエン酸塩、約１２５ｍＭのＮａＣｌおよび約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが約６．０である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｂ）プロモーターに作動可能に連結した、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質またはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶを含む。関連する実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸を含む。
一部の態様では、医薬組成物は、１ｍｌ当たり１０１１～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）の間を含む。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１３～約９×１０１３ｖｇ／ｍｌ、好ましくは約２×１０１３～６×１０１３ｖｇ／ｍｌを含む。他の好ましい実施形態では、医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）は、約１×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約２×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約４×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約５×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約６×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約７×１０１３ｖｇ／ｍｌ、約８×１０１３ｖｇ／ｍｌ、または約９×１０１３ｖｇ／ｍｌを含む。特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２×１０１３ｖｇ／ｍｌ～約５×１０１３ｖｇ／ｍｌを含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル化送達に適した液剤／懸濁剤として製剤化される。関連する実施形態では、医薬組成物はエアロゾル剤として製剤化され、および／または吸入用剤形である。
肺細胞に異種核酸を送達する方法であって、肺細胞を、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶビリオンと接触させるステップを含む、方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、異種核酸は、タンパク質および／または低分子干渉ＲＮＡをコードする。一部の好ましい実施形態では、肺細胞は、肺または気管の任意の細胞である。他の好ましい実施形態では、肺細胞は、これだけに限定されないが、肺胞上皮細胞、気管支（一次、二次または三次）上皮細胞または気管上皮細胞を含めた気道上皮細胞である。一部の好ましい態様では、肺細胞は、線毛気道上皮細胞である。一部の好ましい態様では、肺細胞は、肺胞上皮１型（ＡＥＣＩ）または２型（ＡＥＣＩＩ）細胞である。他の実施形態では、肺細胞は、平滑筋細胞または内皮細胞である。他の実施形態では、肺細胞は、基底細胞、杯細胞または卵母細胞である。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸を含む。
対象（例えば、ヒト対象）の肺に異種核酸を送達する方法であって、対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶビリオンを投与するステップを含む、方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、異種核酸は、タンパク質および／または低分子干渉ＲＮＡをコードする。関連する実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）の上気道、鼻咽頭、副鼻腔、口／頬領域および／または唾液腺に異種核酸を送達する方法であって、対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶビリオンを投与するステップを含む、方法。関連する態様では、ｒＡＡＶまたはそれを含む医薬組成物は、対象に肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内投与によって投与される。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸を含む。
肺疾患を処置するため方法であって、それを必要とする対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸であって、１種または複数の遺伝子産物が、プロモーターに作動可能に連結している、異種核酸とを含む、治療有効量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を投与するステップを含む、方法も本明細書で提供される。一部の態様では、異種核酸は、複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、その場合、複数（例えば、２種）の遺伝子産物の発現を複数（例えば、２種）の独立したプロモーターによって媒介することもでき、複数の導入遺伝子を配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド配列によって隔て、単一のプロモーターによって媒介することもできる。好ましい実施形態では、異種核酸は、治療用タンパク質および／または治療用低分子干渉ＲＮＡをコードする。関連する態様では、ｒＡＡＶによって送達された遺伝子産物（複数可）により、妨害性遺伝子産物のレベルが低下し、かつ／または支持性遺伝子産物が導入されるもしくはそのレベルが補足される。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸を含む。他の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、アルファ－１－抗トリプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
一部の態様では、肺疾患は、肺動脈性肺高血圧症、肺高血圧症、肺がん（原発性、続発性および転移性）、サーファクタント欠乏症、ウイルスおよび／または細菌感染症、嚢胞性線維症、急性気管支炎、肺炎（ウイルス性、細菌性、および真菌性肺炎を含む）、気道感染症（咽頭炎、クループ、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コクシジオイデス症（ｃｏｏｃｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、ハンタウイルス肺症候群、およびヒストプラスマ症を含む）、化学性および過敏性肺炎、結核および他のマイコバクテリア感染症（これだけに限定されないが、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍを含む）、サルコイドーシス、呼吸器合胞体ウイルス、肺水腫、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、塵肺症（炭塵肺、石綿肺、および珪肺症を含む）、間質性肺疾患（サルコイドーシスおよび自己免疫疾患を含む）、肺塞栓症、胸水（ｐｌｅｕａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ）、胸膜炎、中皮腫、気胸、急性気管支炎、細気管支炎（閉塞性細気管支炎を含む）、乳児突然死症候群、睡眠時無呼吸、気管支拡張症、気管支肺異形成症、特発性器質化肺炎、電子たばこまたはベイピングの使用に関連する肺損傷（ＥＶＡＬＩ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、原発性線毛機能不全症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、アルファ－１－抗トリプシン欠損症、喘息、間質性肺疾患、ならびにＣＯＶＩＤ－１９（２０１９年新型コロナウイルス感染症）から選択される。他の態様では、肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。関連する態様では、ＣＯＶＩＤ－１９を処置する方法であって、それを必要とする対象に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種もしくは複数のプロモーターに作動可能に連結した１種もしくは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、治療有効量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、またはｒＡＡＶを含む医薬組成物を投与するステップを含み、遺伝子産物（複数可）により、ウイルス遺伝子産物または宿主細胞遺伝子がノックダウン、改変および／または過剰発現されて、肺もしくは鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒｙｘ）のいずれかにおけるウイルスの病原性もしくは複製が低減もしくは排除され、かつ／または、ウイルスのエピトープに対する中和抗体が発現される、方法が提供される。
一部の態様では、ＩＰＦの処置のための標的とすることができる遺伝子としては、これだけに限定されないが、ＳＦＴＰＡ１（サーファクタントＡ１）およびカベオリン－１が挙げられる。ＣＯＰＤの処置のための標的とすることができる遺伝子としては、これだけに限定されないが、アルファ－１－抗トリプシン、アルファ－１－抗キモトリプシン、アルファ－１－マクログロブリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ１２）、ミクロソームエポキシドヒドロリアーゼ、ＣＹＰ１Ａ１、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ－１、ＴＧＦ－ベータ－１、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１複合体、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ－Ｂ７およびＢｗ１６）、ビタミンＤ結合タンパク質、およびベータ－２－アドレナリン作動性受容体が挙げられる。
関連する態様では、それを必要とする対象における肺疾患を処置するために、ｒＡＡＶまたは医薬組成物は、肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内（投与によって投与される。一部の好ましい実施形態では、感染性ｒＡＡＶは、ネブライザーを使用して投与される。
他の態様では、肺疾患を処置するために、ｒＡＡＶの約１０１２～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの少なくとも１つの用量が対象に投与される。関連する態様では、対象は、約１×１０１１～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２～約９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約９×１０１２ｖｇ／ｋｇ、好ましくは約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは約２．６×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約２．７×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約２．８×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約２．９×１０１２ｖｇ／ｋｇ 約３．０×１０１２ｖｇ／ｋｇまたは約３．１×１０１２ｖｇ／ｋｇを投与される。好ましい実施形態では、対象は、１つまたは複数の用量を１つまたは複数の投与量で投与され、各投与量は、約１×１０１３～約１×１０１５ベクターゲノム（ｖｇ）の間、約１×１０１３～約１×１０１４ｖｇ、約１×１０１４～約１×１０１５ｖｇの間、または約１×１０１５～約５×１０１５ｖｇの間のｒＡＡＶを含む。一部の好ましい態様では、各投与量は、約１×１０１４ｖｇまたは約１×１０１５ｖｇのｒＡＡＶを含む。
本開示は、さらに、バリアントカプシドタンパク質と異種核酸とを含む感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、さらに、感染性ｒＡＡＶビリオンにヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加を付与するバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（および／またはバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸）を提供する。本開示は、さらに、感染性ｒＡＡＶビリオンおよび／または主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、さらに、上記のビリオン、カプシドタンパク質、核酸、および／または宿主細胞のライブラリーであって、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、ライブラリーを提供する。
本開示は、さらに、標的細胞に異種核酸を送達する方法であって、標的細胞を主題の感染性ｒＡＡＶビリオンと接触させる、方法を提供する。本開示は、さらに、個体に遺伝子産物を送達する方法であって、それを必要とする個体に、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを投与するステップを一般に伴う、方法を提供する。主題の方法を実施するための組成物およびキットも本明細書で提供される。
本開示の特色として、（ａ）配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質と、（ｂ）異種核酸とを含む感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンが挙げられる。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
本開示の特色として、（ａ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、１６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む、バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質；ならびに（ｂ）異種核酸を含む感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンが挙げられる。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される抵抗性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加を示す。一部の場合では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２によって示される抵抗性の少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍など）大きい、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性を示す。一部の場合では、ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）によって示される哺乳動物細胞に対する形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳動物細胞に対する形質導入の増加を示す。一部の場合では、哺乳動物細胞は、肝細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、膵臓前駆細胞、筋肉幹細胞、網膜幹細胞など）、内皮細胞、またはがん細胞である。一部の場合では、異種核酸は、ＲＮＡ干渉剤を含む。一部の場合では、異種核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
本開示の特色として、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が挙げられる。一部の場合では、コードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、コードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
本開示の特色として、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が挙げられる。
一部の場合では、コードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（単離された核酸によってコードされる）により、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される抵抗性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加が付与される。一部の場合では、抵抗性の増加は、ＡＡＶ２によって示される抵抗性よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍など）大きい。一部の場合では、コードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（単離された核酸によってコードされる）により、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに、ＡＡＶ２によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳動物細胞に対する形質導入の増加が付与される。
本開示の特色として、上記の主題の核酸を含む単離された宿主細胞が挙げられる。一部の場合では、宿主細胞には核酸が安定にトランスフェクトされている。一部の場合では、宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。一部の場合では、宿主細胞は、組換えＡＡＶベクターをさらに含む。
本開示の特色として、標的細胞に異種核酸を送達する方法であって、標的細胞を主題のビリオン（上記）と接触させるステップを含む、方法が挙げられる。一部の場合では、標的細胞は、肝細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、膵臓前駆細胞、筋肉幹細胞、または網膜幹細胞など）、内皮細胞、またはがん細胞である。一部の場合では、標的細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにある。一部の場合では、標的細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。
本開示の特色として、それを必要とする個体に遺伝子産物を送達する方法であって、個体に、有効量の主題の感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン（上記）を投与するステップを含む、方法が挙げられる。一部の場合では、ｒＡＡＶビリオンの異種核酸は、ＲＮＡ干渉剤を含む。一部の場合では、ｒＡＡＶビリオンの異種核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合では、投与するステップは、感染性ｒＡＡＶビリオンの間接送達を含む。一部の場合では、投与するステップは、感染性ｒＡＡＶビリオンの直接送達を含む。
本開示の特色として、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質が挙げられる。一部の場合では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
本開示の特色として、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、１６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む、バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質が挙げられる。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質により、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに、ＡＡＶ２によって示される抵抗性と比較してヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加が付与される。一部の場合では、抵抗性の増加は、ＡＡＶ２によって示される抵抗性よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍など）大きい。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質により、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに、ＡＡＶ２によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳動物細胞に対する形質導入の増加が付与される。
本開示の特色として、（ｉ）それぞれがバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質と異種核酸とを含む、２種またはそれよりも多くの感染性ｒＡＡＶビリオン；（ｉｉ）それぞれがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、２種またはそれよりも多くの単離された核酸；（ｉｉｉ）それぞれがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、２種またはそれよりも多くの宿主細胞；および（ｉｖ）２種またはそれよりも多くのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つを含むライブラリーが挙げられ、ここで、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の特色として、スターターカプシドタンパク質を含むスターター（親）ビリオンと比べて感染特性の変更を示す改変された感染性ｒＡＡＶビリオンを生成および同定する方法であって、（ａ）スターターカプシドタンパク質からバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を生成するステップであって、スターターカプシドタンパク質が、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含み、各バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、スターターカプシドタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ステップと、（ｂ）それぞれがステップ（ａ）において生成されたバリアントカプシドＡＡＶタンパク質を含む、バリアントＡＡＶビリオンを生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生成されたバリアントＡＡＶビリオンを感染特性の変更についてアッセイして、改変された感染性ｒＡＡＶビリオンを同定するステップとを含む、方法が挙げられる。一部の場合では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーの生成は、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、飽和変異誘発、ループスワッピング変異誘発、断片シャッフリング変異誘発、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異誘発の方法を含む。一部の場合では、感染特性の変更は、スタータービリオンによって示される抵抗性と比較した、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加である。一部の場合では、感染特性の変更は、スタータービリオンによって示される形質導入と比較した、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳動物細胞に対する形質導入の増加である。一部の場合では、改変された感染性ｒＡＡＶビリオンは、スターターカプシドタンパク質に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
本開示の特色として、スターターカプシドタンパク質からバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を生成する方法であって、スターターカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、飽和変異誘発、ループスワッピング変異誘発、断片シャッフリング変異誘発、およびこれらの組合せからなる群から選択される一種の変異誘発に供するステップを含み、スターターカプシドタンパク質が、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む、方法が挙げられる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質または前記ヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸とを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
（項目２）
ヒトＣＦＴＲをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する、項目１に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目３）
前記プロモーターが、構成的プロモーター、必要に応じてＣＭＶ即時型／初期エンハンサー／プロモーターの短縮バージョンである、項目１または２に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目４）
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、好ましくは、前記プロモーターが、前記核酸の肺細胞における優先的発現を指示する、項目１または２に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目５）
前記プロモーターが、ＣＭＶ１７３プロモーターであり、ヒトＣＦＴＲをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、項目１または２に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目６）
前記ＣＭＶ１７３プロモーターが、配列番号４４の配列を有する、項目５に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目７）
前記核酸が、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載のｒＡＡＶウイルス。
（項目８）
それを必要とする対象において嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患を処置するための方法であって、前記対象に、項目１から７のいずれか一項に記載の、治療有効量の感染性ｒＡＡＶを投与するステップを含み、好ましくは、前記対象に、上気道炎症、異常な上皮サイトカインシグナル伝達およびＩｇＥレベルの上昇から必要に応じて選択される嚢胞性線維症の１つまたは複数の特徴を好転させるために効果的な量の前記ｒＡＡＶを投与する、方法。
（項目９）
前記ｒＡＡＶが、前記対象に、肺（気管支）および／または経鼻投与によって、好ましくは吸入によって投与され、好ましくは単回用量で投与される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶが、前記対象に、１×１０ １３ ～５×１０ １５ ベクターゲノム（ｖｇ）の間、より好ましくは１×１０ １４ ～１×１０ １５ ｖｇの間の１つまたは複数の用量で投与される、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患の処置における使用のための、項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１２）
嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患の処置のための医薬の製造における使用のための、項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１３）
項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、ならびに、約１０ｍＭ～約５０ｍＭのクエン酸塩、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌおよび必要に応じて界面活性物質、好ましくは非イオン界面活性物質、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、より好ましくは約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む緩衝液であって、ｐＨが約６．０である緩衝液を含む、吸入に適した医薬組成物。
（項目１４）
約２０ｍＭ～約５０ｍＭのクエン酸塩、約８５ｍＭ～約１２５ｍＭのＮａＣｌおよび約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが約６．０である、項目１３に記載の医薬組成物。
（項目１５）
約２０ｍＭのクエン酸塩、約１２５ｍＭのＮａＣｌおよび約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが約６．０である、項目１４に記載の医薬組成物。
（項目１６）
１ｍｌ当たり１０ １１ ～１０ １４ ベクターゲノム（ｖｇ）を含む、項目１３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１７）
約１×１０ １３ ～約９×１０ １３ ｖｇ／ｍｌ、好ましくは約２×１０ １３ ～６×１０ １３ ｖｇ／ｍｌ、より好ましくは約２×１０ １３ ｖｇ／ｍｌを含む、項目１６に記載の医薬組成物。
（項目１８）
エアロゾル化送達に適した液剤／懸濁剤の形態であるか、またはエアロゾル剤として製剤化されたものであるか、および／または吸入用剤形である、項目１３から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１９）
それを必要とする対象において嚢胞性線維症またはそれに関連する肺疾患を処置するための方法であって、前記対象に、項目１３から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２０）
異種核酸を肺細胞に送達する方法であって、前記肺細胞を、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶビリオンと接触させるステップを含み、それによって、前記遺伝子産物を前記肺細胞において発現させる、方法。
（項目２１）
前記異種核酸が、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質または前記ヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記異種核酸が、配列番号４５の配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記肺細胞が、気道上皮細胞である、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記上皮細胞が、肺胞上皮細胞、気管支（一次、二次または三次）上皮細胞または気管上皮細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記肺細胞が、肺胞上皮１型（ＡＥＣＩ）または２型（ＡＥＣＩＩ）細胞である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記肺細胞が、平滑筋細胞または内皮細胞である、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
肺疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、（ｉ）配列番号１２として記載されているアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）１種もしくは複数のプロモーターに作動可能に連結した１種もしくは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、治療有効量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を投与するステップ、または、前記対象に、前記ｒＡＡＶを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２８）
前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肺動脈性肺高血圧症、肺高血圧症、肺がん（原発性、続発性および転移性）、サーファクタント欠乏症、ウイルスおよび／または細菌感染症、嚢胞性線維症、急性気管支炎、肺炎（ウイルス性、細菌性、および真菌性肺炎を含む）、気道感染症（咽頭炎、クループ、アスペルギルス、コクシジオイデス症、ハンタウイルス肺症候群、およびヒストプラスマ症を含む）、化学性および過敏性肺炎、結核および他のマイコバクテリア感染症（これだけに限定されないが、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍを含む）、サルコイドーシス、呼吸器合胞体ウイルス、肺水腫、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、塵肺症（炭塵肺、石綿肺、および珪肺症を含む）、間質性肺疾患（サルコイドーシスおよび自己免疫疾患を含む）、肺塞栓症、胸水、胸膜炎、中皮腫、気胸、急性気管支炎、細気管支炎（閉塞性細気管支炎を含む）、乳児突然死症候群、睡眠時無呼吸、気管支拡張症、気管支肺異形成症、特発性器質化肺炎、電子たばこまたはベイピングの使用に関連する肺損傷（ＥＶＡＬＩ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、原発性線毛機能不全症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、アルファ－１－抗トリプシン欠損症、喘息、間質性肺疾患、ならびにＣＯＶＩＤ－１９（２０１９年新型コロナウイルス感染症）から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記肺疾患が、ＣＯＰＤであり、前記ｒＡＡＶが、必要に応じて、アルファ－１－抗トリプシン、アルファ－１－抗キモトリプシン、アルファ－１－マクログロブリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ１２）、ミクロソームエポキシドヒドロリアーゼ、ＣＹＰ１Ａ１、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ－１、ＴＧＦ－ベータ－１、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１複合体、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ－Ｂ７およびＢｗ１６）、ビタミンＤ結合タンパク質、およびベータ－２－アドレナリン作動性受容体から選択される１種または複数の遺伝子を標的とする遺伝子産物をコードする異種核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記肺疾患が、ＩＰＦであり、前記ｒＡＡＶが、必要に応じて、ＳＦＴＰＡ１（サーファクタントＡ１）およびカベオリン－１から選択される１種または複数の遺伝子を標的とする遺伝子産物をコードする異種核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記肺疾患が、アルファ－１－抗トリプシン欠損症であり、前記ｒＡＡＶが、機能的なアルファ－１－抗トリプシンをコードする異種核酸を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記ｒＡＡＶまたは医薬組成物が、肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内投与によって投与される、項目２７から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ｒＡＡＶの約１０ １２ ～１０ １５ ベクターゲノム（ｖｇ）の少なくとも１つの用量が、前記対象に投与される、項目２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記対象が、約１×１０ １３ ～約５×１０ １５ ｖｇ、好ましくは約１×１０ １４ ｖｇ～約１×１０ １５ ｖｇを投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
アミノ酸７０８～７５９を欠き、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、生物活性のあるヒトＣＦＴＲタンパク質をコードする核酸であって、配列番号４３として記載されているヌクレオチド配列またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む、核酸。
（項目３７）
配列番号４３として記載されているヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、項目３６に記載の核酸。
（項目３８）
項目３６または３７に記載の核酸、および前記核酸配列に作動可能に連結しており、前記核酸配列に対して異種である発現制御配列を含む、発現カセット。
（項目３９）
前記発現制御配列が、配列番号４４として記載されているヌクレオチド配列を有するＣＭＶ１７３プロモーターを含む、項目３８に記載の発現カセット。
（項目４０）
５’から３’に、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＭＶ１７３プロモーター、（ｃ）コドン最適化された配列番号４３の遺伝子、（ｄ）ＡＡＶ２末端反復を含む、項目３８または３９に記載の発現カセット。
（項目４１）
（ｃ）と（ｄ）の間にＳＶ４０ポリアデニル化配列をさらに含む、項目４０に記載の発現カセット。
図１Ａ～Ｂは、抗体回避の増強のためのＡＡＶの定向進化を示す。
図２Ａ～Ｂは、ヒトＩＶＩＧを使用した抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。 図２Ａ～Ｂは、ヒトＩＶＩＧを使用した抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。
図３Ａ～Ｃは、ＡＡＶに対する高い中和抗体力価の存在が原因で血友病Ｂ臨床試験から除外された個体から取得されたヒト血清を使用した抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。 図３Ａ～Ｃは、ＡＡＶに対する高い中和抗体力価の存在が原因で血友病Ｂ臨床試験から除外された個体から取得されたヒト血清を使用した抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。
図４Ａ～Ｂは、ループ－スワップ／シャッフルおよび飽和変異誘発クローンのアミノ酸配列を示す。
図５は、ＡＡＶバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏトロピズムを示す。
図６Ａ～Ｂは、新規のＡＡＶバリアントのｉｎ ｖｉｖｏにおける局在化および中和を示す。
図７Ａ～Ｄは、ヒト抗体回避体の生成を示す。
図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。 図８Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。 図９Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ａ～Ｉは、ＡＡＶ１～９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１～９）とアラインメントしたＳｈｕｆｆｌｅ１００－７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
図１１は、免疫したマウス血清中のライブラリークローンおよび親血清型の中和抗体力価を示す。
図１２は、ヒト中和抗体の存在下で肺への遺伝子送達の増強を有するカプシドバリアント「Ａ１０１」（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）を同定するために利用した定向進化プロセスを例示する。
図１３Ａは、定向進化プロセスに使用したカプシドライブラリーの推定される遺伝的多様性を例示する。ライブラリーの総多様性は＞１０億種の遺伝子バリアントである。図１３Ｂは、カプシドライブラリーの生産性を例示する。全てのカプシドライブラリーが、ｉｎ ｖｉｖｏ治療用ベクター進化プログラム研究のための材料を作製するために十分なレベルで製造された。投与されたウイルスゲノム（ｖｇ）は標的用量を表し、送達デバイスおよび投与経路に関連する減少を考慮したものではない。
図１４Ａは、選択の第１のラウンドからの、ａ）ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）による投与、またはｂ）ネブライザーによる投与後の単離されたＡＴ ＩＩ細胞からのウイルスゲノムの外部ＰＣＲ増幅を例示する。青色の枠内のバンドは、ウイルスゲノムの上首尾の増幅を表す。温度勾配は、ゲルの各レーンに対応するＰＣＲの間に使用したアニーリング温度を表す。図１４Ｂは、選択の第１のラウンドからの、ａ）ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）による投与、またはｂ）ネブライザーによる投与後の単離されたＡＴ ＩＩ細胞からのウイルスゲノムの内部ＰＣＲ増幅を例示する。青色の枠内のバンドは、ウイルスゲノムの上首尾の増幅を表す。
図１５Ａは、研究の配列決定分析内でのキメラモチーフの頻度を例示する。配列決定分析は、ＡｅｒｏＰｒｏｂｅおよびネブライザー送達デバイスの両方についての、配列決定された集団内での総頻度に基づく。図１５Ｂは、研究のキメラモチーフ内でのＡ１０１バリアントの頻度を例示する。配列決定分析は、ＡｅｒｏＰｒｏｂｅおよびネブライザー送達デバイスの両方についての、配列決定された集団内での総頻度に基づく。
肺試料採取の概略図（実施例３および７）。気管および肺試料採取の略図。右肺内の円は、ＤＮＡおよびタンパク質の単離のために得た近傍試料を表す。組織切片作製のための長軸および短軸に沿った向きの試料が四角で表されている。
ＮＨＰ血清試料を１：１０の血清希釈度で用いたバリアントカプシド（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）による形質導入。研究への組み入れのために適格なＮＨＰ由来の血清試料を抗ＡＡＶ中和抗体の存在について分析した。１：１０の血清希釈度の存在下での形質導入（血清の非存在下での形質導入と比較した）が全てのＮＨＰについて報告されている。研究への組み入れのために選択されたＮＨＰが黄色の棒で示されている。エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３（内部反復）。
バリアントカプシド媒介性ゲノムの生体内分布。ＥＧＦＰ導入遺伝子に対するプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲによる、肺およびさらなる全身器官におけるウイルスゲノムの定量。４８の試料全てにおいてウイルスゲノムが検出された（ＮＨＰ当たりｎ＝１６の試料；ｎ＝３のＮＨＰ）。骨格筋（上腕三頭筋、外側広筋）、横隔膜、腎臓、脾臓、脳および脊髄由来の試験した全ての試料で、定量の下限を下回った。平均±標準誤差；ｎ＝３のＮＨＰ（ＮＨＰ当たり肺当たりｎ＝１６の生検部位、ＮＨＰ当たり肝臓当たりｎ＝１０の生検部位、ＮＨＰ当たり心臓当たりｎ＝１５の生検部位、ＮＨＰ当たり骨格筋当たりｎ＝９の生検部位、ＮＨＰ当たり腎臓当たりｎ＝２の試料、ＮＨＰ当たり脾臓当たりｎ＝１の試料、ＮＨＰ当たり脳当たりｎ＝８の生検部位、ＮＨＰ当たり脊髄当たりｎ＝３の生検部位）。
肺におけるバリアントカプシド媒介性タンパク質発現。ＥＧＦＰタンパク質に対するＥＬＩＳＡによる肺におけるＥＧＦＰタンパク質発現の定量。４８の肺試料全てにおいてＥＧＦＰ発現が観察された（ＮＨＰ当たりｎ＝１６の試料；ｎ＝３のＮＨＰ）。ウイルスゲノムについて陽性であった１０の肝臓試料においてＥＧＦＰ発現が観察された（ＮＨＰ当たりｎ＝１０の試料；ｎ＝３のＮＨＰ）。平均±標準誤差。
肺におけるバリアントカプシド媒介性タンパク質の局在化。ＮＨＰ Ｖ００２９６９の気管（ａ～ｂ）、気管支（ｃ、ｅ、ｇ）、および肺胞（ｄ、ｆ、ｈ）におけるＥＧＦＰ発現の代表的な画像。気管（ｂ）、肺胞（ｄ）、および気管支（ｅ）における白枠で示されているセクションがそれぞれｉ、ｊ、およびｋに拡大画像として提示されている。画像のおおよその場所が概略図のマゼンタ色の枠で示されている。全ての画像においてＥＧＦＰ発現が抗ＧＦＰ抗体によって検出されている（赤色）。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。
肺胞上皮２型非ヒト霊長類細胞の特徴付け。ＮＨＰ ＡＥＣＩＩ細胞の９０％よりも多くがＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性であったことが蛍光顕微鏡法によって示され（図１７Ａ）、フローサイトメトリーによって定量された（図２１Ｂ）。ＡＥＣＩＩ細胞の成熟マーカーであるサーファクタントタンパク質Ｃが播種後１日目および５日目に明白であった（図２１Ｃ）。ＡＥＣＩＩ細胞の増殖率が培養下で経時的に低下したことがＥｄＵ組み入れによって示されている（図２１Ｄ）。ＥｄＵ＝５－エチニル－２’－デオキシウリジン、エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３の内部反復。 肺胞上皮２型非ヒト霊長類細胞の特徴付け。ＮＨＰ ＡＥＣＩＩ細胞の９０％よりも多くがＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性であったことが蛍光顕微鏡法によって示され（図１７Ａ）、フローサイトメトリーによって定量された（図２１Ｂ）。ＡＥＣＩＩ細胞の成熟マーカーであるサーファクタントタンパク質Ｃが播種後１日目および５日目に明白であった（図２１Ｃ）。ＡＥＣＩＩ細胞の増殖率が培養下で経時的に低下したことがＥｄＵ組み入れによって示されている（図２１Ｄ）。ＥｄＵ＝５－エチニル－２’－デオキシウリジン、エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３の内部反復。
非ヒト霊長類の肺胞上皮２型細胞ベクターの特徴付け。ＡＥＣＩＩ ＮＨＰ細胞のＡＬＩ培養物において、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを有するｒＡＡＶ（４Ｄ－Ａ１０１）カプシドは、ＡＡＶ５カプシドよりも高い形質導入率を示し、ここで、ｒＡＡＶとＡＡＶ５はどちらもＣＡＧ－ｅＧＦＰを有した。フローサイトメトリーによるｅＧＦＰ陽性細胞の定量（図２２Ａ）。ｅＧＦＰ陽性細胞の代表的なＩＣＣ画像（図２２Ｂ）。感染後の時間３日間、合計５日間の培養。エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３の内部反復。スチューデントのｔ検定、ＡＡＶ５と比較してｐ＜０．０５。
肺胞上皮２型ヒト細胞の特徴付け。ヒトＡＥＣＩＩ細胞は、培養下で１１日目まで、およそ８０％がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性であり、１１日目に５０％に低下したことが蛍光顕微鏡法によって示され（図２３Ａ）、フローサイトメトリーによって定量された（図２３Ｂ）。ＡＥＣＩＩ細胞の成熟マーカーであるサーファクタントタンパク質Ｃが播種後５日目および１１日目に明白であった（図２３Ｃ）。ＡＥＣＩＩ細胞の増殖率が培養下で経時的に低下したことがＥｄＵ組み入れによって示されている（図２３Ｄ）。ＥｄＵ＝５－エチニル－２’－デオキシウリジン、エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３の内部反復。 肺胞上皮２型ヒト細胞の特徴付け。ヒトＡＥＣＩＩ細胞は、培養下で１１日目まで、およそ８０％がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性であり、１１日目に５０％に低下したことが蛍光顕微鏡法によって示され（図２３Ａ）、フローサイトメトリーによって定量された（図２３Ｂ）。ＡＥＣＩＩ細胞の成熟マーカーであるサーファクタントタンパク質Ｃが播種後５日目および１１日目に明白であった（図２３Ｃ）。ＡＥＣＩＩ細胞の増殖率が培養下で経時的に低下したことがＥｄＵ組み入れによって示されている（図２３Ｄ）。ＥｄＵ＝５－エチニル－２’－デオキシウリジン、エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３の内部反復。
ヒト肺胞上皮２型細胞ベクターの特徴付け。ＡＥＣＩＩヒト細胞のＡＬＩ培養物において、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシド（４Ｄ－Ａ１０１）により、ＡＡＶ５カプシドよりも高い形質導入率が示され、ここで、４Ｄ－Ａ１０１とＡＡＶ５カプシドはどちらもＣＡＧ－ｅＧＦＰを有した。ｅＧＦＰ陽性細胞の代表的なＩＣＣ画像。感染後の時間６および１０日間、合計７および１１日間の培養。
野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９および配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶ（４Ｄ－Ａ１０１）のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和プロファイル。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶと比較して、ヒトＩＶＩＧ中でＡＡＶ中和抗体を回避する優れた能力を示した。ＡＡＶ．ＣＡＧ．ルシフェラーゼベクターを、ＩＶＩＧの希釈物と一緒にインキュベートした後、２Ｖ６．１１細胞にＭＯＩ１，０００で感染させた。抗体を回避することが可能なベクターで細胞に形質導入し、感染の４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＩＶＩＧ＝静脈内免疫グロブリン、エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３、内部反復。＊４Ｄ－Ａ１０１について、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９に対してｐ＜０．０５、†４Ｄ－Ａ１０１について、ＡＡＶ５に対してｐ＜０．０５。
Ａ１０１ ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質についてのｐＨに対する正味の電荷のグラフ。
室温で１日保管した後のＡ１０１－ＧＦＰ ｐＨ溶解性のグラフ。
ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞において、形質導入により、頑強なタンパク質発現および膜局在化がもたらされる。ＨＥＫ２ｖ６．１１に４Ｄ－７１０を用いて形質導入し、抗ＣＦＴＲ抗体を用いた（図２８Ａ）ウエスタンブロットによってプロービングした（図２８Ａ）。代表的な画像（図２８Ｂ）は、免疫細胞化学的検査によって分析された細胞、抗ＣＦＴＲ（赤色）、Ｆ－アクチン（緑色）、ＤＡＰＩ、核（青色）を示す。スケールバーは１００μＭ（図２８Ｂ）および２５μＭ（図２８Ｃ）である。
１６ＨＢＥ１４ｏ－Ｇ５４２Ｘ細胞への４Ｄ－７１０を用いた形質導入。漸増ＭＯＩの４Ｄ－７１０による形質導入後にＨＢＥ培養物から抽出したＲＮＡに対して逆転写－ｄｄＰＣＲ（ＲＴ－ｄｄＰＣＲ）デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施した（図２９Ａ）。外因性ＣＦＴＲΔＲ転写物レベルを決定し、設定された閾値を超えるコピー数／μＬとして定量し、リニアスケールにプロットした。ＢＬＱ、定量限界未満。ＮＴ、形質導入されていない。ＭＯＩ３５，０００および５０，０００での形質導入後のＨＢＥ培養物の免疫細胞化学的検査（図２９Ｂ）。青色はＤＡＰＩであり、赤色はＣＦＴＲタンパク質である。スケールは１００μｍである。
健康なｅｘ ｖｉｖｏ ＡＬＩ肺培養物への４Ｄ－７１０を用いた形質導入。４Ｄ－７１０による形質導入後に培養物から抽出したＲＮＡから調製したｃＤＮＡに対してｄｄＰＣＲを実施した。コドン最適化されたヒトＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を内因性ヒトＣＦＴＲ遺伝子と明確に弁別するために、２種のプライマー／プローブセットを作製した。調査したプライマー／プローブセットの転写物を含有する、設定された閾値を超えるドロップレットの数を定量分析した。ＢＬＱ、定量限界未満。ＮＴ、形質導入されていない。
ＮＨＰ血清試料を１：１０の血清希釈度で用いた４Ｄ－Ａ１０１による形質導入。研究への組み入れのために適格なＮＨＰ由来の血清試料を、４Ｄ－７１０のカプシド（４Ｄ－Ａ１０１、配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）に対する抗ＡＡＶ中和抗体の存在について分析した。１：１０の血清希釈度の存在下での形質導入（血清の非存在下での形質導入と比較した）が全てのＮＨＰについて報告されている。エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３（内部反復）。
ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子に対するプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲによるウイルスゲノムの定量。図３２Ａ、右肺全体を通して分布する肺試料においてウイルスゲノムが頑強に検出された。図３２Ｂ、個々の動物肺試料がおおよその領域および肺葉で示されている：肺胞（緑色）、一次／二次気管支（青色）、三次／下部気管支（赤色）、頭側葉（丸）、中葉（四角）、尾側葉（三角形）、副葉（ひし形）。図３２Ｃ、３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物におけるウイルスゲノムの定量により、心臓、肝臓、脳、骨格筋（上腕三頭筋、外側広筋、横隔膜）、脊髄、膵臓、腎臓、および精巣由来の試験した全ての試料が定量の下限を下回ったことが実証される。３匹の動物全てが気管気管支（ＴＢ）リンパ節に検出可能なウイルスゲノムを有し、１匹の動物が脾臓に検出可能なウイルスゲノムを有した。平均±ＳＤ。
肺における４Ｄ－７１０による導入遺伝子転写物の発現。４Ｄ－７１０導入遺伝子に対するプライマーおよびプローブを使用したＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＦＴＲΔＲ転写物の定量。図３３Ａ、３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物における葉の全体を通して分布した右肺試料において転写物が検出された。ビヒクル動物については全てＢＬＱであった。図３３Ｂ、３×１０１３ｖｇの投与を受けた個々の動物の肺試料がおおよその領域および肺葉によって示されている：肺胞（緑色）、一次／二次気管支（青色）、三次／下部気管支（赤色）、頭側葉（丸）、中葉（四角）、尾側葉（三角形）、副葉（ひし形）。平均±ＳＤ。
肺における４Ｄ－７１０によるタンパク質発現。免疫組織化学染色による、肺におけるＣＦＴＲタンパク質発現。図３４Ａ、各処置群の気管上皮、気管支上皮、および肺胞セクションにおけるＣＦＴＲ発現、代表的な画像。図３４Ｂ、３×１０１３ｖｇで処置された動物の気管上皮、気管支上皮、および肺胞セクションにおけるＣＦＴＲタンパク質発現（個々の動物について示されている）、代表的な画像。
ｐＨに対するＡ１０１－Ｌｕｃ溶解性のグラフ
発明の詳細な説明
定義
アデノ随伴ウイルスは、エンベロープを有さない正二十面体カプシド内の４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムで構成される非病原性パルボウイルスである。「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。ゲノムは、ウイルス複製起点およびパッケージングシグナルとして機能する末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれた３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ｒｅｐ ＯＲＦは、ウイルス複製、転写調節、部位特異的組込み、およびビリオンアセンブリにおいて役割を果たす４種の非構造タンパク質をコードする。ｃａｐ ＯＲＦは、アセンブルして６０ｍｅｒのウイルスカプシドを形成する３種の構造タンパク質（ＶＰ１～３）をコードする。最後に、ｃａｐ遺伝子内に代替読み枠として存在するＯＲＦは、ＡＡＶカプシドタンパク質を核小体に局在化させ、また、カプシドアセンブリプロセスにおいて機能するウイルスタンパク質である、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を産生させる。
ＡＡＶにはいくつかの天然に存在する血清型および１００種を超えるバリアントが存在し、そのそれぞれが、特にカプシドタンパク質の超可変領域内のアミノ酸配列が異なり、したがって、それらの遺伝子送達特性が異なる。何らかのヒト疾患に関連付けられているＡＡＶは存在せず、それにより、組換えＡＡＶが臨床的適用に魅力的なものになっている。
「ＡＡＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の必要がある場合を除き、全ての亜型、および天然に存在するものと組換え型の両方を網羅する。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１またはＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２またはＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３またはＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４またはＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５またはＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６またはＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７またはＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８またはＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ－９またはＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、などである。
「４Ｄ－Ａ１０１」または「Ａ１０１」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドを指す。
「４Ｄ－７１０」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）配列番号４５のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む組換えＡＡＶを指す。
種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブな末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は当技術分野で公知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースにおいて見いだすことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７．１（ＡＡＶ－１）、ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ－１）、ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３．１（ＡＡＶ－２）、Ｊ０１９０１．１（ＡＡＶ－２）、Ｕ４８７０４．１（ＡＡＶ－３）、ＮＣ＿００１７２９．１（ＡＡＶ－３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ－４）、Ｕ８９７９０．１（ＡＡＶ－４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ－５）、ＡＦ０８５７１６．１（ＡＡＶ－５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ－６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ－７）、ＡＦ５１３８５１．１（ＡＡＶ－７）、ＡＦ５１３８５２．１（ＡＡＶ－８） ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ－８）、およびＡＹ５３０５７９．１（ＡＡＶ－９）を参照されたい；これらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸の配列の教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５： ５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１： ６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： １３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： ９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： ３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１： ２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５８： ９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９： １１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３： ３７５－３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４号；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい。
ＡＡＶ血清型に関連付けられる天然に存在するｃａｐ（カプシド）タンパク質の配列は当技術分野で公知であり、それらには、ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ２（配列番号２）、ＡＡＶ３（配列番号３）、ＡＡＶ４（配列番号４）、ＡＡＶ５（配列番号５）、ＡＡＶ６（配列番号６）、ＡＡＶ７（配列番号７）、ＡＡＶ８（配列番号８）、およびＡＡＶ９（配列番号９）が含まれる。「バリアントＡＡＶカプシドタンパク質」という用語は、配列番号１～９に記載される天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質配列のうちの１つと比べて少なくとも１つの置換（欠失、挿入などを含む）を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質である。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド形成されたＡＡＶポリヌクレオチドで構成されるウイルス粒子を指す。
「組換え」とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限またはライゲーションステップ、および天然に見いだされるポリヌクレオチドとは別個の構築物をもたらす他の手順の種々の組合せの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の後代を含む。
ＡＡＶビリオンが異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、標的細胞に送達される導入遺伝子、標的細胞に送達されるＲＮＡｉ剤またはＣＲＩＳＰＲ剤など）を含む場合、一般には、「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」と称される。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている。
「ｒＡＡＶベクター」という用語は、定義によればｒＡＡＶポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）を包含し、また、ｒＡＡＶをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶをコードする一本鎖ポリヌクレオチド（ｓｓ－ｒＡＡＶ）；ｒＡＡＶをコードする二本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓ－ｒＡＡＶ）、例えば、ｒＡＡＶをコードするプラスミド；など）も包含する。
「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子のアセンブリおよびカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にするウイルスを指す。種々のそのようなＡＡＶのためのヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含め、当技術分野で公知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能」は、ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）、ヘルパーウイルスゲノムにコードされる機能を指す。本明細書に記載の通り、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスをもたらすこと、または、例えば産生細胞に必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでもたらすことによるものを含めたいくつかの仕方でもたらすことができる。例えば、１種または複数のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターをｒＡＡＶベクターと一緒に産生細胞にトランスフェクトする。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、コンピテントにアセンブルされたウイルスカプシドを含むものであり、ウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド構成成分を送達することが可能である。用語は、必ずしもウイルスの何らかの複製能を意味するものではない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の他の箇所および当技術分野において記載されている。ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表すことができる。感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比を決定する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１： Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイが記載されている）；およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： ９７３を参照されたい。実施例も参照されたい。
「トロピズム」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）が特定の宿主種または宿主種内の特定の細胞型を優先的に標的とすることを指す。例えば、心臓、肺、肝臓、および筋肉の細胞に感染することができるウイルスは、肺および筋肉細胞のみに感染することができるウイルスと比べてより広範な（すなわち、増加した）トロピズムを有する。トロピズムには、宿主の細胞表面分子の特定の型へのウイルスの依存も含まれ得る。例えば、一部のウイルスは、表面グリコサミノグリカンを有する細胞にのみ感染することができる一方、他のウイルスは、シアル酸を有する細胞にのみ感染することができる（そのような依存性は、特定のクラスの分子が欠損している種々の細胞株をウイルス感染の潜在的な宿主細胞として使用して試験することができる）。一部の場合では、ウイルスのトロピズムは、ウイルスの相対的な選好を説明する。例えば、第１のウイルスは全ての細胞型に感染することができ得るが、表面グリコサミノグリカンを有する細胞へ感染することに関してはるかに上首尾である。第２のウイルスも同じ特徴を選好する（例えば、第２のウイルスも表面グリコサミノグリカンを有する細胞へ感染することに関してより上首尾である）場合、絶対的な形質導入効率が同様でないとしても、第２のウイルスは第１のウイルスと同様の（または同一の）トロピズムを有するとみなすことができる。例えば、第２のウイルスは、試験されるあらゆる所与の細胞型へ感染する際に第１のウイルスよりも効率的であり得るが、相対的な選好が同様（または同一）であれば、それでもなお第２のウイルスを第１のウイルスと同様（または同一）のトロピズムを有するとみなすことができる。一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンのトロピズムは、天然に存在するビリオンと比べて変更されていない。一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンのトロピズムは、天然に存在するビリオンと比べて拡大されている（すなわち、広がっている）。一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンのトロピズムは、天然に存在するビリオンと比べて減少している。
「複製能のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」ウイルス（例えば、複製能のあるＡＡＶ）は、感染性であり、かつ、感染細胞において（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製することも可能である、表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合では、複製能力には、一般に、機能的なＡＡＶパッケージング遺伝子の存在が必要である。一般に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１種または複数のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如により、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製能力がない。一般には、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターの間での組換えによって複製能のあるＡＡＶが生成される可能性を最小限にするために、あらゆるＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠く。多くの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、複製能のあるＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を、たとえあったとしてもわずかにしか含有しないものである（例えば、１０２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、またはｒｃＡＡＶを含有しない）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を含めた任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの改変されたヌクレオチドを含んでもよく、また、非ヌクレオチド構成成分によって中断されていてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリ前になされてもその後になされてもよい。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本鎖分子および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または必要がない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが分かっているまたは予測される２本の相補的一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセント「配列同一性」、つまり、アラインメントした場合に、２つの配列を比較した場合に塩基またはアミノ酸が同じであるパーセンテージを有する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴを含めた方法およびコンピュータプログラムを使用して配列をアラインメントすることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡであり、これは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全子会社であるＭａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．、ＵＳＡからのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージとして入手可能である。アラインメントのための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２６６： Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ （１９９６）， ｅｄ． Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳＡに記載されている。配列内のギャップが許容されるアラインメントプログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおいてギャップが許容されるアルゴリズムの１つの型である。Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７０： １７３－１８７ （１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列をアラインメントすることができる。Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３ （１９７０）を参照されたい。
「遺伝子」とは、細胞においてある種の機能を発揮するポリヌクレオチドを指す。例えば、遺伝子は、転写および翻訳された後の特定のタンパク質をコードすることが可能なオープンリーディングフレームを含有し得る。他方では、遺伝子は、翻訳されない機能的なＲＮＡ産物（例えば、アプタマー、干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）など）をコードし得る。
「遺伝子発現産物」または「遺伝子産物」は、上で定義されている特定の遺伝子の発現によって生じた分子である。遺伝子発現産物には、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などが含まれる。
「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡｉ剤」は、遺伝子（上で定義されている）の発現を変化させるために使用することができる任意の作用剤（またはそのような作用剤をコードするポリヌクレオチド）を包含する。当業者に公知のＲＮＡｉ剤の例としては、これだけに限定されないが、（ｉ）ｓｉＲＮＡ剤；（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ剤；（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ剤、および（ｖ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）剤が挙げられる。
（ｉ）ｓｉＲＮＡ剤（「低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）」または「低分子干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」（またはｓｉＲＮＡ））は、目的の遺伝子（「標的遺伝子」）に標的化されるＲＮＡ二重鎖のヌクレオチドである。「ＲＮＡ二重鎖」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の領域を形成するＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的な対形成によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的とされる遺伝子のヌクレオチド配列と相補的であることから、遺伝子に「標的化」される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、二重鎖の長さは１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。ヘアピンを含有するｓｉＲＮＡ剤は、「ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）剤」とも称され得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する、２つの配列間に置かれたループ部分を含有し得る。ループの長さは変動し得る。一部の実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、３’または５’突出部分も含有し得る。一部の実施形態では、突出は、０、１、２、３、４または５ヌクレオチド長の３’または５’突出である。一般に、標的遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドなど）のレベルは、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む標的遺伝子転写物の少なくとも１９～２５ヌクレオチド長のセグメント（例えば、２０～２１ヌクレオチドの配列）と相補的な特定の二本鎖ヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）によって低下する。一部の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡは約１９～２５ｎｔ長である。例えば、ｓｉＲＮＡ技術に関する記載については、ＰＣＴ出願ＷＯ０／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８；ならびに米国特許出願公開第２００４００２３３９０号を参照されたい。ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、核酸配列によってコードすることができ、核酸配列はプロモーターも含み得る。核酸配列はポリアデニル化シグナルも含み得る。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは合成最小ポリアデニル化シグナルである。
（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡは、遺伝子発現産物と相補的なＲＮＡである。例えば、特定のｍＲＮＡに標的化されるアンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡに相補的な、ＲＮＡに基づく作用剤であり（または改変されたＲＮＡであってもよい）、その場合、アンチセンスＲＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡの発現が変更される（例えば、ＲＮＡの安定性が変更されることによって、ＲＮＡの翻訳が変更されることによって、など）。アンチセンスＲＮＡをコードする核酸も「アンチセンスＲＮＡ」に含まれる。
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ剤。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入してくる核酸のサイレンシングをガイドすることにより、細菌および古細菌にウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫をもたらす。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価物および／もしくはバリアント、すなわち、Ｃａｓ９様タンパク質）は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然に含有し、これは、タンパク質の、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと称される２つの天然に存在するまたは合成ＲＮＡ分子（ガイドＲＮＡとも称される）との会合に依存する。一部の場合では、２つの分子が共有結合により連結して、単一分子（単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも称される）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質が、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質が活性化され、タンパク質が標的核酸配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、標的ＤＮＡが切断されて、二本鎖切断が生じ、それにより、ゲノムの変更（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置き換えなど）がもたらされ、それにより、遺伝子発現が変更され得る。Ｃａｓ９のいくつかのバリアント（そのバリアントはＣａｓ９様という用語に包含される）は、ＤＮＡ切断活性が低下するように変更されている（一部の場合では標的ＤＮＡの両方の鎖の代わりに一本鎖を切断する一方、他の場合ではＤＮＡ切断活性がない状態までま重度に低下している）。ＤＮＡ切断活性が低下した（さらにはＤＮＡ切断活性を有さない）Ｃａｓ９様タンパク質は、それでもなお、標的ＤＮＡにガイドされ得、ＲＮＡポリメラーゼ活性を遮断し得る。したがって、標的ＤＮＡの転写を遮断するために、ＤＮＡを標的とするＲＮＡにより、酵素として不活性のＣａｓ９様タンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所に標的化することができる。ＣＲＩＳＰＲ剤に関する詳細な情報は、例えば、（ａ）Ｊｉｎｅｋ ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１２ Ａｕｇ． １７； ３３７ （６０９６）： ８１６－２１： ”Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”；（ｂ）Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ｆｅｂ． ２８； １５２ （５）： １１７３－８３： ”Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、ならびに（ｃ）米国特許出願第１３／８４２，８５９号およびＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３２５８９号において見いだすことができる；これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、「ＣＲＩＳＰＲ剤」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓ９に基づく系（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質；ＤＮＡを標的とするＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡなどの任意の構成成分；ドナーポリヌクレオチド；など）に使用することができる、天然に存在するおよび／または合成の配列を含む任意の作用剤（またはそのような作用剤をコードする核酸）を包含する。
（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）剤。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮを、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが独特の標的配列を切断することが可能になる。細胞に導入する場合、ＺＦＮを使用して、二本鎖切断を誘導することによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。ＺＦＮの使用に関するより多くの情報については、例えば、これらの全てがＺＦＮに関するそれらの教示について参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ； ２０ （２）： ３２９－３８；Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００３ Ｍａｙ ２； ３００ （５６２０）： ７６４；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１１ Ｊｕｌ． １５； ３３３ （６０４０）： ３０７；Ｏｃｈｉａｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ． ２０１０ Ａｕｇｕｓｔ； １５ （８）： ８７５－８５；Ｔａｋａｓｕ ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ； ４０ （１０）： ７５９－６５；Ｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ２００８ Ｓｕｍｍｅｒ； ５ （２）： １２１－３；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１１ Ａｐｒ． ２６； １０８ （１７）： ７０５２－７；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ． ２０１０ Ｍａｒ． ５； １４０ （５）： ６７８－９１；Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００９ Ｊｕｌ． ２４； ３２５ （５９３９）： ４３３；Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１； ６ （６）： ｅ２１０４５． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０４５． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ． １３；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１１ Ｊｕｌ． １９； １０８ （２９）： １２０１３－７；およびＹｕ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ； ２１ （１１）： １６３８－４０を参照されたい。「ＺＦＮ剤」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／またはポリヌクレオチドを包含する。
（ｖ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）剤。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、実際に任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができ、また、細胞に導入する場合、ＴＡＬＥＮを使用して、二本鎖切断を誘導することによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。ＴＡＬＥＮの使用に関するより多くの情報については、例えば、これらの全てがＴＡＬＥＮに関するそれらの教示について参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１ Ｊｕｌ． ７； ２９ （８）： ７３１－４；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１１ Ｊｕｌ． １５； ３３３ （６０４０）： ３０７；Ｔｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１ Ａｕｇ． ５； ２９ （８）： ６９５－６；およびＨｕａｎｇ ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１ Ａｕｇ． ５； ２９ （８）： ６９９－７００を参照されたい。「ＴＡＬＥＮ剤」という用語は、ＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を含むＴＡＬＥＮおよび／またはポリヌクレオチドを包含する。
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含めた、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、スピード、または特異性に影響を及ぼし得、また、本質的に増強性または阻害性であり得る。当技術分野で公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、通常プロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始させることが可能なＤＮＡ領域である。
「機能するように（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結」または「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結」とは、遺伝子エレメントが近位にあり、エレメントが、予測される様式で作動することが可能になる関係にあることを指す。例えば、プロモーターにより、コード配列の転写を開始することが補助される場合、プロモーターはコード領域に機能するように連結している。この機能的関係が維持される限りはプロモーターとコード領域の間に介在する残基があってもよい。
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を容易にするために、コード領域に機能するように連結した制御エレメントも含む。制御エレメントと、発現のためにそれらが作動可能に連結する遺伝子（単数または複数）の組合せは、時には「発現カセット」と称され、多数の発現カセットが公知であり、当技術分野において利用可能であるか、または当技術分野において利用可能な構成成分から容易に構築することができる。
「異種」とは、ある実体が、それが比較される実体の残りの部分とは遺伝子型の由来が別個であることを意味する。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子操作技法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブなコード配列から取り出され、天然には連結していることが見いだされないコード配列に機能するように連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
「２Ａペプチド」は、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子を生じさせる約２０アミノ酸の「自己切断性」ペプチドを指し、マルチシストロニックベクターにおいてＩＲＥＳエレメントの代わりに使用することができる。非限定的な例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド配列が挙げられる。
「遺伝子変更」および「遺伝子改変」という用語（およびその文法上の変形）は、本明細書では互換的に使用されて、遺伝子エレメント（例えば、ポリヌクレオチド）が細胞に有糸分裂または減数分裂による以外で導入されるプロセスを指す。エレメントは細胞に対して異種であってもよく、細胞にすでに存在するエレメントのさらなるコピーまたは改善されたバージョンであってもよい。遺伝子変更は、例えば、細胞に、組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドを、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿などの当技術分野で公知の任意のプロセスによってトランスフェクトすること、またはポリヌクレオチド－リポソーム複合体と接触させることによって生じさせることができる。遺伝子変更はまた、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターを形質導入するまたは感染させることによって生じさせることもできる。一般に、遺伝子エレメントが細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、細胞およびその後代の表現型および／または遺伝子型を変化させるあらゆる変更がこの用語に含まれる。
細胞は、外因性ＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、そのようなＤＮＡにより（例えば、組換えウイルスを介して）「遺伝子改変」または「形質転換」または「トランスフェクト」されている。外因性ＤＮＡが存在することにより、恒久的なまたは一過性の遺伝子変化が生じる。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノム内に組み込まれて（共有結合により連結されて）もよく、そうでなくてもよい。「クローン」は、単一細胞または共通祖先から有糸分裂によって引き出された細胞の集団である。「細胞株」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多くの世代にわたって安定に成長することが可能な、初代細胞のクローンである。
細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける長期培養の間、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて長期間、遺伝子配列がその機能を果たすために利用可能である場合、細胞は配列によって「安定に」変更、形質導入、遺伝子改変、または形質転換されたと言える。一般に、そのような細胞は、変更された細胞の後代によっても遺伝する遺伝子変更が導入されるという点で、「遺伝的に」変更（遺伝子改変）される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では、互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。用語は、改変；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識用構成成分とのコンジュゲーションがなされたアミノ酸ポリマーも包含する。抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのポリペプチドは、哺乳動物対象へ遺伝子産物を送達すること、およびそのための組成物に関して考察される場合、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、哺乳動物対象への遺伝子産物の送達における使用のための、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、および他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と称することができる）への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、物質または同様の物質が天然に存在するまたは最初に調製された場所に同じく存在し得る他の構成成分の少なくとも一部を欠く物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技法を使用して、その物質を供給源混合物から富化させることによって調製することができる。富化は、溶液の体積当たりの重量など、絶対的に測定することもでき、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質との関連で測定することもできる。本開示の実施形態に関して富化の増加は、単離のさらなる増加である。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、一部の実施形態では、例えば、約８０％～約９０％純粋まで、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、または少なくとも約９９％、またはそれよりも高度に純粋、に精製される。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的なもしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を網羅し、（ａ）疾患の素因があるまたは疾患が後天的に生じるリスクがあり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）が生じることを防止すること；（ｂ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を阻害する、すなわち、その発生を抑止すること；ならびに（ｃ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を軽減する、すなわち、疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）の退縮を引き起こすこと、が含まれる。
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、これだけに限定されないが、ヒト；サルを含めた非ヒト霊長類；哺乳動物競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物愛玩動物（イヌ、ネコなど）；および齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含めた哺乳動物を指す。
一部の実施形態では、個体は、以前に自然にＡＡＶに曝露しており、結果として抗ＡＡＶ抗体（すなわち、ＡＡＶ中和抗体）を有するヒトである。一部の実施形態では、個体は、以前にＡＡＶベクターを投与されており（結果として抗ＡＡＶ抗体を有し得る）、異なる状態に対する処置のためにまたは同じ状態に対するさらなる処置のためにベクターの再投与が必要なヒトである。例えば、肝臓、筋肉、および網膜－全てこのビヒクルに対する中和抗体による影響を受ける組織である－へのＡＡＶ遺伝子送達を伴う臨床試験における肯定的な結果に基づいて、そのような治療への適用／疾患標的が多く存在する。
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。有効量を１回または複数の投与で投与することができる。本開示の目的に関して、化合物（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）の有効量は、特定の病態（例えば、がん）（および／またはそれに付随する症状）を和らげる、好転させる、安定化させる、逆転させる、防止する、その増悪を緩徐化させるまたは遅延させるために十分な量である。したがって、感染性ｒＡＡＶビリオンの有効量は、個体の抗ＡＡＶ抗体の中和活性から回避すること、したがって、個体の標的細胞（複数可）に異種核酸を有効に送達することが可能な感染性ｒＡＡＶビリオンの量である。
本発明をさらに記載する前に、実施形態は当然変動し得るので本発明は記載されている特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的することを意図しないことも理解されるべきである。
値の範囲が提供されている場合、各間に入る値、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間、およびあらゆる他の明示されたまたはその明示された範囲の間に入る値が本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、より小さな範囲に個別に含まれ得、本発明内にも包含され、明示された範囲内のあらゆる具体的に除外される範囲に支配される。明示された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたはその両方を除く範囲も本発明に含まれる。
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験にも使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの（ａｎ）感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「その（ｔｈｅ）感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン」への言及は、１つまたは複数のそのようなビリオンおよび当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。特許請求の範囲は任意の必須ではない要素を除外するように起草されている場合があることにをさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または、「否定的」限定の使用の前提としての機能を果たすことが意図される。
明確にするために別々の実施形態に関して記載されている本発明のある特定の特色を、単一の実施形態において組合せで提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関して記載されている本発明の種々の特色を、別々にまたは任意の適切な部分的組合せで提供することもできる。本発明に関する実施形態の全ての組合せが具体的に本発明に包含され、あたかもありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。さらに、種々の実施形態の全ての部分的組合せおよびその要素も具体的に本発明に包含され、あたかもありとあらゆるそのような部分的組合せが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書におけるこれらは全て、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先立つ権限がないことの容認と解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は、個別に確認する必要がある場合がある実際の刊行物の日付と異なる場合がある。
本開示は、バリアントカプシドタンパク質と異種核酸とを含む感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、さらに、感染性ｒＡＡＶビリオンにヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加を付与するバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（および／またはバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸）を提供する。本開示は、さらに、感染性ｒＡＡＶビリオンおよび／または主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、さらに、上記のビリオン、カプシドタンパク質、核酸、および／または宿主細胞のライブラリーであって、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、ライブラリーを提供する。
本開示は、さらに、標的細胞に異種核酸を送達する方法であって、標的細胞を主題の感染性ｒＡＡＶビリオンと接触させる、方法を提供する。本開示は、さらに、個体に遺伝子産物を送達する方法であって、一般に、それを必要とする個体に、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを投与するステップを伴う、方法を提供する。主題の方法を実施するための組成物およびキットも本明細書で提供される。多くの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオン、主題の核酸、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質、主題の宿主細胞などが単離される。
バリアントＡＡＶカプシドポリペプチド
主題のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチド（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含む感染性ｒＡＡＶビリオンに、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される抵抗性と比較してヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加を付与する。一部の実施形態では、抵抗性の増加は、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される抵抗性よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）大きい。
主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、感染性ｒＡＡＶビリオンに、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳動物細胞に対する形質導入の増加を付与すると言うことができる。一部の実施形態では、形質導入の増加は、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）大きい。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を結合する中和抗体への結合の低減を示す。例えば、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型カプシドＡＡＶタンパク質を結合する中和抗体に対して、抗体の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対する結合親和性と比較して、少なくとも約１．５分の１（例えば、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約７．５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１２分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約１７分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約２５分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約７５分の１、少なくとも約１００分の１、少なくとも約１５０分の１、少なくとも約２００分の１、少なくとも約２５０分の１、少なくとも約３００分の１など）に低減した結合（例えば、親和性の低下）を示し得る。
一部の実施形態では、抗ＡＡＶ中和抗体は、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）に、約１０－７Ｍ未満、約５×１０－６Ｍ未満、約１０－６Ｍ未満、約５×１０－５Ｍ未満、約１０－５Ｍ未満、約１０－４Ｍ未満、またはそれよりも低い親和性で結合する。
「バリアントカプシドタンパク質」という用語は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を包含しない。「バリアントＡＡＶカプシドタンパク質」は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質に存在するアミノ酸配列を含まない。例えば、主題のバリアントカプシドタンパク質は、配列番号１～９に記載される配列のうちのいずれかに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含まない。言い換えれば、主題のバリアントカプシドタンパク質は、配列番号１～９のうちのいずれかに記載されるようなアミノ酸配列を含まない。バリアントカプシドタンパク質は、「スターター」または「親」ＡＡＶカプシドタンパク質とはアミノ酸配列が異なり得、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質または非野生型ＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３～７３６に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３～７３６に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３～７３６に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、およびＩ６９８Ｖを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、およびＩ６９８Ｖを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３～７３６に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｄ１８０Ｎ、Ｎ３１２Ｋ、Ｑ３８５Ｒ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＳ７２１Ｔを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｄ１８０Ｎ、Ｎ３１２Ｋ、Ｑ３８５Ｒ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＳ７２１Ｔを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３～７３６に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５０Ａ、Ｎ５５１Ｓ、およびＩ６９８Ｖを含む。
一部の実施形態では、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば、配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５０Ａ、Ｎ５５１Ｓ、およびＩ６９８Ｖを含む。
例示的なバリアントＡＡＶカプシドタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる（選択された例示的な配列アラインメントについては図８～１０を参照されたい）：
ＳＭ１０－２（アミノ酸配列）（配列番号１０）；ＳＭ１０－２（ヌクレオチド配列）（配列番号２２）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１（アミノ酸配列）（配列番号１１）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１（ヌクレオチド配列）（配列番号２３）；
Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３（アミノ酸配列）（配列番号１２）：
Figure 0007393565000012
Figure 0007393565000013
Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３（ヌクレオチド配列）（配列番号２４）：
Figure 0007393565000014
Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７（アミノ酸配列）（配列番号１３）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７（ヌクレオチド配列）（配列番号２５）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２（アミノ酸配列）（配列番号２６）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２（ヌクレオチド配列）（配列番号３４）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６（アミノ酸配列）（配列番号２７）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６（ヌクレオチド配列）（配列番号３５）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８（アミノ酸配列）（配列番号２８）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８（ヌクレオチド配列）（配列番号３６）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２（アミノ酸配列）（配列番号２９）；Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２（ヌクレオチド配列）（配列番号３７）；ＳＭ１０－１（アミノ酸配列）（配列番号３０）；ＳＭ１０－１（ヌクレオチド配列）（配列番号３８）；ＳＭ１０－８（アミノ酸配列）（配列番号３１）；ＳＭ１０－８（ヌクレオチド配列）（配列番号３９）；ＳＭ１００－３（アミノ酸配列）（配列番号３２）；ＳＭ１００－３（ヌクレオチド配列）（配列番号４０）；ＳＭ１００－１０（アミノ酸配列）（配列番号３３）；およびＳＭ１００－１０（ヌクレオチド配列）（配列番号４１）。
核酸および宿主細胞
本開示は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（上記の通り）、ならびに主題の核酸を含む宿主細胞を提供する。核酸および宿主細胞は、ｒＡＡＶビリオンを生成するために有用である（下記の通り）。
本開示は、主題の核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された宿主細胞を提供する。主題の宿主細胞は、「遺伝子改変された宿主細胞」と称することができ、一般には、単離された細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養下の細胞である。主題の宿主細胞は、下記の通り、主題のｒＡＡＶビリオンを産生させるために有用である。主題の宿主細胞は、主題のｒＡＡＶビリオンを産生させるために使用される場合、「パッケージング細胞」と称される。一部の実施形態では、主題の宿主細胞は、主題の核酸で安定に遺伝子改変される（すなわち、安定にトランスフェクトされる）。他の実施形態では、主題の宿主細胞は、主題の核酸で一過性に遺伝子改変される（すなわち、一過性にトランスフェクトされる）。
主題の核酸は、これだけに限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを含めた、確立された技法を使用して宿主細胞に安定にまたは一過性に導入される。安定な形質転換に関しては、主題の核酸は、一般には、選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性などのいくつかの周知の選択マーカーのうちのいずれかをさらに含む。
主題の宿主細胞は、種々の細胞、例えば、例えばマウス細胞および霊長類細胞（例えばヒト細胞）を含めた哺乳動物細胞のうちのいずれかに主題の核酸を導入することによって生成される。適切な哺乳動物細胞としては、これだけに限定されないが、初代細胞および細胞株が挙げられ、適切な細胞株としては、これだけに限定されないが、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。
一部の実施形態では、主題の宿主細胞は、変異体カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１種または複数のＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、主題の宿主細胞は、下記の通り、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。下により詳細に記載されている通り、ｒＡＡＶビリオンは、主題の宿主細胞を使用して生成される。
感染性ｒＡＡＶビリオン
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と異種核酸（下により詳細に記載されている）とを含み、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される抵抗性と比較してヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加を示す。「抵抗性の増加」とは、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンが、ヒト抗ＡＡＶ抗体の存在下での感染力の増加を示すことを意味する。上記の通り、ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表すことができる。したがって、感染力の増加とは、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比の増加を意味する。ＡＡＶのヒト抗ＡＡＶ抗体に対する抵抗性を決定するために、遺伝子送達効率（すなわち、感染力）を、ヒト抗ＡＡＶ抗体の非存在下での遺伝子送達効率（すなわち、感染力）の５０％まで低下させるために必要な抗体濃度（例えば、血清中濃度、ＩＶＩＧ濃度など）（ｍｇ／ｍＬ）を得るために種々の濃度のヒト抗ＡＡＶ抗体の存在下でＡＡＶの感染力を測定する。遺伝子送達効率をヒト抗ＡＡＶ抗体の非存在下での遺伝子送達効率の５０％まで低下させるために必要な抗体濃度がより高いウイルスは、抗体による中和に対する抵抗性が増加していると言える。したがって、抵抗性が２倍に増加しているということは、遺伝子送達効率をヒト抗ＡＡＶ抗体の非存在下での遺伝子送達効率の５０％まで低下させるために必要な抗体濃度が２倍に上昇することを意味する。一部の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、ヒトＡＡＶ中和抗体に対して、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される抵抗性よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）高い抵抗性を示す。
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で哺乳動物細胞に対する形質導入の増加を示すと言うことができる。一部の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）高い、哺乳動物細胞に対する形質導入を示す。
一部の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を結合する中和抗体への結合の低減を示す。例えば、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型カプシドＡＡＶタンパク質を結合する中和抗体に対して、抗体の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対する結合親和性と比較して、少なくとも約１．５分の１（例えば、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約７．５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１２分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約１７分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約２５分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約７５分の１、少なくとも約１００分の１、少なくとも約１５０分の１、少なくとも約２００分の１、少なくとも約２５０分の１、少なくとも約３００分の１など）の、結合の低下（例えば、親和性の低下）を示し得る。
一部の実施形態では、抗ＡＡＶ中和抗体は、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンに、約１０－７Ｍ未満、約５×１０－６Ｍ未満、約１０－６Ｍ未満、約５×１０－５Ｍ未満、約１０－５Ｍ未満、約１０－４Ｍ未満、またはそれよりも低い親和性で結合する。
一部の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶと比較してｉｎ ｖｉｖｏ滞留時間の増加を示す。例えば、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶの滞留時間よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれを超える倍数の、より長い滞留時間を示す。
所与の主題の感染性ｒＡＡＶビリオンが中和抗体への結合の低減および／または中和抗体に対する抵抗性の増加を示すかどうかは、当業者に公知の任意の慣習的なアッセイを使用して決定することができる。
一部の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０タンパク質を含む。他の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、１種または複数のバリアントカプシドタンパク質に加えて、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０タンパク質のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の変異を含む。
異種核酸
主題のｒＡＡＶベクター（例えば、主題の感染性ｒＡＡＶビリオン）における使用に適した異種ＤＮＡ分子（本明細書では「異種核酸」とも称される）は、任意の異種核酸であり得る。一部の実施形態では、異種核酸は、ポリペプチド（例えば、標的細胞にいくつかの所望の特徴を付与するタンパク質、例えば、細胞の追跡を可能にする蛍光タンパク質、標的細胞において欠如しているまたは変更された活性をもたらす酵素など）をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸は、ＲＮＡ干渉剤を含む（上で定義されている）。
主題の異種核酸は、一般に、サイズが約５キロベース（ｋｂ）未満であり、例えば、レシピエント個体もしくは標的細胞では欠損もしくは欠如しているタンパク質をコードする遺伝子（ヌクレオチド配列）；所望の生物学的もしくは治療効果（例えば、抗細菌、抗ウイルスもしくは抗腫瘍／抗がん）を有するタンパク質をコードする遺伝子；有害なもしくは他の点で望ましくないタンパク質の産生を阻害するもしくは減少させるＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、上で定義されているＲＮＡ干渉剤をコードするヌクレオチド配列）；および／または抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列、が挙げられる。
適切な異種核酸としては、これだけに限定されないが、例えば、炎症性疾患、自己免疫性、慢性および感染性疾患、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）；がん、高コレステロール血症、リソソーム蓄積症、例えば、活性化因子欠乏症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児型遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害（偽性ハーラー・ポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｄ、モルキオＡ型／ＭＰＳ ＩＶＡ、モルキオＢ型／ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＩＸヒアルロニダーゼ欠乏症、ＭＰＳ ＶＩマロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、およびムコリピドーシスＩＶ型を含む）、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／糖原病ＩＩ型、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症型／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／乳児型ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／若年型ＧＭ２ガングリオシドーシス、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、およびウォルマン病、インスリン障害、例えば、糖尿病；成長障害；種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含めた種々の血液障害；遺伝子欠陥、例えば、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症、気腫などの障害を含めた、内分泌、代謝、血液、心血管、神経、筋骨格、泌尿器、肺および免疫障害の処置のために使用されるタンパク質をコードするものが挙げられる。
適切な異種核酸としては、これだけに限定されないが、以下を含めた種々のタンパク質のうちのいずれかをコードするものが挙げられるが、これだけに限定されない：インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω；ＩＦＮ－τ）；インスリン（例えば、ノボリン、ヒューマリン、ヒューマログ、ランタス、ウルトラレンテなど）；エリスロポエチン（「ＥＰＯ」；例えば、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）、またはＥｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチン－α）；Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン－α）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）、Ｅｐｏｇｉｎ（登録商標）（エポエチン－β）；など）；モノクローナル抗体の抗原結合断片（例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ））を含めた、抗体（例えば、モノクローナル抗体）（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍｉｒａ（商標）（アダリムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（エファリズマブ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）；Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）；など）；血液因子（例えば、Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）組織プラスミノーゲン活性化因子；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（組換えヒト第ＶＩＩａ因子）；第ＶＩＩａ因子；第ＶＩＩＩ因子（例えば、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標））；第ＩＸ因子；β－グロビン；ヘモグロビン；など）；コロニー刺激因子（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム；Ｇ－ＣＳＦ）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－単球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、巨核球コロニー刺激因子；など）；成長ホルモン（例えば、ソマトトロピン、例えば、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｓａｉｚｅｎ（登録商標）、Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）など；ヒト成長ホルモン；など）；インターロイキン（例えば、ＩＬ－１；例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を含めたＩＬ－２；ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９；など）；成長因子（例えば、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）（ベクラペルミン；ＰＤＧＦ）；Ｆｉｂｌａｓｔ（登録商標）（トラフェルミン；ｂＦＧＦ）；Ｓｔｅｍｇｅｎ（登録商標）（アンセスチム；幹細胞因子）；ケラチノサイト成長因子；酸性線維芽細胞成長因子、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子；など）；可溶性受容体（例えば、ＴＮＦ－αに結合する可溶性受容体、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；可溶性ＶＥＧＦ受容体；可溶性インターロイキン受容体；可溶性γ／δ Ｔ細胞受容体；など）；酵素（例えば、α－グルコシダーゼ；Ｃｅｒａｚｙｍｅ（登録商標）（イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃａｒａｓｅ）；β－グルコセレブロシダーゼ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ（登録商標）（アルグルセラーゼ；）；酵素活性化因子（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子）；ケモカイン（例えば、ＩＰ－１０；Ｍｉｇ；Ｇｒｏα／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ；ＭＩＰ－１α；ＭＩＰ－１β；ＭＣＰ－１；ＰＦ－４；など）；血管新生剤（例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；抗血管新生剤（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体）；タンパク質ワクチン；神経刺激性ペプチド、例えば、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン（ｇａｓｔｉｎ）、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ベータ－エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン－放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン－放出ホルモン、血管作動性腸ペプチド、睡眠ペプチドなど；他のタンパク質、例えば、血栓溶解剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド、骨形成タンパク質、トロンボポエチン、レラキシン、グリア線維酸性タンパク質、卵胞刺激ホルモン、ヒトアルファ－１抗トリプシン、白血病抑制因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、黄体形成ホルモン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子、好中球走化性因子、神経成長因子 組織メタロプロテイナーゼ阻害物質；血管作動性腸ペプチド、アンジオゲニン、アンジオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）、フィブリン；ヒルジン；白血病抑制因子；ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（例えば、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ））；イオンチャネル、例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）；ジストロフィン；ユートロフィン、腫瘍抑制因子；リソソーム酵素酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）；など。適切な核酸には、上述のタンパク質のうちのいずれかの機能性断片をコードするもの；および上述のタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントをコードする核酸も含まれる。
適切な異種核酸としては、抗原タンパク質をコードするものも挙げられる。抗原タンパク質をコードする異種核酸を含む主題のｒＡＡＶベクターは、哺乳動物宿主における抗原タンパク質に対する免疫応答を刺激するのに適する。抗原タンパク質は、自己抗原、アレルゲン、腫瘍／がん関連抗原、病原性ウイルス、病原性細菌、病原性原生動物、病原性蠕虫、または哺乳動物宿主に感染する任意の他の病原性生物体に由来する。本明細書で使用される場合、「に由来する抗原タンパク質をコードする核酸」という用語は、野生型抗原タンパク質をコードする核酸、例えば、ウイルスタンパク質をコードする、病原性ウイルスから単離された核酸；天然に存在する抗原タンパク質とアミノ酸配列が同一である抗原タンパク質をコードする、実験室で生成された合成核酸；天然に存在する抗原タンパク質とアミノ酸配列（例えば、１アミノ酸～約１５アミノ酸だけ）が異なるが、それにもかかわらず、対応する天然に存在する抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導する抗原タンパク質をコードする、実験室で生成された合成核酸；対応する天然に存在する抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導する、抗原タンパク質の断片（例えば、約５アミノ酸～約５０アミノ酸の断片、その断片は１つまたは複数の抗原エピトープを含む）をコードする、実験室で生成された合成核酸；などを含む。
同様に、自己抗原、アレルゲン、腫瘍／がん関連抗原、病原性ウイルス、病原性細菌、病原性原生動物、病原性蠕虫、または哺乳動物宿主に感染する任意の他の病原性生物体「に由来する」抗原タンパク質は、天然に存在する抗原タンパク質とアミノ酸配列が同一であるタンパク質、および天然に存在する抗原タンパク質とアミノ酸配列（例えば、１アミノ酸～約１５アミノ酸だけ）が異なるが、それにもかかわらず、対応する天然に存在する抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導するタンパク質；ならびに、対応する天然に存在する抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導する、抗原タンパク質の断片（例えば、約５アミノ酸～約１００アミノ酸、例えば、約５～約５０アミノ酸の断片、その断片は１つまたは複数の抗原エピトープを含む）を含む。
一部の実施形態では、主題のｒＡＡＶベクターによってコードされる抗原タンパク質に対する免疫応答により、哺乳動物宿主における、抗原タンパク質または抗原エピトープ（またはｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質または抗原エピトープと交差反応性であるタンパク質またはエピトープ）を示す病原性生物体に対する防御免疫応答が刺激される。一部の実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導される。他の実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対する体液性応答が誘導され、したがって、抗原タンパク質に特異的な抗体が生成される。多くの実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対するＴＨ１免疫応答が誘導される。適切な抗原タンパク質としては、腫瘍／がん関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、および原生動物抗原；ならびにこれらの抗原断片が挙げられる。一部の実施形態では、抗原タンパク質は、細胞内病原体に由来する。他の実施形態では、抗原タンパク質は自己抗原である。さらに他の実施形態では、抗原タンパク質はアレルゲンである。
腫瘍／がん特異的抗原としては、これだけに限定されないが、ＭＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４などを含めた種々のＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか；種々のチロシナーゼのうちのいずれか；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４１５６およびＡＡ４９４３１１）；およびｐ９７黒色腫抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２１５４）が挙げられる。他の腫瘍／がん特異的抗原としては、進行がんに関連するＲａｓペプチドおよびｐ５３ペプチド、子宮頸がんに関連するＨＰＶ１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原、乳癌に関連するＭＵＣＩ１－ＫＬＨ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３６５１）、結腸直腸がんに関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８３１１）、ｇｐ１００（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３）または黒色腫に関連するＭＡＲＴ１抗原、ならびに前立腺がんに関連するＰＳＡ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８１０）が挙げられる。ｐ５３遺伝子配列は公知であり（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６：４６５０－４６５６を参照されたい）、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｍ１４６９４の下で寄託されている。したがって、主題のタンパク質、核酸、および／またはビリオンを、これだけに限定されないが、子宮頸がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がんを含めたがんに対する、および黒色腫に対する免疫療法薬として使用することができる。
ウイルス抗原は、これだけに限定されないが、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、灰白髄炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０２７０７）、およびＣ型肝炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０６８９０）、ならびに他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス（例えば、４型および７型）、狂犬病（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３４６７８）、黄熱病、日本脳炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０７８８３）、デング（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１８５５２）を含めた疾患の原因である公知の病原体に由来する。
適切な細菌抗原および寄生虫抗原としては、これだけに限定されないが、ジフテリア、百日咳（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５２７４）、破傷風（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６４３５３）、結核、細菌性および真菌性肺炎（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉなど）、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０３８３３）、レジオネラ症、ライム病（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５９４８７）、マラリア（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５３８３２）、鉤虫、オンコセルカ症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３２６６）、ボレリア症、および旋毛虫症を含めた疾患の原因である公知の病原体に由来するものが挙げられる。
異種遺伝子産物をコードする適切な異種核酸としては、非翻訳ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ剤（上により詳細に記載されている）（例えば、アンチセンスＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；ＣＲＩＳＰＲ剤、例えば、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ９様タンパク質、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ、および／またはドナーポリヌクレオチド；など）、リボザイムなどが挙げられる。ＲＮＡｉ剤を使用して、遺伝子発現を阻害することができる。一部のＲＮＡｉ剤では、後に遺伝子発現を阻害するために使用することができるツールがもたらされる（例えば、ｃａｓ９またはｃａｓ９様タンパク質などのＣＲＩＳＰＲ剤）。
標的遺伝子としては、有害な（例えば、病的な）標的遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）、例えば、機能不良である（例えば、コードされるタンパク質配列における変異に起因して、遺伝子産物の定常状態のレベルを制御する非コード配列における変異に起因して、など）標的遺伝子産物をコードする任意の遺伝子が挙げられる。標的遺伝子産物としては、これだけに限定されないが、ハンチンチン；Ｃ型肝炎ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス；アミロイド前駆体タンパク質；ｔａｕ；ポリグルタミンリピートを含むタンパク質；ヘルペスウイルス（例えば、水痘帯状疱疹）；任意の病的ウイルス；などが挙げられる。
したがって、ＲＮＡｉ剤をコードする異種核酸を含む主題のｒＡＡＶは、これだけに限定されないが、神経変性疾患、例えば、トリヌクレオチドリピート病、例えば、ポリグルタミンリピートに関連する疾患、例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）など；後天性病変（例えば、異常な生理的、生化学的、細胞、構造的、または分子生物学的状態によって顕在化する疾患または症候群）、例えば、ウイルス感染症、例えば、ＨＣＶ感染の結果として生じるまたは生じる可能性がある肝炎、ＨＩＶ感染の結果として生じる後天性免疫不全症候群；がん；などを含めた種々の障害および状態を処置するために有用である。
多くの実施形態では、ＲＮＡｉ剤をコードする異種核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。適切なプロモーターは当業者には公知であり、それらとして、任意のタンパク質をコードする遺伝子、例えば、内因性に調節される遺伝子または構成的に発現される遺伝子のプロモーターが挙げられる。例えば、細胞の生理的事象、例えば、熱ショック、例えば低酸素状態における酸素レベルおよび／または一酸化炭素レベルによって調節される遺伝子のプロモーターをｓｉＲＮＡコード核酸に作動可能に連結することができる。
ＥＰＯをコードするものまたは目的の核酸などの選択された異種ヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヌクレオチド配列の転写またはその発現を指示する制御エレメントに作動可能に連結される。そのような制御エレメントは、選択された遺伝子に通常付随する制御配列（例えば、内因性細胞制御エレメント）を含み得る。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列としては、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが挙げられる。例としては、これだけに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、目的の遺伝子に対して異種である内因性細胞プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本明細書で使用される。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
一部の実施形態では、細胞型特異的または組織特異的プロモーターが、異種遺伝子産物をコードする異種核酸に作動可能に連結され、したがって、遺伝子産物が特定の細胞型（複数可）または組織（複数可）において選択的にまたは優先的に産生される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターが異種核酸に作動可能に連結される。
例えば、遺伝子産物の筋肉細胞への送達には、筋肉特異的かつ誘導性プロモーター、エンハンサーなどが有用である。そのような制御エレメントとしては、これだけに限定されないが、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリーに由来する、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの；筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２；ヒト骨格アクチン遺伝子および心臓アクチン遺伝子に由来する制御エレメント；筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメントおよびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント；骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント；低酸素誘導性核因子；グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）などのステロイド誘導性エレメントおよびプロモーター；ＲＵ４８６誘導のための融合コンセンサスエレメント；ならびにテトラサイクリンにより調節される遺伝子発現をもたらすエレメントが挙げられる。
主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が切り取られたＡＡＶゲノムに、選択された配列（複数可）を直接挿入することにより、ＡＡＶ ＩＴＲが結合した目的のＤＮＡ分子（異種ＤＮＡ）を有するＡＡＶ発現ベクターを構築することができる。複製およびパッケージング機能を可能にするために十分なＩＴＲの部分が残っている限りは、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失させることができる。そのような構築物は、当技術分野で周知の技法を使用して設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第ＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７－１２９；Ｋｏｔｉｎ， Ｒ． Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５－１６９；ならびにＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７－１８７５を参照されたい。
あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲをウイルスゲノムからまたはウイルスゲノムを含有するＡＡＶベクターから切り取り、別のベクター内に存在する選択された核酸構築物の５’および３’に当業者に公知の任意の慣習的な方法を使用して融合することができる。例えば、１つの適切な手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記に記載されているものなどの標準のライゲーション技法を使用する。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ～５０ｍＭのＮａＣｌ、および４０μＭのＡＴＰ、０．０１～０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ中、０℃～１６℃で（「粘着末端」ライゲーションについて）、または１ｍＭのＡＴＰ、０．３～０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ中、１４℃で（「平滑末端」ライゲーションについて）のいずれかで達成することができる。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、３０～１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（総最終濃度５～１００ｎＭ）で実施される。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６の下で入手可能ないくつかのＡＡＶベクターがそこに記載されている。
さらに、キメラ遺伝子を、１つまたは複数の選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように、合成的に産生させることができる。哺乳動物筋肉細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のために好ましいコドンを使用することができる。完全なキメラ配列は、標準の方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。例えば、Ｅｄｇｅ， Ｎａｔｕｒｅ （１９８１） ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２２３：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８４） ２５９：６３１１を参照されたい。
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンの生成
前置きとして、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングのために宿主または「産生」細胞を用いることが典型的である。そのような産生細胞（通常は哺乳動物宿主細胞）は、一般に、ｒＡＡＶ産生のためのいくつかの異なる型の構成成分を含むまたはそれを含むように改変される。第１の構成成分は、宿主パッケージング細胞により複製され、ベクター粒子内にパッケージングされ得る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノム（または「ｒＡＡＶプロベクター」）である。ｒＡＡＶプロベクターは、通常、遺伝子治療に関しては、それにより別の細胞が遺伝学的に変更されることが望ましい異種ポリヌクレオチド（または「導入遺伝子」）を含む（そのような導入遺伝子のｒＡＡＶベクター粒子内へのパッケージングを有効に使用して、導入遺伝子を種々の哺乳動物細胞に送達することができるためである）。導入遺伝子は、一般に、ＡＡＶベクターの切り取り、複製およびパッケージングの間、ならびにベクターの宿主細胞のゲノムへの組込みの間に認識される配列を含む２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれている。
第２の構成成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパー機能をもたらし得るヘルパーウイルスである。アデノウイルスが一般に用いられるが、当技術分野で公知の通り、他のヘルパーウイルスを使用することもできる。あるいは、必要なヘルパーウイルス機能をヘルパーウイルスから遺伝学的に単離することができ、コード遺伝子を使用して、ヘルパーウイルス機能をトランスにもたらすことができる。ＡＡＶベクターエレメントとヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）を宿主細胞に同時に、または任意の順序で逐次的に導入することができる。
産生細胞でもたらされるＡＡＶ産生のための最終的な構成成分は、それぞれ複製タンパク質およびカプシド形成タンパク質をもたらすＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子などの「ＡＡＶパッケージング遺伝子」である。いくつかの異なるバージョンのＡＡＶパッケージング遺伝子を提供することができる（ｒｅｐ－ｃａｐカセット、ならびに別々のｒｅｐおよび／またはｃａｐカセットを含み、ここで、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をネイティブなプロモーターの制御下に残すことも、異種プロモーターに作動可能に連結することもできる。当技術分野で公知であり、下でより詳細に記載されている通り、そのようなＡＡＶパッケージング遺伝子を宿主パッケージング細胞に一過性にまたは安定に導入することができる。
１．ｒＡＡＶベクター
目的の異種ＤＮＡ（「目的の異種ＤＮＡ」は、本明細書では「異種核酸」とも称される）を含む主題のｒＡＡＶビリオンを、当業者に公知の標準の方法体系を使用して産生させることができる。方法は、一般に、（１）主題のｒＡＡＶベクターを宿主細胞に導入するステップ；（２）ＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞に導入するステップであって、ヘルパー構築物が、宿主細胞において発現されて、ＡＡＶベクターから失われたＡＡＶヘルパー機能を補完することが可能なＡＡＶコード領域を含む、ステップ；（３）１種または複数のヘルパーウイルスおよび／またはアクセサリー機能ベクターを宿主細胞に導入するステップであって、ヘルパーウイルスおよび／またはアクセサリー機能ベクターにより、宿主細胞において効率的な組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ビリオン産生を支持することが可能なアクセサリー機能がもたらされる、ステップ；ならびに（４）宿主細胞を培養して、ｒＡＡＶビリオンを産生させるステップを伴う。ＡＡＶ発現ベクター、ＡＡＶヘルパー構築物およびヘルパーウイルスまたはアクセサリー機能ベクター（複数可）を宿主細胞に標準のトランスフェクション技法を使用して同時に、または連続的に導入することができる。
ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも、転写方向に機能するように連結した構成成分、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域として提供されるように、公知の技法を使用して構築される。制御エレメントは、哺乳動物筋肉細胞において機能的であるように選択される。機能するように連結した構成成分を含有する得られた構築物は機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。ＡＡＶ－２配列については、例えば、Ｋｏｔｉｎ， Ｒ． Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１； Ｂｅｒｎｓ， Ｋ． Ｉ． ”Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， ｅｄｓ．）を参照されたい。本発明のベクターに使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されていてよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、これだけに限定することなく、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７などを含めたいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図された通り機能する、すなわち、宿主細胞のゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り取りおよびレスキューを可能にする、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組込みを可能にする限りは、必ずしも同一である必要も、同じＡＡＶ血清型もしくは分離株に由来する必要もない。ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質の適当な混合物の存在下でのベクター配列の複製を可能にする。ＩＴＲはまた、カプシドにベクター配列を組み入れてＡＡＶ粒子を生成することも可能にする。
ｒＡＡＶビリオンを産生させるために、ＡＡＶ発現ベクターは適切な宿主細胞にトランスフェクションによるものなどの公知の技法を使用して導入される。いくつかのトランスフェクション技法が一般に当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。特に適切なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈澱（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌ． ５２：４５６－４６７）、培養細胞への直接微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ． Ｒ． （１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：４７９－４８８）、電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２－７５１）、リポソーム媒介性遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０）、脂質媒介性形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１７）、および高速微小発射体を使用した核酸送達（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０－７３）が挙げられる。
本開示の目的に関しては、ｒＡＡＶビリオンを産生させるために適した宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができるまたは使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。用語は、トランスフェクトされた元の細胞の後代を含む。したがって、ｒＡＡＶビリオンを産生させるための「宿主細胞」とは、一般に、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す。安定なヒト細胞株、２９３（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを通じて受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３の下で容易に入手可能）由来の細胞が多くの実施形態で使用される。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されており（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９）、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４：４６０）、ヒト胎児腎臓細胞株である。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを産生させるための特に使いやすいプラットフォームをもたらす。
２．ＡＡＶヘルパー機能
上記のＡＡＶ発現ベクターを含有する宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに挟まれたヌクレオチド配列を複製およびカプシド形成させてｒＡＡＶビリオンを産生させるために、ＡＡＶヘルパー機能をもたらすことが可能になっていなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、発現して、今度は生産的ＡＡＶ複製のためにトランスに機能するＡＡＶ遺伝子産物をもたらすことができる、ＡＡＶ由来のコード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶ発現ベクターから失われた必要なＡＡＶ機能を補完するために使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶ ＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域、またはそれらの機能的なホモログの一方または両方を含む。本開示に関しては、ｃａｐ機能は、１つまたは複数の変異体カプシドタンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのカプシドタンパク質は上記の少なくとも１つの変異を含む。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、当技術分野で理解される、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションを含めた多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するためにまとめて必要とされる。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ， Ｒ． Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１を参照されたい。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切なホモログとしては、ＡＡＶ－２ ＤＮＡ複製を媒介することも分かっているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：３０４－３１１）。
ＡＡＶ ｃａｐタンパク質には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が含まれ、ここで、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のうちの少なくとも１つは、上記の少なくとも１つの変異を含む。
宿主細胞に、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前にまたはそれと併せてＡＡＶヘルパー構築物をトランスフェクトすることにより、ＡＡＶヘルパー機能は宿主細胞に導入される。したがって、生産的ＡＡＶ感染のために必要な、失われたＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶヘルパー構築物を使用して、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現をもたらす。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自体で複製することもパッケージされることもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であってよい。一般に使用される、ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードするプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの、いくつかのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２－３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２９３６－２９４５を参照されたい。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードするいくつかの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。
ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方を、１種または複数の必要に応じた選択マーカーを含有するように構築することができる。適切なマーカーとしては、選択マーカーを含有する核酸構築物をトランスフェクトされた細胞に、細胞を適当な選択培地中で成長させた場合に、抗生物質耐性もしくは感受性を付与する、色を付ける、または抗原性特徴を変化させる、遺伝子が挙げられる。本開示の方法を実施するのに有用ないくつかの選択マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシンに対する耐性を付与することによって哺乳動物細胞における選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）；Ｇ４１８に対する耐性を付与することによって哺乳動物細胞における選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）；などが挙げられる。他の適切なマーカーは当業者に公知である。
３．ＡＡＶアクセサリー機能
宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを産生させるために、ＡＡＶに由来しない機能、または「アクセサリー機能」をもたらすこともできるようにする必要がある。アクセサリー機能は、ＡＡＶが複製のために依存する、ＡＡＶに由来しないウイルスおよび／または細胞機能である。したがって、アクセサリー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与するものを含めた、ＡＡＶ複製に必要な非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡが少なくとも含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来してもよい。
特に、当業者に公知の方法を使用してアクセサリー機能を宿主細胞に導入し、次いで、発現させることができる。一般に、アクセサリー機能は、宿主細胞の無関係のヘルパーウイルスによる感染によってもたらされる。アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１型および２型などのヘルペスウイルス；ならびにワクシニアウイルスを含めたいくつかの適切なヘルパーウイルスが公知である。種々の公知の作用剤のいずれかを使用して細胞同期化によってもたらされるものなどの非ウイルスアクセサリー機能も本明細書で使用される。例えば、Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４０：２４１－２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：２１７－２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：１１０－１１７を参照されたい。
あるいは、アクセサリー機能ベクターを使用してアクセサリー機能をもたらすことができる。アクセサリー機能ベクターは、１種または複数のアクセサリー機能をもたらすヌクレオチド配列を含む。アクセサリー機能ベクターは、宿主細胞における効率的なＡＡＶビリオン産生を支持するために適切な宿主細胞に導入することが可能である。アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたは別のウイルスの形態であってよい。アクセサリーベクターはまた、１つまたは複数の直線化されたＤＮＡまたはＲＮＡ断片の形態であってもよく、これは、適当な制御エレメントおよび酵素と会合している場合、宿主細胞において転写または発現されてアクセサリー機能をもたらすことができる。
アクセサリー機能をもたらす核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムからなどの天然の供給源から得ることも、当技術分野で公知の組換えまたは合成方法を使用して構築することもできる。この点について、アデノウイルス由来アクセサリー機能は広範に研究されており、アクセサリー機能に関与するいくつかのアデノウイルス遺伝子が同定されており、部分的に特徴付けられている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． （１９９０） ”Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”， ｉｎ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ， ｖｏｌ． Ｉ （Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ， ｅｄ．）、およびＭｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． １５８：９７－１２９を参照されたい。具体的には、初期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ４、ＶＡＩ ＲＮＡ、および、おそらくＥ１ｂがアクセサリープロセスに関与すると考えられている。Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１９２５－１９２９。ヘルペスウイルス由来アクセサリー機能が記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｇ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ２５：１１３を参照されたい。ワクシニアウイルス由来アクセサリー機能も記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． （１９９０）上記、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：１１０－１１７を参照されたい。
宿主細胞へのヘルパーウイルスの感染、または宿主細胞へのアクセサリー機能ベクターのトランスフェクションの結果として、アクセサリー機能が発現され、それによってＡＡＶヘルパー構築物がトランス活性化されて、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質が産生される。Ｒｅｐ発現産物により、組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡ、例えば、異種核酸が含まれる）がＡＡＶ発現ベクターから切り取られる。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを複製する機能を果たす。発現されたＣａｐタンパク質はカプシドにアセンブルされ、組換えＡＡＶゲノムがカプシド内にパッケージングされる。したがって、生産的ＡＡＶ複製が結果として起こり、ＤＮＡがｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされる。
組換えＡＡＶ複製後、ＣｓＣｌ勾配、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどの種々の従来の精製方法を使用して宿主細胞からｒＡＡＶビリオンを精製することができる。さらに、アクセサリー機能を発現させるために感染が用いられる場合、残留するヘルパーウイルスを公知の方法を使用して不活化することができる。例えば、アデノウイルスは、およそ６０℃の温度に、例えば、２０分またはそれよりも長く加熱することによって不活化することができる。ＡＡＶは非常に熱安定性が高い一方、ヘルパーアデノウイルスは熱に不安定であるので、この処理によりヘルパーウイルスのみが有効に不活化される。
得られたｒＡＡＶビリオンは、その時点で、遺伝子治療への適用におけるなどのＤＮＡ送達のため、または哺乳動物宿主への遺伝子産物の送達のために使用する準備が整っている。
異種核酸の送達
本開示は、さらに、標的細胞および／またはそれを必要とする個体に異種核酸を送達する方法を提供する。一部の実施形態では、それを必要とする個体は、以前に自然にＡＡＶに曝露しており、結果として抗ＡＡＶ抗体（すなわち、ＡＡＶ中和抗体）を有するヒトである。例えば、肝臓、筋肉、および網膜－全てこのビヒクルに対する中和抗体による影響を受ける組織である－へのＡＡＶ遺伝子送達を伴う臨床試験における肯定的な結果に基づいて、そのような治療への適用／疾患標的が多く存在する。
主題の方法は、一般に、（ｉ）個体に有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを投与するステップ、および／または（ｉｉ）標的細胞を主題のビリオンと接触させるステップを伴う。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、ｉｎ ｖｉｖｏ（「直接的」）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（「間接的」）形質導入技法のいずれかを使用して対象に投与される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで（「間接的に」）形質導入する場合、所望のレシピエント細胞（すなわち、「標的細胞」）を個体から取り出し、ｒＡＡＶビリオンを用いて形質導入し、個体に再導入することができる。あるいは、同系または異種細胞を、これらの細胞により個体において不適切な免疫応答が生じないのであれば、これらを使用することができる。
形質導入された標的細胞の個体への送達および導入のための適切な方法は記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンを細胞と、例えば、適当な培地中で組み合わせ、目的のＤＮＡを有する細胞をサザンブロットおよび／もしくはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、または選択マーカーを使用することによってスクリーニングすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞に形質導入することができる。次いで、形質導入された細胞を下でより詳細に記載されている通り医薬組成物に製剤化し、組成物を、対象に、例えば筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射によって、種々の技法によって導入することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、「直接的」）送達に関しては、ｒＡＡＶビリオンを医薬組成物に製剤化し、一般に、非経口的投与経路によって投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内、静脈内などを介して投与する）。
医薬組成物は、治療有効量の、すなわち、問題の病態の症状を低減もしくは好転させるために十分な量の、または所望の利益を付与するために十分な量の目的の遺伝子発現産物を産生させるために十分な遺伝子材料を含む。医薬組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤も含有する。そのような賦形剤には、それ自体では組成物を受け取る個体に対して有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤は、これだけに限定されないが、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含む。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、薬学的に許容される賦形剤に含めることができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質もそのようなビヒクル中に存在してよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で公知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ （２０００） ”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”， ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９９９） Ｈ． Ｃ． Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ７ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ （２０００） Ａ． Ｈ． Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ３ｒｄ ｅｄ． Ａｍｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含めた種々の刊行物に十分に記載されている。
適当な用量は、他の因子の中でも、処置される哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、処置される対象の年齢および全身状態、処置される状態の重症度、問題の特定の治療用タンパク質、その投与形態に依存する。適当な有効量は当業者が容易に決定することができる。
したがって、「治療有効量」は、臨床試験を通じて決定することができる比較的広範な範囲内に入る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ注射、すなわち、骨格筋または心筋への直接注射に関しては、治療有効用量は、およそ約１０６～約１０１５のｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０８～１０１２ほどのｒＡＡＶビリオンである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入に関しては、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、およそ約１０８～約１０１３ほどのｒＡＡＶビリオンである。他の効果的な投与量は、当業者が、用量応答曲線を確立する常套的な試験によって容易に確立することができる。
投与処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。さらに、必要に応じた多くの用量を対象に投与することができる。当業者は適当な投与回数を容易に決定することができる。
目的の細胞（すなわち、「標的細胞」）は、一般には哺乳動物であり、その場合、用語は、ヒト、飼育動物および農場動物、ならびに動物園の動物、実験動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。一部の実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。
目的の標的細胞には、主題のｒＡＡＶビリオンが感染しやすい任意の細胞が含まれる。一部の場合では、例えば、方法が、標的細胞に異種核酸を送達する方法である場合、標的細胞は、個体から取り出された細胞（例えば、「初代」細胞）であってもよく、標的細胞は、組織培養細胞（例えば、樹立細胞株由来）であってもよい。
例示的な標的細胞としては、これだけに限定されないが、肝細胞、膵臓細胞（例えば、膵島細胞：アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞、および／またはイプシロン細胞）、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、造血前駆細胞、神経前駆細胞、内皮細胞、およびがん細胞が挙げられる。例示的な幹細胞標的細胞としては、これだけに限定されないが、造血幹細胞、神経幹細胞、神経堤幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋肉幹細胞、および網膜幹細胞が挙げられる。
「幹細胞」という用語は、本明細書では、自己再生する能力および分化した後代を生成する能力の両方を有する哺乳動物細胞を指すために使用される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ８８：２８７－２９８を参照されたい）。一般に、幹細胞は、以下の特性のうちの１つまたは複数も有する：分裂後の２つの娘細胞が異なる表現型を有し得る、非同期または対称複製を受ける能力；広範囲にわたる自己再生能；有糸分裂的に静止した形態での存在のための能力；およびそれらが存在する全ての組織のクローン再生、例えば、造血幹細胞の、全ての造血の系列を再構成する能力。当業者には理解される通り、「前駆細胞」は、一般には広範囲にわたる自己再生能を有さず、多くの場合に、それらが由来する組織の系列のより制限されたサブセット、例えば、造血状況ではリンパ系または赤血球系列のみを生じ得るという点で、幹細胞とは異なる。本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、上で定義されている「幹細胞」と「前駆細胞」の両方を包含する。
幹細胞は、抗体によって同定される特定のエピトープに関連するマーカーの存在と、特異的抗体との結合の欠如によって同定されるある特定のマーカーの非存在の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における機能アッセイ、特に、幹細胞の、多数の分化した後代を生じさせる能力に関するアッセイによって同定することもできる。
目的の適切な幹細胞としては、これだけに限定されないが、造血幹細胞およびそれに由来する前駆細胞（米国特許第５，０６１，６２０号）；神経堤幹細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９６：７３７－７４９を参照されたい）；神経幹細胞および神経前駆細胞；胚性幹細胞；間葉系幹細胞；中胚葉系幹細胞；肝幹細胞、筋肉幹細胞、網膜幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。他の目的の造血「前駆」細胞としては、リンパ系列に特化する細胞、例えば、未成熟Ｔ細胞およびＢ細胞集団が挙げられる。
精製された幹細胞または前駆細胞の集団を使用することができる。例えば、ヒト造血幹細胞を、ＣＤ３４、ｔｈｙ－１に特異的な抗体を使用して正に選択することも、グリコホリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ２４、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３６、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６６ａ、およびＣＤ６６ｂ；Ｔ細胞特異的マーカー、腫瘍／がん特異的マーカーなどを含み得る、系列特異的マーカーを使用して負に選択することもできる。中胚葉系幹細胞の分離に有用なマーカーとしては、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｔｈｙ－１、ＣＤ４４、ＶＬＡ－４ａ、ＬＦＡ－１１３、ＨＳＡ、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ４５、Ａａ４．１、Ｓｃａ－１などが挙げられる。神経堤幹細胞は、親和性の低い神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）に対する特異的な抗体を用いて正に選択し、マーカーであるスルファチド、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ミエリンタンパク質Ｐｏ、ペルフェリンおよびニューロフィラメントについて負に選択することができる。ヒト間葉系幹細胞は、マーカーであるＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４を使用して正に分離することができる。
用いられる標的細胞は、新鮮な、凍結した、または前培養に供されたものであってよい。用いられる標的細胞は、胎児の、新生児の、成体のものであってよい。造血細胞は、胎児肝臓、骨髄、血液、特にＧ－ＣＳＦもしくはＧＭ－ＣＳＦ動員末梢血、または任意の他の従来の供給源から得ることができる。幹細胞を造血または他の系列の他の細胞から分離する様式は本開示では重要ではない。上記の通り、分化細胞に関連するマーカーを有さない一方、幹細胞に関連するエピトープの特徴を示す細胞の選択的単離によって、幹細胞または前駆細胞の実質的に均一な集団を得ることができる。
個体に送達することができる核酸には、上で定義された異種核酸のいずれかが含まれる。主題の方法を使用して送達することができるタンパク質には、上述のタンパク質のいずれかの機能性断片；および上述のタンパク質のいずれかの機能的バリアントも含まれる。
一部の実施形態では、治療有効量のタンパク質は哺乳動物宿主において産生される。主題の方法を使用して治療有効量の特定のタンパク質が哺乳動物宿主において産生されるかどうかは、特定のタンパク質に適したアッセイを使用して容易に決定することができる。例えば、タンパク質がＥＰＯである場合、ヘマトクリットが測定される。
ｒＡＡＶが抗原タンパク質をコードする場合、主題の方法を使用して個体に送達することができる適切な抗原タンパク質としては、これだけに限定されないが、腫瘍／がん関連抗原、自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）（「自己（ｓｅｌｆ）」抗原）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、およびアレルゲン；ならびにこれらの抗原断片が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導される。他の実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対する体液性応答が誘導され、したがって、抗原タンパク質に特異的な抗体が生成される。多くの実施形態では、哺乳動物宿主において、ｒＡＡＶによりコードされる抗原タンパク質に対するＴＨ１免疫応答が誘導される。抗原タンパク質に対する免疫応答が生じたかどうかは、十分に確立された方法を使用して容易に決定される。例えば、酵素結合免疫吸着検定法を使用して、抗原タンパク質に対する抗体が生じたかどうかを決定することができる。抗原特異的ＣＴＬを検出する方法は当技術分野で周知である。例えば、表面上に抗原タンパク質を発現する、検出可能に標識された標的細胞を使用して、血液試料中の抗原特異的ＣＴＬの存在をアッセイすることができる。
主題の方法を使用して、治療有効量の異種核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸、ＲＮＡｉ剤など）が哺乳動物宿主に送達されたかどうかは、任意の適当なアッセイを使用して容易に決定される。例えば、遺伝子産物が、ＨＩＶを阻害するＲＮＡｉ剤である場合、ウイルス負荷を測定することができる。
改変されたｒＡＡＶビリオンを生成および同定する方法
本開示は、スターターＡＡＶカプシドタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換（欠失、挿入などを含む）を有するアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む改変された感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成および同定する方法を提供する。スターターＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
方法は、一般に、変異体ｒＡＡＶビリオンライブラリーを生成するステップ；および、スターターｒＡＡＶビリオンと比べて変更された特性を有する改変されたｒＡＡＶビリオンについてライブラリーを選択するステップを伴う。スターターｒＡＡＶビリオンは、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含む。本開示は、さらに、ライブラリーおよびライブラリーを含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、所与の選択ステップを２回、３回、４回、またはそれよりも多く繰り返して、主題のＡＡＶライブラリーを変更されたビリオン特性について富化させる。一部の実施形態では、ＡＡＶライブラリー選択後に、個々のクローンを単離し、配列決定を行う。
変異体ＡＡＶライブラリーの生成
スターターＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と比べて１つまたは複数の変異を含む変異体ＡＡＶライブラリーを生成する。スターターｃａｐ遺伝子は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｃａｐである。ｒＡＡＶ ｃａｐ遺伝子における変異は、任意の公知の方法を使用して生成する。スターターＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に対する変異誘発に適した方法としては、これだけに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、飽和変異誘発、ループスワッピング変異誘発、断片シャッフリング変異誘発（すなわち、ＤＮＡシャッフリング）などが挙げられる。変異を生じさせるための方法は当技術分野において十分に記載されている。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ｍａｒｃｈ； １６（３）：２３４－５；Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ． ａｌ．；Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｏｃｔｏｂｅｒ； １６（１０）：１７０３－９；Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ． ａｌ．；Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ； １７（１２）：２０８８－９５；米国特許第６，５７９，６７８号；米国特許第６，５７３，０９８号；および米国特許第６，５８２，９１４号を参照されたい；これらの全てが変異誘発に関するそれらの教示について参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子に変異を含む変異体ＡＡＶライブラリーは、付着伸長（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）プロセスを使用して生成される。付着伸長プロセスは、ＰＣＲに基づく方法を使用したｃａｐ遺伝子の増幅を伴う。鋳型ｃａｐ遺伝子を特異的ＰＣＲプライマーを使用してプライミングし、その後、変性と非常に短いアニーリング／ポリメラーゼにより触媒される伸長のサイクルを繰り返す。各サイクルにおいて、成長しつつある断片が配列相補性に基づいて異なる鋳型とアニーリングし、さらに伸長する。変性、アニーリング、および伸長のサイクルを全長配列が形成されるまで繰り返す。得られた全長配列は、野生型ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と比較してｃａｐ遺伝子に少なくとも１つの変異を含む。
１つまたは複数の変異を含むＡＡＶ ｃａｐ配列を含むＰＣＲ産物が、野生型ＡＡＶゲノムを含有するプラスミドに挿入される。その結果はＡＡＶ ｃａｐ変異体のライブラリーである。したがって、本開示は、約１０～約１０１０種のメンバーを含み、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子における変異を含む、変異体ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子ライブラリーを提供する。ライブラリーの所与のメンバーは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に約１～約５０種の変異を有する。主題のライブラリーは、１０～約１０９種の別個のメンバーを含み、それぞれがＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に異なる変異（複数可）を有する。
ｃａｐ変異体ライブラリーが生成されたら、後で変更されたカプシド特性に基づいて選択することができるウイルス粒子が生成される。ライブラリーのプラスミドＤＮＡが適切な宿主細胞（例えば、２９３細胞）にトランスフェクトされ、その後、ヘルパーウイルスの細胞に導入される。トランスフェクトされた宿主細胞によって産生されたウイルス粒子（ｒＡＡＶライブラリー粒子）が採取される。
ライブラリー選択
ライブラリーが生成されたら、特定のビリオン特性（すなわち、感染特性の変更）について選択される。ウイルス粒子が上記の通り生成され（したがって、改変されたｒＡＡＶビリオンのライブラリーが作製され）、１つまたは複数の選択ステップに供されて、感染特性の変更（配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて）を有する改変されたｒＡＡＶビリオンが同定される。選択される感染の特性としては、これだけに限定されないが、１）ＡＡＶ中和抗体への結合の変更（例えば、結合の低減）；２）ＡＡＶ中和抗体の回避の増加；３）ＡＡＶへの感染に対する抵抗性がある細胞に対する感染力の増加；および４）ヘパリン結合の変更を挙げることができる。
１．ＡＡＶ中和抗体への結合の低減についての選択
一部の実施形態では、主題のＡＡＶライブラリーは、野生型ＡＡＶビリオンに結合し、それを中和する中和抗体への結合の、そのような抗体の野生型ＡＡＶビリオンへの結合および野生型ＡＡＶビリオンの中和と比較した（または配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べた）変更（例えば、低減）について選択される。ＡＡＶライブラリー粒子（ＡＡＶライブラリービリオン）を中和抗体と接触させ、ＡＡＶライブラリー粒子の許容宿主細胞に感染する能力を試験する。一般には、ＡＡＶライブラリー粒子を種々の濃度の中和抗体と接触させる。ＡＡＶライブラリー粒子の感染力を低下させるために必要な中和抗体の濃度が高いほど、ＡＡＶ粒子の中和に対する抵抗性が高い。当業者に公知の任意の慣習的なアッセイを使用して、ＡＡＶライブラリービリオンの抗ＡＡＶ中和抗体への結合を直接測定する（例えば、結合親和性を測定する）ことができる。
２．ＡＡＶ中和抗体の回避の増加についての選択
一部の実施形態では、主題のＡＡＶライブラリーは、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べた、中和抗体の回避の増加（すなわち、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する抵抗性の増加）について選択される。ＡＡＶライブラリー粒子を標的細胞とＡＡＶ中和抗体（通常はヒト抗ＡＡＶ中和抗体）の存在下で接触させる。細胞へのＡＡＶライブラリー粒子による感染を可能にするのに適した時間をおいた後、ヘルパーウイルスを添加し、細胞（複数可）に首尾よく感染したＡＡＶライブラリー粒子を収集する。一部の実施形態では、上首尾の感染を示すビリオンについて感染力が測定される（例えば、上記の通り）。一部の実施形態では、感染、ヘルパーウイルスの添加、およびＡＡＶ粒子の収集のサイクルは１回、２回、３回、またはそれよりも多く繰り返される。種々の程度の回避を選択するために様々な量（濃度）のＡＡＶ中和抗体を用いて選択を行うことができる（例えば、繰り返される各ラウンドは、抗体を前のラウンドと比べて濃度を上昇させて利用することができる）。
３．非許容細胞に対する感染力の増加についての選択
一部の実施形態では、主題のＡＡＶライブラリーは、非許容細胞に対する感染力の増加（配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べた）について選択される。ＡＡＶライブラリー粒子を非許容細胞（例えば、非許容細胞の集団）と接触させる。細胞へのＡＡＶライブラリー粒子による感染を可能にするのに適した時間をおいた後、ヘルパーウイルスを添加し、非許容細胞（複数可）に首尾よく感染したＡＡＶライブラリー粒子を収集する。一部の実施形態では、感染、ヘルパーウイルスの添加、およびＡＡＶ粒子の収集のサイクルは１回、２回、３回、またはそれよりも多く繰り返される。
４．ヘパリン結合の変更についての選択
一部の実施形態では、主題のライブラリーは、野生型ＡＡＶビリオンのヘパリン結合と比べた（または配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べた）ヘパリン結合の増加およびヘパリン結合の低減を含めたヘパリン結合の変更について選択される。ＡＡＶライブラリー粒子をヘパリン親和性マトリックスと接触させる。例えば、ＡＡＶライブラリー粒子をヘパリンアフィニティーカラムに、ＡＡＶライブラリー粒子のヘパリンへの結合を可能にする条件下でロードする。例示的な条件としては、０．１５ＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を用いたカラムの平衡化が挙げられる。ＡＡＶライブラリー粒子をヘパリン親和性マトリックスに結合させた後、ＡＡＶライブラリー粒子／ヘパリン親和性マトリックス複合体を漸増濃度のＮａＣｌを含有する緩衝液を大量に用いて洗浄し、各ＮａＣｌ濃度において、溶出したＡＡＶライブラリー粒子を採取する。例えば、結合後、ＡＡＶライブラリー粒子／ヘパリン親和性マトリックス複合体を、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄し、溶出したＡＡＶライブラリー粒子を採取する。約２５０ｍＭのＮａＣｌ、約３００ｍＭのＮａＣｌ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭのＮａＣｌ、約４５０ｍＭのＮａＣｌ、約５００ｍＭのＮａＣｌ、約５５０ｍＭのＮａＣｌ、約６００ｍＭのＮａＣｌ、約６５０ｍＭのＮａＣｌ、約７００ｍＭのＮａＣｌ、または約７５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて溶出ステップを繰り返す。
ＮａＣｌ濃度が約４５０ｍＭ未満のＮａＣｌで溶出するＡＡＶライブラリー粒子は、野生型ＡＡＶと比べてヘパリン結合特性の低減を示す。ＮａＣｌ濃度が約５５０ｍＭよりも高いＮａＣｌで溶出するＡＡＶライブラリー粒子は野生型ＡＡＶと比べてヘパリン結合特性の増加を示す。
一部の実施形態では、溶出したＡＡＶライブラリー粒子は、許容細胞へのヘルパーウイルスの共感染により増幅させられ、ヘパリン親和性マトリックスで再分画される。このステップを何回か繰り返して、ヘパリン結合特性が変更されたＡＡＶライブラリー粒子を富化させることができる。
本方法では、ＡＡＶライブラリー粒子の生成に続いて１つまたは複数の選択ステップを行うことができる。例えば、一部の実施形態では、方法は、ヘパリン結合の増加について選択するステップ、その後、中和抗体への結合の低減を選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への結合の低減について選択するステップ、その後、ヘパリン結合の増加について選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、ヘパリン結合の低減について選択するステップ、その後、中和抗体への結合の低減について選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への結合の低減について選択するステップ、その後、ヘパリン結合の低減について選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への結合の低減について選択するステップ、その後、幹細胞に対する感染力の増加について選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への結合の低減について選択するステップ、その後、中和抗体の回避の増加について選択するステップを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体の回避の増加について選択するステップ、その後、中和抗体への結合の低減について選択するステップを含む。
したがって、本開示は、複数の核酸を含み、それらの核酸それぞれがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ライブラリーを提供する。コードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載される配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。本開示は、複数のＡＡＶ粒子を含み、それらのそれぞれが、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載される配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子のライブラリーを提供する。変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸は、コードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質の特性と同様に上に記載されている。
本開示は、さらに、（ｉ）それぞれがバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質と異種核酸とを含む、２種またはそれよりも多くの感染性ｒＡＡＶビリオン；（ｉｉ）それぞれがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、２種またはそれよりも多くの単離された核酸；（ｉｉｉ）それぞれがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、２種またはそれよりも多くの宿主細胞；および（ｉｖ）２種またはそれよりも多くのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質、のうちの少なくとも１つを含むライブラリーであって、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１０～１３および２６～３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、ライブラリーを提供する。
組成物およびキット
本開示の方法における使用のための組成物およびキットも提供される。主題の組成物およびキットは、以下のうちの少なくとも１つを含む：主題の感染性ｒＡＡＶビリオン、主題のｒＡＡＶベクター、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む主題の核酸（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｉｄ）、主題の核酸を含む単離された宿主細胞（すなわち、主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む主題の遺伝子改変された宿主細胞）；主題のライブラリー（例えば、上記のライブラリーのいずれか）；および主題のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質。組成物またはキットは、上記の任意の慣習的な組合せを含み得る。組成物またはキットは、ヘルパーウイルスおよび／またはヘルパーウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含み得る。キットは、改変されたバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸（すなわち、「変異体」核酸）の生成のための試薬も含み得る。
上記の構成成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実施するための指示をさらに含み得る（ある特定の実施形態では）。これらの指示は、主題のキット中に種々の形態で存在してよく、それらのうちの１つまたは複数がキット中に存在してよい。これらの指示が存在し得る一形態は、キットの包装中、添付文書中などの、適切な媒体または基材に印刷された情報、例えば、情報が印刷された一枚または複数枚の紙などとしてである。これらの指示のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどである。存在し得るこれらの指示のさらに別の形態は、インターネットを介して使用して離れたサイトの情報にアクセスすることができるウェブサイトアドレスである。
ここで本発明は十分に記載されており、本発明の主旨または範囲から逸脱することなく種々の変更および改変を行うことができることが当業者には明らかである。
（実施例１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターは、現在までに、いくつかの臨床試験において考慮すべき有望性が実証されている。しかし、ＡＡＶベクターへの小児期における曝露またはＡＡＶベクターの以前の投与により生じた循環抗ＡＡＶ抗体により、多くの潜在的な患者に対するＡＡＶ遺伝子治療の実行が妨げられている。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても抗ＡＡＶ抗体回避の増強が可能な新規のＡＡＶバリアントを単離した。低効力および高効力のヒト血清プールおよびヒトＩＶＩＧを使用した選択の結果生じたストリンジェントな圧力により、個々のヒト血清、ヒトＩＶＩＧ、およびマウス血清由来の抗体による中和を回避することが可能なＡＡＶバリアント、現在まで最も広範に回避的なバリアントが進化した。
材料および方法
細胞株
細胞株を、３７℃および５％ＣＯ２で培養し、また、別段の指定のない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＨＴ１０８０細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。ＣＨＯ Ｋ１細胞およびＣＨＯ ｐｇｓＡ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）中で培養した。Ｐｒｏ５細胞およびＬｅｃ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＭＥＭ－アルファ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
選択のためのヒト血清プール
１８種の個々のヒト血清試料をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、Ｍｉｃｈ．）から入手し、各試料について野生型ＡＡＶ２に対する中和抗体力価を決定した（表２）。個々の試料は抗体に対する親和性およびエピトープ特異性の両方にバリエーションがある可能性があるので、等体積の個々の血清試料を混合することにより、３種の効力が強い血清プール（α＝Ａ＋Ｆ＋Ｇ、β＝Ｂ＋Ｈ＋Ｍ、およびγ＝Ｉ＋Ｊ＋Ｎ）を生成した。抗体のこれらのバリエーションの存在下での選択により、多くの既存のヒト抗体に対する抵抗性の全般的な増強がもたらされるはずである。後の選択をＧａｍｉｍｕｎｅ Ｎ、１０％ヒトＩＶＩＧ（Ｂａｙｅｒ、Ｅｌｋｈａｒｔ Ｉｎｄ．）の存在下で実施して、さらにいっそう広範囲の抗体に対する抵抗性について選択した。
表２：個々のヒト血清試料の中和抗体力価
各試料についての中和抗体（ＮＡｂ）力価は感染力を血清の非存在下で測定された値の３７％まで低下させるために必要な血清の体積分率の逆数として報告される。次いで、等体積量の３種の個々の血清試料を混合することによって３種の血清プール（α＝Ａ＋Ｆ＋Ｇ、β＝Ｂ＋Ｈ＋Ｍ、およびγ＝Ｉ＋Ｊ＋Ｎ）を生成した。
Figure 0007393565000015
Figure 0007393565000016
ライブラリーの生成およびウイルス産生
飽和変異誘発ライブラリーを創出するために、ＡＡＶ２ ｃａｐライブラリーを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてそれぞれ５’－ＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣ－３’（配列番号１４）および５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧ－３’（配列番号１５）を使用し、エラープローンＰＣＲ、続いて、Ｚｈａｏらにより記載されている付着伸長プロセスによって生成した。プールされた個々のヒト血清を使用した選択により、飽和変異誘発ライブラリーの基礎としての機能を果たす４つの点変異（結果の節に記載されている）を含有するバリアントが明らかになった。このバリアントのｃａｐ遺伝子を、特定の部位のアミノ酸を変化させることによるさらなる変異誘発に供した。プライマー５’－ｃａｔｔＮＮＫｇａｃｃａｇｔｃｔａｇｇａａｃｔｇｇ－３’（配列番号１６）および対応する逆相補プライマーを使用して、Ｒ４７１アミノ酸部位を変異誘発した。プライマー５’ｇｃｃａｃａａｇｇａｃｇａｔｇａａｇａａＮＮＫｔｔｔｔｔｔｃｃｔｃａｇａｇｃｇｇｇｇｔｔｃｔｃａｔｃｔｔｔｇｇｇａａｇｃａａｇｇｃｔｃａＮＮＫａａａａｃａａｇｔ ｇｔｇｇａｃａｔｔｇ－３’（配列番号１７）および対応する逆相補プライマーを使用して、Ｋ５３２およびＥ５４８アミノ酸部位を変異誘発した。プライマー５’－ｃｃａａｃｃｔｃｃａｇａｇａｇｇｃＮＮＫａｇａｃａａｇｃａｇｃｔａｃｃ－３’（配列番号１８）および対応する逆相補プライマーを使用して、Ｎ５８７アミノ酸部位を変異誘発した。プライマー５’－ｃｃａａｃｔａｃａａｃａａｇｔｃｔＮＮＫａａｔｇｔｇｇａｃｔｔｔａｃｔｇｔｇｇａｃＮＮＫａａｔｇｇｃｇｔｇｔａｔｔ－３’（配列番号１９）および対応する逆相補プライマーを使用して、Ｖ７０８およびＴ７１６アミノ酸部位を変異誘発した。ランダム化ｃａｐループ領域を含有するＡＡＶ２からなるライブラリーおよび野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子由来のシャッフルされたＤＮＡを含有するライブラリーを最初の選択ステップのためにパッケージングし、プールした（Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ． ａｌ．；Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｏｃｔｏｂｅｒ； １６（１０）：１７０３－９；およびＫｏｅｒｂｅｒ ｅｔ． ａｌ．；Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ； １７（１２）：２０８８－９５；どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
進化の第２および第３のラウンドのために、ループ－スワップ／シャッフルライブラリーおよび飽和変異誘発ライブラリーからのｃａｐ遺伝子を、以前に記載されている通り、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてそれぞれ５’－ＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＧ－３’（配列番号２０）および５’－ＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧ－３’（配列番号２１）を使用し、エラープローンＰＣＲに供することにより、ランダム変異誘発ライブラリーを生成した。複製能のあるＡＡＶライブラリーおよびＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する組換えＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を使用し、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用してパッケージングし、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘｏｎａｌ）勾配遠心分離によってウイルスを精製した。ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用のための、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰまたはルシフェラーゼを発現する組換えＡＡＶベクターをＡｍｉｃｏｎ濾過によってさらに精製した。デオキシリボヌクレアーゼ抵抗性ゲノム力価を定量的ＰＣＲによって決定した（Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ． ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００９ Ｍａｒ． １０； １０６（１０）：３８６５－７０；およびＭａｈｅｓｈｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ； ２４（２）：１９８－２０４；どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ライブラリー選択および進化
選択の１回のラウンドは、ＡＡＶ出発ライブラリーを使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞への感染（感染前に、プールされた個々のヒト血清については室温で３０分、または熱失活ＩＶＩＧを用いる場合は３７℃で１時間インキュベートする）、その後、アデノウイルスレスキューおよび上首尾のバリアントの収集と定義される。進化の各ラウンドは、出発ライブラリーを創出するためのｃａｐ遺伝子の変異誘発および３回のラウンドの選択からなる。各ライブラリーを用いて３回のラウンドの進化を実施し、進化の各ラウンド間にクローン分析を実施した。進化の各ラウンドについての出発ライブラリーを上記の通り生成した。選択の第３のラウンドの後、上首尾のＡＡＶバリアントのプールからＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を単離し、ＰＣＲによって増幅させた。ｃａｐ遺伝子をｐＸＸ２組換えＡＡＶパッケージングプラスミドにＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して挿入した。次いで、ｃａｐ遺伝子をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて配列決定し、およびＧｅｎｅｉｏｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して分析した。ＡＡＶ２カプシド（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ受託番号１ＬＰ３）の３次元モデルをＰｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆ．）で描写した。
抗体回避バリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入分析
ＨＥＫ２９３Ｔを感染の２４時間前に３×１０４個の細胞／ウェルの密度でプレーティングした。バリアントを感染前に、熱失活ＩＶＩＧ、個々のヒト血清、または個々のマウス血清と一緒に３７℃で１時間インキュベートし、次いで、細胞にｒＡＡＶ－ＧＦＰを２０００のゲノムＭＯＩで感染させた。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを感染の４８時間後にＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン３．１．０、Ｍｕｌｔｉ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｃｅｌｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して評価した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入分析
選択された変異体の親野生型ＡＡＶ血清型と比較した相対的な形質導入効率を決定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ ｐｇｓＡ細胞（全ての表面グリコサミノグリカンを欠く）、ＣＨＯ Ｐｒｏ５細胞（Ｌｅｃ１細胞を含めたいくつかのグリコシル化変異体についての親株）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１細胞（グリコシル化欠損）、ＨｅＬａ細胞、およびＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫細胞株）を感染の２４時間前にウェル当たり２．５×１０４個の細胞の密度でプレーティングした。細胞にｒＡＡＶ１－ＧＦＰ、ｒＡＡＶ２－ＧＦＰ、ｒＡＡＶ６－ＧＦＰ、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００．１－ＧＦＰ、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００．３－ＧＦＰ、ＳＭ１０．２－ＧＦＰ、またはＳｈｕｆｆｌｅ１００．７－ＧＦＰを１００～１０００のＭＯＩの範囲で感染させた。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを感染の４８時間後にＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して評価した。
抗体回避バリアントのｉｎ ｖｉｖｏ分析
ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子発現の分析のために、８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、マウス当たり４ｍｇのＩＶＩＧまたはリン酸緩衝食塩水（対照マウスに対して）を用い、尾静脈注射によって予備刺激し、２４時間後に、組換えＳｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）、ＳＭ１０－２（配列番号１０参照）、またはＡＡＶ２ベクターを投与した。マウスに、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼをコードする組換えＡＡＶベクターの１０１１ウイルスゲノムを尾静脈注射によって感染させた。生物発光イメージングのために、マウスに２％イソフルランおよび酸素を用いて麻酔を行った。Ｄ－ルシフェリン基質（ＧＯＬＤ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）を５００μｇ／ｇ体重の用量で腹腔内注射した。ＶｉｖｏＶｉｓｉｏｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ｉｍａｇｅｒ（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して画像を生成した。各マウスについて、毎週、４週間にわたって、基質注射の７～１０分後に腹側画像を撮った。感染後５週間で、血清を心臓穿刺によって採取し、次いで、マウスに０．９％食塩水溶液を灌流した。心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、脳、脊髄、および後肢筋肉を収集し、凍結させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼ分析のために、凍結した組織試料をホモジナイズし、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させた。ルシフェラーゼを含有する溶解物を、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって清澄化させた。試料をアッセイするために、溶解物２０μＬをルシフェラーゼアッセイ緩衝液１００μＬに添加し、混合し、５分間インキュベートし、ルミノメーターに入れた。シグナルを、２秒間の遅延を伴って３０秒間積分し、ＴＤ ２０／２０ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）によって検出された相対発光量（ＲＬＵ）として報告した。ルシフェラーゼシグナルをビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定された総タンパク質含有量に対して正規化した。
結果
本発明者らの結果から、ＡＡＶを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において抗ＡＡＶ抗体による中和が大きく克服されるように進化させることできることが実証される。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて野生型ＡＡＶの２～３５倍の中和抗体力価（ヒトＩＶＩＧを使用して）が必要になる新規のＡＡＶバリアントを単離した。抗体の中和特性はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける中和抗体の存在下での形質導入の増強になった。抗ＡＡＶ抗体に対する抵抗性があるそのような新規のクローンの単離により、核酸送達ベクターとしてのＡＡＶに基づく処置のより広範な実行が可能になる（現在はＡＡＶ遺伝子治療に対して不適格である、高い抗体価を有する個体を含む）。
定向進化によるＡＡＶライブラリーの生成および選択
図１ａは、ヒト抗体による中和を回避することが可能な新規のＡＡＶバリアントを単離するために使用した定向進化手法の概略図を示す。ウイルスのライブラリーを下の段落に記載のＤＮＡ変異誘発技法を使用して創出した（図１ａ、ステップ１および２）。最初の選択の間、ＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子に対するエラープローンＰＣＲ変異から展開させたウイルスライブラリーのプールを、種々の希釈度の低効力αヒト血清プールと一緒に室温で３０分間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた（ステップ３）。低効力αヒト血清プールに対する３回のラウンドの選択（図１ａ、ステップ４および５）に続いて、この中和性血清プールに対する抵抗性が増強されたいくつかのバリアントを得た（図１ａ、ステップ６、図７ａ）。バリアント１．４５は、２つの点変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ）を含有し、αプールによる中和に対して、野生型ＡＡＶ２と比較して１０倍を超える抵抗性をもたらした。
バリアント１．４５からのｃａｐ遺伝子をさらなるランダム変異誘発に供し、得られたライブラリーを、並行したβプールおよびγプールに対するさらなる３回のラウンドの選択のために選択した。抗体回避に関して軽微な改善しか観察されなかったので（データは示していない）、回収されたｃａｐ遺伝子をプールし、ＤＮＡシャッフリングおよびＥＰ ＰＣＲによるさらなる多様化に供した。βプールおよびγプールの両方からの漸増量の血清に対するさらなる３回のラウンドの選択の結果、野生型ＡＡＶ２と比較して、ウイルスライブラリーから回収されるウイルスの量の実質的な富化がもたらされた（図７ｂ、ｃ）。両方のプールからの上首尾のｃａｐ遺伝子の配列決定により、両方のライブラリー内に存在する、いくつかの低頻度の変異体、および、単一の優性変異体、４つの点変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、および１６９８Ｖ）を含有するバリアントγ４．３が明らかになった。ヒトＩＶＩＧの存在下で、バリアント１．４５では、中和に対して１．２倍という若干の抵抗性の増強が示された一方、γ４．３では、中和に対して３．１倍の抵抗性の増強が示された（図７ｄ）。この観察により、個々のヒト血清のプールを使用して、一般的なヒト集団中に存在する抗体の回避の増強が可能なＡＡＶバリアントを単離することができるという仮説が確認される。
抗ＡＡＶ抗体による中和に対する抵抗におけるバリアントγ４．３の中程度の成功により、γ４．３ ｃａｐ遺伝子に基づくライブラリーの開発が促された。γ４．３の抗体抵抗性を改善することができるアミノ酸変異を見いだすために、ＡＡＶ２カプシドの免疫原性部位であることが以前に決定されたアミノ酸部位Ｒ４７１、Ｋ５３２、Ｅ５４８、Ｎ５８７、Ｖ７０８、Ｔ７１６を飽和変異誘発に供した。この「飽和変異誘発」ライブラリーを、７種の親ＡＡＶ血清型のランダムなｃａｐキメラで構成される「シャッフルされた」ライブラリーおよび置換されたループ領域を有するＡＡＶ２ ｃａｐで構成される「ループ－スワップ」ライブラリーと一緒に、さらなる３回のラウンドの選択に供した。この選択では、ウイルスライブラリーのプールを、種々の希釈度のヒトＩＶＩＧと一緒に３７℃で１時間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた。ＡＡＶライブラリーを用いた感染、およびアデノウイルス重複感染による感染性ＡＡＶバリアントの増幅に続いて、選択の成功を決定するための方法として、各ライブラリー条件からのウイルスゲノムの数またはウイルス力価を定量し、野生型ＡＡＶ２の力価と比較した（図１ｂ）。飽和変異誘発およびループ－スワップ／シャッフルされたライブラリーを使用した選択の各ラウンドについて、野生型ＡＡＶ２よりも高いウイルス力価を生じた１：１０および１：１００のＩＶＩＧ希釈条件からのウイルスプールをその後の選択のラウンドの出発点として使用した。３回のラウンドの選択後、上首尾のウイルスｃａｐ遺伝子を単離し、個別に試験して、遺伝子送達が最も効率的であるウイルスを決定した。さらに、選択の第３のラウンドで単離されたｃａｐ遺伝子をさらなるラウンドのエラープローンＰＣＲ変異誘発に供し、プロセスを繰り返して、ウイルスの適応度を反復して増加させた。
図１は、抗体回避の増強のためのＡＡＶの定向進化を示す。（ａ）定向進化の概略図。１）いくつかの相補的手法を使用してｃａｐ遺伝子を遺伝学的に多様化することにより、ウイルスライブラリーを創出する。２）ウイルスを、プラスミドトランスフェクションを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージングし、次いで、収集し、精製する。３）ウイルスライブラリーをいくつかの濃度のヒトＩＶＩＧと一緒にインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入する。４）上首尾のウイルスをアデノウイルス重複感染によって増幅させ、回収する。５）上首尾のクローンを、低ＭＯＩで選択を繰り返すことによって富化させる。６）単離されたウイルスＤＮＡにより上首尾のｃａｐ遺伝子を明らかにする。７）上首尾のｃａｐ遺伝子を再度変異させて、選択の新しい出発点として機能させる。（ｂ）ループ－スワップ／シャッフルされた、および飽和変異誘発ライブラリーからの、抗体を回避する変異体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｖａｄｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔｓ）の選択。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にウイルスライブラリーを２４時間感染させた。細胞に生産的に感染したウイルス粒子をアデノウイルス感染によって増幅させ、レスキューされたＡＡＶをｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）によって定量した。１：１０希釈度のＩＶＩＧは１０ｍｇのＩＶＩＧ／ｍＬの濃度に対応する。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
図７は、ＡＡＶ２に基づいたヒト抗体回避体の生成を示す。（ａ）低ストリンジェンシーαプールに対する３回のラウンドの選択後に選択された４種のウイルスクローンでは、ＭＯＩ １のα血清１μＬに対する抵抗性の増強が示される。さらなる２回のラウンドの多様化（すなわち、変異誘発およびＤＮＡシャッフリング）および選択（血清量を増加させて３回のラウンド）の結果、効力が非常に強い大量の（ｂ）βプールおよび（ｃ）γプールの存在下でのウイルス回収が有意に増強された。（ｄ）さらに、２種のウイルスクローン（１．４５およびγ４．３）では、約１００，０００個体からのプールされたヒト静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）を提示する既存の抗体の高度に多様なプールに対して、野生型ＡＡＶ２と比較して１．２３倍および３．１０倍の抵抗性の増強が示される。
新規の進化したＡＡＶバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗体回避の増加
ヒトＩＶＩＧに対する９回のラウンドのスクリーニング後に飽和変異誘発およびループ－スワップ／シャッフルされたライブラリーからの個々の分析について選択され、パッケージングされた１２種のクローンのうち、１２種全てに、野生型ＡＡＶ１およびＡＡＶ２の両方よりも高い中和抗体力価が必要であった（図２ａおよび表１）。中和のために野生型ＡＡＶ２の３５倍のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＶＩＧ濃度が必要であったバリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）は、１ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧの存在下でも依然として細胞のおよそ１０％へ形質導入することが可能であった（図２ｂ）。さらに、ＡＡＶ２飽和変異誘発ライブラリーからのバリアントＳＭ１０－２には、中和のために、野生型ＡＡＶ２の７．５倍のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＷＩＧ濃度が必要であった。さらに、バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３およびＳＭ１０－２（配列番号１０参照）では、血友病Ｂ臨床試験から除外された個々の患者由来の血清試料の存在下で形質導入の増強が示された（図３）（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１１ Ｄｅｃ． ２２； ３６５（２５）：２３５７－６５）。
図２は、抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。３回のラウンドの進化後に単離された抗体回避変異体のｃａｐ遺伝子を使用してＧＦＰをコードする組換えＡＡＶをパッケージングし、ヒトＩＶＩＧと一緒にインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた。残りの感染性粒子の割合を、ハイコンテント蛍光イメージングを使用して決定し、ＩＶＩＧの非存在下での感染力価に対して正規化した。各ライブラリーからのＩＶＩＧに対する抵抗性を有する２種のクローンが示されている。分析した他のクローンについてのデータは表１に示されている。（ａ）中和曲線。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。（ｂ）いくつかのＩＶＩＧ希釈度からの代表的な蛍光画像から、変異体により、高濃度の中和抗体の存在下でＨＥＫ２９３Ｔへの形質導入が可能であることが示される。
図３は、抗体回避バリアントの中和プロファイルを示す。ＡＡＶに対する高い中和抗体力価の存在が原因で血友病Ｂ臨床試験から除外された個体からヒト血清を取得した。ＧＦＰをコードする組換えＡＡＶを個々のヒト血清試料と一緒にインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた。残りの感染性粒子の割合を、蛍光顕微鏡法を使用して決定し、ヒト血清の非存在下での感染力価に対して正規化した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
１２種のクローンの配列分析により、中和抗体に対する抵抗性が最も高い２種のバリアント、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）およびＳｈｕｆｆｌｅ１００－１（配列番号１１参照）が、ＡＡＶ１～４、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９の断片を含有する、ほぼ同一のシャッフルされたカプシドであることが明らかになった（図４）。これらの２種のバリアント間のアミノ酸４６９（ＡＡＶ６残基～ＡＡＶ７残基）および５９８（ＡＡＶ６残基～ＡＡＶ１残基）の差異は、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）の中和抗体力価のほぼ３倍の増加に相当する（表１）。４番目に高い中和抗体に対する抵抗性を有した（表１）バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－７（配列番号１３参照）もまた、シャッフルされたカプシドであり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ８の断片を含有し（図４）、野生型ＡＡＶ１およびＡＡＶ８が抗ＡＡＶ２抗体を回避することに関して効果的であることが示されている報告データとよく合致する。興味深いことに、バリアントＳＭ１０－２（配列番号１０参照）は、バリアントγ４．３によって獲得された点変異を保持し、また、飽和変異誘発部位に野生型残基も保持した。バリアントＳＭ１０－２（配列番号１０参照）は表面残基Ｄ４７２Ｎおよび内部残基Ｌ７３５Ｑにさらなる点変異を獲得した。図４は、ループ－スワップ／シャッフルおよび飽和変異誘発クローンのアミノ酸配列を示す。（ａ）カプシドタンパク質の概略図が、中和ＩＶＩＧ濃度が最も高い、各ライブラリーからの２種のクローンについて示されている。各領域に、それが由来する親血清型に従って濃淡がつけられている。黒色の矢印は、（左から右に）ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の開始コドンを示す。灰色の矢印は、（左から右に）ＡＡＶ２カプシドに基づく表面ループ領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶを示す。（ｂ）解明された構造に基づく完全なＡＡＶ２カプシドの分子モデルが、中和ＩＶＩＧ濃度が最も高い、各ライブラリーからの２種のクローンについて示されている。各領域に、それが由来する親血清型に従って濃淡がつけられている。バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）に関して、黒色の矢印は、バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－１（配列番号１１参照）との差異を示す。バリアントＳＭ１０－２（配列番号１０参照）に関して、変異Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、および１６９８Ｖは表面変異である（黒色）。
表１：ライブラリークローンおよび親血清型のＩＶＩＧ中和抗体力価
ヒトＩＶＩＧを使用して、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびループ－スワップ／シャッフルされたおよび飽和変異誘発ライブラリーから回収されたバリアント由来のカプシドを有する組換えＡＡＶ－ＧＦＰベクターを中和した。遺伝子送達効率をＩＶＩＧの非存在下での遺伝子送達効率の５０％まで低下させるために必要なＩＶＩＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示し、ＡＡＶ２の送達を低減するために必要な濃度と比較する。分析した全てのバリアントに、野生型ＡＡＶ１およびＡＡＶ２よりも高い濃度のＩＶＩＧが必要であった。図２の曲線を指数関数曲線に当てはめることによって中和抗体力価を決定した。配列番号を「アミノ酸、ヌクレオチド」として列挙する。
Figure 0007393565000017
バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３（配列番号１２参照）、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１（配列番号１１参照）、およびＳｈｕｆｆｌｅ１００－７（配列番号１３参照）は、親血清型ＡＡＶ１およびＡＡＶ６の形質導入プロファイルを模倣する形質導入プロファイルを有する（図５）。さらに、ＳＭ１０－２（配列番号１０参照）における変異はヘパリン依存性（親血清型ＡＡＶ２において見られる）を妨げず、ＡＡＶ２と同様のプロファイルがもたらされる（図５）。
図５は、新規のａａｖバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏトロピズムを示す。緑色蛍光タンパク質を発現する組換えＡＡＶベクターを使用して、細胞株のパネル：ＣＨＯ、ｐｇｓＡ（全ての表面グリコサミノグリカンを欠く）、Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１（シアル酸を欠く）、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、およびＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫細胞株）に形質導入して、新しいＡＡＶバリアントの形質導入特性をプロファイリングした。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける新規の進化したＡＡＶバリアントの抗体回避の増加
バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３およびＳｈｕｆｆｌｅ１００－７の局在化パターンを決定するために、ＡＡＶ２、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、またはＳｈｕｆｆｌｅ１００－７を注射したナイーブなマウスの種々の組織におけるルシフェラーゼ酵素活性を調査した（図６ａ）。バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－７は、ＡＡＶ２に対して、心臓に対する形質導入が７倍であり、肺に対する形質導入が５倍であり、肝臓に対する形質導入が４．５分の１であったことを除いて、同様のｉｎ ｖｉｖｏトロピズムを示した。Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３バリアントは、ＡＡＶ２の４倍を超える脳に対する形質導入、３倍を超える肺に対する形質導入、および２７倍の筋肉に対する形質導入を示した。これらのマウス由来の血清の分析により、バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３に関しては、中和のために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＳｈｕｆｆｌｅ１００－３遺伝子送達ベクターを受けたマウス由来の血清についてＡＡＶ１およびＡＡＶ８と等しいかまたはより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ血清濃度が必要であることが示された（図１１）。Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７に関しては、中和のために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、またはＳＭ１０－２遺伝子送達ベクターを受けたマウス由来の血清についてＡＡＶ１と等しいかまたはより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ血清濃度が必要であった（図１１）。さらに、どちらのバリアントも、ＡＡＶ２遺伝子送達ベクターを受けたマウス由来の血清による中和が、試験した全ての野生型ＡＡＶ血清型よりも少なかった。興味深いことに、バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３はまた、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３に対して免疫したマウスの血清による中和も、試験した他の血清型またはバリアントのいずれよりも少なかった（図１１）。このデータから、これらのバリアントを、複数のベクター投与が必要な適用において野生型ＡＡＶ血清型または他のバリアントと組み合わせて使用することができるという可能性が例示される。
図１１は、免疫したマウス血清中のライブラリークローンおよび親血清型の中和抗体力価を示す。ライブラリークローンまたは野生型ＡＡＶを投与されたマウス由来の血清を使用して、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ならびにループ－スワップ／シャッフルされたおよび飽和変異誘発ライブラリーから回収されたバリアント由来のカプシドを有する組換えＡＡＶ－ＧＦＰベクターを中和した。遺伝子送達効率を血清の非存在下での遺伝子送達効率の５０％まで低下させるために必要な血清希釈度が示されている。
バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－７およびＳｈｕｆｆｌｅ１００－３の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体による中和を回避する能力を決定するために、マウスを、ヒトＩＶＩＧを用いて受動的に免疫した後、ＡＡＶを注射した。バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－７では、ルシフェラーゼ酵素活性によって測定して、心臓、肝臓、および筋肉に対する形質導入がＡＡＶ２よりも有意に高かった（図６ｂ）。バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－３では、心臓および筋肉に対する形質導入がＡＡＶ２と比較して有意に高かった（図６ｂ）。
図６は、新規のＡＡＶバリアントのｉｎ ｖｉｖｏにおける局在化および中和を示す。（ａ）ルシフェラーゼをコードする組換えＡＡＶベクターを雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈注射によって投与した。５週間後、分析した各試料について、ルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、総タンパク質に対して正規化した。（ｂ）ヒトＩＶＩＧ ４ｍｇを尾静脈注射した後２４時間で、ルシフェラーゼを発現する組換えＡＡＶベクターを雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈注射によって投与した。５週間後、分析した各試料について、ルシフェラーゼ発現のレベルを総タンパク質に対して正規化した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す、＊＝ｐ＜０．０５。ＲＬＵ、相対ルシフェラーゼ単位。
個々のヒト血清のプールに対して選択されたＡＡＶ２に基づくエラープローンライブラリーから単離されたバリアントγ４．３は、４つの点変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、およびＩ６９８Ｖ）を含有した。興味深いことに、これらの位置のうちの２カ所（Ｎ４４９およびＮ５５１）は、ヒト血清の他のプールを使用して免疫原性残基として以前に同定されており、これにより、これらの部位を伴う抗原エピトープが多くの異なる中和抗体によって標的にされることが実証される。したがって、これらの部位は、変異の興味深く有益な標的である。飽和変異誘発ライブラリーにおける対定向進化および合理的設計の結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＡＶ１およびＡＡＶ２のどちらよりも高い抗体に対する抵抗能を有するバリアントＳＭ１０－２が単離された。バリアントＳＭ１０－２では、バリアントγ４．３において見いだされるものに対して２つのさらなる点変異（Ｄ４７２ＮおよびＬ７３５Ｑ）が組み入れられている。Ｄ４７２Ｎ変異により、ＨＥＫ２９３細胞におけるカプシド合成のレベルが上昇することが以前に示されている。同様に、アミノ酸７３５位の正荷電リシン側鎖の非荷電グルタミン側鎖による置き換えは、アセンブルされたカプシドの内部に位置しているにもかかわらずバリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－７にも存在するので、カプシドを安定化するように機能し得る（図４）。
キメラＡＡＶカプシドの創出により、複数のＡＡＶ血清型からの望ましい特性を統合することができるウイルスバリアントの創出が可能になる。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９も、ＩＶＩＧによる中和に対してＡＡＶ２よりもはるかに大きい抵抗性があることが示されているが、これらのカプシドに特異的なアミノ酸は本発明者らの選択の間に単離されたシャッフルされたバリアントの表面上の小さな範囲にしか存在しなかった（図４）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗体による中和のより効率的な回避を示すバリアントであるＳｈｕｆｆｌｅ１００－３は、その親血清型ＡＡＶ１およびＡＡＶ６と同様のｉｎ ｖｉｔｒｏトロピズムを示したが、感染率がいずれの野生型血清型よりも高かった。バリアントＳｈｕｆｆｌｅ１００－１とＳｈｕｆｆｌｅ１００－３の間のアミノ酸４６９および５９８の差異は、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３の中和抗体力価の増加がほぼ３倍であることに相当する。Ｌｏｃｈｒｉｅらによる研究では、ヒト血清およびＩＶＩＧによって認識される免疫原性残基が異なることが報告されており、異なるヒトはＡＡＶカプシド上の異なるエピトープのセットに対する種々の中和抗体を産生し得、中和からの完全なエスケープが容易ではないことが示唆される（Ｌｏｃｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００６ Ｊａｎｕａｒｙ； ８０（２）：８２１－３４）。本発明者らの研究により、種々の量および効力の抗ＡＡＶ抗体を含有するいくつかの異なる血清プールを使用した複数のラウンドの定向進化の使用の結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても、複数の抗ＡＡＶ抗体プールの存在下での細胞形質導入の増強が可能な新規のＡＡＶバリアントが単離されることが実証される。
動物およびヒトにおけるＡＡＶベクター構成成分に対する適応免疫応答により同じ血清型のＡＡＶベクターの再投与が妨げられることも多く、複数のベクター投与が必要な遺伝子送達適用が難しいものになっている。生体内分布研究に使用されたマウス由来の血清を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにより、これらの血清によるバリアントの中和が野生型ＡＡＶよりも少ないことが実証され（図１１）、バリアントは、ベクター再投与が必要な遺伝子治療戦略に有用であり得る。例えば、Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３はＡＡＶ２を注射されたマウス由来の血清によって中和されず、ＡＡＶ２はＳｈｕｆｆｌｅ１００－３を注射されたマウス由来の血清によって中和されず、このことから、このバリアントを野生型ＡＡＶ血清型と組み合わせてまたは複数のベクター投与が必要な適用において使用することができることが示唆される。結論として、本発明者らは、定向進化を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても、個々のヒト患者、プールされたヒト血清、およびマウス血清に由来する抗ＡＡＶ抗体による中和の低減が可能な新規のＡＡＶバリアントを単離した。
（実施例２）
霊長類の肺に対する遺伝子治療における使用に適したカプシドバリアントの同定
序論
定向進化戦略を使用して、ヒト中和抗体（ＮＡｂ）の存在下で、気管内エアロゾル投与後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）肺胞上皮ＩＩ型（ＡＴ ＩＩ）細胞への遺伝子送達効率が増強されたＡＡＶカプシドバリアントを同定した。簡単に述べると、野生型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｃａｐ遺伝子をいくつかの手法によって多様化して大規模遺伝子ライブラリー（ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ）を創出し、それらをパッケージングしてウイルス粒子のライブラリーを生成し、次いで、選択圧力を適用して、これだけに限定されないが、抗カプシド免疫応答、ある特定の組織に対する形質導入の限定、および特定の細胞型への標的化送達ができないことを含めた遺伝子送達の障壁を克服することができる新規のバリアントを単離した。
方法
細胞株およびライブラリーの作製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において三重トランスフェクションを使用してウイルスライブラリーを作製し、イオジキサノール勾配遠心分離およびＡｍｉｃｏｎ濾過によってウイルスを精製した。デオキシリボヌクレアーゼ抵抗性ゲノム力価を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した。
気管内注射および組織収集
選択に使用した各送達デバイスについて、４～６歳、体重５．５～６．０ｋｇの単一の雄カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に投与した。動物に、１０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１５μｇ／ｋｇのデクスメデトミジンを筋肉内（ＩＭ）送達して麻酔をかけた。５ｍＬのライブラリーを１．７５ｍｇ／ｍＬのヒト静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と予め複合体を形成させ、下記の通り投与した。各動物に５ｍｍの気管内チューブを挿管し、管の先端を鎖骨の高さ（気管分岐部のおよそ５ｃｍ上）に置き、その位置を蛍光透視法によって確認した。
ネブライザーデバイスを気管内チューブの遠位末端に接続し、バード人工呼吸器を使用して、２０ｃｍ Ｈ２Ｏの圧力で、１５±１回の呼吸／分の速度で呼吸を送達した。ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）カテーテル（Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に一片の０．１４４インチ星型チューブを取り付けて、気管内チューブ内の適当な位置選定を容易にした。カテーテルの先端を気管内チューブの先端のすぐ上に配置した。ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）カテーテルをＡｅｒｏＰｒｏｂｅ Ｃａｔｈｅｔｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍに接続し、人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒｔａｔｕｓ）を使用して、１８～２０ｃｍ Ｈ２Ｏの圧力で、２０回の呼吸／分の速度で呼吸を送達した。投与完了後、各動物に対して、抜管を行い、０．１５ｍｇ／ｋｇのアチパメゾールＩＭを与えて鎮静から解除した。動物を麻酔から完全に回復するまで視覚的にモニタリングした後、ホームケージに戻した。
１５±１日目に、訓練を受けた獣医職員により、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを使用し、静脈内に送達して安楽死を実施した。気管を含む肺を取り出し、以下に詳述されている通り解剖した。ＤＮＡをＡＴ ＩＩ細胞から単離し、ウイルスゲノム増幅まで－２０℃で保管した。
肺胞上皮ＩＩ型（ＡＴ ＩＩ）細胞の単離
ＡＴ ＩＩ細胞を非ヒト霊長類の肺から、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｆｌｕｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｙｐｅ ＩＩ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ２０１８， ｐｐ １２１－１２８に記載されている通り単離した。簡単に述べると、肺を、５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＥＧＴＡを含有するＰＢＳ５００ｍＬで、気管内に設置したシリンジを使用してフラッシュした。次いで、肺を１．２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ溶液２５０ｍＬで満たし、３７℃で１時間インキュベートした。肺をホモジナイズして肺の内側を覆う細胞を遊離させ、気道を廃棄した。Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配およびＣＤ１４／ＣＤ４５ Ｄｙｎａｂｅａｄを含む一連の包含および排除ステップ後にＡＴ ＩＩ細胞を単離した。ＡＴ ＩＩ細胞を、ＩＶ型コラーゲンでコーティングしたインサート上で２４時間プレーティングした後、ＤＮＡを単離した。細胞単離物の純度を保証するために、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒおよびサーファクタントタンパク質Ｃをフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学検査によって調査して特徴付けを行った。
治療用ベクター進化
用いたベクター進化プロセスが図１２に示されている。簡単に述べると、ＤＮＡ変異技法とｃａｐ遺伝子の独自の組合せを含むウイルスカプシドライブラリーを創出した（ａ）。次いで、ウイルスを、各粒子が、そのカプシドをコードするｃａｐ遺伝子の周囲の変異体カプシドで構成されるようにパッケージングし（ｂ）、精製した。カプシドライブラリーをｉｎ ｖｉｖｏにおける選択圧力下に置いた。目的の組織または細胞の型を収集して、標的に首尾よく局在したＡＡＶバリアントを単離した。上首尾のウイルスをＰＣＲ増幅によって回収した。上首尾のクローンを、繰り返し選択によって富化させた（段階Ｉ－（ｃ））。次いで、選択されたｃａｐ遺伝子に独自の再多様化を受けさせ、さらなる選択ステップによって富化させて、ウイルス適応度を反復して増加させた（段階２－（ｄ））。ベクター選択段階１および２の間にヒットとして同定されたバリアントを評価して、所望の特性を有するカプシドバリアントを同定した（ｅ）。
モチーフが以下の基準を満たした場合、「ヒット」と言明した：１）モチーフが、選択の２回またはそれよりも多くの連続したラウンドにおいて、配列決定された集団のおよそ５％を占める；または２）モチーフが、選択の１回または複数のラウンドにおいて、配列決定された集団の少なくとも１０％を占める。
結果
送達デバイスパラメータおよびＡＴ ＩＩ細胞の単離に関するパイロット研究
複数の臨床移転可能なデバイスとの下流の適合性を可能にするために、２種の送達デバイス、ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）カテーテル（Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）およびＣＲＯ独自のネブライザーを用いた。両方の送達デバイスを、パイロット研究において、換気パラメータにより全ての肺葉および肺胞嚢への十分な分布がもたらされることを確実にするためにエバンスブルー色素を送達し、評価した。どちらの送達デバイスでも、肺胞区画を含めた全ての葉への良好な分布が実証され、従属葉においてより強い染色が観察された。
ＡＴ ＩＩ細胞の単離プロトコールを、合計６つのＮＨＰ肺を使用して最適化した。プロトコール最適化の結果、治療用ベクター進化の間に使用した両方のＮＨＰ肺から単離されたＡＴ ＩＩ細胞の高い収率および純度がもたらされた。
治療用ベクター進化
治療用ベクター進化プログラムのラウンド１の開始前に、３７種のベクターライブラリーを合成し、製造し、特徴付けた。図１３Ａに示されている通り、プラスミドライブラリーの多様性は、ライブラリー当たりおよそ１×１０６種～１×１０８種未満の個々の独特のバリアントを含むことが推定される。これは、高品質で高度に多様なＡＡＶバリアントの出発ライブラリーに相当する。次に、選択の第１のラウンドのための十分な材料を生成するために各個々のライブラリーの作製を完了した。図１３Ｂに示されている通り、全てのライブラリーが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける治療用ベクター進化選択のための材料を作製するために十分なレベルで製造された。
３７種のライブラリー全てを組み合わせ、両方のＮＨＰに、ＡｅｒｏＰｒｏｂｅ（登録商標）またはネブライザーのいずれかを使用した単回用量エアロゾル投与によって首尾よく投与した。投与前に、ライブラリーを１．７５ｍｇ／ｍＬのヒト静脈注射用免疫グロブリンと一緒にインキュベートした。これは、高いが依然として生理的に関連性のあるヒトＮＡｂの肺粘液濃度に相当する。ＮＨＰ当たり１．７×１０１２ｖｇのライブラリー用量は、製造に関する考慮事項に基づく現行の実行可能な最大用量のおよそ１０分の１の用量に相当する。したがって、これは、肺胞空間においてＮＡｂの存在下でＡＴ ＩＩ細胞に形質導入することが可能なベクターの発見を可能にするためのストリンジェントな選択圧力に相当する。投与の２週間後にＮＨＰ肺を収集した。ＡＴ ＩＩ細胞を肺から単離し、ＤＮＡをＡＴ ＩＩ細胞から単離した。
ＡＡＶカプシドゲノムの上首尾の増幅
組織からのカプシド遺伝子の増幅は、ライブラリーベクターの目的の細胞型への上首尾の局在化を表す。各送達デバイスから増幅されたカプシド（図１４Ａ～Ｂ）を、配列分析のため、およびその後の選択のラウンドを開始するために（必要であれば）、ＡＡＶライブラリーパッケージングプラスミドにクローニングした。
配列決定分析
ライブラリー内の個々のクローンに対して配列決定を実施して、集団内のバリアントの頻度を決定した。各送達デバイスからの最低９０種のクローンに対する配列決定を実施した。バリアントを、配列決定データ内のモチーフの存在について評価した。バリアントを、多数の配列に存在する統合的バリエーション（例えば、カプシド内の一貫した場所における特定の点変異または特定のペプチド挿入配列）の存在に基づいてモチーフに群分けした。モチーフを、選択の２回もしくはそれよりも多くの連続したラウンドにおいて配列決定された集団の少なくとも５％、または選択の１回もしくは複数のラウンドにおいて配列決定された集団の少なくとも１０％を占める場合にのみ、さらなる評価に進めた。後者の基準を満たしたモチーフが図１５Ａ～Ｂに示されている。第１のラウンド後、どちらの送達デバイスを使用してもＡ１０１バリアント（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）への強力な収束が観察されたので、選択が完了したとみなした。
上記の順位付け基準に基づいて、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むＡ１０１カプシドバリアントを、ヒト中和抗体（ＮＡｂ）の存在下で、気管内エアロゾル投与後に霊長類の肺への遺伝子送達効率の増強を付与するものと同定した。Ａ１０１は、主にＡＡＶ１からなるが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６およびＡＡＶ９由来のアミノ酸も含むキメラである。
（実施例３）
肺に対するＡＡＶに基づく遺伝子治療を開発することでの最初の試みでは臨床的安全性が実証されたが、ＡＡＶ２ベクターの使用により、結局、肺細胞に対して効率的に形質導入して嚢胞性線維症における臨床的有用性を示すことはなかった。つい最近、ＡＡＶ１およびＡＡＶ５を含めたさらなるＡＡＶ血清型により、改善はされたが依然として最適ではない、エアロゾル化投与後の、霊長類の肺に対する形質導入が実証された。以下の実験データから、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶの、ヒト中和抗体の存在下でヒトＣＦＴＲなどの導入遺伝子を霊長類の肺全体にわたって効率的に送達するビヒクルとしての驚くべき適性が確認される。
３匹の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）へのエアロゾル投与後の、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したレポーター導入遺伝子（ＧＦＰまたはＥＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）による遺伝子送達を特徴付けた（病理組織の評価を含む）。ｒＡＡＶの噴霧送達により、末梢（気管支肺胞上皮領域）を含めた肺の全ての領域へのウイルスゲノムの頑強な送達がもたらされ、全身性生体内分布は最小限であり、そして、ｒＡＡＶにより肺胞を含めた肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介される。
材料および方法
中和抗体アッセイ
ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）を黒色の不透明な９６ウェルプレートに、１％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、３０，０００個の細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングした。細胞を２４時間プレートに接着させた後、実験を開始した。
各ＮＨＰ血清試料を１：１０、１：２５、１：５０の希釈度でアッセイした。各プレートに形質導入の陽性および陰性対照を含有させた。ＮＨＰ血清試料を、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）ルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結したＣＡＧプロモーターを含む核酸とを含むｒＡＡＶ、ＭＯＩ １，０００と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、各ＮＨＰ血清試料希釈物プラスｒＡＡＶを、２Ｖ６．１１細胞を含有する黒色の不透明な９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。形質導入後の４８時間でルシフェラーゼをＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸの添加と共に、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ基質を細胞に単一ステップで添加した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して発光を読み取った。
変動係数（ＣＶ）および標準偏差を全てのＮＨＰ血清試料希釈物および標準曲線の各点について算出した。ＮＨＰ血清試料を形質導入の陽性対照に対して正規化した。各ＮＨＰに中和抗体力価を割り当てた。各ＮＨＰ血清試料についての中和抗体力価を、≧５０％の形質導入が観察された最低血清希釈度と定義した。１：１０の血清希釈度で≧５０％の形質導入が観察されたＮＨＰを研究に含めるものとみなした。
試験系および免疫抑制
３匹の雄カニクイザルを研究に含めた。動物の年齢は４歳１０カ月～９歳８カ月の範囲で、体重は４．７３ｋｇ～７．０９ｋｇの範囲であった。動物はメチルプレドニゾロン（２０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）による免疫抑制を－７日目に開始して毎週１回受けた。
試験物品の調製および投与
（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）ＥＧＦＰに作動可能に連結したＣＡＧプロモーターを含む核酸とを含むｒＡＡＶの試験物品ロットを氷上で解凍し、まとめてプールし、製剤緩衝液中に、５ｍＬ中２．８０×１０１２ｖｇ／ｋｇの最終用量で各ＮＨＰに送達するために希釈した。各動物に対する試験物品希釈物を表３に提示する。動物をケタミンおよびデクスメデトミジンで鎮静させた。動物に挿管し、挿管チューブの先端を気管分岐部のおよそ５ｃｍ上に置いた。動物を投与のために椅子に座位で置いた。各動物に対して、希釈した試験物品５ｍＬをＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅＩＩ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ（Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ）にロードした。投与の間、圧力を１５～２０ｃｍ Ｈ２Ｏに調整した。１０パルスにわたって目に見えるミストが生じなくなるまで、１２～２４回の呼吸／分の速度で、試験物品を投与した（動物に４０分未満で連続的に投与した）。投与完了後、動物から抜管し、鎮静を解除した。
Figure 0007393565000018
生存、剖検、および組織収集
ＣＲＯ職員によるケージそばでの観察を－７日目から剖検時まで毎日２回、実施した。体重を毎週評価し、定義された時点で血液学的検査および臨床化学的検査のために血液試料を採取した。５７±１日目に、訓練を受けた獣医職員によるペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を使用した安楽死を、その後、両側開胸術およびヘパリン添加リン酸緩衝食塩水を用いた経心腔的灌流を実施した。灌流後、肺（気管を含む）、脳、脊髄（頸部、胸部、および腰部領域）、心臓（心室および心房領域）、肝臓、脾臓、骨格筋（上腕三頭筋、外側広筋）、横隔膜、および腎臓を採取した。組織の試料を採取し、その後のＤＮＡおよびタンパク質の単離のために急速冷凍した。さらなる試料を採取し、その後の免疫蛍光のためのパラフィン包埋および切片作製のために４％パラホルムアルデヒド（肺および神経組織の場合）または１０％中性緩衝ホルマリン（末梢組織の場合）中に固定した。
気管および肺を広範囲にわたって試料採取して、各分析プロセスのための多数の試料を準備した。肺を収集し、気管のできるだけ上側をクランプした。右肺の主気管支をおよそ１ｍｍ離して２回クランプした。クランプの間を切断することによって右肺を取り出した。図１６に記載されている通り、それぞれＤＮＡおよびタンパク質の単離のための１６の試料を右肺の一次／二次気管支、三次気管支、および肺胞を包含する領域から採取した。気管および左肺を４％パラホルムアルデヒドで膨張させ、１０×体積の４％パラホルムアルデヒド中に固定した。次いで、気管および左肺を、図１６に記載されている通り、気管、一次／二次気管支、三次気管支、および肺胞の試料が包含されるように切片作製した。
ウイルスゲノムの生体内分布
ウイルスゲノムの生体内分布を、Ｍａｔｔａｗａｎ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで、ＥＧＦＰ導入遺伝子配列を含有するＡＡＶウイルスゲノムのための適格なアッセイを使用して実施した。ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｑｉａｇｅｎ）および付随するＤＳＰ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して総ＤＮＡを組織試料から抽出した。９６ウェルプレートでｑＰＣＲ反応を実施し、各プレートは、標準曲線、ＱＣ試料のセット、および研究試料を含有した。反応当たりＮＨＰマトリックスＤＮＡ１，０００ｎｇのバックグラウンドで、高コピー、中コピー、および低コピー／反応で２連のＱＣ試料を調製した。可能な場合、組織ＤＮＡ試料を反応当たり１，０００ｎｇで試験した。特定の試料について上記の指定された量をロードすることが不可能な場合（ＤＮＡ濃度が低すぎる、または試料体積が限られていることが原因で）、より少ない量の試料ＤＮＡを分析した。
全ての試料反応を３連で実行し、第３の反応を２００コピーのｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＳＶ４０ ＤＮＡでスパイクして、潜在的なｑＰＣＲ阻害を評価した。第３のスパイクされたウェルにおける測定値によって示されるｑＰＣＲ阻害が１１０コピー未満の標的ＤＮＡで観察された場合、試料ＤＮＡをより少ない量で再分析した。
タンパク質発現の生体内分布
ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および付随する試薬を使用して総タンパク質を組織試料から抽出した。ＧＦＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用してＥＧＦＰを定量し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して総タンパク質を定量した。ＧＦＰおよび総タンパク質の両方について、反応を３連で実施し、各キットは標準曲線を含有した。
免疫蛍光イメージング
組織を、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｗａｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ ５を使用し、イヌ、ＮＨＰ、およびブタ組織に対する標準のプログラムを使用して処理してパラフィンブロックにした。Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｗａｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでスライドを１０μｍの厚さに切り、４℃で保管した。各研究動物（ｎ＝３）およびさらなる対照動物からの肺の切片６個（肺胞および気管支領域を含む）および気管の切片２個に対して免疫組織化学的検査を実施した。パラフィンスライドを標準のパラフィン抗体染色プロトコールを使用して脱水した。簡単に述べると、切片をキシレンで脱パラフィンし、漸減濃度の水中エタノール（１００％、９０％、７０％、５０％および３０％）を用いて再水和させ、その後、ＰＢＳ洗浄を行った。抗原回復を実施した後、抗体を用いた染色を熱誘導性エピトープ回復（ＨＥＩＲ）と圧力の組合せを使用して行った。スライドを煮沸クエン酸ナトリウム緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで、圧力下で３分間インキュベートした。スライドを室温に冷ました後、抗体染色を行った。抗原回復後、スライドを、一次ニワトリポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ＃１３９７０）を１：１０００の希釈で、二次ヤギ抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ａｂｃａｍ＃１７５７７９）を１：１０００の希釈で、およびＤＡＰＩを使用して染色した。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡を使用して蛍光イメージングを実施した。抗ＧＦＰシグナルを遠赤色チャネル（６４７ｎｍ）において１０００ｍｓで取得した。ＤＡＰＩシグナルを青色チャネル（３５５ｎｍ）において１００ｍｓで検出した。全ての画像をＺｅｉｓｓ ＺｅｎＰｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用し、抗ＧＦＰチャネルで同じパラメータおよび画素強度値を使用して処理した。
病理組織評価
組織のトリミング、包埋、切片作製、およびＨ＆Ｅ染色をＳｅｖｅｎｔｈ Ｗａｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで実施した。組織を、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ ５を使用し、イヌ、ＮＨＰ、およびブタ組織に対する標準のプログラムを使用して処理してパラフィンブロックにした。スライドを４μｍの厚さに切り、Ｌｅｉｃａ ＸＬ自動染色機を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。各研究動物（ｎ＝３）およびさらなる対照動物からの肺の切片１６個、気管の切片４個、および気管分岐部の切片１個に対して病理組織評価を実施し、組織病理学者は処理条件に関して盲検とした。所見の性質および重症度について標準の評価尺度を使用してスライドをスコア化した。
コンピュータ化されたシステム
血清中和抗体をスクリーニングするために、データを生成し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｇｅｎ５ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０３．１４、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌバージョン１５．３２を使用して分析した。
組織試料内のウイルスゲノムの定量のために、データを生成し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．４、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２を使用して分析した。
組織試料内のＥＧＦＰ発現の定量のために、データを生成し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｇｅｎ５ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０３．１４、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌバージョン１５．３２、およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２を使用して分析した。
代表的な免疫蛍光イメージングのために、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ ｚ１顕微鏡およびＺｅｎＰｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して画像を取得した。ＺｅｎＰｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して画像を処理した。画像を、提示用にＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔバージョン１５．３２に移した。
全てのデータ分析および編集をＭａｃｂｏｏｋ Ｐｒｏ ｒｕｎｎｉｎｇ ＯＳＸ（１０．１２．６）で行った。
結果および考察
抗ＡＡＶ中和抗体をスクリーニングすることにより研究に組み入れるＮＨＰを同定する
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清中の、配列番号１２のカプシドタンパク質を有するＡＡＶカプシドに対する中和抗体のレベルを評価するために、中和抗体アッセイを使用した。各ＮＨＰ血清試料に中和抗体力価を割り当てた。動物はセロネガティブであるとみなされ、また、１：１０の血清希釈度で≧５０％の形質導入が観察された場合、研究組み入れ基準に合格した。
全部で、２０のＮＨＰ血清試料を４つの９６ウェルプレートにわたって評価した。アッセイ合格基準を１）標準曲線の変動係数（ＣＶ）、２）未知の血清試料のＣＶ、および３）標準曲線についての実際のインプットタンパク質からのパーセント偏差について設定した。標準曲線についての許容されるＣＶを＜２５％と定義したが、実際のＣＶは５％を超えなかった。定量の限界の範囲内に入る、未知の血清試料についての許容されるＣＶを＜３０％と定義したが、実際のＣＶは１９％を超えなかった。標準曲線についてのインプットタンパク質からの許容されるパーセント偏差を＜２５％と定義したが、実際のパーセント偏差は１９％を超えなかった。全てのプレートが全てのアッセイ合格基準を満たし、これらのプレートからのデータを評価のために使用した。全体的に見て、評価した１１のＮＨＰ血清試料（５５％）が、配列番号１２のカプシドタンパク質を有するカプシドに対してセロネガティブであった（図１７）。１：１０の血清希釈度でのパーセント形質導入が高い上位３位のＮＨＰを研究への組み入れのために選択した。選択されたＮＨＰの全てで、ＮＨＰ血清の非存在下で観察される形質導入を上回る形質導入が実証された。この観察は以前の研究で認められており、未知の血清タンパク質との好都合な相互作用の結果である可能性が高い。選択されたＮＨＰのＩＤおよび１：１０の血清希釈度でのパーセント形質導入を表４に報告する。
Figure 0007393565000019
配列番号１２のカプシドタンパク質を含むバリアントカプシドの噴霧送達はＮＨＰにおける忍容性が良好である
研究設計を表５に要約する。全ての動物が試験物品投与後に正常に回復し、予定された剖検日まで生存した。研究の生存部分の間のいかなる時点においても、いずれの動物に関しても有意な臨床的所見は報告されなかった。血液学的および臨床化学的所見に関する参照範囲を外れる軽微な変化がいくつかの時点で一部の動物において認められたが、これらの変動は、正常な生理的変動であると解釈された。剖検時の肉眼的検査の間に主要な所見は報告されなかった。
Figure 0007393565000020
配列番号１２のカプシドタンパク質を含むバリアントカプシドは、肺の全ての領域への頑強な遺伝子送達を媒介する
剖検の間に得られた全ての試料について、ウイルスゲノムをｑＰＣＲによって定量して、バリアントカプシド（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）とＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したＥＧＦＰ導入遺伝子を含む核酸とを含むｒＡＡＶのゲノム生体内分布を決定した。
肺胞嚢、三次気管支、および一次／二次気管支からの試料に相当する、４８の肺試料（ＮＨＰ当たりｎ＝１６の試料；ｎ＝３のＮＨＰ）の全てにおいて、およそ１０４～１０５ｖｇ／μｇの範囲の大量のウイルスゲノムが観察された（図１８）。３匹の動物全てについて、異なる肺葉または異なる肺領域内のウイルスゲノムの量に有意差は認められなかった。少数の心臓および肝臓試料、ＮＨＰ Ｖ００３４２４由来の３（１５のうち）の心臓試料およびＮＨＰ Ｖ００２９６９由来の１０（１０のうち）の肝臓試料には検出可能なウイルスゲノムが存在していた。しかし、ＤＮＡ１μｇ当たりに存在するウイルスゲノムの量は、肺内に存在するウイルスゲノムの量の１，０００分の１～１０，０００分の１であった。骨格筋（上腕三頭筋、外側広筋）、横隔膜、腎臓、脾臓、脳および脊髄由来の試験した試料は全て、定量の下限（ＢＬＱ）を下回った。したがって、ｒＡＡＶの噴霧送達により、肺の全ての領域へのウイルスゲノムの頑強な送達がもたらされ、全身曝露は最小限である。
バリアントカプシド（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）は、肺の全ての領域へのタンパク質発現を媒介し、複数の細胞型に形質導入する
アッセイの定量の下限を上回るウイルスゲノムの存在がｑＰＣＲにより実証された全ての試料について、ＥＧＦＰタンパク質発現を定量した。この試料セットには、３匹全てのＮＨＰ由来の全ての肺試料、ＮＨＰ Ｖ００３４２４由来の３（１５のうち）の心臓試料、およびＮＨＰ Ｖ００２９６９由来の１０（１０のうち）の肝臓試料が含まれた。肺胞嚢、三次気管支、および一次／二次気管支からの試料に相当する、４８の肺試料（ＮＨＰ当たりｎ＝１６の試料；ｎ＝３のＮＨＰ）全てにおいてＥＧＦＰ発現が観察された（図１９）。発現は動物Ｖ００２９６９について、全ての領域および全ての肺葉にわたって最も高かった。３匹の動物全てについて、異なる肺葉内のＥＧＦＰタンパク質発現の量に有意差は認められなかった。一般に、肺胞領域由来の試料には平均または平均を上回る量のＥＧＦＰが含有されたが、この傾向は有意でなかった。ＮＨＰ Ｖ００２９６９由来のｑＰＣＲ＋肝臓試料により検出可能なＥＧＦＰタンパク質発現がもたらされたが、発現レベルは肺における発現レベルよりも桁違いに低かった。
これらの結果は、肝臓へのゲノムの局在化が肺へのゲノムの局在化よりも桁違いに低かったことを実証するゲノムの生体内分布データと一致する（図１８）。ＮＨＰ Ｖ００３４２４由来のｑＰＣＲ＋心臓試料はいかなる検出可能なＥＧＦＰタンパク質発現も含有しなかった。これらの結果から、配列番号１２のカプシドタンパク質を有するカプシドおよび導入遺伝子をコードする核酸を含むｒＡＡＶの噴霧送達により、肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介されることが実証される。
肺の異なる領域内の形質導入の程度をさらに定義するために、免疫蛍光イメージングを実施した。各研究動物（ｎ＝３）およびさらなる対照動物からの肺の切片６個（肺胞および気管支領域を含む）および気管の切片２個を表すスライドをスキャンし、各領域について代表的な画像を取得した。一般に、ＥＧＦＰ発現は、動物Ｖ００２９６９について、全ての領域および全ての肺葉にわたって最も高く、これは、ＥＬＩＳＡによって決定された、動物にわたって観察された相対的な発現量に対応する。気管および気管支内では、ＥＧＦＰ発現は主に線毛上皮層の細胞において観察された（図２０）。肺胞内では、広範なＥＧＦＰ発現が観察されたが（図２０）、ＡＴＩおよびＡＴＩＩ細胞は特定の細胞マーカーの使用なしに決定することはできない。これらの結果から、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドおよび導入遺伝子をコードする核酸を含むｒＡＡＶの噴霧送達により、肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介されることが実証される。
配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶの投与は安全であり、肺組織における炎症を生じさせない
ケージそばでの観察を、投与の１週間前から開始して、研究の生存部分全体を通して毎日２回、実施した。研究の研究生存部分全体を通して動物のいずれにおいても有意な臨床徴候は観察されなかった。血液試料の血液学および臨床化学分析を研究の生存部分全体を通して隔週で、および投与の１週間前に実施した。いくつかの個々の血液学および／または臨床化学検査値が基準範囲から外れたが、これらの値は主に生理的変動と解釈された。
剖検後、肺組織に対して病理組織評価を実施し、対照（投与を受けていない）動物と比較した。限局性の出血、黒色色素および肺胞空間への最小の単核細胞浸潤が全ての動物において観察され、これは、サルにおける一般的な偶発的所見である。さらに、気管における粘膜下リンパ系浸潤および気管分岐部の粘膜表面の炎症も偶発的所見である可能性があり、試験物品投与とは無関係である。有害であるとみなされた観察はなかった。処置された動物における所見に、対照動物において観察されたものと異なるものやより重症度が高いものはなかった。
結論
配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を有するカプシドおよびレポーター導入遺伝子（ＥＧＦＰ）をコードする核酸を含むｒＡＡＶは、カニクイザルへのレポーター遺伝子のエアロゾル送達により特徴付けられた。血清をプレスクリーニングして、試験物品カプシドに対する既存の中和抗体に対してセロネガティブである動物を同定した。動物（ｎ＝３）は、臨床的に関連する作動ネブライザーであるＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅＩＩデバイスを使用して送達された、ｒＡＡＶの実行可能な最大用量を受けた。
肺胞嚢、三次気管支、および一次／二次気管支からの試料に相当する、研究における３匹のＮＨＰ全てにわたる全ての肺試料において、大量のウイルスゲノム（ｑＰＣＲによる）および結果生じたＥＧＦＰ発現（ＥＬＩＳＡおよび免疫染色による）が観察された。少数の心臓および肝臓試料に少ないが検出可能なウイルスゲノムが存在し、他の全ての組織由来の全ての試料では検出可能なウイルスゲノムは示されなかった。これらのデータから、ｒＡＡＶの噴霧送達により、肺の全ての領域へのウイルスゲノムの頑強な送達がもたらされ、全身性生体内分布は最小限であり、そして、ｒＡＡＶにより肺胞を含めた肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介されることが実証される。ｒＡＡＶ送達およびＥＧＦＰ発現は動物の間で一貫しており、複数の気管支レベルおよび肺胞にわたる一様な分布ならびに頭側、中央および尾側セクションにわたる一様な分布が伴った。タンパク質発現データは肝臓へのゲノムの局在化が肺へのゲノムの局在化よりも桁違いに低かったことを実証するゲノムの生体内分布データと一致する。
さらなる実験を実施して、霊長類の肺内のＡＥＣＩＩ細胞に対する効率および特異性を決定する。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶに固有のものを超えるさらなる特異性が望ましい場合、細胞特異的プロモーターの使用を、的の導入遺伝子の発現を駆動するために使用する。本明細書に記載の実験から、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶを、嚢胞性線維症を有する対象の肺にＣＦＴＲ導入遺伝子を安全かつ有効に送達するため、および他の肺障害を処置するために治療用遺伝子を送達するために使用することができることが示される。
（実施例４）
概要
新しく単離した非ヒト霊長類の肺および移植が拒絶されたヒトドナーの肺由来の肺胞上皮２型（ＡＥＣＩＩ）細胞の細胞培養モデルを樹立した。このモデルを、ＡＥＣＩＩ細胞を標的とすることが同定された配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶの特徴付けに使用した。ｒＡＡＶ、および天然の血清型ＡＡＶ５を、ＡＥＣＩＩ細胞の気相液相界面（ＡＬＩ）培養における形質導入効率について評価した。配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶでは、感染効率（ＭＯＩ）３５，０００での頂端形質導入の後、ＡＡＶ５と比較して、ＡＥＣＩＩ細胞に対する形質導入の増強が示された。ｒＡＡＶではヒト抗ＡＡＶ抗体に対する強力な抵抗性も実証された。
ｒＡＡＶカプシドがＡＥＣＩＩ細胞を標的とすること、および感染力がヒトＡＥＣＩＩに移ることを確認するために、ＡＥＣＩＩ細胞をＮＨＰの肺および移植が拒絶されたヒトドナーの肺から単離し、肺環境を模倣するために気相液相界面で培養した。感染後の複数の時点でｒＡＡＶによる形質導入効率をＣＡＧプロモーターによって駆動されるレポーター高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現によって決定し、ＡＡＶ５．ＣＡＧ－ｅＧＦＰと比較した。このデータから、配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶバリアントが、天然に存在する血清型よりも感染力が強く（すなわち、ＡＡＶ５カプシドよりもよりも優れたトランスデューサーであり）、遺伝子疾患に対する処置の改善を潜在的にもたらすことが実証される。
ＡＡＶを用いた前臨床的および臨床的な遺伝子治療研究における１つの一般的な難題は、既存の中和抗体により上首尾の形質導入が阻害される恐れがあることである。ヒト集団内での配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶの、野生型ＡＡＶと比較した、中和抗体を回避する能力を理解するために、ｒＡＡＶ、ならびに野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイにおいてヒトＩＶＩＧに対して分析した。本明細書に提示されるデータは、配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶが、ヒトＩＶＩＧ（ＡＡＶ５の４倍およびＡＡＶ２の３２倍）に曝露した場合に、エアロゾル送達を介した処置および治療用ベクター進化プロセスの間に適用される選択圧力のために極めて重要な構成要素である、中和抗体に対する抵抗性を有することを報告する。
材料および方法
肺胞上皮２型細胞の単離
Ｆａｎｇら１，２に従い、非ヒト霊長類（ＮＨＰ、カニクイザル、ＣＲＯ）または移植が拒絶されたヒトドナーの肺（Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｗｅｓｔ、ドナーＩＤ：ＡＧＥＳ４３０）を使用して肺胞上皮２型細胞（ＡＥＣＩＩ）を単離した。ＮＨＰ細胞の単離に関しては、肺全体を利用した；ヒトドナーの肺に関しては、右中葉を切り分け、細胞の単離に使用した。気管支を、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）およびＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するカルシウムまたはマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａｌｃｉｕｍ ｏｒ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でフラッシュした後、エラスターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて膨張させた。組織を３７℃で１時間インキュベートした。肺をホモジナイズし、気管および気管支を除去した。細胞ホモジネートを、ガーゼの層を通過させて大きな残存片を除いた。細胞を、１００μｍおよび２０μｍのストレーナーを逐次的に通過させた。細胞を二段階Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）密度勾配（７０％および３０％）にロードし、１８００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。中間層を取り出し、遠心分離し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ１４およびＣＤ４５ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して単球およびマクロファージを除去した。残りの細胞を、ＩｇＧコーティングされたプレート上、３７℃で一晩インキュベートしてＴ細胞を除去した。翌日、非接着細胞をプレートから採取し、遠心分離し、低張液に供して赤血球を溶解させた（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ １：１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。得られた細胞を、ヒトＩＶ型コラーゲンコーティングされたインサート（Ｓｉｇｍａ、ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン、２５℃で１８～２４時間）に１．５×１０６個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、市販の補充物質、ウシ胎仔血清（１０％、ＨｙＣｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ならびにインスリン、トランスフェリン、およびセレン（１：２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を伴う気道上皮細胞基本培地（ＡＴＣＣ）中で培養した。播種の１日後、インサートをＰＢＳで２回洗浄して非接着細胞を除去した。気相液相界面（ＡＬＩ）の形成を確実にするためにインサートの上部を乾燥した状態に維持した。
ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色
ＡＬＩが実現された細胞を、培養下でのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色について調査した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、生細胞の高度に酸性の構成成分、例えば、ＡＥＣＩＩ細胞のリソソームおよび層状体によって吸収される指示色素である。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒはＡＥＣＩＩ細胞への印付けのために常套的に使用されている。
接着細胞におけるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒおよび顕微鏡検査
染色が同定されたインサート上の細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ濃縮物を培地中に希釈した（１：１０００）。生細胞染色のために、希釈したＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ１００マイクロリットルをインサートに添加した。細胞を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、インサートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ．１蛍光顕微鏡でイメージングした。無染色ウェルを対照として用い、露出を設定した。
細胞懸濁液におけるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒおよびフローサイトメトリー
細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と一緒に３７℃で１０分間インキュベートする。トリプシンを規定のトリプシン阻害剤（Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で非活性化し、細胞をインサートから採取し、３００×ｇで４分間遠心分離した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ濃縮物を培地中に希釈した（１：１０００）。希釈したＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ１００マイクロリットルを各細胞ペレットに添加し、ハーフスピードでボルテックスして混合した。無染色細胞試料を対照として使用して、フローサイトメトリーゲートを設定した。細胞を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒに流した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性集団を、染色されていない対照から右側にシフトする集団として同定した。
ＥｄＵ組み入れ
細胞増殖を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造者の指示に従って決定した。簡単に述べると、細胞にＥｄＵを２時間パルスし、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した（４℃で１５分間）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒアジドを含むＣｌｉｃｋ－ｉＴ反応カクテルを調製し、細胞と一緒に２５℃で３０分間インキュベートした。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを用いて２５℃で１０分間対比染色した。細胞をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ．１蛍光顕微鏡でイメージングした。
ベクター形質導入
ＮＨＰ ＡＥＣＩＩ細胞へ播種の２日後に形質導入した。ヒトＡＥＣＩＩ細胞へ播種の１日後に形質導入した。形質導入の日に、３種のインサートをトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。トリプシンを規定のトリプシン阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で非活性化した。細胞をインサートから採取し、血球計算器で計数した。インサート当たりの平均細胞数を決定し、それを使用して、インサート当たりに必要な総ウイルスゲノムを算出した。全ての実験について、インサート当たりの総体積１００μｌで感染効率（ＭＯＩ）３５，０００を使用した。細胞の頂端を、配列番号１２のカプシドタンパク質を有するカプシドとＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したＧＦＰ遺伝子とを含むｒＡＡＶ、またはＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したＧＦＰ遺伝子を含む血清型５のネイティブなＡＡＶに、４８時間曝露させた。感染の２日後、ウイルスをインサートから除去して気相液相界面を回復させた。ＮＨＰ細胞については感染の３日後に分析のために収集し、合計で５日間培養した。ヒト細胞については感染の６日後および１０日後に分析のために収集し、合計で７日間および１１日間培養した。
免疫細胞化学的検査（ＩＣＣ）
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した（４℃で１５分間）。細胞を、ＰＢＳ中、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中５％ヤギ血清および２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３０分間ブロッキングした。細胞を、サーファクタントタンパク質Ｃ抗体またはＩｇＧ対照（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、１：１００）と一緒に２５℃で２時間インキュベートした。一次抗体をＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎで３回洗浄し、その後、二次抗体（ヤギ抗家兎（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、１：５００）と２５℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＤＡＰＩを用いて２５℃で１０分間対比染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＩｇＧ対照を使用して露出を設定して、細胞をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ．１蛍光顕微鏡でイメージングした。
フローサイトメトリー
形質導入後、トリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて３７℃で１０分間細胞をはがした。トリプシンを規定のトリプシン阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で非活性化し、細胞をインサートから採取し、３００×ｇで４分間遠心分離した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒに流した。形質導入された（ｅＧＦＰ陽性）細胞を、形質導入されていない対照から右側にシフトする集団として同定した。
中和抗体に対する抵抗性アッセイ
ＨＥＫ２Ｖ６．１１（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した）細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり細胞３×１０４個の密度でプレーティングした。播種の２４時間後、感染前に、（ｉ）配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシド（「Ａ１０１」）と（ｉｉ）ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したルシフェラーゼ導入遺伝子とを含むｒＡＡＶ、ならびに野生型ＡＡＶ（血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、全てルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有する）を５つの希釈度１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００のヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞にｒＡＡＶおよび野生型ＡＡＶをＭＯＩ１，０００で感染させた。各プレートに形質導入のための陽性および陰性対照を含有させた。陽性対照は、ＩＶＩＧの非存在下のｒＡＡＶまたは野生型ＡＡＶのいずれかであった。形質導入の陰性対照は、血清もＡＡＶ．ＣＡＧ－ルシフェラーゼも伴わない培地であった。感染の４８時間後にＣｙｔａｔｉｏｎ ３（Ｂｉｏｔｅｋ）プレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
コンピュータ化されたシステム
ＦｌｏＪｏ， ＬＬＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してフローサイトメトリーデータを分析した。
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して、ＦｌｏＪｏ出力から平均および標準偏差を算出し、ヒストグラムを作成した。
血清中和抗体をスクリーニングするために、データを生成し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｇｅｎ５ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅバーション３．０３．１４、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析した。
結果および考察
非ヒト霊長類ＡＥＣＩＩ ＡＬＩ培養物の特徴付け
肺胞上皮２型細胞（ＡＥＣＩＩ）を非ヒト霊長類（ＮＨＰ）肺から単離し、気相液相界面（ＡＬＩ）で培養した。細胞をコラーゲンコーティングされたインサート上で培養し、ＡＥＣＩＩ特異的マーカーであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ色素およびサーファクタントタンパク質－Ｃ（ＳＰＣ）について分析した。１日目および５日目の細胞は、９０％を超えるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性細胞を含有したことがＩＣＣによって示され、フローサイトメトリーによって定量された（図２１Ａおよび２１Ｂ）。ＡＥＣＩＩ培養細胞を、培養下１日目および５日目に成熟ＡＥＣＩＩマーカーであるＳＰＣについても調査した。細胞は、ＩＣＣによると、分析時点でＳＰＣを発現していた（図２１Ｃ）。ＡＥＣＩＩ培養系をさらに特徴付けるために、細胞有糸分裂を経時的に調査した。有糸分裂を、ＥｄＵ組み入れ、その後のアジドと連結した蛍光色素を用いたＣｌｉｃｋ－ｉＴ反応によってモニタリングした。
有糸分裂を２日目から５日目まで調査し、蛍光顕微鏡法および核染色によって報告した（図２１Ｄ）。有糸分裂は播種の２日後に最も高かった；核へのＥｄＵ組み入れの欠如によって証明される通り、細胞を培養下で維持するにつれて、有糸分裂を受けている細胞の数が減少した。
非ヒト霊長類ＡＥＣＩＩ ＡＬＩ培養系における配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を有するカプシドを含むｒＡＡＶの特徴付け
ＮＨＰから単離されたＡＥＣＩＩ細胞の播種の２日後に、それらの細胞に、配列番号１２のバリアントカプシドタンパク質を有するカプシドとＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子とを含むｒＡＡＶ、または野生型ＡＡＶ５カプシドとＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子とを含むＡＡＶをＭＯＩ３５，０００で用いて形質導入を行った。感染の３日後、合計５日間培養して、細胞をｅＧＦＰ発現についてＩＣＣおよびフローサイトメトリーによって分析した。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶにより、ＡＡＶ５（約８％）と比較して有意に高いパーセンテージのｅＧＦＰ陽性細胞（約３０％）が得られ、これにより、より良好な形質導入効率が示された（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
ヒトＡＥＣＩＩ ＡＬＩ培養物の特徴付け
Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｗｅｓｔから入手したヒト肺の右中葉（ドナーＩＤ：ＡＧＥＳ４３０）を残りの肺セットから切り分け、ＡＥＣＩＩ細胞を単離した。細胞をコラーゲンコーティングされたインサート上で成長させ、ＡＬＩを実現した。純度を決定するために、２種のＡＥＣＩＩマーカー、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＰＣタンパク質発現を調査した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを、新鮮な分離株（０日目）から培養下で１１日間、経時的にモニタリングした。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性細胞は７日目までおよそ８０％であった。ＡＥＣＩＩがＡＥＣＩに分化転換するので、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ陽性細胞集団は１１日目にはおよそ５０％まで減少した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。細胞はまた、分析時点で強力なＳＰＣ発現を示した（図２３Ｃ）。
ＮＨＰ ＡＥＣＩＩ系と同様に有糸分裂を経時的にモニタリングした。同様の結果が観察され、培養下での最初の３日以内に最も多くの細胞が有糸分裂を受け、経時的に減少した（図２３Ｄ）。
ヒトＡＥＣＩＩ ＡＬＩ培養系における４Ｄ－Ａ１０１の特徴付け
播種の１日後、ヒトＡＥＣＩＩ細胞に、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶまたはｅＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ５をＭＯＩ３５，０００で感染させた。感染の６日後および１０日後、細胞を、形質導入効率の代理としてｅＧＦＰ発現についてイメージングした。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶでは、感染後の６日目および１０日目のどちらにおいても、ＡＡＶ５と比較して高レベルのｅＧＦＰ陽性細胞が示された（図２４）。細胞はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色を維持し、それにより、ＡＥＣＩＩ細胞表現型が示される。
中和抗体に対する抵抗性アッセイ
各ＩＶＩＧ希釈度における各ＡＡＶルシフェラーゼベクターの相対発光量（ＲＬＵ）を形質導入の陽性対照であるＡＡＶルシフェラーゼベクター単独に対して正規化した。正規化後、各ＩＶＩＧ希釈度の各ベクターを変換し、パーセント形質導入として表した。高いパーセント形質導入は低い中和と相関し、低いパーセント形質導入は高い中和と相関する。次いで、各ＡＡＶルシフェラーゼベクターに、５０％を超える形質導入に達する最低希釈度と定義される中和抗体力価を割り当てた。全体的に見て、４Ｄ－Ａ１０１により、中和抗体への抵抗に関して、試験した各野生型ＡＡＶと比較して改善が実証された（図２５、ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞のヒトＩＶＩＧの存在下でのパーセント形質導入が例示されている）。４Ｄ－Ａ１０１により、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９と比較して抗体回避の３２倍を超える増加が実証され、また、野生型ＡＡＶ５と比較して抗体回避が４倍良好であった（表６）。
Figure 0007393565000021
結論
ＡＥＣＩＩ細胞を単離し、ＡＬＩで培養し、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ染色およびＳＰＣ発現によって決定して、高い純度を維持した。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶにより、ＮＨＰおよびヒトＡＥＣＩＩ ＡＬＩ培養系のどちらにおいてもＡＡＶ５と比較して優れた形質導入効率が示された。
配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶの、プールされたヒトＩＶＩＧ中の中和抗体を回避する能力により、患者に対するｒＡＡＶの治療的有望性が増強されることが実証された。これらの結果に基づいて、既存の中和抗体が存在することに基づいて処置から除外される標的患者集団の部分がはるかに少なくなる可能性がある。
（実施例５）
配列番号１２のＶＰ１カプシドタンパク質、配列番号１２のアミノ酸１３８～７３６を含むＶＰ２カプシドタンパク質および配列番号１２のアミノ酸２０３～７３６を含むＶＰ３カプシドを含むカプシドと、導入遺伝子をコードする核酸（例えば、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子またはＣＦＴＲなどの治療用導入遺伝子）とを含む組換えＡＡＶ粒子の溶解性、送達、および保管のために最適な製剤緩衝液を選択し、特徴付けるために、製剤スクリーニング研究を行った。
全ての研究を、親和性（ＡＶＢ）および陰イオン交換（ＣＩＭＱＡ）クロマトグラフィーによって精製されたカプシド（配列番号１２のＶＰ１を含む）を用いて実施した。最初の研究を、０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃを伴うＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）中に予め製剤化した精製された材料を用いて行った。これらのロットを希釈したか、または関連性のある緩衝系への緩衝液交換を行った。後の研究を、ＣＩＭＱＡ精製の直後に適当な緩衝系への直接の緩衝液交換を行ったロットを用いて行った。
凍結融解安定性
１ｍＬ当たり約２～３×１０１３ウイルスゲノムを含有する少量の試料一定分量（≦１００μＬ）を１．５ｍＬのポリプロピレン管に移し、５サイクルまたは１０サイクルのいずれかの、急速凍結（すなわち、－８０℃での急冷）に供し、その後、氷の結晶が目に見えなくなるまでの室温で解凍した。別の研究において、およそ約６×１０１１ウイルスゲノム／ｍＬを含有する≧５ｍＬの体積を１５ｍＬのポリプロピレンＦａｌｃｏｎ管に移し、－８０℃におよそ１時間置き（凍結するまで）、次いで、室温でおよそ１時間、穏やかに混合して、氷の結晶が観察されなくなるまで解凍した。このプロセスをさらに２回繰り返した（３×ＦＴ）。第３の凍結融解サイクル後に試料を室温で一晩保管した。
５℃、室温、３７℃および４０℃／７５％ＲＨにより安定性が促進された
１ｍＬ当たりおよそ１×１０１２～６×１０１３ウイルスゲノムの濃度範囲の様々な試料の一定分量を（≦１００μＬ）１．５ｍＬのポリプロピレン管または２．０ｍＬのポリプロピレンクリオバイアルに入れ、５℃、室温、３７℃および４０℃／７５％ＲＨで各研究プロトコールの所定の時間保管した。試料管をベント収納ボックスで保管し、試料保管中の蒸発損失の影響を最小限にするためにパラフィルムを常套的に使用した。
撹拌安定性
１ｍＬ当たり約２～３×１０１３ウイルスゲノムを含有する少量の試料一定分量（≦１００μＬ）を１．５ｍＬのポリプロピレン管に移し、１５００ｒｐｍに設定したボルテックスミキサーに固定した試料ボックスの内部に入れた。試料を室温で２～４日間撹拌した。
荷電状態モデリング
エクセルに基づく荷電状態の計算器（オンラインダウンロード；Ｇａｌｅ Ｒｈｏｄｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍａｉｎｅ）を、イオン化可能で不安定な残基が自動的に抽出され、定量されるように改変した。カプシドタンパク質単量体（例えば、ＶＰ１およびＶＰ３）の正味の電荷を、各イオン性種に、各ｐＨ間隔（≦１ｐＨ単位）で部分的な負電荷および部分的な正電荷を付加することによって決定した：
負電荷寄与＝残基数＊－１＊（１０＾－（ｐＫａ－ｐＨ）／（（１０＾－（ｐＫａ－ｐＨ））＋１）
正電荷寄与＝残基数＊（１０＾（ｐＫａ－ｐＨ）／（（１０＾（ｐＫａ－ｐＨ））＋１）
Figure 0007393565000022
報告された等電点（ｐＩ）は、正味の電荷が０に最も近いと数学的に決定されたｐＨである。
２８０ｎｍにおける吸光係数（理論値）
ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を使用して、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質のモル質量を既知の一次配列に基づいて決定した。２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を以下の方程式に従って算出した：（Ｍ－１ ｃｍ－１）＝（＃Ｔｒｐ）（５，５００）＋（＃Ｔｙｒ）（１，４９０）＋（＃シスチン）（１２５）。注：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は全てシステイン残基を５つ含有するが、文献によると、ＡＡＶシステインはジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ＝シスチン）を形成しない。次いで、Ａｂｓ２８０ｎｍ ０．１％（または１ｍｇ／ｍＬ溶液と等しい吸光度単位）を、モル吸光係数をモル質量で割ることによって算出した。
Figure 0007393565000023
２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）およびＵＶ分光測定による濁度
試料（または緩衝液）およそ３０μＬを３ｍｍの石英キュベットに移し、ＵＶスペクトル（２５０～４００ｎｍ；１ｎｍ間隔）をＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で収集した。あるいは、複数の試験物品（または緩衝液）をＵＶ Ｓｔａｒ ９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＵＶスペクトル（２５０～４００ｎｍ；１ｎｍ間隔）をＣｙｔａｔｉｏｎプレートリーダーで収集した。マイクロタイター試料ウェルの経路長を、９７７および９００ｎｍにおける吸光度を測定し、以下の方程式に当てはめることによって経験的に決定した：
Figure 0007393565000024
緩衝液および試料のスペクトルを、各波長において測定された光学濃度（Ｏ．Ｄ．）をキュベットまたは試料ウェルの経路長で割ることによって経路長１ｃｍのセルに対して正規化した。２連で実行した場合は正規化されたスペクトルを平均した。試料のスペクトルを、対応する緩衝液ブランクに対する正規化されたＯ．Ｄ．値を引き算することによってバックグラウンド補正した。２８０ｎｍにおける光散乱の寄与（ＬＳ２８０）を、非吸収ＵＶ領域（約３００～４００ｎｍ）から得られたｌｏｇ－ｌｏｇ外挿を使用して算出し、Ｏ．Ｄ．２８０－ＬＳ２８０＝Ａ２８０から引き算した。光散乱補正したＡ２８０に試料希釈係数（適切な場合には）を掛け、理論的なＶＰ３吸光係数（Ａｂｓ２８０ｎｍ ０．１％＝１．７１）で割って、推定カプシドタンパク質濃度をｍｇ／ｍＬ単位のタンパク質として得た。しかし、この方法では、ＤＮＡの吸光度に起因してカプシドタンパク質の過大評価が起こりやすい。あるいは、この報告において、ＤＮＡの吸光度に起因するカプシドタンパク質の過大評価を回避するために、さらなる変換なしにＡ２８０値を提示する。Ｏ．Ｄ．３５０値を最初に使用して、自己会合から生じる光散乱または濁度の変化を半定量的にモニタリングした。しかし、この報告では、３５０／Ａ２８０値も提示し、散乱を可溶性画分におけるカプシドの量に対して正規化している。
ｐＨ
少体積または大体積のｐＨプローブを使用して、それぞれ試料または緩衝液のｐＨを測定した。ｐＨプローブを、ｐＨ４．０１、７．０１、１０．０１の包装済みＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ｐＨ標準液を使用して較正した。
凝固点降下法による重量オスモル濃度
参照溶液（例えば、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）または試料１５μＬをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒのフリーザーチャンバーに移した。試料を凍結するまで過冷却し、プラトーが観察されるまで温度をモニタリングした。プラトー温度を使用して、以下の方程式に従って重量オスモル濃度を算出した：溶質１ｍＯｓｍ／水１ｋｇ＝凝固点の１．８５８ミリ度（ｍ°Ｃ）の降下。
動的光散乱による流体力学的サイズおよび多分散
試料およそ３０μＬを清潔な３ｍｍのキュベット（ＺＮ２１１２）にロードし、複数のスキャン（ｎ＝２または３）をＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａで収集した（分散剤＝水、試料型＝タンパク質）。スキャンを平均して強度（％）および体積（％）についてのプロットを生成した。低レベルのＨＭＷ種は強度（ＬＳ 約直径６ 約Ｍｗ２）によってより容易に観察されるので、前者を初期製剤スクリーニングの間に利用した。適切な場合には、同様にスキャンを平均してＣｕｍｕｌａｎｔｓ Ｆｉｔｓによる多分散、強度による平均サイズ（１０～１００ｄ．ｎｍ）、体積による平均サイズ（１０～１００ｄ．ｎｍ）、強度による％面積（１０～１００ｄ．ｎｍ）および体積による％面積（１０～１００ｄ．ｎｍ）についての値も生成した。
Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｍａｇｉｎｇ（ＢＭＩ）によるサブビジブル粒子の選別
バックグラウンドメンブレンイメージング（ＢＭＩ）をＨｏｒｉｚｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで実施した。ブランクの９６ウェル試料プレートをホライゾンシステム（Ｈｏｒｉｚｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）にロードし、バックグラウンド画像を取得した。次いで、プレートを真空マニホールドに移した。ウェル当たりおよそ２０～３０μＬの試料をロードした。ブロッティングペーパーおよびブロッティングペーパーアダプターを真空マニホールドに取り付け、試料プレートをスタックの上部に再配置した。真空をオンにしてウェルの底部に残ったあらゆる液体を除去した。続いて、試料プレートをＨｏｒｉｚｏｎ機器に移した。粒子計数および画像を採取した（２～１０μｍ、１０～２５μｍ、＞２５μｍ、および全体）。
ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）による力価
凍結一定分量５～１０μＬをＳＯＰ－ＡＤ－０１８に従ったｄｄＰＣＲによるＡＡＶゲノム濃度の決定にかけた。配列番号１２のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶの試料を、０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ－６８非イオン界面活性物質（ＤＰＢＳ＋０．０２％Ｆ６８）を含有する、カルシウムおよびマグネシウムを伴うダルベッコリン酸緩衝食塩水中に希釈し、デオキシリボヌクレアーゼＩ酵素と混合してあらゆるカプシド形成されていないＤＮＡを消化し、ＤＰＢＳ＋０．０２％Ｆ６８を用いてさらに希釈して、試験物品をアッセイのダイナミックレンジ内に入れた。デオキシリボヌクレアーゼで処理した試料を続いてｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒｍｉｘおよびＳＶ４０（またはＣＦＴＲ）プライマー／ＦＡＭ標識プローブと混合した。次いで、反応混合物２０μＬを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ａｕｔｏ ＤＧ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを使用してドロップレット中に分配し、ＰＣＲに供し、次いで、各ドロップレットを個別に蛍光シグナルについて測定するＢｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒで読み取った。陽性および陰性ドロップレットのポアソン統計分析を使用して標的配列（複数可）の絶対的な定量をもたらすＢｉｏ－Ｒａｄ ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用してデータを分析した。鋳型なしの対照を使用して、試料についての陰性ベースラインを設定した。デオキシリボヌクレアーゼＩ酵素による処理を伴わないｄｄＰＣＲも選択された試料に対して実施した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による化学的純度
凍結一定分量５～１０μＬを、ＳＯＰ－ＡＤ－０２８ Ｒｅｖ．００（Ｋｒｙｐｔｏｎ（商標）染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるカプシド純度の決定）またはＳＯＰ－ＡＤ－００２（銀染色ＬＤＳ－ＰＡＧＥによるカプシド純度の決定）に従った化学的純度分析にかけた。手短に述べると、およそ１．００×１０１０（ＳＯＰ－ＡＤ－０２８）または１．００×１０９（ＳＯＰ－ＡＤ－００２）ウイルスゲノムを４×ＬＤＳ試料緩衝液、１０×試料還元剤、水と混合し、９５℃で１０分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを、上部チャンバー（１×ＳＤＳ緩衝液＋抗酸化剤）および下部チャンバー（１×ＳＤＳ緩衝液）を含有するゲルボックスに固定した。熱変性させ（還元した）反応混合物をゲルにロードした。ゲルボックスカバーを取り付け、外付け電源に電極を接続した。次いで、製造者の仕様に従って電力を印加した。試料色素の前方がゲル全体の長さの≧４分の３になったら電流フローを停止した。ゲルを洗浄し、製造者の指示に従って染色した。ゲルイメージングをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｅｒで実施した。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現による機能活性
凍結一定分量１５μＬを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の分析にかけた。ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞に１０，０００ＭＯＩでの形質導入を行い、形質導入の７２時間後に収集した。ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡法によってイメージングし、フローサイトメトリーによって定量した。
精製ＡＡＶの、ダルベッコリン酸緩衝食塩水に基づく製剤緩衝液（０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ－６８非イオン界面活性物質（ＤＰＢＳ＋０．０５％Ｆ６８）を含有する、カルシウムおよびマグネシウムを伴うダルベッコリン酸緩衝食塩水）への、≧１×１０１３ウイルスゲノム／ミリリットル（ｖｇ／ｍＬ）までの濃縮および緩衝液交換の間、配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドを有するｒＡＡＶの有意な減少（約５０％）が観察された。本明細書に記載の実験により、減少の根本原因が決定され、優れた製剤緩衝液が記載される。
配列番号１２のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のｐＩはそれぞれ６．７、７．４および６．８であると推定された。ＶＰ１はＶＰ２およびＶＰ３と比較して有する荷電残基の数が多く、これが、ｐＨ５未満およびｐＨ９より上で観察される正味の電荷の理論差の原因である可能性がある（図２６）。しかし、ｐＨ５～ｐＨ９の間の正味の電荷は、ＶＰ１とＶＰ３でほぼ同様であるようである、その一方、ＶＰ２についてはいくらかのわずかな差異が予測される。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３単量体は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）および遊離のシステイン（Ｃ）残基を含有する。したがって、ＶＰ１およびＶＰ３単量体は、低ｐＨではアスパラギン酸シャッフリングを、中性／塩基性ｐＨでは脱アミドを、高ｐＨでは酸化およびジスルフィドシャッフリングを受けやすいと想定される。
ＤＢＰＳのｐＨはおよそ７．０である。これは、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質のｐＩまたは理論的な溶解度の最小値に非常に近い。したがって、接線流濾過による濃縮および緩衝液交換の間に観察される物理的不安定性においてｐＨが役割を果たし得ることが疑われた。
ｐＨ対溶解度
配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドとＧＦＰをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ出発材料（ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中、約２×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を解凍し、低イオン強度（約１４ｍＭのＮａＣｌ）および生理的イオン強度（約１５０ｍＭのＮａＣｌ）の両方で、種々の緩衝液（ｐＨ４～８）中におよそ２×１０１２ｖｇ／ｍＬまで１０倍希釈した。低イオン強度製剤では、ｐＨが４から８に上昇するにつれて高分子量（ＨＭＷ）種のｐＨ依存性の増加が示された。このｐＨ依存性は１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で有意に低下した。
続いて、試料を室温で保管し、次いで、翌日にＵＶ分光測定によって評価した（Ｔ＝１日、室温で）。図２７において、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度（Ａ２８０）がｐＨに対してプロットされている。低イオン強度試料では、ｐＨ５を超えるとＡ２８０シグナルの非常に急激な低減が示され（すなわち、ｒＡＡＶ濃度の低下が推測される）、これは、ＤＬＳによって観察された物理的不安定性と一致していた。１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する全ての試料で同様のＡ２８０値が示された。これらのデータから、より低いｐＨおよび塩の添加により溶解度が改善されるようであることが示される。製剤の詳細、試料のｐＨおよびＡ２８０値（光散乱および経路長補正済み）は以下に見いだすことができる：
Figure 0007393565000025
これらの結果から、イオン強度とｐＨの両方がｒＡＡＶの溶液状態での挙動に影響を及ぼすことが示唆されるようである。したがって、追跡研究を行って、ｐＨ５から８までの、塩化ナトリウム（約０．１５Ｍのイオン強度）またはクエン酸三ナトリウム（高イオン強度）の存在下でのｒＡＡＶの溶解限度をさらに評価した。配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドとルシフェラーゼをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ出発材料（ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中、１．７６×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を解凍し、種々の緩衝液（表７）中、およそ３×１０１３ｖｇ／ｍＬの標的まで緩衝液交換し濃縮した。プロセス収率を、回収されたウイルスゲノムを出発材料のウイルスゲノムで割ることによって推定した。ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｆ６８製剤および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８製剤について回収率の低下が観察された。これらの低収率もまた、緩衝液交換および濃縮のより遅い速度に対応するようである。
Figure 0007393565000026
塩化ナトリウムを含有する試料で同様のｐＨ依存性傾向、すなわち、ｐＨの上昇に伴う溶解度の低下が力価およびＡ２８０によって示された。高イオン強度製剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８＋１００ｍＭのクエン酸ナトリウム＋０．００５％Ｆ６８）に関して、試験した製剤の中で最も高い溶解性が示され、これにより、イオン強度の影響がさらに実証された。０．２μｍで濾過した試料についてｐＨ依存性傾向があるようであった、すなわち、より低いｐＨでＯ．Ｄ．３５０が増加した。しかし、３５０／Ａ２８０値もプロットして、可溶性画分中のｒＡＡＶの量に対する物理的不安定性を表わした。３５０／Ａ２８０により、ｐＨ５において不安定性が示された。しかし、ｐＨ６において屈曲が観察され（１０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８）、これは、高い溶解性と物理的安定性の平衡を表すようである。高イオン強度製剤ではｐＨ６製剤と同等の濁度が示された。図３５（表７のデータに対応する）によって例示される通り、より低いｐＨでは０．１５ＭのＮａＣｌの存在下で溶解性の改善が示され（塩濃度が約１５０ｍＭのＮａＣｌである場合、ｐＨ５および６ではｐＨ７および８と比較して溶解性が高い）、より高いｐＨにおいて溶解性を「回復する」ためにはイオン強度の増加が必要であることが明白に実証される。これらの所見から、クエン酸塩、ｐＨ６製剤の使用が最終的にもたらされた。
ＤＬＳ（動的光散乱）により、高イオン強度製剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８＋１００ｍＭのクエン酸三ナトリウム＋０．００５％Ｆ６８）以外は、濃縮された試料中のＨＭＷ種のレベルの変動が示された。しかし、ＨＭＷ種は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８製剤において観察された持続性のサブミクロン種以外は、０．２μｍでの濾過後に大きく減少した。これは、同じ試料について観察された３５０／Ａ２８０の増加と一致する。
この研究の結果から、ｐＨ≦６の場合、またはイオン強度を０．１５Ｍよりも高くした場合、ｒＡＡＶを≧３×１０１３ｖｇ／ｍＬで製剤化することが可能であることが示唆された。しかし、低ｐＨ（例えば、ｐＨ５）では可溶性ＨＭＷ種のリスクがあり得、より高いｐＨ製剤では、ＦＤＡの不活性成分データベースによる他の承認された吸入用製品に見いだされる量を超えるイオン強度調整剤（例えば、クエン酸ナトリウム）の濃度が必要な可能性がある。したがって、次の研究は、２０～１００ｍＭのクエン酸ナトリウムの影響も評価しながら、製剤のｐＨ範囲を狭めること（６～８）を目的とした。
配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドとＧＦＰをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ出発材料（ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中、８．７５×１０１２ｖｇ／ｍＬ）を解凍し、種々の緩衝液（表８；全ての製剤が０．００５％Ｆ６８も含む）中に、およそ３×１０１３ｖｇ／ｍＬの標的まで、緩衝液交換し、濃縮した。緩衝液のｐＨおよび重量オスモル濃度（ｒＡＡＶを伴わない）は表９に見いだすことができる。製剤化された試料を０．２μｍで濾過し、一定分量をポリプロピレン管に入れた。各製剤について１つの一定分量をＴ＝０測定に使用し、次いで、４日間の室温で１５００ｒｐｍでの撹拌に供した。別の一定分量を使用して、凍結融解（５／１０×ＦＴサイクル）、室温での保管（Ｔ＝１３日）および２８日間の保管（２～８℃で１５日間、その後、室温で１３日間）の影響を評価した。ｒＡＡＶ出発材料を、ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｆ６８中、８．４６×１０１２ｖｇ／ｍＬで、選択された条件下で評価した。
Figure 0007393565000027
 から導き出された概算の推定値である
Figure 0007393565000028
多数の製剤および条件をスクリーニングする必要があるので、ｄｄＰＣＲによる力価分析を控えめに使用した。しかし、Ｔ＝０における試料力価は約２．３～２．９×１０１３ｖｇ／ｍＬの範囲であった（表１０）。このわずかな変動性は、大多数の条件が＞９０％の回収率を満たすかまたはこれを超えたようなので、プロセスの規模の小ささに関連すると想定された。例外として、ｆＰＤ＿２０１９＿００６＿００３、ｆＰＤ＿２０１９＿００６＿００５およびｆＰＤ＿２０１９＿００６＿００７については全てでより低い回収率が示された。試料力価を２８日間の保管（２～８℃で１５日間、その後、室温で１３日間）後にも測定した。全ての製剤でＴ＝０に対して≧１００％の力価が保持された。
Figure 0007393565000029
製剤のいずれについても、試験した条件で、％体積による流体力学的サイズに関して観察された有意な変化はわずか～全くなかった。したがって、一般には低レベルのＨＭＷ種の存在に対してより感度が高い、％強度による流体力学的サイズについてオーバーレイを生成した。ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０５およびｆＰＤ＿２０１９＿００６－１０では、１５００ｒｐｍで４日間の撹拌後にピーク幅の増加が示された。これは、試料多分散のプロットにおいても観察することができた。出発材料（ｆＰＤ＿２０１９＿００６－１３）のＴ＝０における多分散は、スクリーニングした１２種の製剤のいずれよりも大きく、これにより、元のＤＰＢＳ製剤に対する改善がさらに示唆された。
表９は、Ａ２８０値ならびにＴ＝０に対する％残存Ａ２８０を含む。４日間の１５００ｒｐｍでの撹拌後のｆＰＤ＿２０１９＿００６－１１およびｆＰＤ＿２０１９＿００６－１３（ＤＰＢＳ対照）およびｆＰＤ＿２０１９＿００６－０３、ならびに、２８日間の保管後にわずかな降下が見られたｆＰＤ＿２０１９＿００６－０８以外は、大多数の製剤でそれらのそれぞれのＡ２８０シグナルの≧９５％が保持された。
撹拌した試料に関して、他の試験条件と比較して有意に多数の粒子が観察され、これは、撹拌の長さが過度に攻撃的であった可能性があることを意味する。しかし、適用される異なるストレス要因に対する製剤の応答は変動するようであった。例えば、ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０５では、撹拌後に、含有される＞１０μｍの粒子の数が増加した一方、ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０９およびｆＰＤ＿２０１９＿００６－１０では、１０回の凍結融解後に計数の増加が示された。
研究ｆＰＤ＿２０１９＿００６において生成された力価および物理的安定性に関する結果を、半定量的重み付け系を用いて評価し、ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０１（２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８）、ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０２（５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋７０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８）、ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０８（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ５＋５０ｍＭのＮａＣｌ＋５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム＋０．００５％Ｆ６８）およびｆＰＤ＿２０１９＿００６－１２（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８＋１００ｍＭのクエン酸三ナトリウム＋０．００５％Ｆ６８）が全て、さらに研究すべき好都合な特徴を示すことが決定された。この決定に続いて、２８日間試料の残りの一定分量を、Ｋｒｙｐｔｏｎ染色ＰＡＧＥによって分析した。試験した全ての試料においてＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が観察された。低分子量（ＬＭＷ）バンドも種々の存在量で観察された；ｆＰＤ＿２０１９＿００６－０１におけるものが最も顕著であった。残念ながら、Ｔ＝０は、これらのＬＭＷバンドが分解生成物なのかプロセス不純物なのかが不明であったので、比較のために利用不可能であった。したがって、化学的安定性を追跡研究において評価した。
配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドとＣＦＴＲをコードする核酸とを含むｒＡＡＶのＣＩＭＱＡプール（ｌｏｔ＃ｄＰＤ＿２０２０＿００１、７．９２×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を、ｆＰＤ＿２０１９＿００６において同定された４種の緩衝液中へ直接、およそ３×１０１３ｖｇ／ｍＬの標的まで、緩衝液交換し、濃縮した。ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｆ６８中、配列番号１２のＶＰ１を有するカプシドとＧＦＰをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ（Ｌｏｔ＃４ＤＥＲ００００５７ ｖｇ／ｍＬ）を、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８中、およそ６Ｅ１３ｖｇ／ｍＬの標的まで、緩衝液交換し、濃縮した。続いて、ｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ製剤およびｒＡＡＶ－ＧＦＰ製剤の一定分量をポリプロピレン管に入れ、１０回の凍結融解サイクル、１５００ｒｐｍで４０時間の撹拌、または４０℃で４０時間の保管のいずれかに供した。
Figure 0007393565000030
ｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ、Ｔ＝０における力価は、１．７～１．９×１０１３ｖｇ／ｍＬの範囲であった。これは、３×１０１３ｖｇ／ｍＬの標的よりも≧３０％の低下であったが、溶解限界（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）ではなく、作業体積の小ささに起因するものであった。ｐＨ７およびｐＨ８製剤（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０２およびｆＰＤ＿２０２０＿００１－０３）では撹拌ストレスに供した場合におよそ４％の低下が示された一方、ｐＨ６製剤（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０１およびｆＰＤ＿２０２０＿００１－０４）については低下が観察されなかった。この安定性の傾向は４０℃では有意に拡大し、ｐＨ７およびｐＨ８製剤では≧９０％の低下が示された一方、ｐＨ６の低下は＜３０％であった。４種のｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ製剤の全てで、１０回の凍結融解サイクル後に≧１００％の力価が保持された。ｒＡＡＶ－ＧＦＰ（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０５、Ｔ＝０において５．３Ｅ１３ｖｇ／ｍＬ）はｐＨ６において非常に安定であることが判明し、撹拌中には低下せず、４０℃での保管、１０回の凍結融解サイクル中の低下は＜３％であった。同じ緩衝液中に製剤化されたｒＡＡＶ－ＣＦＴＲと、ｒＡＡＶ－ＧＦＰの間の相対的な安定性の差異は、導入遺伝子サイズに関連すると推測された。しかし、今後のさらなる研究が必要である。
ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０２（ｐＨ７）およびｆＰＤ＿２０２０＿００１－０３（ｐＨ８）では、４０℃での保管中にｐＨ６試料と比較してより大きなＡ２８０シグナル減少が示された。これは、力価について観察された傾向と一致するが、減少の大きさは縮小した。これは４０℃での保管中の空のカプシド（および遊離のＤＮＡ）の量の増加に関連し得る。空のカプシドおよびＤＮＡは依然としてＵＶ光を吸収するであろうが、後者は、デオキシリボヌクレアーゼ処理を受けやすいであろう。ｒＡＡＶ－ＧＦＰ製剤（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０５）についてのＡ２８０に関する結果も力価分析と一致する；最小の変化～変化なし。
Figure 0007393565000031
強度プロットによる流体力学的サイズについて、全てのｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ試料について４０℃でのピーク幅の増加が示された。ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０１において低レベルのＨＭＷ種が検出された。しかし、力価およびＵＶの有意差から、安定性の低い製剤では、沈殿、表面吸着または空／完全カプシド比の変化に起因して、このピークが存在しないことが示唆され得る。サイズの差は体積ではあまり明白ではないが、多分散がわずかな差異に対して高感度であることも判明した。他の試験方法と一致して、ｒＡＡＶ－ＧＦＰではわずかな変化が示された～変化が全く示されなった。
４０℃での保管の結果、Ａ１０１－ＧＦＰ製剤（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０５）について、２～１０μｍの粒子計数が多くなったようである。これは、濃度依存的な現象である（すなわち、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ力価がｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ試料のおよそ３倍である）ことが想定された。興味深いことに、この試料は＞１０μｍの粒子の数が比較的少ないことを示しており、これは、おそらく、製剤ではより大きな凝集体の形成が妨げられることを示唆する。同じ緩衝液中に製剤化されたｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０１）については、撹拌および熱に対する感受性が示されたが、＞２５μｍの粒子の形成には抵抗性するようであった。他のｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ製剤では＞２５μｍの粒子へのわずかな傾向が示された。
Ｔ＝０、１５００ｒｐｍで４０時間、または１０×ＦＴ後で有意差は観察されなかった。しかし、ｐＨ７（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０２）製剤およびｐＨ８（ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０３）製剤ではＬＭＷ種の増加が示され、過負荷であるようであった。逆に、ｆＰＤ＿２０２０＿００１－０１では、４０℃での保管後にいくつかのＨＭＷバンドの存在が示された。しかし、これが試料調製または染色手順に関連するアーチファクトであるかどうかは不明であった（例えば、銀染色は非定量的であると考えられる）。幸運にも、同じ試料に対してウエスタンブロット分析も実施された。ウエスタンブロットにより、ｐＨ７およびｐＨ８ ４０℃試料が過負荷（力価に基づく負荷）であることが明白に実証された。これにより、Ａ２８０と比較して不釣合いな力価の低下が、空のカプシドの増加に起因する可能性があるという観念がさらに支持される。ウエスタンブロット分析により、４０℃でのｆＰＤ＿２０２０＿００１－０１試料についてＨＭＷバンドは観察されなかった。
製剤スクリーニングの試みの大部分では、ｒＡＡＶの物理的安定性を改善すること、およびより低い程度に、化学的安定性をモニタリングすることに焦点が当てられている。しかし、重要な部分；機能活性については依然として対処されていない。したがって、ｆＰＤ＿２０２０＿００１研究において試験した製剤のうちの３種に関して、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ機能活性を評価した。ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｆ６８中ｒＡＡＶ－ＧＦＰ（１．５８×１０１３（１．５８ａ１０１３）ｖｇ／ｍＬ）を、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８（ｆＰＤ＿２０２０＿００２－０１）、１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７＋５０ｍＭのクエン酸塩＋５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８（ｆＰＤ＿２０２０＿００２－０２）または５０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ６＋７０ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８（ｆＰＤ＿２０２０＿００２－０３）中、およそ３×１０１３ｖｇ／ｍＬの標的まで、緩衝液交換し、濃縮した。続いて、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ製剤の一定分量をポリプロピレン管に入れ、室温で１３日間保管した。Ｔ＝０における力価を測定し（表１２）、値をＴ＝０試料およびＴ＝１３日間試料の両方に適用した（すなわち、機能試験に対して同じ負荷体積）。
Figure 0007393565000032
Ｔ＝０における流体力学的サイズを評価した。３種の試験した製剤について差異は観察されなかった。室温で１３日間の保管中にＡ２８０シグナルの減少は観察されなかった（表１４）。
Figure 0007393565000033
蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーの結果から、全てのｒＡＡＶ－ＧＦＰ試料で緑色蛍光タンパク質発現が示された一方、ビヒクルについては蛍光が観察されなかったことが実証された。室温で１３日間の保管後に観察された％ＧＦＰ陽性細胞の差異はわずか～全くなく、これは、３種の製剤全てでｒＡＡＶ機能活性が保存されたことを意味する。
ｆＰＤ＿２０２０＿００１およびｆＰＤ＿２０２０＿００２研究の結果に基づいて、２種のクエン酸塩、ｐＨ６製剤の最終的な評価を進めることを決定した。２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８中に製剤化された精製ｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ（４Ｄ１３０１０９）（ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０１、ｌｏｔ＃ｄＰＤ＿２０２０＿００７）および５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋８５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８中に製剤化された精製ｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ（４Ｄ１３０１０９）（ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０２、ｌｏｔ＃ｄＰＤ＿２０２０＿００７）を解凍し、一定分量（約１００μＬ）をポリプロピレン管に入れた。各製剤について２つの一定分量（ｎ＝２）をＴ＝０測定に使用した。残りのバイアルを４０℃／７５％ＲＨに置き、４時間後（ｎ＝２）、２０時間後（ｎ＝２）または４４時間後（ｎ＝２）に抜き取った。２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６製剤（ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０１）には以前の研究において良好な安定性が示された同じ緩衝液を使用した。５０ｍＭのクエン酸塩製剤は、以前の研究においてわずかな変化が同定された５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６製剤と同様であり、溶液張度を増加させるためにＮａＣｌ濃度を７０ｍＭから８５ｍＭに上昇させた。２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６緩衝液、および５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６緩衝液の重量オスモル濃度は、それぞれ２８９ｍＯｓｍ／ｋｇおよび２９５ｍＯｓｍ／ｋｇであった。
Figure 0007393565000034
ｄｄＰＣＲによる力価分析（ｎ＝２）を、ＤＮＡアーゼによる前処理ありで、およびＤＮＡアーゼによる前処理なしで行った。２つの方法間で測定可能な差異が観察され、これにより、遊離のカプシドＤＮＡおよび／またはデオキシリボヌクレアーゼ感受性のカプシド（例えば、混乱している（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）または化学的に損傷を受けている）のいずれかの存在が示唆される。しかし、４０℃／７５％ＲＨでの力価の低下は２つの製剤について同等であった。
ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０２（５０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６製剤）についてＡ２８０シグナルの減少の増加が観察され、これは、おそらく、可溶性画分のいくらかの部分の塩析（または沈殿）を示唆するものである。興味深いことに、濁度がｆＰＤ＿２０２０＿００３－０１について増加し、これにより、より低いクエン酸塩濃度の溶液中で維持された混乱した種の存在がさらに示唆される。
ＤＬＳは、濁度に関する結果への傾向があった。試料ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０１では、４０℃／７５％ＲＨにおいて２０および４４時間で検出可能なレベルのＨＭＷ種が強度によって示された一方、種は、ｆＰＤ＿２０２０＿００３－０２には存在しないようであった。このピークはピーク面積％および多分散に関して観察された差異を説明するものである。
試料を化学的純度についてもＰＡＧＥによって分析した。観察は、以下の通りである。どちらの製剤についてもＴ＝０において切断産物が検出された。おそらく、これらは、下流の精製で残存したプロセス不純物である。低レベルの切断産物は４０℃／７５％ＲＨにおいて長時間かけて形成し始める。どちらの製剤の化学的純度も同等であるようである。
これらの結果に基づいて、クエン酸塩の増加により、４０℃／７５％ＲＨにおけるｒＡＡＶ－ＣＦＴＲの物理的安定性にわずかな改善が付与され得ることが決定された。しかし、これが真の保護効果であるかどうかも、Ａ２８０の同時の低下が、物理的に不安定な種が塩析されたことを示唆するものであるかどうかも、不明であった。さらに、５０ｍＭのクエン酸塩では、２０ｍＭのクエン酸塩製剤と比較して力価低下の低減は示されず、ＰＡＧＥによると、どちらの製剤でもＬＭＷ種が同様に増加したようであった。したがって、５０ｍＭのクエン酸塩製剤では、吸入用薬物製品への許容性が低い可能性があるより高いクエン酸塩濃度を正当化するだけの十分な改善がもたらされないことが決定された。
したがって、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８製剤がＮＨＰパイロット毒性／用量範囲決定研究のためのリード製剤として確証された。仮のパイロット毒性試験物品要件は表１６に見いだすことができる。低用量（約６×１０１１ｖｇ／ｍＬ）凍結融解安定性を評価するための研究（ｆＰＤ＿２０２０＿００６）を実施した。
Figure 0007393565000035
２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００５％Ｆ６８中、ｒＡＡＶ－ＣＦＴＲ（４Ｄ１３０１０９、ｌｏｔ＃４ＤＥＲ００００６０．０２、約３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を、同じ製剤緩衝液中に、およそ６×１０１１ｖｇ／ｍＬの標的まで希釈した（総体積５．５ｍＬで低用量）。一定分量１００μＬをＴ＝０における力価およびＤＬＳのために取り出した。残りの材料を－８０℃のフリーザーに１時間入れた。管を取り出し、室温で１時間解凍した。解凍した管を穏やかに反転させて混合し、一定分量１００μＬをＤＬＳおよび力価のために取り出した（１×凍結融解）。このプロセスをさらに２回繰り返した。第３の凍結融解サイクル後、材料を室温で一晩保管した。
３回の凍結融解（３×ＦＴ）サイクルを通じて力価の変化はほとんど示されなかった一方、３×ＦＴ試料を室温で一晩保管した場合、力価のわずかな低下（約１０％）が観察された。しかし、この値は依然としてｄｄＰＣＲアッセイの変動の範囲内であり、したがって、最悪のシナリオとみなした。
ＤＬＳにより凍結融解試料に物理的安定性に有意差は観察されなかった。Ｔ＝０、２×および３×ＦＴ試料のより少量の一定分量（約５０μＬ）についても、室温でさらに１時間の保管後に測定した（２時間の全解凍）。これらの試料において変化は観察されなかった。
（実施例６）
ヒト細胞における４Ｄ－７１０のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ特徴付け
（ｉ）配列番号１２のカプシドと（ｉｉ）配列番号４５のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶ（４Ｄ－７１０）の、ヒト細胞へ形質導入するおよび配列番号４３のコドン最適化されたヒトＣＦＴＲ導入遺伝子（ｃｏｈＣＦＴＲΔＲ、アミノ酸７０８～７５９が欠失した機能的なＣＦＴＲ遺伝子をコードする）を送達する能力を評価した。ヒト細胞は、ＨＥＫ２ｖ６．１１、１６ＨＢＥ１４ｏ－Ｇ５４２Ｘ（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを通じて入手したもの）およびｅｘ ｖｉｖｏ ＡＬＩ非ＣＦ培養物であった。治療用導入遺伝子カセットのタンパク質発現、タンパク質の膜への局在化およびｍＲＮＡ発現を評価した。
材料および方法－ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。細胞を、ウエスタンブロット分析のために、１％ｖ／ｖのＮＰ－４０を含有するＰＢＳ中に４℃で３０分間溶解させた後、不溶性材料を除去した。ウエスタンブロッティングのために、１×ローディング色素および還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｏｌｔ）を含有する等体積の溶解物を５０℃で１０分間加熱し、次いで、４～１２％ビス－トリスアクリルアミドゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｏｌｔ）にロードし、２５０Ｖで４５分間流した。ゲルを半乾燥で、「高ＭＷ」転写設定のＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏで０．２μＭのニトロセルロース（ＢＩＯ－ＲＡＤ）に転写した（１０分間、１．３Ａ）。次いで、ブロットを超純水で手短にすすいだ後、１×ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１０分間ブロッキングした。次いで、ブロットを、抗ＣＦＴＲ抗体（Ａｂ６６０、ＣＦＦ／ＵＮＣ １：５００）または抗チューブリン抗体（Ｅ－７、ＤＳＨＢ １：１０００）を含有する１×ｉＢｉｎｄＦｌｅｘ溶液中、室温で穏やかに振とうしながら２時間インキュベートした。次いで、ブロットを、振とうしながら０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で５分間洗浄した。この洗浄ステップをさらに２回繰り返した。次いで、ブロットを、１×ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ溶液中、抗マウス－ＨＲＰ二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：５０００）中、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ－０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を用いた洗浄ステップを繰り返した。次いで、洗浄したブロットをＤｕｒａＷｅｓｔ ＨＲＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）で５分間コーティングし、次いで、ブロットをＢＩＯ－ＲＡＤ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでイメージングした。
材料および方法－免疫細胞化学的検査。免疫細胞化学的検査のために、２ｖ６．１１細胞をポリ－Ｌ－リシンコーティングされたガラスチャンバースライド上で成長させ、１６ＨＢＥ１４ｏ－を、ウシＩ型コラーゲンおよびヒト血漿フィブロネクチンの両方でコーティングされたトランスウェルインサート上で成長させた。形質導入の２日後（２ｖ６．１１）または４日後（１６ＨＢＥ１４ｏ－）、細胞を４％ＰＦＡ中に、室温、暗闇中で２０分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを伴わない）中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで透過処理し、ブロッキング緩衝液中、ＣＦＴＲ ＭＭ１３－４抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１００）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液は、ＰＢＳ中、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、５％ヤギ血清、および２％ウシ血清アルブミンからなった。抗体をＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎで洗い流した後、二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）をブロッキング緩衝液に添加し、室温、暗闇中で１時間置いた。続いて、二次抗体を洗い流した。核を、ＰＢＳ中４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、次いで、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、カバーガラスを被せ、続いて、イメージングした。細胞をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１蛍光顕微鏡を使用してイメージングした。Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＬＬＣ、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ）を使用して画像加工を行った。
材料および方法－ＲＮＡ抽出およびドロップレットデジタルＰＣＲ。ＲＮＡを細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して単離し、Ｍａｘｉｍａ Ｈ ｍｉｎｕｓ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡ試料を、１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中での段階希釈によって調製した。次いで、試料を、ｄｄＰＣＲスーパーミックス、およびＣＦＴＲΔＲ（配列番号４３）または内因性ＣＦＴＲ遺伝子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれかを標的とするプライマー／プローブセットを含有するマスターミックスにプレーティングした。次いで、試料を、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用してナノリットルのドロップレットに分配し、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）でのエンドポイントＰＣＲに供し、各ドロップレットを個別に蛍光シグナルについて測定するＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）で読み取った。次いで、データを、陽性ドロップレット（閾値を超える蛍光シグナルを含有するドロップレット）および陰性ドロップレット（閾値を下回る蛍光シグナルを有するドロップレット）のポアソン統計分析を使用して、標的配列（複数可）の絶対的な定量をもたらすＢＩＯ－ＲＡＤのＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析をさらに行った。
結果
最初の概念実証である４Ｄ－７１０を用いた形質導入後の導入遺伝子発現およびタンパク質の膜への局在化を、比較的単純な系である（より複雑なヒト気相液相界面細胞モデルと比較して）ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞株へ形質導入することによって評価した。ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞は、ヒト胎児由来腎臓株であるＨＥＫ－２９３Ｔに由来し、ヒトアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６タンパク質のポナステロンＡ誘導性発現を有する。複数のＡＡＶ血清型により、この細胞株への高い形質導入効率が可能である。簡単に述べると、ＨＥＫ２ｖ６．１１を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを伴うＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。集密になったら、細胞を種々のＭＯＩで４８時間処理した。ポナステロンを１μｇ／ｍｌまで添加して、ＡＡＶベクターからの発現を増加させた。細胞をウエスタンブロットによってまたは免疫細胞化学的検査によって分析し、４Ｄ－７１０を用いて２４時間形質導入し、形質導入の４８時間後にウエスタンブロットによってまたは免疫細胞化学的検査（ＩＣＣ）によって分析した。４Ｄ－７１０のＨＥＫ２ｖ６．１１細胞への用量依存的形質導入を、感染効率（ＭＯＩ）を上昇させてウエスタンブロットによって実証した（図２８Ａ）。ＥＲコア－グリコシル化形態のタンパク質を反映するＢバンド（１５０ｋＤａ）、および、完全にグリコシル化された成熟形態のＣＦＴＲを反映するＣバンド（１７０～１８０ｋＤａ）を認めることができ、適切なタンパク質翻訳および細胞プロセシングが示唆される。代表的な免疫蛍光画像により、ＣＦＴＲタンパク質の用量依存的形質導入（図２８Ｂ）ならびに細胞質での発現（図２８Ｂ）および膜での発現（図２８Ｃ）がさらに実証される。形質導入されていない対照では、内因性ＣＦＴＲタンパク質が検出されないことが示され、これにより、検出されたタンパク質が形質導入されたＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子であることが示される。したがって、未成熟形態および成熟形態のＣＦＴＲΔＲが作製されるだけでなく、ＣＦＴＲΔＲタンパク質の膜発現がＩＣＣ（抗ＣＦＴＲ抗体およびＦ－アクチン抗体を使用して細胞膜を染色する）によって観察された。
ヒト肺細胞株に対する４Ｄ－７１０を用いた形質導入を評価した。１６ＨＢＥ１４ｏ－Ｇ５４２Ｘ細胞は、ＣＦＴＲヌル変異（Ｇ５４２Ｘ、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集を使用して生成）を有し、かつＣＦＴＲを発現しない、不死化ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞株（元々、複製起点欠損ＳＶ４０プラスミドで不死化された）である。１６ＨＢＥ１４ｏ－Ｇ５４２Ｘ細胞を、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１０９５－０７２）プラス１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ２６１４０－０７９）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）中で培養した。細胞をトランスウェルインサート中に、インサート当たり細胞９，０００個で播種した。培地を上部（１００μＬ）および底部（５００μＬ）の両方に添加した。播種後３日目に、細胞の頂端を種々のＭＯＩで処理し、７２時間置いた。細胞を、免疫細胞化学的検査、またはコドン最適化されたＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡ（４Ｄ－７１０導入遺伝子）に特異的なプライマーおよびプローブを使用した逆転写－ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｄｄＰＣＲ）によって分析した。外因性ＣＦＴＲタンパク質を検出するために、形質導入をドキソルビシンによる処理（１μＭ）と並行して実施し、培養培地中、２４時間置いた。４Ｄ－７１０によるヒト気管支上皮細胞への形質導入後のコドン最適化されたＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子の転写物レベルを評価するために、１６ＨＢＥ１４ｏ－Ｇ５４２Ｘ培養物へ、４Ｄ－７１０を漸増ＭＯＩで用いて形質導入した。４Ｄ－７１０を用いたＨＢＥへの形質導入をさらに確認するために、ＲＴ－ｄｄＰＣＲを実施して、ＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡのコピー数を決定した。図２９Ａは、漸増ＭＯＩに対するＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡのコピー数の用量依存的応答曲線を示す。ドキソルビシンの存在下で、形質導入された細胞を免疫細胞化学的検査によって同定し（図２９Ｂ）、５０，０００ＭＯＩでは３５，０００ＭＯＩと比べてより多数の細胞が形質導入された。したがって、ヒト気管支上皮細胞に対する用量依存的形質導入およびこれらの疾患と関連性のあるヒト細胞におけるＣＦＴＲ導入遺伝子の頑強な発現が実証された。
気相液相界面（ＡＬＩ）培養物は健康な（非ＣＦ）肺に由来し、したがって、ＣＦＴＲの内因性発現を有する。内因性ＣＦＴＲを、短縮型４Ｄ－７１０ ＣＦＴＲ導入遺伝子の発現と、内因性ＣＦＴＲに特異的またはＣＦＴＲΔＲ ＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブを使用したＲＴ－ｄｄＰＣＲを使用して区別した。ｅｘ ｖｉｖｏ非ＣＦ肺の標準のＡＬＩ培養は、ｉｎ ｖｉｖｏ肺系の最良のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルである（これらの培養物は、均一でない細胞型との複合体である（ｉｎ ｖｉｖｏにおける肺と同様に））。簡単に述べると、ｅｘ ｖｉｖｏヒトＡＬＩ非ＣＦ肺培養物をＩＶ型コラーゲンコーティングされたＣｏｒｎｉｎｇトランスウェルインサートにプレーティングし、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、ゲンタマイシン、およびアンホテリシンＢを含むＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ ＡＬＩ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０５０４０）中、製造者のプロトコールに従って基礎培養した。播種の３０日後にＡＬＩ培養物が成熟したら、培養物の頂端を、０．６２５μＭのイダルビシンの存在下で、種々のＭＯＩで処理し、培養培地中、２４時間置いた。形質導入の７日後、細胞を、内因性ＣＦＴＲに特異的またはＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブを使用したＲＴ－ｄｄＰＣＲによって分析した。ｅｘ ｖｉｖｏ健康ＡＬＩ肺への形質導入後のコドン最適化されたＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子の転写物レベルを評価するために、ＡＬＩ培養物に、イダルビシンの存在下、４Ｄ－７１０をＭＯＩ５０，０００および１００，０００で用いて形質導入した。形質導入の７日後にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ－ｄｄＰＣＲを調製された試料に対して実行し、ドロップレット当たりの転写物レベルをコピー／μＬ値として分析した。定量により、設定された閾値を超える、調査したプライマー／プローブセットの転写物を含有するドロップレットの数を分析した。コドン最適化されたヒトＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を内因性ヒトＣＦＴＲ遺伝子と明確に弁別するために、２種のプライマー／プローブセットを創出した。予測通り、形質導入されていないＡＬＩ培養物では定量の限界レベルを下回るＣＦＴＲΔＲ転写物が発現された（図３０）。４Ｄ－７１０を用いた形質導入後、細胞においてＣＦＴＲΔＲ転写物の用量依存的な増加が示された（図３０）。５０，０００ＭＯＩでは、ＣＦＴＲΔＲの転写物レベルは内因性ＣＦＴＲレベルの約８０％である（図３０）。１００，０００ＭＯＩでは、ＣＦＴＲΔＲ転写物は内因性ＣＦＴＲレベルに達し、一部の場合では、それを超えて上昇した（図３０）。これらのデータから、４Ｄ－７１０により、ｅｘ ｖｉｖｏ肺ＡＬＩ培養物に形質導入し、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を用量依存的に発現させることができること、および、高ＭＯＩにおいて、ＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡが内因性ＣＦＴＲを超えて増加することが例示される。
結論－４Ｄ－７１０は、肺の呼吸に関する状態である、ＣＦＴＲ変異によって引き起こされる嚢胞性線維症を、好ましくは肺への単一用量エアロゾル送達によって処置するために設計された、組換えＡＡＶ遺伝子置き換え治療用製品である。４Ｄ－７１０は、肺への治療用遺伝子産物の送達に驚くほど有用であると定向進化によって同定された配列番号１２のカプシドタンパク質と、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む異種核酸（配列番号４５のヌクレオチド配列は、ＣＭＶ１７３プロモーター（配列番号４４）に作動可能に連結した、コドン最適化されたヒト嚢胞性線維症遺伝子治療ペイロード（配列番号４３）を含む）とを含む。本明細書で提供される、ヒト細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおけるデータから、４Ｄ－７１０により、嚢胞性線維症クラスＩ変異を含有するヒト気管支上皮細胞における、および健康ＡＬＩ肺培養物における、ヒトＣＦＴＲ転写物および導入遺伝子発現が回復することが実証された。さらに、４Ｄ－７１０による形質導入後に発現するＣＦＴＲタンパク質が、ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞において発現され、翻訳後にグリコシル化され、細胞質および細胞膜に局在した。これらのデータから、４Ｄ－７１０により、ヒト肺細胞株に形質導入し、検出可能なＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡを送達し、ＣＦＴＲタンパク質の用量依存的な産生および発現されたＣＦＴＲタンパク質の膜への局在化をもたらすことが可能であることが実証される。安全、頑強かつ広範にわたる形質導入およびエアロゾル送達後の最小限の全身曝露での霊長類の肺全体にわたる導入遺伝子発現が実証されている実施例３および実施例７のデータと組み合わせて、これらのデータは、嚢胞性線維症および他の肺障害に対する遺伝子治療の開発のための既存のＡＡＶ血清型を超える大幅な進歩を表す。
（実施例７）
カニクイザルの肺への４Ｄ－７１０のエアロゾル送達についての用量範囲およびパイロット安全性研究
操作されたウイルスベクターの、様々な用量レベルの範囲内での単回エアロゾル化投与後に細胞に形質導入し、ＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子を気道、肺、および他の組織において発現させる能力を評価するための、カニクイザルにおけるパイロット研究において４Ｄ－７１０治療用製品の安全性および形質導入活性を試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を開始した。実施例６において考察されている通り、４Ｄ－７１０は、配列番号１２のカプシドタンパク質と配列番号４５の異種核酸とを含むｒＡＡＶである。４Ｄ－７１０の異種核酸構成成分は、配列番号４４のＣＭＶ１７３プロモーターに作動可能に連結した、配列番号４３のヌクレオチド配列－コドン最適化されたヒトＣＦＴＲΔＲ導入遺伝子－を含む。意図された治療用導入遺伝子カセットの発現および機能をカニクイザル霊長類においてｉｎ ｖｉｖｏで特徴付けた。血清をプレスクリーニングして、試験物品カプシドに対する既存の中和抗体に対してセロネガティブである動物を同定した。動物に、ビヒクル（製剤緩衝液のみ）、３×１０１２ｖｇの４Ｄ－７１０、または３×１０１３ｖｇの４Ｄ－７１０を、遠位肺への最適な送達を確実にするためにＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅＩＩデバイス（Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、喉頭のすぐ下に、内視鏡的に送達した。８週間後、選択された組織（肺、心臓、骨格筋、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、脳、脊髄、気管気管支リンパ節、および精巣）を分析のために収集した。ウイルスゲノムをｑＰＣＲによって定量した。検出可能なウイルスゲノムを含有する組織試料をＣＦＴＲΔＲ転写物についてＲＴ－ｑＰＣＲによって評価し、肺試料を切片作製し、ＣＦＴＲタンパク質発現についてＩＨＣによってイメージングした。
下記のデータから、４Ｄ－７１０の噴霧送達により、末梢（気管支肺胞上皮）領域を含めた肺の全ての領域へのウイルスゲノムの頑強な送達がもたらされ、全身性生体内分布は最小限であり、そして、４Ｄ－７１０によりＣＦＴＲΔＲ転写物および肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介されることが実証される。ビヒクルまたは試験物品４Ｄ－７１０（３×１０１２および３×１０１３ｖｇ）を投与された動物での有害な安全性所見は報告されなかった。
材料および方法
中和抗体アッセイ
ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手したもの）を黒色の不透明な９６ウェルプレートに、１％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、３０，０００個の細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングした。細胞を２４時間プレートに接着させた後、実験を開始した。
各非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清試料を１：１０、１：２５、１：５０の希釈度でアッセイした。各プレートに形質導入のための陽性および陰性対照を含有させた。ＮＨＰ血清試料を、ウイルスと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルに４Ｄ－Ａ１０１．ＣＡＧ－ルシフェラーゼ（配列番号１２のカプシドタンパク質とＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したルシフェラーゼをコードする異種核酸とを含むｒＡＡＶ）をＭＯＩ１，０００で感染させた。１時間のインキュベーション後、各ＮＨＰ血清試料プラス４Ｄ－Ａ１０１．ＣＡＧ－ルシフェラーゼ希釈物を、ＨＥＫ２ｖ６．１１細胞を含有する黒色の不透明な９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。形質導入の４８時間後にルシフェラーゼをＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸの添加と共に、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ基質を細胞に単一ステップで添加した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して発光を読み取った。
変動係数（ＣＶ）および標準偏差を全てのＮＨＰ血清試料希釈物および標準曲線の各点について算出した。ＮＨＰ血清試料を形質導入の陽性対照に対して正規化した。各ＮＨＰに中和抗体力価を割り当てた。各ＮＨＰ血清試料についての中和抗体力価を、≧５０％の形質導入が観察された最低血清希釈度と定義した。１：１０の血清希釈度で≧５０％の形質導入が観察されたＮＨＰを研究に含めるものとみなした。
試験系および免疫抑制
７匹の雄カニクイザルを研究に含めた。動物の年齢は４．７歳～４．９歳の範囲であり、体重は３．８ｋｇ～６．０ｋｇの範囲であった。動物は、メチルプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）による免疫抑制を－７日目に開始して安楽死および組織採取（Ｄ４９）の１週間前まで毎週１回受けた。さらなる詳細は、医薬品開発業務受託機関（ＣＲＯ）による研究報告書（係属中の前臨床試験報告書（Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｐｏｒｔ Ｐｅｎｄｉｎｇ））に提示されている。
試験物品の調製および投与
４Ｄ－７１０の試験物品（ＴＡ）ロットおよびビヒクルを、５ｍＬ中、３×１０１２ｖｇおよび３×１０１３の最終用量で送達するために製剤緩衝液中に希釈した。ＴＡを室温で＞１時間解凍し、管を穏やかに５回反転させた後、５ｍＬを送達デバイス（ＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅＩＩ）に添加した。
動物に、Ｔｅｌａｚｏｌ（ＩＭ、７～８ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔をかけ、カフ付き気管内チューブ（サイズ４．５）を気管内の咽頭のすぐ下に置き、輸送中および椅子に乗せる間にはずれることを回避するために固定した。その後、気管内チューブをエアロゾル生成系に接続するために、動物を椅子に真っすぐの姿勢で座らせた。動物を外部熱のためにブランケットおよびＢａｉｒ Ｈｕｇｇｅｒで覆い、麻酔への曝露および麻酔からの回復の間、心拍数およびＯ２飽和度をモニタリングした。
エアロゾル生成および送達系にはエアロゾル生成のためのＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅ ＩＩ Ｂｒｅａｔｈ Ａｃｔｕａｔｅｄ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（ＢＡＮ、Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｎａｄａ）を使用した。合計５ｍＬの対照または試験物品を、麻酔した動物に気管内チューブを介して送達した。ネブライザーのキャップのノブを切り換えることにより、ネブライザーを連続的なエアロゾル生成モードで作動させた。さらに、ネブライザーのキャップの内側の通気孔に栓をした。
動物の観察
ケージそばでの観察を屋内非ヒト霊長類の世話と管理のための手順のＣＲＯ飼育ＳＯＰ（ＣＲＯ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＳＯＰ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｄｏｏｒ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）に従って毎日２回実施した。処置および手順を行う日に、研究担当者が動物を注意深く観察した。主要な観察には、これだけに限定されないが、嘔吐の徴候、嗜眠、呼吸窮迫、およびチアノーゼ、粘膜の変色、嘔吐、および口からの不規則な排出または血便／尿が含まれた。
採血
全ての採血前に、動物を一晩、飲料水は自由に摂ることができるようにして絶食させ、採血後すぐに給餌した。臨床病理ならびに抗体価および免疫原性分析用の血液試料を大腿静脈の静脈穿刺によって採取した。血液学的検査および全血球計算（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）用の試料（ＥＤＴＡ中１ｍＬ）を、採取の２４～４８時間後に分析するために、採取日に外部のリファレンスラボラトリー（ＩＤＥＸＸ）に輸送した。臨床化学的検査用の試料（ＳＳＴ中１ｍＬ）を採取日にＣＲＯの病理検査室で分析した。
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）
絶食させた動物に、ヒト以外の霊長類の麻酔のＳＯＰ（ＳＯＰ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ｏｆ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）に従い、塩酸ケタミン、その後、イソフルラン吸入を用いて麻酔をかけた。ＢＡＬをＳＯＰ ＡＣＬ－１５３６ヒト以外の霊長類における肺洗浄および／または気管支鏡検査の実施手順（ＳＯＰ ＡＣＬ－１５３６ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ｌｕｎｇ Ｌａｖａｇｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｂｒｏｎｃｈｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）に従って実施するために、適当なサイズにしたカフ付き気管内チューブを気管分岐部のすぐ近位に挿入して、小児用気管支ファイバースコープの挿入を可能にした。ベースライン（Ｄ－７）および処置の４週間後に肺の両側から試料を採取した。ダルベッコＰＢＳの１０ｍＬ一定分量を３回、肺の適当な側に気管支スコープを通じて導入し、逐次的に吸引した。最初の洗浄からの洗浄分離液を別に保持し、２回目および３回目の洗浄液を採取の間に合わせ、採取後２時間未満のうちに処理するまで氷上で保持した。全ての洗浄液からの合わせた細胞を計数し、スライドを調製して、ＣＲＯの形態学的基準を使用した鑑別細胞計算を実施した。
安楽死および剖検
安楽死のために、ＣＲＯ ＳＯＰ、大型動物の安楽死（Ｌａｒｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）に従い、動物にケタミン（１１．０～１２．４ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を用いて麻酔をかけ、その後、安楽死用溶液をＩＶ注射した。死亡を確認後、訓練を受けた剖検員がＣＲＯ ＳＯＰ 非げっ歯類種の剖検手順（Ｎｅｃｒｏｐｓｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｎｏｎｒｏｄｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ）に従って剖検を実施し、組織を採取し、秤量し、保存し、検査した。組織をＤＮＡおよびＲＮＡに関して適宜処理した、または病理組織分析のために調製した。
任意の組織を採取する前に、動物にヘパリン添加食塩水を灌流した。肺および気管、骨格筋（横隔膜、上腕三頭筋、および外側広筋）、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、精巣、腎臓、脳、気管気管支リンパ節、ならびに脊髄を採取した。各組織を異なる領域に分け、各領域から複数の試料を採取した。主要な末梢器官の肉眼的剖検検査を実施し、あらゆる同定された病変から組織試料を採取した。組織の試料を採取し、その後のＤＮＡ用に急速冷凍したか、またはその後のＲＮＡ単離のためにＲＮＡＬａｔｅｒで保管した。さらなる試料を採取し、免疫組織化学的検査のためのその後のパラフィン包埋および切片作製のために１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。
気管および肺を広範囲にわたって試料採取して、各分析プロセスのための多数の試料を準備した。肺を収集し、気管のできるだけ上側をクランプした。右肺の主気管支をおよそ１ｍｍ離して２回クランプした。クランプの間を切断することによって右肺を取り出した。図１６に記載されている通り、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡの単離のための１６の試料を右肺の一次／二次気管支、三次気管支、および肺胞を包含する領域から採取した。気管および左肺を固定液で膨張させ、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。次いで、気管および左肺を、図１６に記載されている通り、気管、一次／二次気管支、三次気管支、および肺胞の試料が包含されるように切片作製した。
ウイルスゲノムの生体内分布および導入遺伝子発現
ＮＨＰ組織における定量のために、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）および逆転写酵素リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）法を展開した。各群からのＮＨＰの肺におけるウイルスゲノムの定量を、コドン最適化された導入遺伝子（配列番号４３）に対する（それに特異的な）プライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲおよびＲＴ－ｑＰＣＲによって実施した。組織において測定されたウイルス力価はＤＮＡ１μｇ当たりのコピー数として表され（ＢＬＱ＝５０）、導入遺伝子転写物はＲＮＡ２５０ｎｇの反応当たりのコピー数として表される（ＢＬＱ＝２５）。
全ての動物からの、図１６に記載される気管、一次／二次気管支、三次気管支、および肺胞の試料を包含する気管および左肺組織試料に対して免疫組織化学的検査を実施した。ＣＦＴＲ ＩＨＣアッセイを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＵＬＴＲＡ自動染色機および検出試薬、ＣＣ１Ｓ抗原回復プロトコールおよびチラミド増幅キット、ならびに抗ＣＦＴＲマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２７０２３８ Ｍ３Ａ７）を使用して実施した。
結果
抗ＡＡＶ中和抗体スクリーニングにより研究に組み入れるＮＨＰが同定される
ＮＨＰ血清中の４Ｄ－Ａ１０１カプシド（配列番号１２のカプシドタンパク質を含む）に対する中和抗体のレベルを評価するために、中和抗体アッセイを使用した。各ＮＨＰ血清試料に中和抗体力価を割り当てた。動物はセロネガティブであるとみなされ、また、１：１０の血清希釈度で≧５０％の形質導入が観察された場合、研究への組み入れ基準に合格した。
全部で、５０のＮＨＰ血清試料を評価した。アッセイ合格基準を１）標準曲線の変動係数（ＣＶ）、２）未知の血清試料のＣＶ、および３）標準曲線についての実際のインプットタンパク質からのパーセント偏差について設定した。標準曲線についての許容されるＣＶを＜２５％と定義した。定量の限界の範囲内に入る、未知の血清試料についての許容されるＣＶを＜３０％と定義した。標準曲線についてのインプットタンパク質からの許容されるパーセント偏差を＜２５％と定義した。全てのプレートが全てのアッセイ合格基準を満たし、これらのプレートからのデータを評価のために使用した。全体的に見て、評価した１９のＮＨＰ血清試料（３８％）が、４Ｄ－Ａ１０１に対してセロネガティブであった（図３１）。１：１０の血清希釈度でパーセント形質導入が最も高く、ベンダーにおける健康スクリーニングに合格したＮＨＰを研究への組み入れのために選択した。選択されたＮＨＰのＩＤおよび１：１０希釈度でのパーセント形質導入を表１７に報告する：
Figure 0007393565000036
Figure 0007393565000037
Figure 0007393565000038
４Ｄ－７１０の噴霧送達はＮＨＰにおける忍容性が良好である
研究設計を表１８に要約する：
Figure 0007393565000039
本研究の実施中に時期尚早に死亡したまたは安楽死させた動物はいなかった。研究期間の間にＴＡ曝露に関連する窮迫または健康問題の何らかの徴候を示した動物はいなかった。処置および試料採取の間に食欲の低下および摂食行動の変化は観察されなかった。本研究の間に処置に関連する体重の変化は生じなかった。
血液学的検査および全血球計算用の試料を採取日に外部のリファレンスラボラトリー（ＩＤＥＸＸ）に輸送し、採取後４８時間未満のうちに分析した。臨床化学的検査エンドポイント用の試料を採取日にＣＲＯの病理検査室で分析した。臨床化学的検査パラメータの一部は経時的に変化したが、いずれの時点においても、ビヒクル群と、どちらの用量レベルの４Ｄ－７１０処置群を比較しても差異は観察されなかった。同様に、吸入による処置の８週間後にベースラインレベルと比較して血液学的検査および血液細胞計数のいずれにも大きな変化は見られなかった。
右および左洗浄側について洗浄液（ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）中の細胞鑑別および細胞数を決定し、全てのデータを両側からの平均として表す。ＢＡＬＦ中の総細胞数および鑑別は、Ｄ２８に測定してベースラインレベルと比較して処置群間で異ならず、変動性および試料サイズの小ささに起因して、さらなる結論を出すことはできない。
器官の重量および体重に対する重量を安楽死の日に全ての処置群について収集した。器官の重量および体重に対して正規化した重量は処置群のいずれの間でも異ならなかった。
剖検時の肉眼的検査の間に主要な所見は報告されなかった。顕微鏡レベルの検査により、検査した組織において処置に関連する所見は認められないと結論づけられた。
４Ｄ－７１０により肺の全ての領域への頑強な遺伝子送達が媒介される
４Ｄ－７１０のゲノム生体内分布を決定するために、剖検中に得られた試料について段階的手法でウイルスゲノムを定量した。ビヒクル、３×１０１２ｖｇ、および３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物から得た全ての肺試料を分析した。３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物から採取した脳、脊髄（頸部、胸部、および腰部領域）、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、骨格筋（上腕三頭筋、外側広筋、横隔膜）、気管気管支リンパ節、および精巣試料を全て分析した。次いで、ウイルスゲノムがＢＬＱレベルを超えた組織をより低い用量の３×１０１２ｖｇで分析した（データ未決定）。データをＤＮＡ１μｇ当たりのウイルスゲノムとして報告する。
ｑＰＣＲ分析の結果から、Ｒ６と印が付けられた試料以外は、肺胞嚢（遠位）、三次気管支（中央）、および一次／二次気管支（近位）からの試料に相当する異なる肺領域の全体を通したウイルスの一様な送達が示される。この試料は、気管分岐部の近傍にあり、したがって、右側と左側の肺を分離し結紮する位置であることに起因して採取が困難であった（図１６参照）。３×１０１２ｖｇおよび３×１０１３ｖｇ用量群についての残りの試料位置における平均コピー数はそれぞれ１０４および１０５であった（図３２Ａ）。低用量群と高用量群の間の少なくとも１０倍の差異は、処置用量の差異が１０倍であることとよく一致する。同じ処置群内の全ての動物については、異なる肺葉または異なる肺領域内のウイルスゲノムの量に有意差は認められなかった（図３２Ｂ）。
３×１０１３ｖｇの４Ｄ－７１０の投与を受けた動物における非肺全身曝露を測定した（図３２Ｃ）。動物の気管気管支リンパ節に約１０４ｖｇ／μｇの検出可能なウイルスゲノムが存在した（図３２Ｃ）。これらの動物におけるこの組織についての病理学的読み取りは正常である。１匹のＮＨＰが脾臓に検出可能なウイルスゲノムを有し（図３２Ｃ）、病理学的読み取りにより正常であることが明示された。脳、脊髄、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、骨格筋、および精巣由来の試験した他の試料は全て定量の下限を下回った（図３２Ｃ）。試験物品に関連する病理は報告されなかった。したがって、４Ｄ－７１０の噴霧送達により、安全かつ肺の全ての領域へのウイルスゲノムの頑強な送達がもたらされ、非肺全身曝露は最小限である。
４Ｄ－７１０により肺の全ての領域への導入遺伝子発現が媒介される
４Ｄ－７１０の導入遺伝子発現を決定するために、剖検中に得られた試料についてＣＦＴＲΔＲ転写物を段階的手法で定量した。ビヒクル、３×１０１２ｖｇ、および３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物から得た全ての肺試料を分析した。３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物から採取した脳、脊髄、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、骨格筋、気管気管支リンパ節、および精巣試料を全て分析した（データ未決定）。次いで、転写物がＢＬＱレベルを超えた組織をより低い用量の３×１０１２ｖｇで分析した（データ未決定）。データをＲＮＡ２５０ｎｇの反応当たりのコピーとして報告し、ＲＮＡ１μｇ当たりのコピーとしてグラフ作成する。
ＲＴ－ｑＰＣＲ分析の結果から、肺における上首尾の形質導入および転写物の発現が示される。３×１０１３ｖｇの投与を受けた動物では、４８の肺試料のうちの４４がＢＬＱを超え、ＲＮＡ１μｇ当たり約１０３コピーであり、ビヒクル試料にＢＬＱを超えたものはなかった（図３３Ａ）。４つのＢＬＱ試料うち３つが、採取が技術的に困難であった同じＲ６試料位置からのものであり、１匹のＮＨＰがさらなる試料ＢＬＱを有した。Ｒ６と印が付けられた試料以外で（上記の理論的根拠を参照されたい）、肺胞嚢（遠位）、三次気管支（中央）、および一次／二次気管支（近位）からの試料に相当する異なる肺領域全体を通した形質導入（図３３Ｂ）が観察された。対照的に、より低い用量３×１０１２ｖｇ動物由来の肺試料では、４８の試料のうち４１がＢＬＱであった。これらのデータから、３×１０１３ｖｇの用量の４Ｄ－７１０により、ＮＨＰの肺組織に定量可能に形質導入し、治療用ＣＦＴＲΔＲ転写物を発現させることが可能になることが示唆される。
免疫組織化学的検査によって検出されたＣＦＴＲタンパク質発現により、ビヒクルと比較した場合、４Ｄ－７１０で処置されたＮＨＰの肺では、気管上皮、気管支上皮、および肺胞セクションにおけるＣＦＴＲ発現の増加が示される（図３４Ａ）。ビヒクル（図３４Ａ）と比較して、３×１０１３ｖｇで処置された動物の全てでＣＦＴＲ発現の頑強な増加が観察された（図３４Ｂ）。これらの結果から、４Ｄ－７１０の噴霧送達により、肺の全ての領域へのタンパク質発現が媒介されることが実証される。
結論
治療用製品、４Ｄ－７１０は、カニクイザルへのエアロゾル送達により特徴付けられた。血清をプレスクリーニングして、試験物品カプシド４Ｄ－Ａ１０１に対する既存の中和抗体に対してセロネガティブである動物を同定した。動物に、ビヒクル（製剤緩衝液）、３×１０１２ｖｇ用量の４Ｄ－７１０、または３×１０１３ｖｇ用量の４Ｄ－７１０のいずれかを、ＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓｅＩＩデバイスを使用して送達した。
研究におけるＮＨＰにわたって、肺胞嚢、三次気管支、および一次／二次気管支からの試料に相当する肺試料において大量のウイルスゲノムならびに得られたＣＦＴＲΔＲ転写物発現およびＣＦＴＲタンパク質発現が観察された。単一の脾臓試料に少ないが検出可能なウイルスゲノムが存在し、他の全ての組織由来の全ての試料では検出可能なウイルスゲノムは示されなかった。これらのデータから、４Ｄ－７１０の噴霧送達により、霊長類の肺の全ての領域（気管、肺胞および気管支上皮）へのウイルスゲノムの安全かつ頑強な送達がもたらされ、全身性生体内分布は最小限であることが実証される。これらのデータから、４Ｄ－７１０により、肺胞を含めた肺の全ての領域へのＣＦＴＲΔＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質産物の頑強な発現が媒介されることがさらに実証され、これにより、配列番号１２のカプシドタンパク質を含むカプシドを有するｒＡＡＶの、種々の肺障害の処置のための肺送達ベクターとしての適性が確認され、また、ヒト患者における嚢胞性線維症の処置のために生物活性のあるＣＦＴＲ治療用導入遺伝子の送達のための、４Ｄ－７１０（配列番号１２のカプシドタンパク質と配列番号４５の異種核酸とを含む）の使用が具体的に支持される。
本発明をその具体的な実施形態を参照して説明してきたが、当業者は本発明の真の主旨および範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができ、また等価物で代用することができることが理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの１つまたは複数のステップを本発明の目的、主旨および範囲に適合させるための多くの改変を行うことができる。そのような改変は全て、添付されている特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。

Claims (28)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む、対象における肺細胞への異種核酸の送達における使用のための組成物であって、前記ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも９０％同一であって、かつ配列番号１２のアミノ酸番号に基づいてアミノ酸４６９におけるＴｈｒおよびアミノ酸５９８におけるＡｌａを含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドと、（ｉｉ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む前記異種核酸とを含み、前記組成物は、肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内投与によって前記対象に投与され、前記カプシドタンパク質が抗ＡＡＶ抗体による中和に対して耐性であることを特徴とする、組成物。
  2. 前記肺細胞が、気道上皮細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞から選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. 前記気道上皮細胞が、基底細胞、杯細胞または線毛気道上皮細胞である、請求項２に記載の使用のための組成物。
  4. 前記気道上皮細胞が、肺胞上皮１型（ＡＥＣＩ）、肺胞上皮２型（ＡＥＣＩＩ）細胞、気管支上皮細胞または気管上皮細胞である、請求項３に記載の使用のための組成物。
  5. 前記組成物が、エアロゾル剤として製剤化されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  6. 前記組成物が、ネブライザーにより投与されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  7. 前記組成物が、１ｍｌ当たり前記ｒＡＡＶの１０１１～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  8. 前記遺伝子産物をコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  9. 前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項８に記載の使用のための組成物。
  10. 前記プロモーターが、組織特異的プロモーターを含む、請求項８に記載の使用のための組成物。
  11. 前記異種核酸が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  12. 前記異種核酸が、配列番号４３と少なくとも９５％同一の配列のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  13. 前記異種核酸が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  14. 前記カプシドタンパク質が、配列番号１２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  15. 前記カプシドタンパク質が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  16. 配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも９０％同一であり、かつ配列番号１２のアミノ酸番号に基づいてアミノ酸４６９におけるＴｈｒおよびアミノ酸５９８におけるＡｌａを含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドと組み合わせて使用するための医薬組成物であって、前記カプシドタンパク質が抗ＡＡＶ抗体による中和に対して耐性であり、前記医薬組成物が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む核酸を含み、前記ヌクレオチド配列が、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードする、医薬組成物。
  17. ｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）配列番号１２、または配列番号１２と少なくとも９０％同一であって、かつ配列番号１２のアミノ酸番号に基づいてアミノ酸４６９におけるＴｈｒおよびアミノ酸５９８におけるＡｌａを含むアミノ酸配列のカプシドタンパク質を含み、前記カプシドタンパク質が抗ＡＡＶ抗体による中和に対して耐性である、カプシドと、（ｉｉ）ＣＦＴＲまたはヒトＣＦＴＲタンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含み、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結しており、前記ＣＦＴＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、医薬組成物。
  18. 前記ＣＦＴＲタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記ＣＦＴＲをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記発現制御配列が構成的プロモーターを含み、好ましくは、前記構成的プロモーターはＣＭＶ１７３である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 前記組成物が、吸入のために製剤化されているかまたは吸入に好適である、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. クエン酸塩を含む緩衝液に製剤化されている、ｒＡＡＶウイルスを含む医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶウイルスが、（ｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含み、前記カプシドタンパク質が抗ＡＡＶ抗体による中和に対して耐性である、カプシドと、（ｉｉ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含み、前記異種核酸が、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質配列のアミノ酸７０８～７５９を欠く生物活性のある短縮型ＣＦＴＲタンパク質をコードする、医薬組成物。
  23. 前記ｒＡＡＶウイルスが、１０ｍＭ～５０ｍＭのクエン酸塩、７０ｍＭ～１５０ｍＭのＮａＣｌおよび必要に応じて界面活性物質を含む緩衝液に製剤化されている、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. ２０ｍＭ～５０ｍＭのクエン酸塩、８５ｍＭ～１２５ｍＭのＮａＣｌおよび約０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが６．０である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. ２０ｍＭのクエン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、ｐＨが６．０である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記ＣＦＴＲタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列と同一である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記医薬組成物が、肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内投与によって投与されることを特徴とする、嚢胞性線維症の処置における使用のための請求項１６から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. 嚢胞性線維症の処置のための医薬の製造のための請求項１６から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬組成物は、肺、気管支内、鼻腔内、気管内、および／または気管支内投与のためのものである、使用。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115552021A (zh) * 2020-04-27 2022-12-30 4D分子治疗有限公司 用于肺递送的腺相关变体、制剂和方法
WO2023172873A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids with improved lung tropism and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016526045A (ja) 2013-05-31 2016-09-01 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
WO2020014479A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Baxalta Incorporated Aav compositions
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056762A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 University Of Iowa Research Foundation Truncated cmv promoters and vectors containing same
WO2006036465A2 (en) * 2004-09-03 2006-04-06 University Of Florida Compositions and methods for treating cystic fibrosis
WO2017201121A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav for gene therapy in lungs
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
CA3136939A1 (en) * 2019-04-19 2020-10-22 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector formulations and methods
CN115552021A (zh) * 2020-04-27 2022-12-30 4D分子治疗有限公司 用于肺递送的腺相关变体、制剂和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016526045A (ja) 2013-05-31 2016-09-01 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
WO2020014479A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Baxalta Incorporated Aav compositions
WO2020117898A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Abeona Therapeutics Inc. Recombinant adeno-associated viral vector for gene delivery

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hum Gene Ther.，2015年，26(1)，pp.36-46
Pediatric Pulmonology，2005年，40(S28)，p.275, Poster Session Abstract 249
Proc Natl Acad Sci U S A.，2005年，102(8)，pp.2952-2957

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